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3  Ergebnisse

3.1 Vorversuche

3.1.1 Dosisfindung des uveitogenen Melaninproteins

Die Spaltlampenuntersuchung zeigte bei zwei von fünf Tieren der mit 25 µg Melanin­protein immu­nisierten Gruppe ab dem 15. Tag eine vermehrte Dilatation und korken­zieherartige Schlängelung der Irisgefäße. Zwischen dem 17. und 18. Tag kamen vereinzelt Hornhautpräzipitate, Fibrinexsu­date und hintere Syn­echien bis zur vollständigen Okklusion der Pupille hinzu.

Die höhere Antigendosis von 250 µg Melaninprotein hatte bereits zwischen dem 10. und 16. Tag bei 4 von 5 Tieren die obengenannten Symptome einer Uveitis zur Folge. Auf­fallend war, dass sich Hornhaut­präzipitate [Abb. 5,7], Fibrinexsudate [Abb. 6,7] und hintere Synechien bis zur vollständi­gen Pupillen­okklusion [Abb. 6,9] innerhalb eines Tages außerordentlich schnell und teils auch ohne eine zuvor erkennbare Gefäßdilatation [Abb. 8] entwickelten.

3.1.2 Induktion der EMIU ohne Adjuvantien

Bei den Tieren der Versuchsgruppe, die keine Adjuvantien erhalten hatte (n=6), wurden innerhalb von 21 Tagen keine Veränderungen des Augenvorderabschnittes beobachtet.

3.1.3 Intravital-Fluoreszenz-Mikroskopie

Die Methode der Intravitalmikroskopie war bei dem Modell der Experimentellen Melanin-induzierten Uve­itis bis zum 10. Tag p.i. grundsätzlich anwendbar [Abb. 10]. Bei zwei der am 12. Tag unter­suchten Tiere wurde die Qualität der Videobilder sehr stark durch Protein- und Zellexsudate beeinflusst, so dass nicht ver­tretbar hohe Fehlerquoten bei der Auswertung der Videosequenzen entstan­den wären [Abb. 11]. Weiterhin konnte infolge der hohen Anzahl fluoreszierender Zellen nicht mehr genau zwischen intravasal und bereits interstitiell befindlichen Leukozyten unterschie­den werden. Aus diesem Grund wurden am 12. Tag keine weiteren intravitalmikro­skopischen Untersuchungen durchgeführt.

Abbildung 5: Hornhautpräzipitate einer Ratte mit EMIU (6 Tage p.i.).
Fetter Pfeil – Iriskrause; dünner Pfeil – Präzipitate.


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Abbildung 6: EMIU am 10. Tag: stärkere Dilatation und korkenzieherartige Schlängelung der Irisgefäße, durch Fibrin bedingte Unschärfe einzelner Irisbezirke, beginnende Ausbildung hinterer Synechien.

Abbildung 7: EMIU am 9. Tag: Irisgefäßdilatation, wenig Fibrin in der Vorderkammer und zusätzlich sicht­bare Hornhautendothelbeschläge


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Abbildung 8: EMIU am 8. Tag p.i. - Irisgefäßdilatation bei einer Lewisratte, im regredienten Licht durch dunklere Schattierung andeutungsweise erkennbare Infiltration ein­zelner Irisbereiche (Pfeile).

Abbildung 9: EMIU am 14. Tag p.i. - Ausbildung einer Iris bombata mit Seclusio pupillae. Die Infiltration des zentralen Irisstromas ist deutlich durch dunklere Schattierung (Pfeile) und Strukturunschärfe zu erkennen.


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Abbildung 10: Intravitalmikroskopisches Videostandbild von Irisvenolen einer Ratte mit EMIU (10. Tag). Helle Punkte entsprechen fest am Endothel haftenden Leukozyten, helle Streifen innerhalb des Gefäßlumens stellen im Fluss befindliche Leukozyten oder am Endothel entlang rollende Leukozyten dar.

Abbildung 11: Intravitalmikroskopisches Videostandbild von Irisvenolen einer Ratte mit EMIU (12. Tag). Auffallend ist eine durch Exsudate bedingte Bildunschärfe und die große Anzahl extravasal befindlicher sowie am Endothel haftender Leukozyten.


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3.2  Experimentelle Melanin-induzierte Uveitis

3.2.1 Intravital-Fluoreszenz-Mikroskopie/ Videosequenzanalyse

3.2.1.1 Rollende Leukozyten bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Der Anteil der rollenden Leukozyten an der Gesamtzahl der einen definierten Gefäß­abschnitt durch­querenden Leukozyten stieg erstmals am 6. Tag signifikant auf 22,0±1,9 gegenüber 5,7±0,7 Zellen/min bei nicht immunisierten Tieren (naiv) an, um am 8. Tag ein Maximum von 40,8±4,2 Zellen/min zu errei­chen. Die vitalmikro­skopischen Analysen der nur mit Adjuvantien behandelten Kontroll­gruppe (Protokoll II) ergaben für rollende Leukozyten am 8. Tag keine signi­fikante Zu­nahme (10,3±1,2 Zellen/min) [Abb. 12].

3.2.1.2 Rollende Leukozyten (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Die Behandlung von EMIU-Tieren mit liposomalem Clodronat (Protokoll III) bewirkte am 10. Tag einen Rückgang rollender Leukozyten (16,6±1,8 vs. 30,7±2,9 Zellen/min) gegenüber unbehan­delter EMIU, wo­gegen Leer-Liposomen die Zahl rollender Leukozyten bei EMIU (Protokoll IV, 10. Tag: 34,8±4,2 Zel­len/min) nicht beeinflussten [Abb. 12].

3.2.1.3 Fest haftende Leukozyten bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Nicht immunisierte Tiere (naiv) zeigten 59,67±7,09 pro mm2 fest am Endothel haften­de Leukozyten. Bei EMIU konnte eine Zunahme dieses Parameters auf 175,42±18,24 Zellen/mm2 am 8. Tag ge­messen wer­den (p<0,05). Eine weitere Steigerung fand bis zum 10. Tag statt (371,71±30,67 Zel­len/mm2) (p<0,05). Die nur mit Adjuvantien behandelte Gruppe (Protokoll II) wies auch hier keine Veränderungen gegenüber nicht immunisierten Tieren auf (naiv) [Abb. 12].

3.2.1.4 Fest haftende Leukozyten (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Die Zahl der über einen Beobachtungszeitraum von 20 Sekunden an der Gefäßwand haftenden Leuko­zyten war bei mit liposomalem Clodronat behandelten Tieren am 8. Tag um die Hälfte ver­mindert (88,29±12,97 vs. 175,42±18,24 Zellen/mm2). Am 10. Tag lag dieser Wert mit 128,51±12,91 Zellen/mm2 etwas höher als jener am 8. Tag, zeigte aber eine Reduktion auf ein Drittel der Werte fest haftender Leukozyten bei EMIU-Tieren (Protokoll I) (p<0,05).

Die mit Leer-Liposomen behandelten EMIU-Gruppen (Protokoll IV) wiesen bei der Zahl fest haf­tender Leukozyten keinen signifikanten Unterschied zu EMIU-Gruppen am 8. Tag und 10. Tag auf [Abb. 12].

3.2.1.5 Leukozytenflux bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Im Verlauf der okulären Entzündung (EMIU) nahm der Leukozytenflux in Irisvenolen bis zum 6. Tag zu (567±19/ min). Danach fiel der Leukozytenflux bis zum 10. Tag auf 260±19 Zellen/min ab (p<0,05).

Ein signifikant höherer Leukozytenflux zeigte sich bei der nur mit Adjuvantien behan­delten Gruppe (Protokoll II) am 8. Tag gegenüber EMIU-Tieren (553±25 vs. 350±26 Zellen/min) (p<0,05) [Abb. 12].

3.2.1.6 Leukozytenflux (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Die Zahl der einen definierten Gefäßabschnitt innerhalb einer Minute durch­queren­den Leukozyten war bei mit liposomal verkapseltem Clodronat be­handelten Tieren zum 8. Tag auf Werte von 425±16 /min und am 10.Tag bis auf 685±24 Zellen/min (p<0,05) gestiegen. Die mit Leer-Liposo­men behandelte EMIU-Gruppe (Protokoll IV) zeigte am 8. Tag im Vergleich zur EMIU-Gruppe unter Clodronat-Behandlung kei­nen signifi­kanten Unterschied im Leukozytenflux. Am 10. Tag war der Flux von Leuko­zyten bei mit Clodronat-Liposomen (685±24 /min) oder Leer-Liposomen (648±29 Zellen/min) behan­delten EMIU-Gruppen deutlich höher als bei nicht immuni­sierten Tieren (naiv: 421± 31 Zellen/min) oder bei Tieren mit EMIU zum entsprechendem Zeitpunkt (p<0,05) [Abb. 12].


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Abbildung 12: Rollende und adhärente Leukozyten sowie Leukozytenflux in Irisvenolen bei EMIU. Als rol­lende Leukozyten wurden jene Zellen bezeichnet, die sich wesentlich langsamer als Zellen im Blutstrom direkt am Gefäßendothel entlang bewegen. Leukozyten, die sich während des Beobachtungszeitraumes von 20 Sekunden nicht fortbewegten, wurden als adhärente Zellen bezeichnet. Je Zeitpunkt und Gruppe wurden 6 Tiere untersucht.

Bei einer Tiergesamtzahl von n=60 wurden rollende, adhärente und frei fließende Leukozyten in 720 Gefäß­segmenten quantifiziert; naiv: nicht immunisierte, unbehandelte Tiere; Protokoll I: EMIU (mit bovinem Mela­ninprotein und Adjuvantien immunisierte Tiere); Protokoll II: mit Adjuvantien behandelte Tiere; Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere; Protokoll IV: mit Leer-Liposomen behandelte EMIU-Tiere. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich einzelner Gruppen (Balken), im Vergleich zu naiv (Stern).


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3.2.2  Kammerwasseranalyse

3.2.2.1 Zellen bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Am 8. Tag wurde erstmalig ein Anstieg der ins Kammerwasser emigrierten Zellen (24±4 Zellen/µl) beob­achtet. Die Zellzahl des Kammerwassers bei EMIU-Tieren stieg bis zum 10. Tag auf 82±17 Zellen/µl gegenüber 7±1 Zellen/µl bei nicht immunisierten Tieren an (naiv) (p<0,05). Die Tiere, denen nur Adjuvantien verabreicht wur­den (Protokoll II), wiesen eine mit nicht immunisierten Tieren vergleichbare Zellzahl des Kammer­wassers auf [Abb. 13].

3.2.2.2 Zellen (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Am 8. Tag konnten keine signifikanten Unterschiede der Zellzahl im Kammerwasser zwischen der EMIU-Gruppe und denen mit liposomalem Clodronat bzw. mit Leer-Lipo­somen (Protokoll IV) be­handelten EMIU-Gruppen festgestellt werden.

Unter Behandlung mit liposomalem Clodronat emigrierten bei EMIU-Tieren am 10. Tag mit 11±2 Zellen/µl deutlich weniger Zellen in das Kammerwasser als bei EMIU-Tieren (82±17 Zellen/µl) oder mit Leer-Lipo­somen behandelten EMIU-Tieren (Protokoll IV: 100±29 Zellen/µl).

Keine signifikanten Unterschiede der Zellzahl im Kammerwasser war zwischen nur mit Adjuvantien be­handelten Tieren und mit Clodronat behandelten EMIU-Tieren feststellbar (Protokoll II vs. Proto­koll III) [Abb. 13].

Abbildung 13: Zellen im Kammerwasser bei EMIU. Bei allen Tieren (n=66) wurde Kammerwasser aus bei­den Augen entnommen. Bei jedem Auge wurde zweimal 1µl Kammerwasser analysiert und aus beiden Zählungen/Messungen der Mittelwert gebildet; naiv:nicht immunisierte, unbehandelte Tiere; Protokoll I: EMIU (mit bovinem Melaninprotein und Adjuvantien immunisierte Tiere); Protokoll II: nur mit Adjuvantien behandelte Tiere; Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere; Protokoll IV: mit Leer-Liposomen be­handelte EMIU-Tiere. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich einzelner Gruppen (Balken); im Ver­gleich zu naiv (Stern).


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3.2.2.3  Protein bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Die Erhöhung der Proteinkonzentration bei EMIU auf 12,52±1,66 mg/ml am 10. Tag gegenüber Werten von 2,15±0,31 mg/ml nicht immunisierter Tiere (naiv) war signifikant [Abb. 14].

3.2.2.4 Protein (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Bei der mit liposomalem Clodronat behandelten EMIU-Gruppe war die Proteinexsudation in das Kam­merwasser mit 2,7±0,25 mg/ml um ein Vielfaches geringer ausgeprägt als bei der mit Leer-Liposomen behandelten EMIU-Gruppe (Protokoll IV: 14,17±2,08 mg/ml) und der EMIU-Gruppe (p<0,05). Es handelt sich dabei um eine mit nicht immunisierten Tieren vergleichbare Proteinkon­zentration (naiv) [Abb. 14].

Abbildung 14: Protein im Kammerwasser bei EMIU. Bei allen Tieren (n=66) wurde Kammerwasser aus bei­den Augen entnommen. Bei jedem Auge wurde zweimal 1µl Kammerwasser analysiert und aus beiden Zählungen/Messungen der Mittelwert gebildet; naiv:nicht immunisierte, unbehandelte Tiere; Protokoll I: EMIU (mit bovinem Melaninprotein und Adjuvantien immunisierte Tiere); Protokoll II: mit Adjuvantien behandelte Tiere; Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere; Protokoll IV: mit Leer-Liposomen be­handelte EMIU-Tiere. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich einzelner Gruppen (Balken); im Ver­gleich zu naiv (Stern).


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3.2.3  Blutbild

3.2.3.1 Gesamtleukozytenzahl bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Als Zeichen einer frühen Entzündungsreaktion stieg die absolute Leukozytenzahl im peripheren Blut bis zum 6. Tag stetig an (8,9±1,9 x109/l) und fiel bis zum 10. Tag auf 1,22±0,12 x109/l ab (p<0,05) [Abb. 15].

3.2.3.2 Gesamtleukozytenzahl (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Am 10. Tag wies die Leukozytenzahl im peripheren Blut von EMIU-Tieren (1,22±0,12 x109/l) und mit lipo­somalem Clodronat behandelten EMIU-Tieren (7,90±1,37 x109/l) einen signifikanten Unter­schied auf (p<0,05) [Abb. 15].

3.2.3.3 Lymphozyten bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Das periphere Blutbild nicht immunisierter Tieren (naiv) hatte einen Lympho­zyten­anteil von 72,62±2,89 %. Bei EMIU-Tieren nahm der Lymphozytenanteil im Entzündungs­verlauf ständig ab. Am 8. Tag wurden die niedrigsten Werte gemessen (25,55±10,12 % Lymphozyten). Auffällig war am 8. Tag der noch nied­rigere Lympho­zytenanteil von 14,07±1,43 % bei nur mit Adjuvantien be­handelten Tieren im Ver­gleich zu nicht immunisierten Tieren (Protokoll II vs. naiv) (p<0,05) [Abb. 15].

3.2.3.4 Lymphozyten (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Der Anteil der Lymphozyten im Differentialblutbild bei mit liposomalem Clodronat be­handelten Tieren stieg tendenziell bis zum 10. Tag auf 49,20±11,51 % gegenüber 28,47±9,65 % bei mit Leer-Liposomen behandelten EMIU-Tieren an (Protokoll IV). Es zeigte sich allerdings keine Signifikanz [Abb. 15].

3.2.3.5 Neutrophile bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Keinen signifikanten Unterschied zeigten die prozentualen Anteile Neutrophiler im peri­pheren Blut von EMIU-Tieren und nur mit Adjuvantien behandelten Tieren (Protokoll II). Der Neutrophilenwert dieser Tiere war allerdings am 10. Tag mit 73,98±0,60 % deutlich höher ausgeprägt als der Wert von 18,15±1,52 % bei nicht immunisierten Tieren (naiv) (p<0,05) [Abb. 15].

3.2.3.6 Neutrophile (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Am 8. und 10. Tag war im prozentualen Anteil Neutrophiler im peripheren Blut keine signifikante Differenz zwischen EMIU-Tieren und mit liposomalem Clodronat oder mit Leerliposomen behan­delten EMIU-Tieren (Protokoll IV) feststellbar. Jedoch war der Anteil Neutrophiler bei der mit Leer-Liposomen behandelten EMIU-Gruppe am 8. Tag deutlich höher als bei nicht immunisierten Tieren (67,00±9,10 % vs. 18,15±1,52 %; Protokoll IV vs. naiv) (p<0,05) [Abb. 15].


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Abbildung 15: Gesamtleukozytenzahl, Neutrophile und Lymphozyten bei EMIU. Allen Tieren (n=66) wurde eine Blutprobe entnommen; naiv: nicht immunisierte, unbehandelte Tiere; Proto­koll I: EMIU (mit bovi­nem Melaninprotein und Adjuvantien immunisierte Tiere); Protokoll II: mit Adjuvantien behandelte Tiere; Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere; Protokoll IV: mit Leer-Liposomen behandelte EMIU-Tiere. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich einzelner Gruppen (Balken), im Vergleich zu naiv (Stern).


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3.2.4  Blutplasmaanalyse

3.2.4.1 TNF-α bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Das Serum TNF-α zeigte einen biphasischen Verlauf mit einem ersten Anstieg am Tag 4 (191,7±68,3 vs. 51,7±16,1 pg/ml; Protokoll I vs. naiv). Zum 10. Tag stieg das TNF-α im Serum auf extrem hohe Werte von 954,9±216,3 pg/ml (p<0,05) [Abb. 16].

3.2.4.2 TNF-α (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Am 8. Tag waren bei mit Clodronat-Liposomen behandelten Tieren nur sehr geringe Konzentra­tionen an Tumornekrosefaktor-α nachweisbar. Sie zeigten keinen signifi­kanten Unterschied zu nicht immunisierten Tieren (Protokoll III vs. naiv). Verglichen mit dem Entzündungsmodell EMIU bewirkte die Behandlung mit Clodronat am 10. Tag eine signifikante Reduktion von TNF-α im Plasma: 32,5±2,7 vs. 954,9±216,3 pg/ml (Protokoll III vs. Protokoll I) (p<0,05) [Abb. 16].

3.2.4.3 IFN-γ bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Am 6. Tag war bei Tieren mit EMIU die höchste IFN-γ-Konzentration von 51,5±3,8 pg/ml nachweis­bar. Im weiteren Verlauf fielen die IFN-γ-Konzentrationen bis zum 8.Tag (37,7±16,2 pg/ml; Protokoll I) und zum 10. Tag ab (24,4±5,1 pg/ml) [Abb. 16].

3.2.4.4 IFN-γ (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Ein Nachweis von IFN-γ mit einer Konzentration von 28,4±6,3 pg/ml im Plasma gelang bei der mit Clo­dronat-Liposomen behandelten EMIU-Gruppe am 10. Tag. An­sonsten lagen die Werte für IFN-γ unter der Nachweisgrenze des ELISA-Kits von 13 pg/ml (p<0,05) [Abb. 16].

Abbildung 16: TNF-α und IFN-γ im Plasma bei EMIU. Protokoll I: EMIU (mit Melaninprotein und Adjuvan­tien immunisierte Tiere); Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere. Nachweisgrenze des TNF-α/IFN-γ-ELISA-Kits: 20 pg/ml bzw. 13 pg/ml. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich zu naiv (Stern).


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3.2.5  Immunohistologie der Milz

Zur Verifizierung der Makrophagendepletion entsprechender Versuchstiere wurden immunhisto­chemische Untersuchungen der Milz durchgeführt. Es zeigte sich, dass immunisierte oder zusätz­lich mit Leerliposomen behandelte Tiere reichlich ED1+-Zellen in der Marginalzone der Milz aufwie­sen [Abb. 17]. Im Milz­gewebe der mit liposomalem Clodronat behandelten EMIU-Tiere waren diese Zellen nicht nachzuweisen [Abb. 17].

Abbildung 17: Immunhistochemie der Milz. Zur Verifizierung der Clodronat-Liposomen-Behandlung wur­den immunhistochemische Untersuchungen an Milzgewebe durchgeführt. Das zur Markierung ED1+-Makrophagen verwendete Chromogen zeigte sich durch Braunfär­bung [A]. Nach anhaltender Clodronat-Liposomen-Behandlung lassen sich keine Makro­phagen darstellen [B].


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der Humboldt-Universität zu Berlin
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24.06.2005