Analyse der Regulationsmechanismen des humanen Tumorsuppressor Gens H REV107 1

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin
von

Steffen Reich

geb. am 19. Januar 1971 in Genf, Schweiz

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Christoph Markschies

Dekan: der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Dr. habil. Christine Sers
2. Prof. Dr. Hanspeter Herzel
3. Prof. Dr. Wolfgang Uckert

Tag der mündlichen Prüfung:23. Mai 2006

Diese Arbeit widme ich Frau Anke Reich, deren Liebe und Geduld mich durch die schönen und schweren Stunden dieser Promotionszeit begleitet haben.

"Let it be known
there is a fountain
that was not made
by the hands of men..."

Ripple (Hunter, Garcia), 1970, American Beauty, The Grateful Dead

Zusammenfassung

Das Tumorsuppressor Gen H REV107 1 wird in normalen Geweben ubiquitär exprimiert, während die Expression in humanen Mamma-, Ovarial-, und Lungentumoren unterdrückt ist. H REV107 1 hemmt das Tumorwachstum in vitro und in vivo. Die Expression und Regulation des H REV107 1 Gens wurde in verschiedenen, humanen Zelllinien untersucht.

In den Tumor Zelllinien A27/80, OVCAR-3, SKOV-3, RCC26, MZ1257 und in der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 wird die H REV107 1 Expression durch IFN-γ induziert. In OVCAR-3, A27/80, SKOV-3 und RCC26 und in der humanen Ovarialepithelzelllinie HOSE wurde eine Korrelation der H REV107 1 und der IRF 1 Expression nach Induktion mit IFN-γ gezeigt. H-rev107-1 konnte in NIH3T3 auch nach konditionaler IRF-1 Expression, Proteinsynthese-unabhängig, nachgewiesen werden. Dies zeigt, dass H rev107 1 ein direktes Zielgen von IRF-1 ist.

In der KRAS-transformierten Rattenzelllinie ROSE199A2/5 und in der humanen Teratokarzinomzelllinie PA-1 ließ sich die H rev107 1 Expression durch Unterdrückung des MEK/ERK-Signalwegs mit dem MEK-1 Inhibitor PD98059 aktivieren. Die Hemmung des PI3K-Signalwegs mit dem Inhibitor LY294002 führte zu keiner Re-Expression von H rev107 1. In Dies bedeutet, dass H REV107 1 durch mindestens zwei verschiedene Signalwege, IFN-γ und MEK/ERK, reguliert wird.

Die H-REV107-1 Promoter Region wurde in silico bestimmt, in vitro amplifiziert und in das pGL-3 basic Luciferase Reporter Plasmid kloniert. Der H-REV107-1 Promoter enthält keine TATA-Box, sondern ein Initiator Element sowie, in dem für eine TATA-Box definierten Abstand, eine ATF-2 Bindungsstelle. Die Inkubation von transient transfizierten Zellen mit TNF-α, cAMP und IFN-γ steigerte die Luciferase Aktivität unter der Kontrolle des mit 980 bp längsten Promoter Konstrukts. Mit Hilfe von verschiedenen Deletionskonstrukten und Konstrukten, in denen potentielle Transkriptionsfaktorbindungsstellen mutiert waren, wurden die regulatorischen Bereiche des Promoters bestimmt. Mutationen der IRF-1 und der STAT-1 Bindungsstellen, die potentielle Ziele des IFN-γ Signalwegs darstellen, ergaben keinen Verlust der Luciferase Aktivität. Eine Mutation der cRel-Bindungsstelle, potentiell über NFκB reguliert, resultierte in einer Luciferase Aktivität von nur 9% des Wildtyp Promoterkonstrukts. Die Mutation der CREB/ATF-2 Bindungsstelle reduzierte die Luciferase Aktivität auf 37%. Die Ko-Transfektion des Gesamtpromoter-Konstrukts mit einem NFκB Suppressor, dem dominant negativen IκB Expressionsplasmid, reduzierte die Luciferase Aktivität um 53%. Diese Ergebnisse legen nahe, dass NFκB und ATF-2 die H REV107 1 Expression positiv regulieren.

Um eine biologische Funktion der durch Mutation inaktivierten c-Rel und CREB/ATF-2 Bindungsstellen zu zeigen, wurden Gel-Retardationsassays (EMSA) durchgeführt. Mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers konnte die Bindung von ATF-2 an das, die CREB/ATF-2 Bindungsstelle enthaltende, P³²-markierte, Oligonukleotid gezeigt werden. Obwohl auch das, die c-Rel-Bindungsstelle enthaltende, Oligonukleotid spezifisch von einem Protein gebunden wurde, konnte dieses nicht mit einem Antikörper der NFκB-Familie identifiziert werden. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass H-REV107-1 durch eine IFN-γ induzierte, möglicherweise PKR vermittelte, Signalkette von den Faktoren IRF-1 und ATF-2 direkt, sowie von NFκB indirekt, reguliert wird.

Eigene Schlagworte: H-REV107-1, ATF-2, IRF-1, NFκB, Tumorsuppressor

Abstract

The H REV107 1 class II tumor suppressor gene is ubiquitously expressed in normal tissues and downregulated in human breast, ovarian and lung tumors. HREV1071 has the capacity to suppress growth of tumor cells in vitro and in vivo. In A27/80, OVCAR3, SKOV3, RCC26, MZ1257 and ROSE199 cell lines H REV107 1 is upregulated after treatment with IFNγ. A NIH3T3 cell line harboring an estrogeninducible IRF1/hER fusion protein showed a protein synthesis independent upregulation of H rev107 1 expression after induction of IRF1. The parental NIH3T3 cell line showed no induction of H rev107 1 expression after treatment with estrogen. This demonstrates that H rev107 1 is a direct target of IRF1. Furthermore, a time course dependent correlation between H REV107 1 and IRF 1 expression was confirmed in OVCAR3 and A27/80 cell lines. Additionally, there was a correlation between H REV107 1 and IRF 1 expression in the immortalized human ovarian epithelial cell line HOSE and in the carcinoma cell lines SKOV3 and RCC26.

Inhibition of the MEK/ERK pathway in a RAStransformed derivate of immortalized rat ovarian surface epithelial cells, ROSE199 A2/5, using the MEK1 inhibitor PD 98059, but not the inhibitor of the PI3K pathway LY 294002, leads to a restored expression of H rev107 1. In the teratocarcinoma cell line PA1 but not in the A27/80 or OVCAR3 cell lines, PD 98059 partially restored expression of H REV107 1. Therefore, H REV107 1 can be a target of the MEK/ERK-pathway in the ROSE199 A2/5 and the PA1 cell line. Thus, H REV107 1 is regulated by at least two different pathways.

To understand the regulatory mechanisms of the expression of the H REV107 1 gene, the putative promoter region was analyzed in silico. The sequence was amplified and cloned into the pGL3basic Luciferase Reporter plasmid (Promega™). Induction of the promoter constructs with TNFα, cAMP and IFNγ increased the luciferase activity. Several deletions constructs and constructs with putative transcription factor binding sites mutated were used to narrow down the important regulatory elements of the promoter. While mutations of an IRF1 binding site and a STATbinding site as potential targets of the IFNγ signaling pathway did not reduce the luciferase activity, the mutations of a cRel binding site and a CREB/ATF2 binding site decreased the luciferase activity by 91% and 63%, respectively. Cotransfection of the full length promoter construct with a dominant negative I#SYMBOL#B expression plasmid, a repressor of NF#SYMBOL#B activation, reduced the luciferase activity to 47%. As a result of the investigation H REV107 1 is directly regulated by IRF1 and probably indirectly regulated by NFκB and the MEK/ERK signaling pathway.

To show a biological function of the CREB/ATF2 and the cRel binding site, an Electro Mobility Shift Assay (EMSA) was performed, using a P32-labeled oligonucleotid, which included the CREB/ATF2 or the cRel binding site. The binding of ATF2 to the CREB oligonucleotid was demonstrated by the use of a specific antibody. While there was also a specific protein binding to the cRel binding site, none of the used antibodies of the NFκB family resulted in a supershift with the cRel oligonucleotid. The ATF2 binding site in the posititon –30 bp - 23 bp of the human, TATA-less HREV1071 promoter replaces the TATA-like element, which can be found in the Hrev1071 promoter of rat and mouse.

Keywords: H-REV107-1, ATF2, IRF1, NFκB, tumor suppressor

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1  Die Tumorentstehung
    • 1.1.1  Onkogene
    • 1.1.2 Tumorsuppressorgene
      • 1.1.2.1  Klasse I Tumorsuppressorgene
        • 1.1.2.1.1  Expressionsverlust durch Deletion und Mutationen
      • 1.1.2.2 Klasse II Tumorsuppressorgene
        • 1.1.2.2.1  Expressionsverlust durch Aktivierung von Suppressoren
        • 1.1.2.2.2 Expressionsverlust durch Inaktivierung regulatorischer Faktoren
        • 1.1.2.2.3 Expressionsverlust durch epigenetische Veränderungen
      • 1.1.2.3 Klasse II Tumorsuppressorgene im therapeutischen Ansatz
  • 1.2  H-REV107-1 ist ein Klasse II Tumorsuppressorgen
    • 1.2.1  Expression von H-REV107-1 in normalem Gewebe, in Tumoren sowie normalen und malignen Zelllinien
    • 1.2.2  H-rev107-1 besitzt wachstumshemmende Eigenschaften
    • 1.2.3  H-REV107-1 liegt in humanen Tumoren als Wildtyp-Sequenz vor
  • 1.3 Die H-REV107 Familie
    • 1.3.1  Entdeckung und Funktion der Mitglieder der H-REV107 Gen-Familie
    • 1.3.2 Die H-REV107 Familie ist Teil der NlpC/P60-Superfamilie
      • 1.3.2.1  Die P60-ähnliche Familie
      • 1.3.2.2 Die AcmB-ähnliche Familie
      • 1.3.2.3 Die YaeF-ähnliche Familie
      • 1.3.2.4 Die LRAT-ähnliche Familie
  • 1.4 Die humane H-REV107 Proteinfamilie
  • 1.5 Fragestellung der Arbeit
• 2 Materialien und Methoden
  • 2.1  Materialien
    • 2.1.1  Chemikalien
    • 2.1.2 Kits
    • 2.1.3 Geräte
    • 2.1.4 Enzyme
    • 2.1.5 Zelllinien
    • 2.1.6 Bakterienstämme (Escherichia coli)
    • 2.1.7  Antikörper für den Gel Retardations-Assay
    • 2.1.8 Membranen
    • 2.1.9  Oligonukleotide
      • 2.1.9.1  Primer für die Sequenzierung
      • 2.1.9.2 Primer zur Synthese der Fragmente der SEAP Konstrukte
      • 2.1.9.3  Primer zur Synthese der Fragmente der pGL3 Konstrukte
      • 2.1.9.4 Primer für die Sondenherstellung
      • 2.1.9.5 Primer für die zielgerichtete Mutagenese
      • 2.1.9.6  Oligonukleotide für EMSA Experimente
    • 2.1.10  Plasmide, Konstrukte und Phagen
    • 2.1.11  Software
      • 2.1.11.1  Promoteranalyse
      • 2.1.11.2 Datenbanken
    • 2.1.12 Stammlösungen
    • 2.1.13 Medien
      • 2.1.13.1  Zellkultur
      • 2.1.13.2 Bakterienkultur
    • 2.1.14 Gel-Zusammensetzung
  • 2.2 Methoden
    • 2.2.1  RNA-Isolierung aus Säuger-Zelllinien
    • 2.2.2 DNA Isolierung
      • 2.2.2.1  Maxi Präparation
      • 2.2.2.2 Mini Präparation
    • 2.2.3 Manipulation von DNA
      • 2.2.3.1  Verdau von DNA
      • 2.2.3.2 Dephosphorylierung von DNA-Enden
      • 2.2.3.3 Ligation von DNA Fragmenten
      • 2.2.3.4 Einführung von Punkt-Mutationen
    • 2.2.4 5´-Endmarkierung von Oligonukleotiden
    • 2.2.5 Northern Blot Hybridisierung für mRNA
    • 2.2.6 Southern Blot Hybridisierung für DNA
    • 2.2.7 PCR
      • 2.2.7.1  Herstellung der humanen H-REV107-1 Sonde für den Northern- und Southern Blot Hybridisierungsassay
      • 2.2.7.2  Herstellung der IRF-1 Sonde für den Northern Blot Hybridisierungsassay (human und Ratte)
      • 2.2.7.3 Herstellung der Ratten H-rev107-1 Sonde für den Northern Blot Hybridisierungsassay
      • 2.2.7.4 Herstellung der pGL3-Promoterkonstrukte
      • 2.2.7.5 Herstellung der SEAP-Promoterkonstrukte
    • 2.2.8 Sequenzierung
      • 2.2.8.1  Genome Priming System
      • 2.2.8.2 zyklische Sequenzierung
    • 2.2.9 Primer Extension
      • 2.2.9.1  Markieren des Primers
      • 2.2.9.2 radioaktive Sequenzierung im Zuge des Primer Extension Nachweises
    • 2.2.10 Bakterienkultur
      • 2.2.10.1  allgemeine Bakterienkultur
      • 2.2.10.2 Transformation
    • 2.2.11 Zellkultur
      • 2.2.11.1  allgemeine Zellkultur
      • 2.2.11.2 Transiente Transfektion
    • 2.2.12 Reporterassay
      • 2.2.12.1  Great EscAPe^TM SEAP Reporter Assay System (Clontech)
      • 2.2.12.2 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)
    • 2.2.13 Proteinisolierung aus Zellkernen
    • 2.2.14 EMSA
• 3 Ergebnisse
  • 3.1  Aufbau des humanen H-REV107-1 Gens
  • 3.2 Expression von H REV107 1 in Säugetier-Zelllinien
    • 3.2.1  Die H-REV107-1 Genexpression in unbehandelten Zelllinien
    • 3.2.2 Abhängigkeit der H REV107 1 Genexpression von RAS-Signalwegen
    • 3.2.3 Abhängigkeit der H REV107 1 Genexpression von der Methylierung CpG-reicher Regionen
  • 3.3  H REV107 1 als Zielgen von IFN-γ und IRF-1
    • 3.3.1  Expression von H REV107 1 nach der Applikation von IFN-γ
    • 3.3.2 Induktion der H rev107 1 Expression mittels Östrogen-induzierbarer Aktivität von Irf-1
    • 3.3.3 Korrelation der H REV107 1 und der IRF 1 Genexpression in humanen Zelllinien
    • 3.3.4 Zeitabhängige Korrelation der Genexpression von H-REV107-1 und IRF 1
    • 3.3.5  H-REV107-1 als Zielgen des MAPK- und des STAT-Signalwegs
  • 3.4 Klonierung des H-REV107-1 Promoters
    • 3.4.1  Identifizierung relevanter genomischer Bereiche aus einer Genbank
    • 3.4.2 Klonierung der H-REV107-1 positiven DNA Fragmente in den Vektor Bluescript II KS+ (Stratagene)
    • 3.4.3 Vergleich der Restriktionsprodukte des Phagen P1-8 mit den Restriktionsprodukten genomischer Gesamt-DNA
  • 3.5 Bestimmung regulatorischer Bereiche im H REV107 1 Promoter
    • 3.5.1  in silico Bestimmung der Promotersequenz
    • 3.5.2 Analyse der Transkriptionsstartpunkte
    • 3.5.3 Bestimmung von H REV107 1 Core Promoter Elementen
    • 3.5.4  in silico Analyse der Transkriptionsfaktorenbindungsstellen
  • 3.6 Analyse des H REV107 1 Promoters mittels Reporter Assay
    • 3.6.1  Klonierung des H-REV107-1 Promoters in den SEAP Reportersystem-Vektor
    • 3.6.2 SEAP Reporter Assay
  • 3.7 Analyse des H REV107 1 Promoters im Dualen Luciferase Reporter System pGL3
    • 3.7.1  Klonierung des H-REV107-1 Promoters in den Dualen Luciferase Vektor pGL3
    • 3.7.2 Die Aktivität verkürzter H REV107 1 Promoterkonstrukte
    • 3.7.3 Die Aktivität der H REV107 1 Promoterkonstrukte nach Stimulation mit IFN-γ, TNF-α, cAMP und Nogalamycin
    • 3.7.4 Die Aktivität der H REV107 1 Promoterkonstrukte nach Mutation einzelner Transkriptionsfaktorbindungsstellen
    • 3.7.5 Die Aktivität der H REV107 1 Promoterkonstrukte in Abhängigkeit vom NFκB-Signalweg
    • 3.7.6 Methylierung von A-3
  • 3.8 Analyse der promoterbindenden Transkriptionsfaktoren
    • 3.8.1  Analyse der potentiellen cRel-Bindungsstelle
    • 3.8.2 Nachweis der Spezifität der Protein-Oligonukleotid Bindung durch Kompetition mit unmarkierten Oligonukleotiden und durch den Einsatz mutierter Oligonukleotide
    • 3.8.3 Analyse der potentiellen CREB-Bindungsstelle
    • 3.8.4 Nachweis der Spezifität der Protein-Oligonukleotid Bindung durch Kompetition mit unmarkierten Oligonukleotiden sowie durch den Einsatz mutierter Oligonukleotide
    • 3.8.5 Identifizierung in vitro bindender Proteine mit Hilfe von Antikörpern
      • 3.8.5.1 Identifizierung der die cRel Bindungsstelle bindenden Proteine mit Hilfe von Antikörpern der NFκB Familie
      • 3.8.5.2 Identifizierung der die CREB-Bindungsstelle bindenden Proteine mit Hilfe von Antikörpern der CREB-Familie
  • 3.9 Abschließende in silico Analyse des H-REV107-1 Promoters
    • 3.9.1  Der DNA-Bereich 5´ der untersuchten Promotersequenz
    • 3.9.2 Der DNA-Bereich 3´ des Transkriptionsstartpunkts
    • 3.9.3 Unterschiede der H-REV107-1 Promotoren von Ratte, Maus und Mensch
• 4  Diskussion
  • 4.1  Bindungsstellen-unabhängige Promoterstudien
    • 4.1.1  Der Core-Promoter des humanen H REV107 1 Gens
    • 4.1.2 Die Bestimmung des Transkriptionsstartpunkts
  • 4.2 Die Signalweg-abhängige Regulation von H REV107 1
    • 4.2.1  Die Suppression der H rev107 1 Expression über den MEK/ERK-Signalweg
    • 4.2.2 Die Induktion der H REV107 1 Expression über IFN-γ induzierte Signalwege und durch IRF-1
    • 4.2.3 Die Wechselwirkung zwischen den über MEK verlaufenden und den von IFN-γ induzierten Signalwegen
    • 4.2.4 Die Induktion der H REV107 1 Expression über den TNF-α induzierten Signalweg
    • 4.2.5 Die Wechselwirkungen zwischen dem TNF-α und dem IFN-γ induzierten Signalweg
    • 4.2.6 Die Induktion der H REV107 1 Expression durch den cAMP-abhängigen Signalweg und den Faktor ATF-2
    • 4.2.7 Ein Modell der H REV107 1 Regulation
    • 4.2.8 Die H REV107 1 Expression in der Antwort der Zelle auf eine Vireninfektion
    • 4.2.9 Die Methylierung des Promoters sowie die mögliche Bedeutung der GC-Box
  • 4.3  Ausblick
• Liste der Abkürzungen
• Referenzen
• Danksagung
• Publikationsliste
• Selbständigkeitserklärung

Tabellen

• Tabelle 1: Die H-REV107 Genfamilie wird auch als HRASLS Genfamilie bezeichnet. Insgesamt gehören fünf Gene zu der Familie, darunter H-REV107-1, das auch HRASLS3 genannt wird. Mit Ausnahme von HRASLS sind alle Mitglieder der Genfamilie in der Region 11q12.3 lokalisiert.
• Tabelle 2: Die relativen Übereinstimmungen der Aminosäure-Sequenzen der H-REV107 Familie (Nazarenko et al., 2004). Zum Vergleich wurden alle nicht-redudanten GenBank CDS Einträge sowie Translationen und SwissProt Einträge herangezogen.
• Tabelle 3: PCR-Programm zum Einbringen zielgerichteter Mutationen
• Tabelle 4: PCR-Programm zur Synthese der humanen H-REV107-1 Sonde
• Tabelle 5: PCR-Programm zur Synthese der IRF-1 Sonde
• Tabelle 6: PCR-Programm zur Synthese der Ratten H-rev107-1 Sonde
• Tabelle 7: Annealing Temperaturen und Anzahl der Zyklen für die folgenden PCR Programme zur Synthese der pGL3-Konstrukte
• Tabelle 8: PCR-Programme zur Synthese der pGL3-Konstrukte
• Tabelle 9: Annealing Temperaturen und Anzahl der Zyklen für die folgenden PCR-Programme zur Synthese der SEAP-Konstrukte
• Tabelle 10: PCR-Programme zur Synthese der SEAP-Konstrukte A-2 und A-4
• Tabelle 11: PCR-Programme zur Synthese der SEAP-Konstrukte B-2, C-2 und D-2
• Tabelle 12: PCR-Programm zur Durchführung von Sequenzierungen
• Tabelle 13: PCR-Programm zur Durchführung der radioaktiven Sequenzierung
• Tabelle 14: Potentielle Transkriptionsfaktorenbindungsstellen im Bereich von –335 bis –997 vom Translationsstartpunkt der H REV107 1 Promotersequenz. (Die Bezeichnung #1 und #2 im Falle von cRel und CCAAT stammt nicht aus der Datenbank, sondern dient der Übersichtlichkeit.)
• Tabelle 15: Zusammenfassung der mittels PCR hergestellten Promoterkonstrukte. Beginn und Ende der jeweiligen Konstrukte sind auf den Translationsstartpunkt +1 bezogen.
• Tabelle 16: Zahlenwerte zur Abbildung 30. In der Zelllinie NIH3T3 wurde der Mittelwert der Luciferase-Aktivität der einzelnen Konstrukte relativ zum Mittelwert der Luciferase Aktivität des Leervektors SEAP-Basic gemessen. Jede Transfektion wurde mindestens dreimal durchgeführt. Die Standardabweichung ergibt sich aus der Mittelung der Werte, die Fehlerfortpflanzung wurde beim Errechnen der relativen Werte berücksichtigt. Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-4 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.
• Tabelle 17: Zahlenwerte zur Abbildung 32. In den Zelllinien NIH3T3, SKOV-3, PA-1, A27/80 und OVCAR-3 wurde der Mittelwert der Luciferase-Aktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts A-3 relativ zum Mittelwert der Luciferase Aktivität des Leervektors pGL3-Basic gemessen. Jede Transfektion wurde mindestens dreimal durchgeführt. Die Standardabweichung ergibt sich aus der Mittelung der Werte, die Fehlerfortpflanzung wurde beim Errechnen der relativen Werte berücksichtigt. Diese Vorgehensweise gilt für alle pGL3 Promoter Assays und wird bei den folgenden Darstellungen nicht mehr beschrieben. Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 in der Zelllinie NIH3T3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte des Konstrukts A-3 in den weiteren Zelllinien beziehen sich auf diese 100%.
• Tabelle 18 Zahlenwerte zum Reporter Assay in NIH3T3 Zellen (Abb. 35). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.
• Tabelle 19: Zahlenwerte zum Reporter Assay in SKOV-3 Zellen (Abb. 36). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.
• Tabelle 20 Zahlenwerte zum Reporter Assay in A27/80 Zellen (Abb. 37). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.
• Tabelle 21: Zahlenwerte zum Reporter Assay in OVCAR-3, PA-1 und A27/80 Zellen (Abb. 38). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde jeweils gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.
• Tabelle 22 Zahlenwerte zum Reporter Assay in NIH3T3 Zellen (Abb. 39). Der Wert für das unbehandelte Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Messungen beziehen sich auf diese 100%.
• Tabelle 23: Zahlenwerte zum Reporter Assay in NIH3T3 Zellen (Abb. 40). Der Wert für das in unbehandelte NIH3T3 Zellen transfizierte Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.
• Tabelle 24: Tabelle der in die potentiellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen eingeführten Mutationen. Im Vergleich werden die Erkennungssequenzen (ES) des Wildtyps (wt) und der mutierten Form (mt) gezeigt. Eingeführte Mutationen sind mit großen Buchstaben gekennzeichnet. Die Position gibt die Position der Bindungsstelle innerhalb des Promoters an. (Translationsstart = +1)
• Tabelle 25: Zahlenwerte zum Reporter Assay in NIH3T3 Zellen (Abb. 41). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.
• Tabelle 26: Zahlenwerte zum Reporter Assay in SKOV-3 3 und OVCAR-3 Zellen (Abb. 42). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde jeweils gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.
• Tabelle 27: Zahlenwerte zum Reporter Assay in unbehandelten oder mit TNF-α (1000U/ml) behandelten NIH3T3 Zellen (Abb. 44). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.
• Tabelle 28: Zahlenwerte zum Reporter Assay in NIH3T3 Zellen (Abb. 46). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte des methylierten A-3 Konstrukts bezieht sich auf diese 100%.
• Tabelle 29: Übersicht über die im Verlauf der Experimente verwendeten Oligonukleotide
• Tabelle 30: Zum spezifischen Nachweis gebundener Transkriptionsfaktoren eingesetzte Antikörper
• Tabelle 32: IFN-γ abhängige, potentielle Bindungsstellen 3´ des H REV107 1 Transkriptionsstart-punkts
• Tabelle 33: Potentielle Transkriptionsfaktorbindungsstellen im Maus Promoter
• Tabelle 34: Potentielle Transkriptionsfaktorbindungsstellen im humanen Promoter
• Tabelle 35: Potentielle Transkriptionsfaktorbindungsstellen im Ratten Promoter

Bilder

• Abbildung 1: Schematische Darstellung der zirkulären Permutation konservierter Aminosäuren in der YaeF- und LRAT-ähnlichen Familie
• Abbildung 2: Der Vergleich der Proteinsequenzen der Mitglieder der H-REV107-Familie. Die fettgedruckten Buchstaben zeigen die in allen Familienmitgliedern konservierten Aminosäuren. Die grau hinterlegten Bereiche zeigen potentielle Domänen. Die Domänen sind mit ihrem jeweiligen Namen überschrieben (Nazarenko et al., 2004).
• Abbildung 3: Aufbau des humanen H-REV107-1 Gens. Die vier Exons sind über eine Länge von 39700 Basenpaaren auf Chromosom 11q12.3 lokalisiert. ATG bezeichnet den Translationsstartpunkt. Die Analyse wurde mit Hilfe der Datenbank „high throughput genome sequencing“ von NCBI durchgeführt. URL:
• Abbildung 4: a) Northern Blot Analyse der H rev107 1 mRNA Expression in der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 und der KRAS-transformierten Ratten Ovarialkarzinomzelllinie ROSE199A2/5. Der Pfeil zeigt die H rev107 1 spezifische mRNA. b) Photo des mit Ethidiumbromid gefärbten Gels als Ladekontrolle.
• Abbildung 5: a) Northern Blot Analyse der H REV107 1 mRNA Expression in der immortalisierten Ovarialepithelzelllinie HOSE und den Ovarialkarzinomzelllinien SKOV-3, OVCAR-3 und A27/80. Der geschlossene Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische Bande. Der offene Pfeil zeigt die Bande des nicht näher spezifizierten Gens. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande. b) Northern Blot Analyse der H REV107 1 mRNA Expression in der immortalisierten Ovarialepithelzelllinie HOSE, den Ovarialkarzinomzelllinien SKOV-3, OVCAR-3 und A27/80 sowie der Teratokarzinomzelllinie PA-1. Der obere Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische Bande. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.
• Abbildung 6: a) Northern Blot Analyse der H rev107 1 mRNA Expression in der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 und der KRAS-transformierten Ratten Ovarialkarzinomzelllinie ROSE199A2/5. ROSE199A2/5 wird 48 h mit dem MEK1 Inhibitor PD98059 (50 μg/ml), und 48 h mit dem PI3K Inhibitor LY294002 (10 μg/ml) behandelt. Der obere Pfeil zeigt die H rev107 1-spezifische Bande. Der untere Pfeil zeigt, zur Kontrolle der RNA-Beladung, die 28S-spezifische Bande. b) Northern Blot Analyse der H REV107 1 mRNA Expression in der humanen Teratokarzinomzelllinie PA-1. Die Zelllinie wird 48 h mit dem MEK1 Inhibitor PD98059 (50 μg/ml) und 48 h mit dem PI3K Inhibitor LY294002 (10 μg/ml) behandelt. Der obere Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische Bande. Der untere Pfeil zeigt, zur Kontrolle der RNA-Beladung, die 28S-spezifische Bande.
• Abbildung 7: Die obere Abbildung zeigt die H REV107 1 Expression in einem Northern Blot Hybridisierungsassay. Die untere Abbildung zeigt das mit Ethidiumbromid angefärbte Gel als Ladungskontrolle. Die ersten vier Spuren zeigen das Ergebnis für die Zelllinie OVCAR-3, die nächsten vier Spuren für die Zelllinie A27/80, die folgenden vier Spuren für die Zelllinie OAW und die letzten vier Spuren für die Zelllinie SKOV-3. Die RNA wird aus unbehandelten, aus nur mit IFN-γ behandelten (48 Stunden, 100 U/ml), aus nur mit 5-Aza-2´-Desoxycytidin (48 Stunden, 1 μmol) oder aus mit IFN-γ (48 Stunden, 100 U/ml) und 5-Aza-2´-Desoxycytidine (48 Stunden, 1 μmol) behandelten Zellen isoliert (siehe + / - in der Legende). Im Falle der Behandlung mit 5-Aza-2´-Desoxycytidin wird das Medium nach 24 Stunden gewechselt. Der obere Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische Bande.
• Abbildung 8: Northern Blot Analyse der H rev107 1 mRNA Expression in der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 und der KRAS-transformierten Ratten Ovarialkarzinomzelllinie ROSE199A2/5. Die Zellen sind unbehandelt oder wurden für 48 Stunden mit 500 U/ml oder 1000 U/ml IFN-γ behandelt . Der Pfeil zeigt die H rev107 1-spezifische mRNA. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.
• Abbildung 9: Vereinfachte Darstellung des STAT-Signalwegs. Das STAT-1 Homodimer bindet im Zellkern an die GAS-Bindungsstelle eines Promoters und aktiviert die Expression des zugehörigen Gens (Ramana et al., 2002).
• Abbildung 10: Northern Blot Analyse der H rev107 1 und der Irf-1 mRNA Expression in der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 und der KRAS-transformierten Ratten Ovarialkarzinomzelllinie ROSE199A2/5. Die Zellen sind unbehandelt oder 48 h mit 500 U oder 1000 U IFN-γ/ml behandelt. Die beiden oberen Pfeile zeigen die H rev107 1 und die Irf 1 spezifische mRNA. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der untere Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.
• Abbildung 11: Northern Blot Analyse der H rev107 1 mRNA Expression in der Zelllinie KA-1. Die Zellen sind unbehandelt bzw. für 48 Stunden mit Östrogen (1 μmol) oder mit Östrogen (1μmol) und Cycloheximid (50 μmol) behandelt. Der Pfeil zeigt die H rev107 1-spezifische mRNA. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.
• Abbildung 12: Northern Blot Analyse von H REV107 1 und IRF 1 in der immortalisierten Ovarialepithelzelllinie HOSE, den Ovarialkarzinomzelllinien SKOV-3, OVCAR-3 und A27/80 sowie der Teratokarzinomzelllinie PA-1. Die beiden oberen Pfeile zeigen die H REV107 1- und die IRF 1-spezifische Bande. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der untere Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.
• Abbildung 13: a) Northern Blot Analyse der H REV107 1 und IRF 1 mRNA Expression in den Ovarialkarzinomzelllinien OVCAR-3 und A27/80. Die Zellen sind unbehandelt bzw. 48h mit 500 U oder 1000 U IFN-γ/ml behandelt. Die beiden oberen Pfeile zeigen die H REV107 1- und die IRF 1-spezifische mRNA. Der untere Pfeil zeigt, zur Kontrolle der RNA-Beladung, die 28S-spezifische Bande. b) Northern Blot Analyse der H REV107 1 und IRF 1 mRNA Expression in der Ovarialkarzinomzelllinie SKOV-3 . Die Zellen sind unbehandelt bzw. 48h mit 500 U oder 1000 U IFN-γ/ml behandelt. Die beiden oberen Pfeile zeigen die H REV107 1- und die IRF 1-spezifische mRNA. Der untere Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande. c) Northern Blot Analyse der H REV107 1 und IRF 1 mRNA Expression in den Nierenkarzinomzelllinien RCC26 endo und RCC26 exo. Die Zellen sind unbehandelt bzw. 48h mit 500 U oder 1000 U IFN-γ pro ml Kulturmedium behandelt. Die beiden oberen Pfeile zeigen die H REV107 1- und die IRF 1-spezifische mRNA. Der untere Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.
• Abbildung 14: Northern Blot Analyse der H REV107 1 und IRF 1 mRNA Expression zu verschiedenen Zeitpunkten in der humanen Ovarialkarzinomzelllinie A27/80. Die Zellen sind über einen Zeitraum von 24 Stunden (100 U/ml) bzw. 96 Stunden (1000 U/ml) mit 100 U/ml oder 1000 U/ml IFN-γ pro ml Kulturmedium behandelt. Der obere Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische, der mittlere Pfeil die IRF 1-spezifische und der untere Pfeil die 28S-spezifische mRNA.
• Abbildung 15: Northern Blot Analyse der H REV107 1 und IRF 1 mRNA Expression zu verschiedenen Zeitpunkten in der humanen Ovarialkarzinomzelllinie OVCAR-3. Die Zellen sind über einen Zeitraum von 24 Stunden (100 U) bzw. 96 Stunden (1000 U) mit 100 U oder 1000 U IFN-γ pro ml Kulturmedium behandelt worden. Der obere Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische, der mittlere Pfeil die IRF 1-spezifische und der untere Pfeil die 28S-spezifische mRNA.
• Abbildung 16: Northern Blot Analyse der H rev107 1 und der Irf 1 mRNA Expression in der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 und der KRAS-transformierten Ratten Ovarialkarzinomzelllinie ROSE199A2/5. ROSE199 und ROSE199A2/5 wird 48h mit dem MEK Inhibitor PD98059 (50 μg/ml) und 48h mit dem PI3K Inhibitor LY294002 (10 μg/ml) behandelt. Die oberen Pfeile zeigen die H rev107 1 und die Irf 1 spezifische Bande. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der untere Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.
• Abbildung 17: Oben: Northern Blot Analyse der H rev107 1 mRNA Expression in der KRAS-transformierten Ratten Ovarialkarzinomzelllinie ROSE199A2/5. Die Zellen sind unbehandelt, 48 Stunden mit 500 U oder 1000U/ml IFN-γ, 48 Stunden mit 50 μmol PD98059 oder 48 Stunden gleichzeitig mit 50 μmol PD98059 und 1000U/ml IFN-γ behandelt worden. Der Pfeil zeigt die H rev107 1-spezifische mRNA. Unten: Photo des mit Ethidiumbromid gefärbten Gels als Ladekontrolle.
• Abbildung 18: Northern Blot Analyse der H REV107 1 mRNA Expression in der humanen Ovarialkarzinomzelllinie A27/80. Die Zellen sind unbehandelt, 48 Stunden mit 500 U/ml oder 1000U/ml IFN-γ behandelt oder 48 Stunden mit 50 μmol PD98059 bzw. gleichzeitig mit 50 μmol PD98059 und 1000U/ml IFN-γ behandelt. Der Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische mRNA. Als Ladungskontrolle dient das Photo des mit Ethidiumbromid gefärbten Gels.
• Abbildung 19: Northern Blot Analyse der H REV107 1 mRNA Expression in der humanen Nierenkarzinomzelllinie MZ1257. Die Zellen sind unbehandelt oder 48 Stunden mit 1000 U IFN-α, 1000 U IFN-γ bzw. 500 U TNF-α pro ml behandelt. Der Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische mRNA. Als Ladungskontrolle dient die Northern Blot Analyse des selben Blots mit einer GAPDH Sonde.
• Abbildung 20: cDNA Sequenz des H REV107 1 Gens. Die Primer, die zur Herstellung der spezifischen Sonde verwendet wurden, sind in fetten Buchstaben dargestellt.
• Abbildung 21: Southern Blot Hybridisierung mit der, aus den Phagen 1-3, 1-8, 1-10 und 1-12, isolierten Phagen-DNA, die vor der Hybridisierung mit den angegebenen Enzymen geschnitten wurde. Als Sonde wird ein 387 bp großes Fragment der H REV107 1 cDNA benutzt (Abb. 20). Die Pfeile zeigen die stark positiven DNA-Fragmente, die in einer Größenordnung von 7 kb (untere Pfeile) bis mehr als 15 kb (obere Pfeile) liegen.
• Abbildung 22: Southern Blot Hybridisierung mit der aus dem Phagen 1-8 isolierten DNA, die vor der Hybridisierung mit den angegebenen Enzymen geschnitten wurde. Als Sonde wird ein Teil der H REV107 1 cDNA benutzt. Die Pfeile zeigen die stark positiven DNA-Fragmente.
• Abbildung 23: In einem Southern Blot Hybridisierungsassay wird mit Hilfe der H-REV107-1 Sonde überprüft, ob die zuvor aus dem „low-melting“ Agarose Gel isolierte DNA-Bande das H REV107 1 Gen enthält. Der linke Pfeil zeigt das stark positive Signal des zuvor aus dem Phagen P1-8 isolierten, ca. 5.5 kB großen DNA-Fragments. Der rechte Pfeil zeigt im Vergleich dazu die 3.7 kb große DNA-Bande des linearisierten Bluescript II KS+ Vektors, die ebenfalls ein positives Signal zeigt.
• Abbildung 24: In einem Southern Blot Hybridisierungsassay werden die Bluescript KS+ Plasmide, die ein subkloniertes H REV107 1 Fragment enthalten, nach Verdau mit EcoRI, mit der H-REV107-1Sonde hybridisiert. Der linke Pfeil zeigt die zum Vergleich aufgetragene, 5.5 kb große Ausgangs-DNA. 1-7 sind positive, mit EcoRI verdaute Bluescript Klone.
• Abbildung 25: In einem Southern Blot Hybridisierungsassay werden die, mit je einem Restriktionsenzym geschnittenen, verschiedenen Proben humaner Gesamt-DNA und die DNA des Phagen P1-8 mit der H-REV107-1 Sonde hybridisiert. Die Pfeile zeigen die, jeweils gleich großen, positiven Signale der verschiedenen Proben.
• Abbildung 26: Schematische Darstellung potentieller H-REV107-1 Promoterbereiche und Transkriptionsstartpunkte nach in silico Analyse Von verschiedenen Promoteranalyse – Programmen vorgeschlagene, potentielle Promoterbereiche und Transkriptionsstartpunkte (TSP), sowie die in der NCBI Datenbank "alu" identifizierte Alu-Sequenz. Pfeile: 1) FirstEF (Promoterbereich), 2) ConPro (Promoterstartpunkt), 3) PromoterInspector (Promoterbereich), 4) ConPro (TSP), 5) McPromoter (TSP-Bereich), 6) DataBaseTSS (TSP), (7) 12-1 cDNA (TSP). Fett gedruckt: bp -716 bis –999 (Alu-Sequenz).
• Abbildung 27: Schematische Darstellung verschiedener, experimentell bestimmter, Transkriptionsstartpunkte des H REV107 1 Gens. 9-1, 3-1 und 12-1 zeigen die Startpunkte der cDNA-Klone, die Nummern 1–6 die Ergebnisse der Primer Extension und DBTSS den Startpunkt des längsten Klons aus der DBTSS-Datenbank.
• Abbildung 28: Schematische Darstellung potentieller Core Promoter Elemente für die Transkriptionsstartpunkte DBTSS und 12-1. Die Nummerierung bezieht sich in dieser Abbildung auf die jeweilige Base A des Transkriptionsstartpunkts. Die Base 5´ der Startbase erhält die Bezeichnung -1. CREB (Bindungsstelle für einen Faktor der CREB-Familie), BRE (TFIIB Recognition Element), Inr (Initiator Element, beinhaltet das CAP-Signal CA [-1,+1]), CT-Signal, DPE (Downstream Promoter Element) und MED-1 (Multiple Start Site Element Downstream)
• Abbildung 29: Schematische Darstellung der regulatorischen Region des H-REV107-1 Gens mit potentiellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen. Der Translationsstartpunkt ist mit A⁺¹TG gekennzeichnet. Oberhalb des Primers A befindet sich der nicht amplifizierbare Bereich. Die jeweiligen Primer sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Die potentiellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen sind unterstrichen. Die Bindungsstelle für STAT-1 überlappt mit den Bindungsstellen cRel #1 und cRel #2 und ist mit einer gestrichelten Linie gekennzeichnet. Der gestrichelte Pfeil max. TSP zeigt den Transkriptionsstartpunkt der längsten H REV107 1 cDNA (DBTSS).
• Abbildung 30: Aktivität der verschiedenen Promoter-Konstrukte im SEAP II Reporter Assay in NIH3T3 Zellen. Die Aktivitäten sind relativ zum Wert der Aktivität des Leervektors SEAP-Basic angegeben.
• Abbildung 31: Aktivität des SEAP II Promoterkonstrukts A-4, nach Ko-Transfektion eines RAS Expressionsplasmids (A-4 + RAS) bzw. des entsprechenden Leervektors pDCR (A-4 + pDCR) in NIH3T3 Zellen.
• Abbildung 32: Aktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts (A-3) in verschiedenen Zelllinien im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega). Die Aktivitäten sind relativ zur Aktivität des Leervektors pGL3-Basic angegeben.
• Abbildung 33: Schematische Darstellung der regulatorischen Region des H-REV107-1 Gens mit potentiellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen und Primer Positionen. Die zur Herstellung der Konstrukte verwendeten Primer sind mit Pfeilen gekennzeichnet. In 5´→3´-Richtung sind das die Primer A bis F, in 3´→5´-Richtung die Primer 1 bis 3. Die potentiellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen sind unterstrichen. Die STAT-1 Bindungsstelle überlagert sich mit den Bindungsstellen cRel #1 und cRel #2 und ist mit einer gestrichelten Linie gekennzeichnet. Der gestrichelte Pfeil TSP zeigt den Transkriptionsstartpunkt der längsten H REV107 1 cDNA an. Dieser wurde aus der DBTSS Datenbank ermittelt. +1 zeigt den Translationsstartpunkt ATG an.
• Abbildung 34: Schematische Darstellung der im pGL3 System hergestellten Promoter-Konstrukte. A-3 zeigt den Gesamtpromoter mit den potentiell funktionellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen. Auf den weiteren Konstrukten sind nur Bindungsstellen eingezeichnet, die nicht mehr auf dem nächstkürzeren Konstrukt vorhanden sind. Die Zahlen vor und nach dem jeweiligen Konstrukt zeigen die Entfernung zum Translationsstartpunkt +1 an.
• Abbildung 35: Aktivität der verschiedenen Promoterkonstrukte in der Zelllinie NIH3T3 im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega). Oberhalb der Balken sind die im Vergleich zum vorherigen Balken entfernten Transkriptionsfaktorbindungsstellen aufgeführt. Die Aktivitäten sind relativ zum Wert der Aktivität des Leervektors pGL3-Basic angegeben.
• Abbildung 36: Aktivität der verschiedenen Promoterkonstrukte in der Zelllinie SKOV-3 im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega). Oberhalb der Balken sind die im Vergleich zum vorherigen Balken entfernten Transkriptionsfaktorbindungsstellen aufgeführt. Die Aktivitäten sind relativ zum Wert der Aktivität des Leervektors pGL3-Basic angegeben.
• Abbildung 37: Aktivität der verschiedenen Promoterkonstrukte in der Zelllinie A27/80 im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega). Oberhalb der Balken sind die im Vergleich zum vorherigen Balken entfernten Transkriptionsfaktorbindungsstellen aufgeführt. Die Aktivitäten sind relativ zum Wert der Aktivität des Leervektors pGL3-Basic angegeben.
• Abbildung 38: Aktivität der Promoterkonstrukte A-3 und B-3 in der Zelllinie OVCAR-3, PA-1 und A27/80 im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega). Oberhalb der Balken ist die im Vergleich zum vorherigen Balken entfernte Transkriptionsfaktorbindungsstelle IRF-1/ISRE aufgeführt.
• Abbildung 39: Induktion von NIH3T3 Zellen mit verschiedenen Reagenzien und Messung der Aktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts A-3. Die Behandlung erfolgt für 24 Stunden und beginnt 4 Stunden nach der Transfektion der Zellen mit dem Promoterkonstrukt. Die Konzentrationen bezeichnen die Endkonzentrationen im Medium. Die Aktivitäten sind relativ zum Wert der Aktivität des Leervektors pGL3-Basic angegeben.
• Abbildung 40: Aktivität verschiedener Promoterkonstrukte in der unbehandelten oder mit TNF-α (1000 U/ml) behandelten Zelllinie NIH3T3 im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega). Oberhalb der Balken sind die im Vergleich zum vorherigen Konstrukt entfernten Transkriptionsfaktorbindungsstellen aufgeführt. Die Aktivitäten sind relativ zum Wert der Aktivität des Leervektors pGL3-Basic angegeben.
• Abbildung 41: Aktivität mutierter Promoterkonstrukte sowie des methylierten Gesamtpromoter-Konstrukts (A-3 methyliert) in der Zelllinie NIH3T3
• Abbildung 42: Aktivität der mutierten Promoterkonstrukte in den Zelllinien a)SKOV-3 und b) OVCAR-3 im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega).
• Abbildung 43: Schematische Darstellung des NFκB-Signalwegs. Die Aktivierung des TNF-Rezeptors führt zum proteasomalen Abbau von IκB und zur Translokation von NFκB in den Kern (de Martin et al, 1999).
• Abbildung 44: Einfluss des TNF-α-Signalweges bzw. des NFκB-Inhibitors dn-IκB auf die Aktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts A-3 ohne und mit Mutation der cRel #1 Bindungsstelle. Die Behandlung der Zellen mit 1000 U TNF-α/ml erfolgte für 48 Stunden.
• Abbildung 45: Analyse der H REV107 1 Promotersequenz mit CPGPLOT. Es zeigt sich, dass die gesamte Promotersequenz bis in den 5´-Bereich des Gens hinein sehr CpG-reich ist.
• Abbildung 46: Aktivität des, mit der Methylase SssI methylierten, Promoterkonstrukts A-3 methyliert im Vergleich zum nicht methylierten Konstrukt A-3.
• Abbildung 47: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 10 μg Kernproteine a) unbehandelter NIH3T3 Zellen bzw. b) mit 500 U/ml TNF-α behandelter NIH3T3 Zellen auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten.
• Abbildung 48: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 7 μg Kernproteine unbehandelter NIH3T3 Zellen auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. Die Kompetitoren sind im 100-fachen Überschuss eingesetzt worden.
• Abbildung 49: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 10 μg Kernproteine a) unbehandelter NIH3T3 Zellen oder b) cAMP behandelter Zellen (Endkonzentration: 200 μmol) auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten.
• Abbildung 50: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 10 μg Kernproteine unbehandelter NIH3T3 Zellen auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. a) Kompetitoren sind im 100fachen Überschuss eingesetzt. Die Pfeile zeigen auf die Spots der radioaktiven, gebundenen Oligonukleotide, die durch Einsatz nicht-markierter, identischer Oligonukleotide, aber nicht durch den Einsatz nicht-markierter, mutierter bzw. unspezifischer Oligonukleotide verdrängt werden. b) Die Pfeile zeigen auf die Banden, die bei Verwendung des mutierten Oligonukleotids CREB mt (H-REV107-1) verschwinden.
• Abbildung 51: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 10 μg Kernproteine unbehandelter NIH3T3 Zellen auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. Die Pfeile zeigen auf „Supershifts", die auf die Bindung spezifischer Antikörper an die Oligonukleotid-Kernprotein Komplexe beruhen.
• Abbildung 52: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 10 μg Kernproteine cAMP behandelter NIH3T3 Zellen (Endkonzentration: 200 μmol) auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. Der geschlossene Pfeil zeigt auf den „Supershift“, der auf der Bindung des für ATF-2 spezifischen Antikörper an den Oligonukleotid-Kernprotein Komplex beruht. Der offene Pfeil zeigt den spezifischen Oligonukleotid-Kernprotein Komplex (ohne dem gebundenen Antikörper).
• Abbildung 53: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 10 μg Kernproteine a)unbehandelter bzw. b) cAMP behandelter NIH3T3 Zellen (Endkonzentration: 200 μmol) auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. Die jeweils ersten offenen Pfeile zeigen auf die Signale, die durch den Einsatz des mutierten Oligonukleotids CREB mt (H-REV107-1) nicht mehr vorhanden sind. Der geschlossene Pfeil zeigt auf den „Supershift“, der auf der Bindung des ATF-2 spezifischen Antikörper an den Oligonukleotid-Kernprotein Komplex beruht. Der unterhalb des geschlossenen Pfeils liegende offene Pfeil zeigt auf die Stelle, an der sich zuvor die Bande des Oligonukleotid-Kernprotein Komplex (ohne dem gebundenen Antikörper) befand.
• Abbildung 54: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 5 μg Kernproteine unbehandelter Zellen auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. Die Pfeile zeigen auf „Supershifts", die auf die Bindung des ATF-2 Antikörpers an die Oligonukleotid-Kernprotein Komplexe beruhen.
• Abbildung 55: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 5 μg Kernproteine cAMP behandelter Zellen auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. Die Pfeile zeigen auf „Supershifts", die auf die Bindung des ATF-2 Antikörpers an die Oligonukleotid-Kernprotein Komplexe beruhen.
• Abbildung 56: Schematischer Vergleich der Promotoren des Menschen-, Maus- und Ratten H REV107 1 Gens.
• Abbildung 57: Ein möglicher, gemeinsamer Einfluss des MEK-1 und des IFN-γ induzierten Signalwegs auf die H REV107 1 Expression
• Abbildung 58: Der NFκB-Signalweg führt zur Aktivierung von Zielgenen. Dies wird durch den Repressors dnIκB verhindert. dnIκB bindet NFκB, lässt sich aber, im Gegensatz zum Wildtyp-IκB, nicht durch Phosphorylierung aus dem IκB-NFκB Komplex trennen. NFκB bleibt im Zytosol gebunden und die Transkription der Zielgene wird unterbunden.
• Abbildung 59: Mögliche Wechselwirkungen zwischen dem TNF-α und dem IFN-γ induzierten Signalweg, die zur H REV107 1 Expression führen. PKR aktiviert NFκB, dass in den Zellkern translokalisiert. Dort aktiviert die Kinase p38 die transaktivierenden Eigenschaften von NFκB.
• Abbildung 60: Mögliche Signalwege, die ausgehend von einer Induktion durch IFN-γ und TNF-α zu einer Aktivierung der H-REV107-1 Genexpression führen. Dabei steht die Kinase PKR im Mittelpunkt, die die Aktivitäten von p38, JNK, STAT-1 und NFκB postiv reguliert.