Aus der Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Experimentelle Melanin-induzierte Uveitis
Modulation der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion durch Makrophagendepletion
- Intravitalmikroskopische Analysen -

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Joachim Puchta

aus Dresden

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. U. Pleyer
2. Prof. Dr. med. J. Wollensak
3. Prof. Dr. med. F. Krombach

Datum der Promotion: 23.11.2001

Widmung:

Meinen Eltern und Lehrern.

Inhaltsverzeichnis

• Fragestellung
• 1  Einleitung
  • 1.1 Anatomie und Physiologie der Uvea
  • 1.2 Entzündungen der Uvea – Epidemiologie und Ätiologie
  • 1.3 Tiermodelle der nichtinfektiösen Uveitis
    • 1.3.1 Experimentelle Melaninprotein-induzierte Uveitis (EMIU)
  • 1.4 Therapiemöglichkeiten der Uveitis
  • 1.5  Antigenpräsentierende Zellen im Vorderabschnitt des Auges
  • 1.6  Leukozyten-Endothelzell-Interaktion
  • 1.7  Intravitalmikroskopie
  • 1.8 Clodronat
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Tiere
  • 2.2 Antigenpräparation
  • 2.3 Vorversuche
    • 2.3.1 Dosisfindung des uveitogenen Melaninproteins
    • 2.3.2 Induktion der EMIU ohne Adjuvantien
  • 2.4 Induktion der EMIU
  • 2.5 Makrophagendepletion bei EMIU mit liposomal verkapseltem Clodronat
    • 2.5.1 Liposomenherstellung
  • 2.6  Kontrollen
  • 2.7 Intravital-Fluoreszenz-Mikroskopie
  • 2.8  Videosequenzanalyse
  • 2.9 Blut-/Plasmaanalyse
  • 2.10 Kammerwasseranalyse
  • 2.11 Immunohistologie der Milz
  • 2.12 Software
  • 2.13 Statistik
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Vorversuche
    • 3.1.1 Dosisfindung des uveitogenen Melaninproteins
    • 3.1.2 Induktion der EMIU ohne Adjuvantien
    • 3.1.3 Intravital-Fluoreszenz-Mikroskopie
  • 3.2  Experimentelle Melanin-induzierte Uveitis
    • 3.2.1 Intravital-Fluoreszenz-Mikroskopie/ Videosequenzanalyse
      • 3.2.1.1 Rollende Leukozyten bei unbehandelten Tieren (EMIU)
      • 3.2.1.2 Rollende Leukozyten (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat
      • 3.2.1.3 Fest haftende Leukozyten bei unbehandelten Tieren (EMIU)
      • 3.2.1.4 Fest haftende Leukozyten (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat
      • 3.2.1.5 Leukozytenflux bei unbehandelten Tieren (EMIU)
      • 3.2.1.6 Leukozytenflux (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat
    • 3.2.2  Kammerwasseranalyse
      • 3.2.2.1 Zellen bei unbehandelten Tieren (EMIU)
      • 3.2.2.2 Zellen (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat
      • 3.2.2.3  Protein bei unbehandelten Tieren (EMIU)
      • 3.2.2.4 Protein (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat
    • 3.2.3  Blutbild
      • 3.2.3.1 Gesamtleukozytenzahl bei unbehandelten Tieren (EMIU)
      • 3.2.3.2 Gesamtleukozytenzahl (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat
      • 3.2.3.3 Lymphozyten bei unbehandelten Tieren (EMIU)
      • 3.2.3.4 Lymphozyten (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat
      • 3.2.3.5 Neutrophile bei unbehandelten Tieren (EMIU)
      • 3.2.3.6 Neutrophile (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat
    • 3.2.4  Blutplasmaanalyse
      • 3.2.4.1 TNF-α bei unbehandelten Tieren (EMIU)
      • 3.2.4.2 TNF-α (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat
      • 3.2.4.3 IFN-γ bei unbehandelten Tieren (EMIU)
      • 3.2.4.4 IFN-γ (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat
    • 3.2.5  Immunohistologie der Milz
• 4  Diskussion
• 5  Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Lebenslauf
• Eidesstattliche Erklärung

Bilder

• Abbildung 1: Schematische Darstellung der Leukozyten-Endothel-Interaktion. [A] Mit Intravitalmikrosko­pie nachweisbare Ad­härenzphänomene der Leukozyten am vaskulä­ren Endothel. [B] Molekulare Grundlagen der Adhäsion und Transmigration von Leukozyten in perivaskuläres Gewebe - Adhäsionsmoleküle und Chemokine.
• Abbildung 2: Fluoreszierende Liposomen. Fluoreszenzfarbstoff: Rhodamin 6G.
• Abbildung 3: Schema für Immunisation und Behandlung der Tiere.
• Abbildung 4: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur intravitalmikroskopischen Darstellung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion am Auge: Die nakotisierten Tiere erhalten intravasal geeignete Fluo­reszenzfarbstoffe (z.B. Rhodamin 6G) zur selektiven Darstellung der Leukozyten. Nachdem die Tiere unter dem Objektiv des Mikro­skops positioniert wurden, können durch eine zusätzlich installierte CCD-Kamera Bildsequen­zen auf einem SVHS-Videorekorder gespeichert werden. Die Auswertung erfolgt über ein System zur digitalen Bildanalyse. Weitere Einzelheiten siehe Text.
• Abbildung 5: Hornhautpräzipitate einer Ratte mit EMIU (6 Tage p.i.). Fetter Pfeil – Iriskrause; dünner Pfeil – Präzipitate.
• Abbildung 6: EMIU am 10. Tag: stärkere Dilatation und korkenzieherartige Schlängelung der Irisgefäße, durch Fibrin bedingte Unschärfe einzelner Irisbezirke, beginnende Ausbildung hinterer Synechien.
• Abbildung 7: EMIU am 9. Tag: Irisgefäßdilatation, wenig Fibrin in der Vorderkammer und zusätzlich sicht­bare Hornhautendothelbeschläge
• Abbildung 8: EMIU am 8. Tag p.i. - Irisgefäßdilatation bei einer Lewisratte, im regredienten Licht durch dunklere Schattierung andeutungsweise erkennbare Infiltration ein­zelner Irisbereiche (Pfeile).
• Abbildung 9: EMIU am 14. Tag p.i. - Ausbildung einer Iris bombata mit Seclusio pupillae. Die Infiltration des zentralen Irisstromas ist deutlich durch dunklere Schattierung (Pfeile) und Strukturunschärfe zu erkennen.
• Abbildung 10: Intravitalmikroskopisches Videostandbild von Irisvenolen einer Ratte mit EMIU (10. Tag). Helle Punkte entsprechen fest am Endothel haftenden Leukozyten, helle Streifen innerhalb des Gefäßlumens stellen im Fluss befindliche Leukozyten oder am Endothel entlang rollende Leukozyten dar.
• Abbildung 11: Intravitalmikroskopisches Videostandbild von Irisvenolen einer Ratte mit EMIU (12. Tag). Auffallend ist eine durch Exsudate bedingte Bildunschärfe und die große Anzahl extravasal befindlicher sowie am Endothel haftender Leukozyten.
• Abbildung 12: Rollende und adhärente Leukozyten sowie Leukozytenflux in Irisvenolen bei EMIU. Als rol­lende Leukozyten wurden jene Zellen bezeichnet, die sich wesentlich langsamer als Zellen im Blutstrom direkt am Gefäßendothel entlang bewegen. Leukozyten, die sich während des Beobachtungszeitraumes von 20 Sekunden nicht fortbewegten, wurden als adhärente Zellen bezeichnet. Je Zeitpunkt und Gruppe wurden 6 Tiere untersucht.
• Abbildung 13: Zellen im Kammerwasser bei EMIU. Bei allen Tieren (n=66) wurde Kammerwasser aus bei­den Augen entnommen. Bei jedem Auge wurde zweimal 1µl Kammerwasser analysiert und aus beiden Zählungen/Messungen der Mittelwert gebildet; naiv:nicht immunisierte, unbehandelte Tiere; Protokoll I: EMIU (mit bovinem Melaninprotein und Adjuvantien immunisierte Tiere); Protokoll II: nur mit Adjuvantien behandelte Tiere; Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere; Protokoll IV: mit Leer-Liposomen be­handelte EMIU-Tiere. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich einzelner Gruppen (Balken); im Ver­gleich zu naiv (Stern).
• Abbildung 14: Protein im Kammerwasser bei EMIU. Bei allen Tieren (n=66) wurde Kammerwasser aus bei­den Augen entnommen. Bei jedem Auge wurde zweimal 1µl Kammerwasser analysiert und aus beiden Zählungen/Messungen der Mittelwert gebildet; naiv:nicht immunisierte, unbehandelte Tiere; Protokoll I: EMIU (mit bovinem Melaninprotein und Adjuvantien immunisierte Tiere); Protokoll II: mit Adjuvantien behandelte Tiere; Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere; Protokoll IV: mit Leer-Liposomen be­handelte EMIU-Tiere. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich einzelner Gruppen (Balken); im Ver­gleich zu naiv (Stern).
• Abbildung 15: Gesamtleukozytenzahl, Neutrophile und Lymphozyten bei EMIU. Allen Tieren (n=66) wurde eine Blutprobe entnommen; naiv: nicht immunisierte, unbehandelte Tiere; Proto­koll I: EMIU (mit bovi­nem Melaninprotein und Adjuvantien immunisierte Tiere); Protokoll II: mit Adjuvantien behandelte Tiere; Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere; Protokoll IV: mit Leer-Liposomen behandelte EMIU-Tiere. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich einzelner Gruppen (Balken), im Vergleich zu naiv (Stern).
• Abbildung 16: TNF-α und IFN-γ im Plasma bei EMIU. Protokoll I: EMIU (mit Melaninprotein und Adjuvan­tien immunisierte Tiere); Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere. Nachweisgrenze des TNF-α/IFN-γ-ELISA-Kits: 20 pg/ml bzw. 13 pg/ml. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich zu naiv (Stern).