VorversucheDosisfindung des uveitogenen Melaninproteins

Die Spaltlampenuntersuchung zeigte bei zwei von fünf Tieren der mit 25 µg Melaninprotein immunisierten Gruppe ab dem 15. Tag eine vermehrte Dilatation und korkenzieherartige Schlängelung der Irisgefäße. Zwischen dem 17. und 18. Tag kamen vereinzelt Hornhautpräzipitate, Fibrinexsudate und hintere Synechien bis zur vollständigen Okklusion der Pupille hinzu.

Die höhere Antigendosis von 250 µg Melaninprotein hatte bereits zwischen dem 10. und 16. Tag bei 4 von 5 Tieren die obengenannten Symptome einer Uveitis zur Folge. Auffallend war, dass sich Hornhautpräzipitate [Abb. 5,7], Fibrinexsudate [Abb. 6,7] und hintere Synechien bis zur vollständigen Pupillenokklusion [Abb. 6,9] innerhalb eines Tages außerordentlich schnell und teils auch ohne eine zuvor erkennbare Gefäßdilatation [Abb. 8] entwickelten.

Induktion der EMIU ohne Adjuvantien

Bei den Tieren der Versuchsgruppe, die keine Adjuvantien erhalten hatte (n=6), wurden innerhalb von 21 Tagen keine Veränderungen des Augenvorderabschnittes beobachtet.

Intravital-Fluoreszenz-Mikroskopie

Die Methode der Intravitalmikroskopie war bei dem Modell der Experimentellen Melanin-induzierten Uveitis bis zum 10. Tag p.i. grundsätzlich anwendbar [Abb. 10]. Bei zwei der am 12. Tag untersuchten Tiere wurde die Qualität der Videobilder sehr stark durch Protein- und Zellexsudate beeinflusst, so dass nicht vertretbar hohe Fehlerquoten bei der Auswertung der Videosequenzen entstanden wären [Abb. 11]. Weiterhin konnte infolge der hohen Anzahl fluoreszierender Zellen nicht mehr genau zwischen intravasal und bereits interstitiell befindlichen Leukozyten unterschieden werden. Aus diesem Grund wurden am 12. Tag keine weiteren intravitalmikroskopischen Untersuchungen durchgeführt.

Abbildung 5: Hornhautpräzipitate einer Ratte mit EMIU (6 Tage p.i.).
Fetter Pfeil – Iriskrause; dünner Pfeil – Präzipitate.

Abbildung 6: EMIU am 10. Tag: stärkere Dilatation und korkenzieherartige Schlängelung der Irisgefäße, durch Fibrin bedingte Unschärfe einzelner Irisbezirke, beginnende Ausbildung hinterer Synechien.

Abbildung 7: EMIU am 9. Tag: Irisgefäßdilatation, wenig Fibrin in der Vorderkammer und zusätzlich sichtbare Hornhautendothelbeschläge

Abbildung 8: EMIU am 8. Tag p.i. - Irisgefäßdilatation bei einer Lewisratte, im regredienten Licht durch dunklere Schattierung andeutungsweise erkennbare Infiltration einzelner Irisbereiche (Pfeile).

Abbildung 9: EMIU am 14. Tag p.i. - Ausbildung einer Iris bombata mit Seclusio pupillae. Die Infiltration des zentralen Irisstromas ist deutlich durch dunklere Schattierung (Pfeile) und Strukturunschärfe zu erkennen.

Abbildung 10: Intravitalmikroskopisches Videostandbild von Irisvenolen einer Ratte mit EMIU (10. Tag). Helle Punkte entsprechen fest am Endothel haftenden Leukozyten, helle Streifen innerhalb des Gefäßlumens stellen im Fluss befindliche Leukozyten oder am Endothel entlang rollende Leukozyten dar.

Abbildung 11: Intravitalmikroskopisches Videostandbild von Irisvenolen einer Ratte mit EMIU (12. Tag). Auffallend ist eine durch Exsudate bedingte Bildunschärfe und die große Anzahl extravasal befindlicher sowie am Endothel haftender Leukozyten.

Experimentelle Melanin-induzierte UveitisIntravital-Fluoreszenz-Mikroskopie/ Videosequenzanalyse Rollende Leukozyten bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Der Anteil der rollenden Leukozyten an der Gesamtzahl der einen definierten Gefäßabschnitt durchquerenden Leukozyten stieg erstmals am 6. Tag signifikant auf 22,0±1,9 gegenüber 5,7±0,7 Zellen/min bei nicht immunisierten Tieren (naiv) an, um am 8. Tag ein Maximum von 40,8±4,2 Zellen/min zu erreichen. Die vitalmikroskopischen Analysen der nur mit Adjuvantien behandelten Kontrollgruppe (Protokoll II) ergaben für rollende Leukozyten am 8. Tag keine signifikante Zunahme (10,3±1,2 Zellen/min) [Abb. 12].

Rollende Leukozyten (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Die Behandlung von EMIU-Tieren mit liposomalem Clodronat (Protokoll III) bewirkte am 10. Tag einen Rückgang rollender Leukozyten (16,6±1,8 vs. 30,7±2,9 Zellen/min) gegenüber unbehandelter EMIU, wogegen Leer-Liposomen die Zahl rollender Leukozyten bei EMIU (Protokoll IV, 10. Tag: 34,8±4,2 Zellen/min) nicht beeinflussten [Abb. 12].

Fest haftende Leukozyten bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Nicht immunisierte Tiere (naiv) zeigten 59,67±7,09 pro mm²fest am Endothel haftende Leukozyten. Bei EMIU konnte eine Zunahme dieses Parameters auf 175,42±18,24 Zellen/mm² am 8. Tag gemessen werden (p<0,05). Eine weitere Steigerung fand bis zum 10. Tag statt (371,71±30,67 Zellen/mm²) (p<0,05). Die nur mit Adjuvantien behandelte Gruppe (Protokoll II) wies auch hier keine Veränderungen gegenüber nicht immunisierten Tieren auf (naiv) [Abb. 12].

Fest haftende Leukozyten (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Die Zahl der über einen Beobachtungszeitraum von 20 Sekunden an der Gefäßwand haftenden Leukozyten war bei mit liposomalem Clodronat behandelten Tieren am 8. Tag um die Hälfte vermindert (88,29±12,97 vs. 175,42±18,24 Zellen/mm²). Am 10. Tag lag dieser Wert mit 128,51±12,91 Zellen/mm² etwas höher als jener am 8. Tag, zeigte aber eine Reduktion auf ein Drittel der Werte fest haftender Leukozyten bei EMIU-Tieren (Protokoll I) (p<0,05).

Die mit Leer-Liposomen behandelten EMIU-Gruppen (Protokoll IV) wiesen bei der Zahl fest haftender Leukozyten keinen signifikanten Unterschied zu EMIU-Gruppen am 8. Tag und 10. Tag auf [Abb. 12].

Leukozytenflux bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Im Verlauf der okulären Entzündung (EMIU) nahm der Leukozytenflux in Irisvenolen bis zum 6. Tag zu (567±19/ min). Danach fiel der Leukozytenflux bis zum 10. Tag auf 260±19 Zellen/min ab (p<0,05).

Ein signifikant höherer Leukozytenflux zeigte sich bei der nur mit Adjuvantien behandelten Gruppe (Protokoll II) am 8. Tag gegenüber EMIU-Tieren (553±25 vs. 350±26 Zellen/min) (p<0,05) [Abb. 12].

Leukozytenflux (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Die Zahl der einen definierten Gefäßabschnitt innerhalb einer Minute durchquerenden Leukozyten war bei mit liposomal verkapseltem Clodronat behandelten Tieren zum 8. Tag auf Werte von 425±16 /min und am 10.Tag bis auf 685±24 Zellen/min (p<0,05) gestiegen. Die mit Leer-Liposomen behandelte EMIU-Gruppe (Protokoll IV) zeigte am 8. Tag im Vergleich zur EMIU-Gruppe unter Clodronat-Behandlung keinen signifikanten Unterschied im Leukozytenflux. Am 10. Tag war der Flux von Leukozyten bei mit Clodronat-Liposomen (685±24 /min) oder Leer-Liposomen (648±29 Zellen/min) behandelten EMIU-Gruppen deutlich höher als bei nicht immunisierten Tieren (naiv: 421± 31 Zellen/min) oder bei Tieren mit EMIU zum entsprechendem Zeitpunkt (p<0,05) [Abb. 12].

Abbildung 12: Rollende und adhärente Leukozyten sowie Leukozytenflux in Irisvenolen bei EMIU. Als rollende Leukozyten wurden jene Zellen bezeichnet, die sich wesentlich langsamer als Zellen im Blutstrom direkt am Gefäßendothel entlang bewegen. Leukozyten, die sich während des Beobachtungszeitraumes von 20 Sekunden nicht fortbewegten, wurden als adhärente Zellen bezeichnet. Je Zeitpunkt und Gruppe wurden 6 Tiere untersucht. Bei einer Tiergesamtzahl von n=60 wurden rollende, adhärente und frei fließende Leukozyten in 720 Gefäßsegmenten quantifiziert; naiv: nicht immunisierte, unbehandelte Tiere; Protokoll I: EMIU (mit bovinem Melaninprotein und Adjuvantien immunisierte Tiere); Protokoll II: mit Adjuvantien behandelte Tiere; Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere; Protokoll IV: mit Leer-Liposomen behandelte EMIU-Tiere. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich einzelner Gruppen (Balken), im Vergleich zu naiv (Stern).

KammerwasseranalyseZellen bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Am 8. Tag wurde erstmalig ein Anstieg der ins Kammerwasser emigrierten Zellen (24±4 Zellen/µl) beobachtet. Die Zellzahl des Kammerwassers bei EMIU-Tieren stieg bis zum 10. Tag auf 82±17 Zellen/µl gegenüber 7±1 Zellen/µl bei nicht immunisierten Tieren an (naiv) (p<0,05). Die Tiere, denen nur Adjuvantien verabreicht wurden (Protokoll II), wiesen eine mit nicht immunisierten Tieren vergleichbare Zellzahl des Kammerwassers auf [Abb. 13].

Zellen (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Am 8. Tag konnten keine signifikanten Unterschiede der Zellzahl im Kammerwasser zwischen der EMIU-Gruppe und denen mit liposomalem Clodronat bzw. mit Leer-Liposomen (Protokoll IV) behandelten EMIU-Gruppen festgestellt werden.

Unter Behandlung mit liposomalem Clodronat emigrierten bei EMIU-Tieren am 10. Tag mit 11±2 Zellen/µl deutlich weniger Zellen in das Kammerwasser als bei EMIU-Tieren (82±17 Zellen/µl) oder mit Leer-Liposomen behandelten EMIU-Tieren (Protokoll IV: 100±29 Zellen/µl).

Keine signifikanten Unterschiede der Zellzahl im Kammerwasser war zwischen nur mit Adjuvantien behandelten Tieren und mit Clodronat behandelten EMIU-Tieren feststellbar (Protokoll II vs. Protokoll III) [Abb. 13].

Abbildung 13: Zellen im Kammerwasser bei EMIU. Bei allen Tieren (n=66) wurde Kammerwasser aus beiden Augen entnommen. Bei jedem Auge wurde zweimal 1µl Kammerwasser analysiert und aus beiden Zählungen/Messungen der Mittelwert gebildet; naiv:nicht immunisierte, unbehandelte Tiere; Protokoll I: EMIU (mit bovinem Melaninprotein und Adjuvantien immunisierte Tiere); Protokoll II: nur mit Adjuvantien behandelte Tiere; Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere; Protokoll IV: mit Leer-Liposomen behandelte EMIU-Tiere. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich einzelner Gruppen (Balken); im Vergleich zu naiv (Stern).

Protein bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Die Erhöhung der Proteinkonzentration bei EMIU auf 12,52±1,66 mg/ml am 10. Tag gegenüber Werten von 2,15±0,31 mg/ml nicht immunisierter Tiere (naiv) war signifikant [Abb. 14].

Protein (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Bei der mit liposomalem Clodronat behandelten EMIU-Gruppe war die Proteinexsudation in das Kammerwasser mit 2,7±0,25 mg/ml um ein Vielfaches geringer ausgeprägt als bei der mit Leer-Liposomen behandelten EMIU-Gruppe (Protokoll IV: 14,17±2,08 mg/ml) und der EMIU-Gruppe (p<0,05). Es handelt sich dabei um eine mit nicht immunisierten Tieren vergleichbare Proteinkonzentration (naiv) [Abb. 14].

Abbildung 14: Protein im Kammerwasser bei EMIU. Bei allen Tieren (n=66) wurde Kammerwasser aus beiden Augen entnommen. Bei jedem Auge wurde zweimal 1µl Kammerwasser analysiert und aus beiden Zählungen/Messungen der Mittelwert gebildet; naiv:nicht immunisierte, unbehandelte Tiere; Protokoll I: EMIU (mit bovinem Melaninprotein und Adjuvantien immunisierte Tiere); Protokoll II: mit Adjuvantien behandelte Tiere; Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere; Protokoll IV: mit Leer-Liposomen behandelte EMIU-Tiere. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich einzelner Gruppen (Balken); im Vergleich zu naiv (Stern).

BlutbildGesamtleukozytenzahl bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Als Zeichen einer frühen Entzündungsreaktion stieg die absolute Leukozytenzahl im peripheren Blut bis zum 6. Tag stetig an (8,9±1,9 x10⁹/l) und fiel bis zum 10. Tag auf 1,22±0,12 x10⁹/l ab (p<0,05) [Abb. 15].

Gesamtleukozytenzahl (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Am 10. Tag wies die Leukozytenzahl im peripheren Blut von EMIU-Tieren (1,22±0,12 x10⁹/l) und mit liposomalem Clodronat behandelten EMIU-Tieren (7,90±1,37 x10⁹/l) einen signifikanten Unterschied auf (p<0,05) [Abb. 15].

Lymphozyten bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Das periphere Blutbild nicht immunisierter Tieren (naiv) hatte einen Lymphozytenanteil von 72,62±2,89 %. Bei EMIU-Tieren nahm der Lymphozytenanteil im Entzündungsverlauf ständig ab. Am 8. Tag wurden die niedrigsten Werte gemessen (25,55±10,12 % Lymphozyten). Auffällig war am 8. Tag der noch niedrigere Lymphozytenanteil von 14,07±1,43 % bei nur mit Adjuvantien behandelten Tieren im Vergleich zu nicht immunisierten Tieren (Protokoll II vs. naiv) (p<0,05) [Abb. 15].

Lymphozyten (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Der Anteil der Lymphozyten im Differentialblutbild bei mit liposomalem Clodronat behandelten Tieren stieg tendenziell bis zum 10. Tag auf 49,20±11,51 % gegenüber 28,47±9,65 % bei mit Leer-Liposomen behandelten EMIU-Tieren an (Protokoll IV). Es zeigte sich allerdings keine Signifikanz [Abb. 15].

Neutrophile bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Keinen signifikanten Unterschied zeigten die prozentualen Anteile Neutrophiler im peripheren Blut von EMIU-Tieren und nur mit Adjuvantien behandelten Tieren (Protokoll II). Der Neutrophilenwert dieser Tiere war allerdings am 10. Tag mit 73,98±0,60 % deutlich höher ausgeprägt als der Wert von 18,15±1,52 % bei nicht immunisierten Tieren (naiv) (p<0,05) [Abb. 15].

Neutrophile (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Am 8. und 10. Tag war im prozentualen Anteil Neutrophiler im peripheren Blut keine signifikante Differenz zwischen EMIU-Tieren und mit liposomalem Clodronat oder mit Leerliposomen behandelten EMIU-Tieren (Protokoll IV) feststellbar. Jedoch war der Anteil Neutrophiler bei der mit Leer-Liposomen behandelten EMIU-Gruppe am 8. Tag deutlich höher als bei nicht immunisierten Tieren (67,00±9,10 % vs. 18,15±1,52 %; Protokoll IV vs. naiv) (p<0,05) [Abb. 15].

Abbildung 15: Gesamtleukozytenzahl, Neutrophile und Lymphozyten bei EMIU. Allen Tieren (n=66) wurde eine Blutprobe entnommen; naiv: nicht immunisierte, unbehandelte Tiere; Protokoll I: EMIU (mit bovinem Melaninprotein und Adjuvantien immunisierte Tiere); Protokoll II: mit Adjuvantien behandelte Tiere; Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere; Protokoll IV: mit Leer-Liposomen behandelte EMIU-Tiere. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich einzelner Gruppen (Balken), im Vergleich zu naiv (Stern).

BlutplasmaanalyseTNF-α bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Das Serum TNF-α zeigte einen biphasischen Verlauf mit einem ersten Anstieg am Tag 4 (191,7±68,3 vs. 51,7±16,1 pg/ml; Protokoll I vs. naiv). Zum 10. Tag stieg das TNF-α im Serum auf extrem hohe Werte von 954,9±216,3 pg/ml (p<0,05) [Abb. 16].

TNF-α (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Am 8. Tag waren bei mit Clodronat-Liposomen behandelten Tieren nur sehr geringe Konzentrationen an Tumornekrosefaktor-α nachweisbar. Sie zeigten keinen signifikanten Unterschied zu nicht immunisierten Tieren (Protokoll III vs. naiv). Verglichen mit dem Entzündungsmodell EMIU bewirkte die Behandlung mit Clodronat am 10. Tag eine signifikante Reduktion von TNF-α im Plasma: 32,5±2,7 vs. 954,9±216,3 pg/ml (Protokoll III vs. Protokoll I) (p<0,05) [Abb. 16].

IFN-γ bei unbehandelten Tieren (EMIU)

Am 6. Tag war bei Tieren mit EMIU die höchste IFN-γ-Konzentration von 51,5±3,8 pg/ml nachweisbar. Im weiteren Verlauf fielen die IFN-γ-Konzentrationen bis zum 8.Tag (37,7±16,2 pg/ml; Protokoll I) und zum 10. Tag ab (24,4±5,1 pg/ml) [Abb. 16].

IFN-γ (EMIU) nach Behandlung mit liposomalem Clodronat

Ein Nachweis von IFN-γ mit einer Konzentration von 28,4±6,3 pg/ml im Plasma gelang bei der mit Clodronat-Liposomen behandelten EMIU-Gruppe am 10. Tag. Ansonsten lagen die Werte für IFN-γ unter der Nachweisgrenze des ELISA-Kits von 13 pg/ml (p<0,05) [Abb. 16].

Abbildung 16: TNF-α und IFN-γ im Plasma bei EMIU. Protokoll I: EMIU (mit Melaninprotein und Adjuvantien immunisierte Tiere); Protokoll III: mit liposomalem Clodronat behandelte EMIU-Tiere. Nachweisgrenze des TNF-α/IFN-γ-ELISA-Kits: 20 pg/ml bzw. 13 pg/ml. Mittelwert±Standardfehler; p<0,05 im Vergleich zu naiv (Stern).

Immunohistologie der Milz

Zur Verifizierung der Makrophagendepletion entsprechender Versuchstiere wurden immunhistochemische Untersuchungen der Milz durchgeführt. Es zeigte sich, dass immunisierte oder zusätzlich mit Leerliposomen behandelte Tiere reichlich ED1+-Zellen in der Marginalzone der Milz aufwiesen [Abb. 17]. Im Milzgewebe der mit liposomalem Clodronat behandelten EMIU-Tiere waren diese Zellen nicht nachzuweisen [Abb. 17].

Abbildung 17: Immunhistochemie der Milz. Zur Verifizierung der Clodronat-Liposomen-Behandlung wurden immunhistochemische Untersuchungen an Milzgewebe durchgeführt. Das zur Markierung ED1+-Makrophagen verwendete Chromogen zeigte sich durch Braunfärbung [A]. Nach anhaltender Clodronat-Liposomen-Behandlung lassen sich keine Makrophagen darstellen [B].