Analyse der Regulationsmechanismen des humanen Tumorsuppressor Gens H REV107 1

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin
von

Steffen Reich

geb. am 19. Januar 1971 in Genf, Schweiz

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Christoph Markschies

Dekan: der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Dr. habil. Christine Sers
2. Prof. Dr. Hanspeter Herzel
3. Prof. Dr. Wolfgang Uckert

Tag der mündlichen Prüfung:23. Mai 2006

Diese Arbeit widme ich Frau Anke Reich, deren Liebe und Geduld mich durch die schönen und schweren Stunden dieser Promotionszeit begleitet haben.

"Let it be known
there is a fountain
that was not made
by the hands of men..."

Ripple (Hunter, Garcia), 1970, American Beauty, The Grateful Dead

Zusammenfassung

Das Tumorsuppressor Gen H REV107 1 wird in normalen Geweben ubiquitär exprimiert, während die Expression in humanen Mamma-, Ovarial-, und Lungentumoren unterdrückt ist. H REV107 1 hemmt das Tumorwachstum in vitro und in vivo. Die Expression und Regulation des H REV107 1 Gens wurde in verschiedenen, humanen Zelllinien untersucht.

In den Tumor Zelllinien A27/80, OVCAR-3, SKOV-3, RCC26, MZ1257 und in der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 wird die H REV107 1 Expression durch IFN-γ induziert. In OVCAR-3, A27/80, SKOV-3 und RCC26 und in der humanen Ovarialepithelzelllinie HOSE wurde eine Korrelation der H REV107 1 und der IRF 1 Expression nach Induktion mit IFN-γ gezeigt. H-rev107-1 konnte in NIH3T3 auch nach konditionaler IRF-1 Expression, Proteinsynthese-unabhängig, nachgewiesen werden. Dies zeigt, dass H rev107 1 ein direktes Zielgen von IRF-1 ist.

In der KRAS-transformierten Rattenzelllinie ROSE199A2/5 und in der humanen Teratokarzinomzelllinie PA-1 ließ sich die H rev107 1 Expression durch Unterdrückung des MEK/ERK-Signalwegs mit dem MEK-1 Inhibitor PD98059 aktivieren. Die Hemmung des PI3K-Signalwegs mit dem Inhibitor LY294002 führte zu keiner Re-Expression von H rev107 1. In Dies bedeutet, dass H REV107 1 durch mindestens zwei verschiedene Signalwege, IFN-γ und MEK/ERK, reguliert wird.

Die H-REV107-1 Promoter Region wurde in silico bestimmt, in vitro amplifiziert und in das pGL-3 basic Luciferase Reporter Plasmid kloniert. Der H-REV107-1 Promoter enthält keine TATA-Box, sondern ein Initiator Element sowie, in dem für eine TATA-Box definierten Abstand, eine ATF-2 Bindungsstelle. Die Inkubation von transient transfizierten Zellen mit TNF-α, cAMP und IFN-γ steigerte die Luciferase Aktivität unter der Kontrolle des mit 980 bp längsten Promoter Konstrukts. Mit Hilfe von verschiedenen Deletionskonstrukten und Konstrukten, in denen potentielle Transkriptionsfaktorbindungsstellen mutiert waren, wurden die regulatorischen Bereiche des Promoters bestimmt. Mutationen der IRF-1 und der STAT-1 Bindungsstellen, die potentielle Ziele des IFN-γ Signalwegs darstellen, ergaben keinen Verlust der Luciferase Aktivität. Eine Mutation der cRel-Bindungsstelle, potentiell über NFκB reguliert, resultierte in einer Luciferase Aktivität von nur 9% des Wildtyp Promoterkonstrukts. Die Mutation der CREB/ATF-2 Bindungsstelle reduzierte die Luciferase Aktivität auf 37%. Die Ko-Transfektion des Gesamtpromoter-Konstrukts mit einem NFκB Suppressor, dem dominant negativen IκB Expressionsplasmid, reduzierte die Luciferase Aktivität um 53%. Diese Ergebnisse legen nahe, dass NFκB und ATF-2 die H REV107 1 Expression positiv regulieren.

Um eine biologische Funktion der durch Mutation inaktivierten c-Rel und CREB/ATF-2 Bindungsstellen zu zeigen, wurden Gel-Retardationsassays (EMSA) durchgeführt. Mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers konnte die Bindung von ATF-2 an das, die CREB/ATF-2 Bindungsstelle enthaltende, P32-markierte, Oligonukleotid gezeigt werden. Obwohl auch das, die c-Rel-Bindungsstelle enthaltende, Oligonukleotid spezifisch von einem Protein gebunden wurde, konnte dieses nicht mit einem Antikörper der NFκB-Familie identifiziert werden. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass H-REV107-1 durch eine IFN-γ induzierte, möglicherweise PKR vermittelte, Signalkette von den Faktoren IRF-1 und ATF-2 direkt, sowie von NFκB indirekt, reguliert wird.

Eigene Schlagworte: H-REV107-1, ATF-2, IRF-1, NFκB, Tumorsuppressor

Abstract

The H REV107 1 class II tumor suppressor gene is ubiquitously expressed in normal tissues and downregulated in human breast, ovarian and lung tumors. HREV1071 has the capacity to suppress growth of tumor cells in vitro and in vivo. In A27/80, OVCAR3, SKOV3, RCC26, MZ1257 and ROSE199 cell lines H REV107 1 is upregulated after treatment with IFNγ. A NIH3T3 cell line harboring an estrogeninducible IRF1/hER fusion protein showed a protein synthesis independent upregulation of H rev107 1 expression after induction of IRF1. The parental NIH3T3 cell line showed no induction of H rev107 1 expression after treatment with estrogen. This demonstrates that H rev107 1 is a direct target of IRF1. Furthermore, a time course dependent correlation between H REV107 1 and IRF 1 expression was confirmed in OVCAR3 and A27/80 cell lines. Additionally, there was a correlation between H REV107 1 and IRF 1 expression in the immortalized human ovarian epithelial cell line HOSE and in the carcinoma cell lines SKOV3 and RCC26.

Inhibition of the MEK/ERK pathway in a RAStransformed derivate of immortalized rat ovarian surface epithelial cells, ROSE199 A2/5, using the MEK1 inhibitor PD 98059, but not the inhibitor of the PI3K pathway LY 294002, leads to a restored expression of H rev107 1. In the teratocarcinoma cell line PA1 but not in the A27/80 or OVCAR3 cell lines, PD 98059 partially restored expression of H REV107 1. Therefore, H REV107 1 can be a target of the MEK/ERK-pathway in the ROSE199 A2/5 and the PA1 cell line. Thus, H REV107 1 is regulated by at least two different pathways.

To understand the regulatory mechanisms of the expression of the H REV107 1 gene, the putative promoter region was analyzed in silico. The sequence was amplified and cloned into the pGL3basic Luciferase Reporter plasmid (Promega™). Induction of the promoter constructs with TNFα, cAMP and IFNγ increased the luciferase activity. Several deletions constructs and constructs with putative transcription factor binding sites mutated were used to narrow down the important regulatory elements of the promoter. While mutations of an IRF1 binding site and a STATbinding site as potential targets of the IFNγ signaling pathway did not reduce the luciferase activity, the mutations of a cRel binding site and a CREB/ATF2 binding site decreased the luciferase activity by 91% and 63%, respectively. Cotransfection of the full length promoter construct with a dominant negative I#SYMBOL#B expression plasmid, a repressor of NF#SYMBOL#B activation, reduced the luciferase activity to 47%. As a result of the investigation H REV107 1 is directly regulated by IRF1 and probably indirectly regulated by NFκB and the MEK/ERK signaling pathway.

To show a biological function of the CREB/ATF2 and the cRel binding site, an Electro Mobility Shift Assay (EMSA) was performed, using a P32-labeled oligonucleotid, which included the CREB/ATF2 or the cRel binding site. The binding of ATF2 to the CREB oligonucleotid was demonstrated by the use of a specific antibody. While there was also a specific protein binding to the cRel binding site, none of the used antibodies of the NFκB family resulted in a supershift with the cRel oligonucleotid. The ATF2 binding site in the posititon –30 bp - 23 bp of the human, TATA-less HREV1071 promoter replaces the TATA-like element, which can be found in the Hrev1071 promoter of rat and mouse.

Keywords: H-REV107-1, ATF2, IRF1, NFκB, tumor suppressor

Inhaltsverzeichnis

Tabellen

Bilder



© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
12.10.2006