1 Einleitung

1.1  Die Tumorentstehung

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Zur Entstehung eines Tumors sind verschiedene Schritte notwendig. Im allgemeinen werden drei Phasen der Tumor-Entstehung unterschieden: Initiation, Promotion und Metastasierung. Betrachtet man die biologischen Änderungen, die notwendig sind, um aus einer normalen Zelle einen Tumor entstehen und metastasieren zu lassen, so sind folgende Mechanismen von Bedeutung: Übergehen der Zellzyklusblockade, Auslösen eigener Wachstumssignale, Induktion der Angiogenese, Auflösen des Zellverbandes und Metastasierung, Hemmung der Apoptose sowie Insensivität gegenüber wachstumshemmenden Signalen (Hanahan und Weinberg, 2000).

Die Gene, die in einem oder mehreren dieser Prozesse eine wichtige Rolle spielen, bezeichnet man je nach ihrer Funktion als Onkogene oder Tumorsuppressorgene. Onkogene sind Gene, die in ihrer Aktivität das Tumorwachstum positiv beeinflussen. Als Tumorsuppressorgene bezeichnet man Gene, die in ihrer normalen Funktion einer Transformation der Zelle entgegenstehen.

1.1.1  Onkogene

Onkogene besitzen in Zellen eine normale, wachstumsfördernde Funktion. Sie werden hier auch als Proto-Onkogene bezeichnet. Proto-Onkogene können durch Mutation, Amplifikation oder Translokation verändert und ihre Genprodukte so in einen permanent aktiven Zustand überführt werden. Die konstitutive Aktivität des Genprodukts führt z.B. über die Signalübertragung zu permanent aktivierten Signalwegen. Das natürliche Gleichgewicht der verschiedenen Signalwege der Zelle wird so nachhaltig gestört und es kommt zu einem Fehlverhalten dieser Zelle, z.B. dem Übergehen der Zellzyklusblockade.

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Ein bekanntes Beispiel für Onkogene sind die RAS Gene. Diese Gene kodieren für die membrangebundenen und zur Gruppe der kleinen, GTP-bindenden Proteine gehörenden RAS Proteine, die verschiedene, mitogene Signalwege aktivieren. Ihre besondere Bedeutung in der Tumorentstehung wird an Hand ihrer Beteiligung in verschiedenen Tumoren deutlich. So ist jeweils eines der drei RAS Gene HRAS, KRAS oder NRAS in 90% der Magen-, in 50% der Darm-, in 50% der Schilddrüsen- und in 30% der Lungentumore mutiert (Bos, 1989). In seiner aktiven Form bindet RAS Guanin-Triphosphat (GTP). Die Hydrolyse des GTP zu GDP, und damit die Inaktivierung von RAS, wird durch die RAS-eigene GTPase Funktion und über GAP Proteine (GTPase Activating Protein) gesteuert. Die bekannten Mutationen, die zum Austausch der Aminosäuren 12, 13, 59 oder 61 führen, bewirken, dass GAP Proteine nicht mehr binden und RAS in einer konstitutiv aktiven Form vorliegt.

Ein anderes Beispiel ist das Bcr-Abl Onkogen, welches durch die „Philadelphia Chromosom Translokation“ entsteht. Durch diese chromosomale Translokation entsteht das Fusionsprotein Bcr-Abl, das konstitutiv aktiv ist und ebenfalls unablässig mitogene Signalwege stimuliert (u. a. über RAS). Bcr-Abl ist so für die Entstehung von Leukämien mitverantwortlich (Kurzrock et al., 1988).

Eine weitere Möglichkeit der verstärkten Aktivierung von Onkogenen ist die Überexpression. Bekannte und in der Tumorentstehung wichtige Beispiele sind die Tyrosin-Kinase Rezeptoren (z.B. EGF, HER2) die, ausgehend von ihrer zytoplasmatischen Domäne, proliferationsfördernde Signalwege aktivieren. Die Überexpression beruht meist auf Gen-Amplifikationen.

1.1.2 Tumorsuppressorgene

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Tumorsuppressorgene sind die funktionellen Gegenspieler der Onkogene, indem sie die Zellteilung kontrollieren. In vielen Fällen führt der Verlust ihrer Funktionalität zu einer unkontrollierten Aktivität der Onkogene (Kuivaniemi, 1989).

1.1.2.1  Klasse I Tumorsuppressorgene

Der Verlust der Tumorsuppressorgen-Aktivität kann auf verschiedenen Mechanismen beruhen. Es besteht die Möglichkeit einer Beschädigung des Gens durch Mutation oder Deletion. Tumorsuppressorgene, die auf Grund dieser Mechanismen irreversibel inaktiviert worden sind, bezeichnet man als Klasse I Tumorsuppressorgene.

1.1.2.1.1  Expressionsverlust durch Deletion und Mutationen

Ein seit langem bekanntes und mit am Besten untersuchtes Klasse I Tumorsuppressorgen ist das Gen für das Retinoblastoma (Rb) Protein. Rb ist das am häufigsten durch Mutation oder Deletion veränderte Gen in Tumoren des Menschen (El-Deiry et al., 1993). Das Rb Protein kontrolliert die Zellteilung, indem es den G1-Kontrollpunkt des Zellzyklus überwacht und so den Eintritt in die S-Phase inhibiert. Dies führt zur terminalen Differenzierung der Zelle. Dieser Prozess wird in erster Linie über den Rb-E2F Komplexes gesteuert, in dem Rb, durch Bindung an den Transkriptionsfaktor E2F, dessen aktivierende Eigenschaften hemmt. Dadurch wird die Expression verschiedener, den Zellzyklus aktivierender Gene (z.B. CyclinE oder E2F selbst), verhindert. Die Stabilität des Rb-E2F Komplexes ist abhängig vom Phosphorylierungsstatus des Rb-Proteins. Dieser wird von den Proteinkomplexen CyclinD/CDK4/6 und CyclinE/CDK2 reguliert. Die Phosphorylierung von Rb führt zur Aufspaltung des Rb-E2F Komplexes, wie es z.B. von Wachstumsfaktoren über die Expression von CyclinD1 vermittelt wird, und damit zur Freisetzung des Transkriptionsfaktors E2F. Durch den Verlust des Tumorsuppressorgens Rb wird das Proto-Onkogen E2F zum Onkogen. In vielen Tumoren ist Rb deletiert oder mutiert. Der Ausfall dieses bedeutenden Zellzyklusregulators kann zu Retinoblastomen, Osteosarkomen und kleinzelligen Lungenkarzinomen führen (Weinberg, 1995; Tuveson und Jacks, 1999; Stevaux und Dyson, 2002; Sherr und Roberts, 1999).

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Ein anderes, weit weniger gut untersuchtes Beispiel ist das LKB1/STK11 Gen. Das Protein ist eine Serin-Threonin Kinase mit ungeklärter, biologischer Funktion. In vitro Studien zeigen eine wachstumsunterdrückende Aktivität der Kinase (Tiainen et al., 1999). Eine Keimbahn Mutation des Gens führt zur Ausbildung des Peutz-Jeghers (PJ) Syndroms. Patienten mit dieser Erkrankung besitzen ein hohes Risiko für die Entstehung eines gastrointestinalen oder extraintestinalen Tumors. In 25 % der untersuchtenLungenadenokarzinome und in 20 % der untersuchten Lungentumorzelllinien aus PJ-Patienten sind Punktmutationen in LKB1/STK11 gefunden worden. Sechs von sieben dieser Mutationen sind Nonsense-Mutationen, die siebte führt zu einer Verschiebung des Leserahmens. Alle diese Mutationen führen zu einem verstümmelten LKB1/STK11-Protein, welches eine nur unvollständige, katalytische Domäne besitzt (Sanchez-Cespedes et al., 2002).

1.1.2.2 Klasse II Tumorsuppressorgene

Neben den irreversiblen Störungen der genomischen Integrität besteht auch die Möglichkeit, dass die Expression eines Gens durch einen reversiblen Mechanismus verhindert wird. Das Gen selbst wird dabei nicht verändert. Die Expressionshemmung kann durch eine Inaktivierung positiver Regulatoren (z.B. Transkriptionsfaktoren bzw. deren Aktivatoren), oder durch die Aktivierung negativer Regulatoren (z.B. Inhibitoren) erfolgen. Des weiteren kann auch die Methylierung der im Promoter enthaltenen CpG-Inseln, Deacetylierung oder Methylierung von Histonen und daraus resultierende Chromatinänderungen zu einer Unterdrückung der Genexpression führen. Tumorsuppressorgene, deren Expression durch einen der genannten Mechanismen gehemmt wird, bezeichnet man als Klasse II Tumorsuppressorgene. Auch als Klasse I definierte Tumorsuppressorgene können durch einen Klasse II Mechanismus gehemmt werden. Beispiele hierfür sind die Gene HIC 1 oder p16. Die chromosomale Region, auf der HIC 1 lokalisiert ist, ist in vielen Gehirn- und Brusttumoren deletiert, dagegen ist HIC 1 in einer großen Anzahl von epithelialen und hematopoetischen Tumoren methyliert (Trink et al., 1998). Im Zusammenhang mit dem Klarzell Sarkom sind für das p16 Gen sowohl Punkt Mutationen als auch homozygote Deletionen beschrieben (Takahira et al., 2004). In gastritischen Dysplasien jedoch ist p16 häufig hypermethyliert (Sun et al., 2004).

1.1.2.2.1  Expressionsverlust durch Aktivierung von Suppressoren

Die erhöhte Aktivität von Onkogenen kann zur Expression, Translation oder direkten Aktivierung eines Suppressors führen, der dann die Expression von Tumorsuppressorgenen verhindert. So zeigt Watnick et al. die Repression des anti-angiogenen Faktors Thrombospondin 1 (Tsp 1) durch den Transkriptionsfaktor c-Myc. c-Myc wird über einen, vom konstitutiv aktiven HRAS-Onkoprotein ausgehenden, Signalweg über PI3K, Rho und ROCK durch Phosphorylierung aktiviert. Durch die Suppression von Tsp 1 wird die Angiogenese stimuliert und ein stärkeres Tumorwachstum ermöglicht (Watnick et al., 2003).

1.1.2.2.2 Expressionsverlust durch Inaktivierung regulatorischer Faktoren

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Nicht nur die Aktivierung von Onkogenen, auch die Inaktivierung von positiven Faktoren, wie z.B. Transkriptionsfaktoren, kann dramatische Auswirkungen auf die Expression von Klasse II Tumorsuppressorgenen haben. Häufig handelt es sich um komplexe Zusammenhänge, bei denen Ursache und Wirkung nicht sofort zuordenbar sind. Ein solches Beispiel ist der Zusammenhang zwischen der Hypermethylierung des p14 ARF Gens und der Hemmung der Tumorsuppressorgene Maspin und KAI1. Das Tumorsuppressorprotein p14ARF verhindert normalerweise den Nukleus-Zytosol Transport des Onkoproteins MDM2 und lokalisiert es im Zellkern, hauptsächlich im Nukleolus (Zhang und Xiong, 1999). Ist das p14 ARF Gen hypermethyliert, wird es nicht mehr exprimiert und der MDM2 Nukleus-Zytosol Transport nicht länger blockiert. Unter diesen Bedingungen findet sich MDM2 sowohl im Zellkern als auch im Zytosol (Esteller et al., 2001). Im Zytosol führt MDM2 zum Abbau des Tumorsuppressors p53, gleichzeitig blockiert freies MDM2 im Zellkern die transkriptionale Aktivität von p53 (Prives, 1998).Die Inhibierung des Transkriptionsfaktors p53 führt schließlich zum Verlust der Expression verschiedener Tumorsuppressorgene. Zu diesen Genen gehören neben bekannten Zellzyklusregulatoren auch das Gen Maspin, das bei Brusttumorzellen die Ausbildung von Metastasen und die Tumorzellen-Invasion verhindert (Zou et al., 1994; Zou et al., 2000), und KAI1, das in Tumoren der Prostata als Metastasierungs-Suppressor von Bedeutung ist (Mashimo et al., 1998).

1.1.2.2.3 Expressionsverlust durch epigenetische Veränderungen

DNA-Methylierung ist ein durch Methyltransferasen (Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b) katalysierter Prozess, der zu einem definierten Methylierungsmuster während der Embryogenese führt und dieses Muster bei der Replikation der adulten Zelle immer wieder reproduziert. Ca. 80% der CpG-Dinukleotide des Genoms sind methyliert, wobei das Cytosin der CpG-Dinukleotide zu 5´-Methylcytosin umgewandelt wird. Die de novo Methylierung, sowie die „erhaltende“ Methylierung findet aber auch in somatischen Zellen statt und ist kein statischer sondern ein dynamischer Vorgang (Szyf, 2003). Dieser Prozess, der über die Inaktivierung regulatorischer Regionen zur Hemmung der Genexpression führt, spielt beim genomischen Imprinting, bei der X Chromosom-Inaktivierung, bei der Alterung und bei der gewebespezifischen Regulation der Genexpression eine wichtige Rolle (Li et al., 1993; Tate und Bird, 1993; Reik und Walter, 2001).

Die Inaktivierung der Promoteraktivität beruht auf einer direkten, sterischen Behinderung der Transkriptionsfaktor-Bindung, wenn die methylierten CpG-Inseln in direkter Nähe von Transkriptionsfaktorbindungsstellen liegen oder mit diesen überlappen. Des weiteren führt eine mit der Methylierung einhergehende Änderung der Chromatinstruktur zu einer geschlossenen, für Proteine nicht mehr zugänglichen DNA-Struktur, wodurch die Genexpression indirekt gehemmt wird.

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In Krebszellen werden häufig hypermethylierte Promoterregionen von Tumorsuppressorgenen gefunden. Dies führt zu einer verringerten oder fehlenden Genexpression, wie z.B. bei den Genen p21 WAF1 , p16 oder p15, deren Genprodukte als CDK-Inhibitoren wirken(Chen et al., 2000; Herman et al., 1995; Ng et al., 1997). In hepatozellulärem Tumorgewebe zeigen bei 51 untersuchten Fällen eine ganze Reihe von Tumorsuppressorgenen eine Methylierung ihrer Promoterregionen. Die Tumorsuppressorgene SOCS 1 sind in 65%, GSTP in 54%, APC in 53%, E-cadherin in 49% und p15 in 49% der untersuchten Proben methyliert. Im direkten Vergleich von nicht-tumorigenem Gewebe mit Hepatokarzinomen zeigen 53% der malignen Proben eine Promoter Methylierung von drei oder mehr Tumorsuppressorgenen, jedoch keine der normalen Proben (Yang et al., 2003). Ähnliche Beobachtungen wurden auch in anderen Tumortypen gemacht, dabei zeigten sich Überlappungen und Unterschiede zwischen den jeweiligen Listen der methylierten Gene.

Wie in Tumorzellen Gene Sequenz-spezifisch von Methyltransferasen hypermethyliert werden, ist noch ungeklärt. Di Croce et al. zeigen die Rekrutierung der Methyltransferasen durch das, in manchen Leukämien vorhandene und durch eine Translokation entstandene, Fusionsprotein PML-RAR an den RARβ2-Promoter. Zum Nachweis dieser Hypothese wurden Zellen mit einem RARβ-Luciferase Reporterplasmid transfiziert und eine Korrelation zwischen der Methylierung des endogenen RAR2β-Promoters und der Methylierung des Promoters des RARβ-Luciferase Reporterplasmids gemessen. DiCroce schlägt vor, dass ein Teil des PML-RAR Fusionsproteins die Methyltransferase bindet, während der andere Teil als Transkriptionsfaktor an den Promoter des Zielgens andockt und so die Methyltransferase zum Promoter gelenkt wird (Di Croce et al., 2002). Diese Beweisführung ist von Esteller et al. in Frage gestellt worden, der Leukämien, die das PML-RAR Fusionsprotein besitzen und Subtypen der Leukämien, die das Fusionsprotein nicht besitzen, miteinander verglichen hat und keinen Unterschied in der Häufigkeit der RAR2β Methylierung feststellen konnte (Esteller et al., 2002). Trotzdem ist die Bindung zwischen Metyhltransferasen und Transkriptionsfaktoren ein möglicher Mechanismus, der jedoch als Mechanismus für die Methylierung der bekannten Tumorsuppressorgene erst noch nachgewiesen werden muss.

1.1.2.3 Klasse II Tumorsuppressorgene im therapeutischen Ansatz

Um für therapeutische Zwecke Klasse II Tumorsuppressorgene reaktivieren zu können, gilt es herauszufinden, auf Grund welchen Auslösers und an welcher Stelle innerhalb des komplexen Signalnetzwerkes eine Veränderung eintritt, die zum Verlust der Expression des Tumorsuppressorgens führt. Für die meisten Klasse II Tumorsuppressorgene ist dies nicht bekannt. Einige der Demethylierungsreagenzien, die die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen aufheben sollen, befinden sich in der Phase der klinischen Tests, darunter die Dnmt1 Inhibitoren 5-Aza-2´-Desoxycytidin und MG98 sowie verschiedene Dnmt1 Antisense-Oligonukleotide (Szyf, 2003). In einer Analyse von 200 Patienten, die an Akuter Myeloischer Leukämie erkrankt und mit 5´-Azacytidin behandelt wurden, wurde bei 20% eine vollständige Remission der Erkrankung erreicht. Bei der Behandlung mit 5-Aza-2´-Desoxycytidin lag der Anteil der vollständigen Remission sogar über 30% (Zhou et al., 1997) Eine neuere Studie zeigt bei der Behandlung von Akuter und Chronischer Myeloischer Leukämie mit 5-Aza-2´-Desoxycytidin eine positive Reaktion bei 65% der Patienten (Issa et al., 2004). Trotz des erfolgreichen Einsatzes demethylierender Agenzien bleibt die hohe Toxizität dieser Substanzen ein Problem in der klinischen Anwendung. Daher ist die Entwicklung neuer, spezifisch wirkender Substanzen ein Schwerpunkt der aktuellen, pharmazeutischen Forschung.

1.2  H-REV107-1 ist ein Klasse II Tumorsuppressorgen

1.2.1  Expression von H-REV107-1 in normalem Gewebe, in Tumoren sowie normalen und malignen Zelllinien

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1994 wurde das H rev107 1 Gen der Ratte aus einer subtraktiven cDNA Bank isoliert. Diese Bank entstand durch physikalische Subtraktion der cDNA zweier Zelllinien, der HRAS-transformierten Ratten Fibroblastenzelllinie FE8 und der daraus hervorgegangenen, phänotypischen Revertante F9. F9 exprimiert immer noch das HRAS Onkogen, hat jedoch im Gegensatz zu FE-8 seine malignen Eigenschaften verloren. H rev107 1 wird in den HRAS-transformierten FE-8 Zellen nicht, in den F9 Revertanten jedoch deutlich exprimiert. Somit konnte es aus der subtraktiven cDNA-Bank isoliert werden (Hajnal et al, 1994).

Des weiteren zeigen auch die, gegen eine Transformation mit HRAS resistenten Zelllinien REF52 (Ratten Embryonale Fibroblastenzelllinie) und EK-3 (ein Maus NIH3T3 Derivat), ein hohes H rev107 1 Expressionsniveau, während die für eine Transformation sensitiven Zelllinien, wie z.B. NIH3T3 oder 208F, ein sehr niedriges Expressionsniveau aufweisen. Durch Transfektion der REF52 Zellen mit dem nukleären Adenovirus Onkogen E1A kann die H-rev107-1 Expression auf das 208F Niveau gedrückt werden. Die Resistenz der REF52 Zellen gegen die Transformation durch HRAS wird durch die Transfektion mit E1A aufgehoben (Hajnal et al, 1994).

Während H rev107 1 in normalen Geweben der Ratte ubiquinär exprimiert wird, kann in Gewebe von Leber-, Nieren-, und Pankreastumoren sowie in experimentellen Mammatumoren Hras-transgener Mäuse zwar eine geringe Menge H-rev107-1 mRNA, jedoch kein Protein nachgewiesen werden (Sers et al., 1997).

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Auch in normalen humanen Geweben wird H-REV107-1 ubiquinär exprimiert. In Tumorzelllinien kann das Transkript nur in acht von 27 untersuchten Tumorzelllinien detektiert werden. Auch in primären Plattenepithelkarzinomen kann kein H-REV107-1 gefunden werden (Husmann et al., 1998).

1.2.2  H-rev107-1 besitzt wachstumshemmende Eigenschaften

Die Transfektion und Überexpression der H-rev107-1 cDNA in der HRAS-transformierten Ratten Hepatomazelllinie ANR4 sowie in der Fibroblastenzelllinie FE8 reduziert das Koloniewachstum um bis zu 75%. Nach einer stabilen Transfektion mit dem H-rev107-1 cDNA Konstrukt zeigen im Western Blot nur fünf von 13 Klonen ein erhöhtes Niveau an H-rev107-1 Protein. Eine Immunofluoresenzanalyse dieser fünf Klone hat ergeben, dass nur 20-50% der Zellen das Protein exprimieren. Diese Zahl verringert sich nach einigen Wochen in Kultur bis auf unter 10%. Diese Reduktion der Kolonienanzahl sowie die in vitro Selektion gegen H-rev107-1 Protein exprimierende Zellen zeigt sich in der immortalen Zelllinie 208F nicht (Sers et al., 1997).

Injiziert man H rev107 1 überexprimierende FE-8 Zellen in Nacktmäuse, so zeigen diese, bis zum Tag 11, ein vermindertes Tumorwachstum. Zellen, die aus solchen Tumoren in Kultur übernommen werden, zeigen einen Anteil von ca. 15% H-rev107-1 Protein exprimierender Zellen, im Vergleich zu dem Anteil von ca. 55% positiver Zellen, die den Mäusen gespritzt wurden. Auch in vivo erfolgt eine Selektion gegen H rev107 1 exprimierende Zellen.

1.2.3  H-REV107-1 liegt in humanen Tumoren als Wildtyp-Sequenz vor

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Die Überexpression von HRAS in der Zelllinie 208F führt zum Verlust der H-rev107-1 Expression, die jedoch in der Revertante F9 wieder hergestellt ist. Dies macht es sehr wahrscheinlich, dass der Verlust der Expression auf einer reversiblen Veränderung in der Zelle beruht, die den Mechanismus der Regulation betrifft.

Um in humanen Geweben die Möglichkeit einer Mutation auszuschließen, wurden verschiedene Tumorgewebe aus Ovar und Lunge auf Mutationen im H-REV107-1 Gen untersucht. Da keine Mutationen entdeckt werden konnten, kann man davon ausgehen, dass das H-REV107-1 Gen zumindest in diesen Geweben nicht durch Mutationen oder Deletionen, sondern auf Grund einer Veränderung im Regulationsmechanimus in seiner Expression supprimiert wird. H REV107 1 ist somit ein Klasse II Tumorsuppressorgen mit einer bislang unbekannten Funktion.

1.3 Die H-REV107 Familie

1.3.1  Entdeckung und Funktion der Mitglieder der H-REV107 Gen-Familie

Als erstes Gen dieser Familie wurde 1994 von Hajnal et al. das H rev107 1 Gen der Ratte beschrieben. 1998 wurde mittels differentieller PCR das RARRES3/TIG3 Gen von DiSepio et al. nach Induktion einer primären humanen Keratinozytenzelllinie mit dem synthetischen Retinsäure-Derivat Tazaroten gefunden (DiSepio et al., 1998). Gleichzeitig konnten auch Husmann & Sers et al. das Gen isolieren. Das RARRES3/TIG3 Gen weist eine signifikante Homologie zu H rev107 1 auf. Als drittes Gen der Familie wurde 1999 von Akiyama et al. mit Hilfe differentieller Subtraktion zweier Maus Zelllinien das Ac 1 Gen isoliert. In der undifferenzierten, chondrogenen Maus Zelllinie ATDC5 wurde Ac 1 mRNA gefunden, die undifferenzierte, pluripotente Maus Zelllinie C3H10T1/2 exprimierte kein Ac 1. Im Menschen wird AC 1 überwiegend im Skelett-Muskel, dem Herz, dem Hippocampus und im Knochengewebe exprimiert (Akiyama et al., 1999). 1998 wurde von Husmann et al. das humane Homolog zu H rev107 1 und 2001 von Ito et al. das humane Homolog zu Ac 1 isoliert (Husmann et al., 1998; Ito et al., 2001). Alle drei Gene zeigen die Eigenschaft, dass sie nach Expression in RAS transformierten Zelllinien die Kolonienanzahl reduzieren und das Zellwachstum deutlich verringern. Über zwei weitere Mitglieder der Gen-Familie, HRLP5 (GeneID: 117245) und HRASLS2 (GeneID: 54979), ist außer der cDNA- und der Proteinsequenz sowie der chromosomalen Lokalisation nichts bekannt (Strausberg et al., 2002).

1.3.2 Die H-REV107 Familie ist Teil der NlpC/P60-Superfamilie

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Durch Analyse der in Datenbanken gespeicherten DNA- und Aminosäuren Sequenzen, konnte Hughes et al. 2001 eine Verwandtschaft der 2A-Proteine aus Picorna-Viren mit den Proteinen der H-REV107 Familie zeigen (Hughes und Stanway, 2000). 2003 gelang es Anantharaman et al., die H-REV107 Familie der NlpC/P60-Superfamilie zuzuordnen.

NlpC/P60 Proteine bilden eine Gruppe verschiedenster Proteine, die in vielen Bakterienstämmen vertreten sind. Darunter finden sich Zellwand-Peptidasen sowie Proteine unbekannter Funktion. Allen gemein ist eine katalytische Domäne mit einem N-terminalen, konservierten Cystein, gefolgt von einem C-terminalen, konservierten Histidin. Zwischen diesen befindet sich ein konservierter Bereich mit einem Glycin, dem oftmals eine Asparaginsäure folgt. Diese drei bzw. vier konservierten Aminosäuren bilden das für die NlpC/P60-Superfamilie charakteristische Motiv. Die NlpC/P60 Superfamilie wurde von Anantharaman & Aravind in vier Gruppen eingeteilt, die P60-ähnliche, die AcmB-ähnliche, die YaeF-ähnliche und die LRAT-ähnliche Familie (Anantharaman und Aravind, 2003).

Tabelle 1: Die H-REV107 Genfamilie wird auch als HRASLS Genfamilie bezeichnet. Insgesamt gehören fünf Gene zu der Familie, darunter H-REV107-1, das auch HRASLS3 genannt wird. Mit Ausnahme von HRASLS sind alle Mitglieder der Genfamilie in der Region 11q12.3 lokalisiert.

Name

weitere Namen

Lokalisation des Gens

Größe des Proteins (Aminosäuren)

Expression des Gens

Literatur

HRASLS
(HRAS-like suppressor)

AC-1

3q29

168

Gehirn, Herz, Testis, Skelettmuskel

Akiyama et al., 1999
Ito et al., 2001

HRASLS2

11q12.3

162

mRNA experimentell bestätigt. Kodierende Sequenz als Computeranalyse vorhergesagt

GeneID: 54979

HRASLS3

H REV107 1 H REV107 3

11q12.3

162

Ubiquitär in epithelialem Gewebe

Hajnal et al., 1994
Husmann et al., 1998

RARRES3
(Retinoic acid receptor responder 3)

RIG 1
TIG
3
H
REV107 2

11q12.3

164

Ubiquitär, auch in Lymphozyten und Schilddrüse

DiSepio et al., 1998

HRLP5
(HREV107like protein 5)

11q12.3

279

mRNA experimentell bestätigt. Kodierende Sequenz als Computeranalyse vorhergesagt

Strausberg et al., 2002

1.3.2.1  Die P60-ähnliche Familie

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Die P60-ähnliche Gruppe besteht aus weit verbreiteten Proteinen verschiedener Bakterienstämme, bei denen es sich, soweit charakterisiert, ausschließlich um Peptidasen handelt. Alle Mitglieder dieser Familie haben entweder ein Signalpeptid oder besitzen eine transmembrane Region, woraus sich auf eine extrazelluläre Lokalisation der Proteine schließen lässt.

1.3.2.2 Die AcmB-ähnliche Familie

Die AcmB-ähnliche Familie ist die divergenteste Protein-Familie. Sie setzt sich aus den beiden großen Subfamilien AcmB und LytN zusammen, deren Vorkommen zum größten Teil auf Gram-positive Bakterienstämme begrenzt ist und deren Funktion sich auf Zellwand-Hydrolasen beschränkt. Die Architektur ihrer Domänen entspricht dabei oftmals derjenigen der Mitglieder der P60-ähnlichen Familie. Eine dritte Subfamilie kommt aus γ-Proteobakterien und Trypanosomen und wird durch die gemeinsame Amino-terminale Amidase-Domäne GSPS charakterisiert.

1.3.2.3 Die YaeF-ähnliche Familie

Die YaeF-ähnliche Familie besitzt, genauso wie die LRAT-ähnliche Familie, eine zirkuläre Permutation der, in den NlpC/P60 Proteinen vorhandenen, konservierten Aminosäuren (Abb. 1). Diese zirkuläre Permutation führt dazu, dass hier das konservierte Glycin am N-terminalen Ende liegt. Darauf folgt das konservierte Histidin und C-terminal liegt das konservierte Cystein. Gemeinsam mit den LRAT-Proteinen besitzen die Proteine der YaeF-ähnlichen Familie, C-terminal ein weiteres, konserviertes Cystein. Die YaeF-ähnliche Familie setzt sich aus YaeF- und PoxvirusG6R-ähnlichen Mitgliedern zusammen, die in Bakterien, dem Archeon Archaeoglobus, in C. elegans und in Poxviren vorkommen (Anantharaman und Aravind, 2003).

1.3.2.4 Die LRAT-ähnliche Familie

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Die Mitglieder der LRAT-ähnlichen Familie werden bisher hauptsächlich in Eukaryoten und tierischen Viren gefunden. Je ein Protein dieser Familie kommt auch im Proteom von Vibrio cholera und Anabaena vor. In Vertebraten existieren zwei weitere Subfamilien, zum einen die H-REV107 Familie, zum anderen die, durch das noch nicht charakterisierte, humane NSE2 Protein definierte, NSE-Familie. Die von diesen Proteinen am weitesten charakterisierte Lecithin Retinol Acyltransferase (LRAT) spielt in Vertebraten eine wichtige Rolle bei der Lagerung und der Bereitstellung von Retinol als Retinylester (Rando, 2002). Neben dem katalytischen Cystein der NCE-Domäne ist für die enzymatische Funktion des LRAT-Proteins auch das weiter C-terminal liegende Cystein essentiell. Mit H-REV107-1 verwandte Proteine wurden auch in Picorna-Viren wie dem humanen Parecho Virus, dem Aichi Virus und dem Encephalomyelitis Virus gefunden (Hughes und Stanway, 2000). Außerdem wurden dem H-REV107-1 verwandte Proteine in humanen Calici Viren, wie dem Norwalk Virus und seinen Verwandten, gefunden. Die Mitglieder der NSE-Familie haben gemein, dass bei ihnen das Cystein der NCE-Domäne durch ein Serin ersetzt worden ist. Eine biochemische Funktion ihrer Domänen ist nicht bekannt. NSE2 interagiert mit α-Catenin und zeigt ein signifikant erhöhtes Expressionsniveau in Brusttumoren (Adam et al., 2003).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der zirkulären Permutation konservierter Aminosäuren in der YaeF- und LRAT-ähnlichen Familie

1.4 Die humane H-REV107 Proteinfamilie

Die engere H-REV107-ähnliche Proteinfamilie besteht aus den fünf Proteinen H-REV107-1 (HRASLS3), HRASLS2, AC-1 (HRASLS1), RARRES3 und HRLP5 und besitzt drei konservierte Domänen (Abb. 2). Vom N-terminalen zum C-terminalen Ende werden die Domänen als die GDL-, die HWAIY- und die NCE-Domäne bezeichnet. Die Funktion der Domänen ist weitgehend unbekannt. Die einzige Ausnahme in Eukaryonten ist die NCE-Domäne. Bei dem verwandten Protein LRAT bildet das Cystein das katalytische Zentrum der NCE-Domäne, das die Veresterung von Retinol zu Retinylester steuert. Zwischen der HWAIY- und der NCE-Domäne befinden sich zwei weitere Domänen, die jeweils nur in einigen Mitgliedern der Familie konserviert sind. So folgt nach der HWAIY-Domäne eine DXXG-Domäne, die sowohl in H-REV107-1 als auch in RARRES3 vorkommt, und darauf folgend eine NKXD-Domäne, die in H-REV107-1, in HRASLS2 und in HRLP5 konserviert ist. Diese zwei Domänen haben eine hohe Übereinstimmung mit zwei, in GPTasen konservierten, Regionen. Bisher konnte aber für kein Mitglied der H-REV107-Familie eine GTPase-Aktivität gezeigt werden. Am C-Terminus befindet sich eine lange, hydrophobe Sequenz, mit der die Proteine an intrazelluläre Membranen binden. Auch die Funktionen dieser weiteren Domänen sind in Eukaryonten bislang unklar (Nazarenko et al., 2004).

↓13

Tabelle 2: Die relativen Übereinstimmungen der Aminosäure-Sequenzen der H-REV107 Familie (Nazarenko et al., 2004). Zum Vergleich wurden alle nicht-redudanten GenBank CDS Einträge sowie Translationen und SwissProt Einträge herangezogen.

Protein

Übereinstimmung

Ähnlichkeit

H-REV107-1

100%

100%

HRASLS2

60%

82%

RARRES-3

51%

66%

HRLP5

51%

64%

HRASLS

46%

64%

Abbildung 2: Der Vergleich der Proteinsequenzen der Mitglieder der H-REV107-Familie. Die fettgedruckten Buchstaben zeigen die in allen Familienmitgliedern konservierten Aminosäuren. Die grau hinterlegten Bereiche zeigen potentielle Domänen. Die Domänen sind mit ihrem jeweiligen Namen überschrieben (Nazarenko et al., 2004).

1.5 Fragestellung der Arbeit

Die Expression des Klasse II Tumorsuppressorgens H-REV107-1 wird in Tumorzellen reversibel supprimiert. Diese Suppression ist vermutlich essentiell, um eine maligne Transformation der Zellen zu ermöglichen. Für therapeutische Zwecke ist es daher wichtig, die Suppression des Gens aufheben zu können. Eine Voraussetzung dafür ist das Verständnis der Abhängigkeit der H REV107 1 Genexpression von den entsprechenden Transkriptionsfaktoren.

↓14

Das Ziel dieser Arbeit ist es, diese Regulations-Mechanismen zu finden. Dazu soll untersucht werden, von welchen Signalwegen die Transkription des H-REV107-1 Gens abhängig ist. Des weiteren sollen die allgemeinen Mechanismen der H-REV107-1 Expression aufgeklärt, die funktionellen Regionen des Promoters analysiert sowie die, für die Regulation verantwortlichen, spezifischen Transkriptionsfaktoren identifiziert werden.


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der Humboldt-Universität zu Berlin
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12.10.2006