2 Materialien und Methoden

2.1  Materialien

2.1.1  Chemikalien

2.1.7  Antikörper für den Gel Retardations-Assay

2.1.9  Oligonukleotide

2.1.9.1  Primer für die Sequenzierung

2.1.9.3  Primer zur Synthese der Fragmente der pGL3 Konstrukte

humane H-REV107-1 Sonde (Northern- und Southern Blot Hybridisierungsassay)

Ratten H-rev107-1 Sonde (Northern Blot Hybridisierungsassay)

humane und Ratten IRF-1 Sonde (Northern Blot Hybridisierungsassay)

Primer Extension Assay

Die unterstrichenen Basen zeigen die eingeführten Mutationen.

2.1.9.6  Oligonukleotide für EMSA Experimente

2.1.10  Plasmide, Konstrukte und Phagen

2.1.11  Software

2.1.11.1  Promoteranalyse

2.1.13.1  Zellkultur

D10

Für Östrogen-freies Medium (KA-1 Zellen) wurde fötales Kälberserum der Firma Boehringer Mannheim (Katalog-Nr.: 210 471) verwendet.

2.2.1  RNA-Isolierung aus Säuger-Zelllinien

Zur Isolierung von Gesamt-RNA wurde das RNeasy Kit von Qiagen benutzt. Die entsprechenden Zellen wurden in Zellkulturschalen (10 cm Durchmesser) kultiviert, das Medium abgesaugt und die Zellen einmal mit PBS (1x) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit RLT-Puffer abgelöst, in ein Mikrozentrifugationsröhrchen überführt und kurz mit dem Vortex resuspendiert. Zur Homogenisierung der Probe wurde diese mindestens fünfmal durch eine Kanüle (Durchmesser: 0.9 mm) gezogen. Ein Volumenäquivalent 70%igen Ethanols wurde zugegeben und gut gemischt. Die Probe wurde auf eine RNeasy Säule gegeben und für 15 Sekunden bei 8000 x g zentrifugiert. Die Probe wurde auf der Säule mit dem Puffer RW1 und anschließend zweimal mit dem Puffer RPE gewaschen. Zuletzt wurde die RNA mit 50 μl RNase freiem Wasser eluiert (1 Minute bei 8000 x g). Die RNA wurde bei – 80°C aufbewahrt.

2.2.2.1  Maxi Präparation

100 ml Bakterienkultur wurden 10 Minuten bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 6.7 ml Maxiprep Puffer (25 mM Tris-HCl [pH 8.0], 50 mM Glucose, 10 mM EDTA [pH 8.0]) und 100 μg RNAseA/ml Lösung gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden der Lösung 13.3 ml 0.2 N NaOH und 1% SDS (Endkonzentration) zugegeben. Nach 5 min bei Raumtemperatur wurden 10 ml 3M Kaliumacetat zugegeben, gemischt und 20 min bei 4°C inkubiert. Das entstandene Präzipitat wurde bei 4°C, für 20 min bei 9000 x g abzentrifugiert, die wässrige Phase entnommen und das restliche Präzipitat abfiltriert. Ein Volumenäquivalent bestehend aus einem Gemisch von Tris-gesättigtem Phenol, Chloroform, Isopropanol im Verhältnis 25/24/1 wurde mit der Lösung vermischt und anschließend die Phasen bei 17 °C für 10 min bei 16000 x g getrennt. Die wässrige Phase wurde abgenommen, mit einem Volumenäquivalent eines 49/1 Gemisches aus Chloroform und Isopropanol gemischt und für 10 min bei 17 °C und 16000 x g abzentrifugiert. Die wässrige Phase wurde erneut abgenommen und 3 M NaCl im Verhältnis 1/10 sowie das 0.7fache Volumenäquivalent Isopropanol zugegeben. Das Gemisch wurde bei 16000 x g und 4°C für 25 min abzentrifugiert, der wässrige Überstand abgegossen, das feste Pellet mit 70%igem EtOH gewaschen und in Tris-HCl [pH8.0] aufgenommen. Die DNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei –20°C eingefroren.

Kleinere Mengen DNA (-10μg) wurden mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) isoliert. Dazu wurden 1.5 ml Bakterienkultur abzentrifugiert, das Pellet in 250 μl Puffer P1 gelöst und in ein Mikrozentrifugationsröhrchen überführt. Nach Zugabe von 250 μl Puffer P2 wurde das Mikrozentrifugationsröhrchen dreimal geschüttelt und anschließend 350 μl Puffer N3 zugegeben. Das entstandene Präzipitat wurde abzentrifugiert und der Überstand auf eine QIAprep Säule gegeben. Diese wurde anschließend mit den Puffern PB und PE gewaschen. Zuletzt wurde die DNA mit 10 mM Tris-HCl [pH 8.0] von der Säule eluiert und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C eingefroren.

2.2.3.1  Verdau von DNA

Soweit nicht anders angegeben, wurden zur Restriktion von DNA Enzyme der Firma Promega nach Anleitung des Herstellers verwendet und die DNA mit dem entsprechenden Enzym für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Das Enzym wurde anschließend den Angaben entsprechend inaktiviert. Die DNA der Phagen wurde auf Grund ihrer Größe über einen Zeitraum von 12 Stunden verdaut.

Die linearisierte DNA wurde in 1xTA Puffer und 5 mM CaCl für 5 Minuten bei 30 °C inkubiert. Für jedes Mikrogramm DNA wurde eine Einheit des Enzyms HK Phosphatase (Epicentre Technologies) zugegeben und das Gemisch für eine Stunde bei 30 °C inkubiert. Abschließend wurde die Phosphatase durch Inkubation bei 65 °C und 15 Minuten inaktiviert.

Zur Ligation von DNA-Fragmenten in Vektoren wurde das Fast-Link DNA Ligation and Screening Kit (Epicentre Technologies) nach Anleitung des Herstellers verwendet. Dazu wurden 1.5 μl 10fach Puffer, 1mM ATP sowie Fragment-DNA und dephosphorylierte Vektor-DNA im molaren Verhältnis 3:1 (Gesamt-Menge: ca. 50 ng) gemischt. Hierzu wurden zwei Einheiten Fast-Link Ligase zugegeben. Das Gemisch wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend für 15 Minuten bei 70°C inkubiert.

Parallel dazu wurde eine Probe des nicht dephosphorylierten Leervektors zur Kontrolle ligiert. Ein kleiner Teil der Proben wurde mit einem Restriktionsenzym linearisiert und zur Kontrolle auf einem 1%igem Agarosegel aufgetrennt. Aus dem Vergleich der Banden konnte abgelesen werden, ob das Fragment mit dem Vektor ligiert worden war. Das Restriktionsprodukt des Vektors, in den das Fragment ligiert wurde, sollte entsprechend des Fragments größer sein, als der zur Kontrolle linearisierte Leervektor.

Gezielte Mutationen wurden mit dem QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kits (Stratagene), nach Anleitung des Herstellers, in Plasmid-DNA eingeführt. Mit Hilfe dieser Methode wurden in den Transkriptionsfaktorbindungsstellen des H-REV107-1 Promoters gezielt Nukleotide ausgetauscht.

Die Beschreibung der Methode in Kürze: Ein ca. 30 Basenpaare langes, komplimentäres Primerpaar mit den gewünschten, in die Plasmid DNA einzuführenden Mutationen, wurde mit der Plasmid-DNA, dNTPs, und der Pfu Turbo DNA Polymerase in einer PCR Reaktion eingesetzt.

Tabelle 3: PCR-Programm zum Einbringen zielgerichteter Mutationen

In dieser Reaktion wurde die DNA mit der eingeführten Mutation synthetisiert. Die neu synthetisierte DNA enthält im Unterschied zur Ausgangs-DNA einen Knick. Dem auf 37 °C abgekühlten Reaktionsgemisch wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms DpnI zugegeben, welches nur die Ausgangs-DNA, aber nicht die neu synthetisierte DNA verdaute. Der Verdau fand bei 37 °C für eine Stunde statt. Die übriggebliebene, mutierte DNA wurde in XL1-Blue Supercompetente Zellen transformiert. In den Bakterien wurde der Knick von diesen repariert und die DNA vervielfältigt. Abschließend wurde die DNA mit Hilfe der DNA-Maxipräparation gewonnen und zur Kontrolle sequenziert.

Die 5´-Endmarkierung von Oligonukleotiden wurde mit dem Nick Translation Kit von AmershamPharmacia Biotech, entsprechend dem Protokoll, durchgeführt. Dazu wurden 100 ng Oligonukleotid, 10 μl Nukleotid-Puffer und 5 μl dCTP [α-³²P] (10mCi/ml) mit H₂O auf 50 μl aufgefüllt. Anschließend wurde 5 μl Enzym-Lösung zugegeben, gemixt, kurz abzentrifugiert und für 2 Stunden bei 15 °C inkubiert. Ein μl der Probe wurde in ein leeres Röhrchen gefüllt und die α-³²P-Einbaurate mit einem Szintillationszähler gemessen. Die restliche Probe wurde für fünf Minuten bei 95 °C denaturiert und die gewünschte Menge verwendet.

Zehn μg Gesamt-RNA, gemischt mit 2μl RNA-Ladepuffer, wurden mittels Elektrophorese in einem formaldehydhaltigen, einprozentigem Agarosegel aufgetrennt (Elektrolytlösung:1fach MOPS). Das Gel wurde auf einen UV-Tisch gelegt, fotografiert und zurechtgeschnitten. Anschließend wurde es für 10min in 5xSSC equilibriert. Das Gel wurde mit der Rückseite nach oben auf einen Bogen Whatmanpapier gelegt, dessen Enden in eine Lösung von 20xSSC hingen. Eine in 2xSSC equilibrierte Nylonmembran (HybondN) wurde auf das Gel gelegt, mit vier Lagen Whatmanpapier belegt und mit genügend saugfähigem Zellulosepapier bedeckt. Es wurde darauf geachtet, dass sich zwischen dem Gel und der Nylonmembran keine Luftblasen befanden. Durch die aus dem Gel aufsteigende Flüssigkeit wurde die RNA im Laufe von 16 Stunden auf die Nylonmembran transferiert. Die Membran wurde anschließend für 10 Minuten in 2xSSC gewaschen und die RNA durch Bestrahlung mit UV-Licht (2 Minuten, 120mJ/cm²) fixiert. Die Membran wurde in Prähybridisierungslösung (ExpressHyb, Clontech), der 10 μl (10mg/ml) tRNA /ml ExpressHyb zugegeben war, bei 42 °C für mindestens 30 Minuten inkubiert. Eine markierte Sonde (Herstellung der Sonde siehe Kapitel 2.2.7) wurde für 2 Minuten bei 95°C denaturiert, der Hybridisierungslösung zugegeben und die Membran für weitere 4 Stunden inkubiert. Anschließend wurde die Membran in 2xSSC mit 0.1% SDS bei Raumtemperatur bei wiederholtem Austausch der Waschlösung für 30 Minuten gewaschen. Danach wurde die Membran in 0.1xSSC mit 0.1% SDS für eine Stunde bei 50 C gewaschen. Die Membran wurde in Plastikfolie eingeschweißt, in einer Dunkelkammer in eine Filmkassette auf einen Röntgenfilm (BioMAX MS) gelegt und über Nacht bei -70°C exponiert.

Die isolierte und gereinigte DNA eines Phagen, wurde mit den entsprechenden Restriktionsenzymen geschnitten. Die DNA wurde in einem einprozentigen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt (Laufpuffer 1xTAE). Das Gel wurde auf einen UV-Tisch gelegt, fotografiert und zurechtgeschnitten. Anschließend wurde es für 2 x 20 min in einer Lösung aus 0.4 M NaOH, 1 M NaCl equilibriert und die DNA denaturiert. Das Gel wurde mit der Rückseite nach oben auf einen Bogen Whatmanpapier gelegt, dessen Enden in eine Lösung von 0.4 M NaOH, 1 M NaCl hingen. Eine Nylonmembran (HybondN+) wurde auf das Gel gelegt, mit vier Lagen Whatmanpapier belegt und mit genügend saugfähigem Zellulosepapier bedeckt. Es wurde darauf geachtet, dass sich zwischen dem Gel und der Nylonmembran keine Luftblasen befanden. Durch die aus dem Gel aufsteigende Flüssigkeit wurde die DNA im Laufe von 16 Stunden auf die Nylonmembran transferiert. Die Membran wurde anschließend in einer Lösung, bestehend aus 0.5 M Tris-HCl [pH 7.2] und 1.0M NaCl für 2 x 20 Minuten neutralisiert und die DNA durch Bestrahlung mit UV-Licht (2 Minuten, 120mJ/cm²) fixiert. Die Membran wurde in Prähybridisierungslösung (ExpressHyb, Clontech), der 10 μl (10mg/ml) tRNA /ml ExpressHyb zugegeben war, bei 60 °C für mindestens 30 Minuten inkubiert. Ein radioaktiv markiertes, PCR-synthetisiertes H-REV107-1 cDNA Fragment, welches das 5´-Ende des Gens enthielt, wurde für 2 Minuten bei 95 °C denaturiert, der Hybridisierungslösung zugegeben und die Membran für weitere 4 Stunden bei 60°C inkubiert (Herstellung der Sonde siehe Kapitel 2.2.7). Anschließend wurde die Membran in 2xSSC mit 0.1% SDS bei Raumtemperatur bei wiederholtem Austausch der Waschlösung für 30 Minuten gewaschen. Danach wurde die Membran in 0.1xSSC mit 0.1% SDS für eine Stunde bei 50 °C gewaschen. Die Membran wurde in Plastikfolie eingeschweißt, in einer Dunkelkammer in eine Filmkassette auf einen Röntgenfilm (BioMAX MS) gelegt und über Nacht bei -70°C exponiert.

2.2.7.1  Herstellung der humanen H-REV107-1 Sonde für den Northern- und Southern Blot Hybridisierungsassay

Sequenz der Primer: siehe Tabelle 2.1.9.4

Programm:

Tabelle 4: PCR-Programm zur Synthese der humanen H-REV107-1 Sonde

2.2.7.2  Herstellung der IRF-1 Sonde für den Northern Blot Hybridisierungsassay (human und Ratte)

Programm:

Tabelle 5: PCR-Programm zur Synthese der IRF-1 Sonde

Programm:

Tabelle 6: PCR-Programm zur Synthese der Ratten H-rev107-1 Sonde

Tabelle 7: Annealing Temperaturen und Anzahl der Zyklen für die folgenden PCR Programme zur Synthese der pGL3-Konstrukte

PCR Programm für alle pGL3-Konstrukte:

Tabelle 8: PCR-Programme zur Synthese der pGL3-Konstrukte

Tabelle 9: Annealing Temperaturen und Anzahl der Zyklen für die folgenden PCR-Programme zur Synthese der SEAP-Konstrukte

Die Promoterkonstrukte für die funktionelle Untersuchungen, B-2, C-2, D-2 und A-2 wurden mittels PCR aus dem Gesamtpromoterfragment A-4 hergestellt.

PCR Programm für Konstrukte A-2 und A-4:

Tabelle 10: PCR-Programme zur Synthese der SEAP-Konstrukte A-2 und A-4

PCR Programm für die Konstrukte B-2, C-2 und D-2:

Tabelle 11: PCR-Programme zur Synthese der SEAP-Konstrukte B-2, C-2 und D-2

2.2.8.1  Genome Priming System

Um eine längere DNA Sequenz zu sequenzieren konnte man anstatt des "Primer-Walkings“ auch das Genome Priming System verwenden. Bei diesem System wurden mit Hilfe eines, vom Transposon Tn7 abgeleiteten Transprimer™ Elements, in jedes Zielplasmid zwei Primer-Bindungsstellen (Primer N und S; Sequenz siehe Kapitel 2.1.9.1) statistisch zufällig verteilt in die Plasmid-DNA inseriert.

Durch Sequenzierung einer genügend hohen Anzahl an Klonen, ausgehend jeweils von den inserierten Primer-Bindungsstellen, erhält man eine vollständige Abdeckung der Ziel-DNA. Die Zusammensetzung der einzelnen, sich überlappenden Fragmente, erfolgt mit Hilfe eines Computers.

Zu einem Gemisch aus Ziel-DNA (0.08 µg) und zu inserierendem Transprimer™ (0.02 µg) wurde Transposase TnsABC zugegeben und für 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe eines Startmixes lief die Reaktion für eine Stunde bei 37 °C und wurde abschließend 10 Minuten bei 75 °C inaktiviert.

Die DNA wurde in Bakterien transformiert und Klone durch Zugabe entsprechender Antibiotika selektioniert. Aus 50 Klonen wurde die transformierte DNA isoliert und anschließend mit dem Primer N und dem Primer S sequenziert.

Sequenzierungen wurden mit dem SequiTherm EXCEL II DNA Sequencing Kit-LC (Epicentre Technologies) durchgeführt. Die Primer (siehe Kapitel 2.1.9.1) waren IRD 800 markiert und wurden von MWG Biotech bezogen. Aus einem frisch hergestellten Mix, bestehend aus 7.2 μl 3.5xSequiTherm EXCEL II Sequenzier-Puffer, 2 pmol markiertem Primer, 700 ng DNA, 1 μl SequiTherm EXCEL II DNA Polymerase, der mit H₂O auf 17 μl aufgefüllt wurde, wurden je 4 μl entnommen und zu je 2 μl SequiTherm EXCEL II Termination Mix A, C, G oder T gegeben. Das Gemisch wurde mit Mineralöl überschichtet, 5 Minuten bei 95 °C denaturiert und anschließend eine PCR mit folgenden Parametern durchgeführt:

Tabelle 12: PCR-Programm zur Durchführung von Sequenzierungen

Abschließend wurden 3 μl Stop/Loading Puffer zugegeben.

Zur Analyse der Sequenzierung wurden die Proben für 3 Minuten auf 70 °C erwärmt und je 1.2 μl der Probe auf ein Sequenziergel aufgetragen. Das Sequenziergel wurde aus 350 μl 10% APS, 400 μl DMSO, 30 ml Sequagel XR und 7.5 ml Sequagel Complete Buffer (beides National Diagnostics) hergestellt. Die Analyse erfolgte mit dem Sequenzierautomat LI-COR DNA-Sequencer 4000 und wurde mit der Software DataBase Image IR am Computer ausgewertet.

2.2.9.1  Markieren des Primers

Das Oligonukleotid HRev107 PrimExt 2 wurde mit ATP [γ-³²P] (10 mCi/ml) am 5`-Ende markiert. Dazu wurden 50 pmol Primer mit 2 Einheiten Polynukleotid-Kinase (PNK; NEB), 5 μl 10 x PNK-Puffer, 2 μl ATP [γ-³²P] und 36 μl H₂O für eine Stunde bei 37°C inkubiert und die PNK anschließend für 15 min bei 70°C inaktiviert. Freies ATP [γ-³²P] wurde über eine Sephadex-Säule (G 25, Calbiochem) vom Primer abgetrennt und dieser anschließend mit 10 mM Tris-HCl [pH 8.0] von der Säule gewaschen. Zum Bestimmen der Einbaurate wurden die γ-Zerfälle pro Sekunde mit Hilfe eines Szintillationszählers gemessen. Die Konzentration des Primers wurde auf 10⁵ Zerfälle pro Sekunde je μl verdünnt und für jede Probe eine Menge des Primers eingesetzt, die 2x10⁴ Zerfälle pro Sekunde entsprach.

Um kleine Abweichungen beim Pipettieren der Proben, die zu stark unterschiedlichen Signalen auf dem Röntgenfilm geführt hätten, zu vermeiden, wurden alle Ansätze für 10 Proben oder mehr angesetzt. Im Ansatz für 1 Probe wurde Primer entsprechend einer Menge von 2x10⁴ Zerfälle/s und 30 μg Gesamt-RNA mit H₂O auf 50 μl Gesamtvolumen aufgefüllt. Die Probe wurde mit NaAcetat/EtOH gefällt und die getrocknete Probe in 30 μl Hybridisierungspuffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.9]; 1 mM EDTA; 250 mM KCl) aufgenommen. Das Gemisch wurde für 10 min auf 80°C erwärmt und über Nacht bei 30°C stehen gelassen. Die Probe wurde erneut gefällt und anschließend eine Reverse Transkription mit der Transkriptase SuperscriptII (Life Technologies) durchgeführt. Das Pellet wurde hierfür in 4 μl 5x RT-Puffer, 2 μl 0.1 M DTT, 1 μl 10 mM dNTPs, 0.5 μl RNAsin und 11.5 μl H₂O gelöst und für 2 Minuten bei 37 °C inkubiert. Jetzt wurde 1 μl Reverse Transkriptase zugegeben und die Probe für 10 Minuten bei 37 °C, 50 Minuten bei 42 °C und 5 Minuten bei 95 °C inkubiert. Das fertige Produkt wurde mit 40 ng RNAaseA behandelt und die Behandlung mit 1 μl EDTA (0.5 M, [ph 8.0]) gestoppt. Die Probe wurde wieder mit NaAcetat/EtOH gefällt und in 4 μl 10 mM Tris-HCl [pH 8.0] aufgenommen.

Der Primer für die Sequenzierung wurde entsprechend dem "Nick Translation" Protokoll mit ATP [γ-³²P] (10 mCi/ml) und Polynukleotid Kinase am 5´-Ende markiert (s. Kapitel 2.2.4) und gemäss dem Protokoll der SequiTherm EXEL II Sequenzierung (s. Kapitel 2.2.8.2) eingesetzt.

Durchführung siehe Sequenzierung

Tabelle 13: PCR-Programm zur Durchführung der radioaktiven Sequenzierung

Das Produkt der Primer Extension Reaktion wurde neben dem Produkt der Sequenzierung auf einem 8%igen Polyacrylamidgel (7 M Harnstoff) aufgetragen und bei 250V aufgetrennt. Als Laufpuffer wurde 1 x TBE verwendet. Die Proben wurden vor dem Auftragen für 2 Minuten auf 72 °C erwärmt und jeweils 2 μl Loading-Buffer zugegeben. Die Spannungsquelle wurde abgeschaltet, wenn die Bromphenol-Bande ca. 2 cm über dem Gelende stand. Das Gel wurde anschließend auf Whatmanpapier überführt, für zwei Stunden bei 70 °C vakuumgetrocknet, in Frischhaltefolie eingeschlagen und über Nacht zusammen mit einem Röntgenfilm bei –70°C in eine Filmkassette gelegt. Der entwickelte Film wurde von Hand ausgewertet.

2.2.10.1  allgemeine Bakterienkultur

Bakterienkulturen auf festem Medium: Agar-Agar enthaltenes LB-Medium wurde aufgekocht und auf 50 °C abgekühlt. Jetzt wurde das gewünschte Antibiotikum zugegeben (Ampicillin, Kanamycin; jeweils mit einer Endkonzentration von 50 μg/ml) und das Medium in 10 cm Petrischalen gegossen. Auf dem ausgehärteten Medium wurde die Bakterienkultur ausgestrichen und für 14 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die gewachsenen Kolonien wurden bis zu zwei Wochen bei 4 C aufbewahrt.

Bakterienkulturen in Flüssigmedium: LB-Medium wurde mit Ampicillin versetzt (Endkonzentration: 50 μg/ml) und je 2 ml auf 14 ml Zentrifugenröhrchen aufgeteilt. In dieses Medium wurde mit Hilfe einer sterilen Pipettenspitze eine, von einer Agarplatte abgenommene Bakterienkolonie oder eine bei –80°C in Gefriermedium eingefrorene Bakterienkultur eingebracht und für 14 Stunden bei 37 °C und einer Schüttelfrequenz von 220 Umdrehungen in der Minute inkubiert.

Phagen (Vektor pPAC4): Zur Kultivierung der Phagen-Klone wurde das Medium 2×YT benutzt und mit Kanamycin versetzt (Endkonzentration: 50 μg/ml). Je 200 ml des Mediums wurden aus einem, bei – 80°C in Gefriermedium aufbewahrten, Phagenlysat angeimpft und für 14 Stunden bei 37 °C und einer Schüttelfrequenz von 220 Umdrehungen in der Minute inkubiert.

E.coli XL-2 Blue Ultracompetente Zellen oder E.coli Sure-2 Zellen (Stratagene) wurden auf Eis aufgetaut und pro Ansatz 100 μl in ein Mikrozentrifugierröhrchen aliquotiert. Nach Zugabe von 2 μl ß-Mercaptoethanol wurden die Bakterien für 10 Minuten auf Eis inkubiert. 10–20 ng der zu transformierenden DNA wurden zugegeben und 30 Minuten auf Eis stehen gelassen. Anschließend wurden die Zellen in einem Wasserbad einem 42°C warmen und 30 Sekunden langen Hitzeimpuls ausgesetzt. Nachdem die Zellen für 2 Minuten auf Eis abgekühlt waren, wurden 900 μl 37 °C warmes NYZ⁺ Medium zugegeben und die Zellen für eine Stunde bei 37°C und einer Schüttelfrequenz von 220 Umdrehungen in der Minute inkubiert. 100 μl dieser Bakterienkultur wurden auf die, mit dem entsprechenden Antibiotikum versetzten, Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

2.2.11.1  allgemeine Zellkultur

Soweit nicht anders beschrieben, wurde für die Zellkultur DMEM Medium mit 10% fötalem Kälber-Serum, 1 % Glutamin (Ultraglutamin, Bio Whittaker Europe) und 1000 μg Streptomycin/Penicillin je ml Medium) verwendet. Gegebenenfalls wurde ein entsprechendes Antibiotikum als Selektionsmittel zugegeben. Die Zellen wurden bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Zum Passagieren der Zellen wurden die Zellen mit Trypsin abgelöst und 1:10 verdünnt. Für die KA-1 Zelllinie wurde ein Östrogen-freies Kälber-Serum verwendet.

1x10⁵ Zellen wurden pro well (2 cm Durchmesser) in 6-well Platten ausgesät und 24 Stunden bei 37 C im Brutschrank inkubiert. Die Transfektion erfolgte gemäss den Angaben des Herstellers (Fugene, Boehringer Mannheim). Zu 97 μl serumfreien DMEM Medium wurden 3 μl Fugene gegeben, anschließend wurden 1–2 μg DNA zugegeben und das Gemisch für 15 Minuten bei sterilen Bedingungen und Raumtemperatur inkubiert, bevor es dann auf die Zellen verteilt wurde. Die Zellen wurden für 24 Stunden im Brutschrank ruhen gelassen. Anschließend wurde das Medium abgesaugt und die Zellen in dem für sie notwendigen Medium weiter inkubiert und entsprechend der durchgeführten Experimente weiterverwendet.

2.2.12.1  Great EscAPe^TM SEAP Reporter Assay System (Clontech)

1x10⁵ Zellen wurden in Sechs-well Platten (Durchmesser 2 cm) ausplattiert und nach 24 Stunden mit den entsprechenden Reporterplasmiden transfiziert (siehe Kapitel 2.2.11.2). Weitere 48 Stunden später wurden die Zellen mit dem Great EscAPe^TM SEAP Reporter Assay aufgearbeitet. Dazu wurden 110 μl vom Zellmedium in ein Mikrozentrifugationsröhrchen überführt und zum Abtrennen von möglicherweise mitüberführten, abgelösten Zellen für 10 Sekunden bei 12.000 x g abzentrifugiert. 100 μl vom Überstand wurden in ein neues Mikrozentrifugationsröhrchen überführt. Die Proben wurden bis zum Messen der Lumineszens bei –20°C eingefroren.

Zu je 25μl Probe wurden 75μl 1x Dilution-Puffer gegeben und vorsichtig gemischt. Die Proben wurden für 30 Minuten bei 65°C in einem Heizofen inkubiert, auf Eis für 2 Minuten abgekühlt, anschließend ließ man die Proben sich langsam bis auf Raumtemperatur erwärmen. 100 μl Assay Puffer wurden zugegeben und die Probe für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Abschließend wurden 100 μl 1.25 mmol CSPD Chemilumineszens-Substrat zugegeben und die Probe für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach konnte die Lumineszenz in einem Luminometer bestimmt werden.

1x 10⁵ Zellen wurden in Sechs-well Platten (Durchmesser 2 cm) ausplattiert und nach 24 Stunden mit den entsprechenden Reporterplasmiden transfiziert. Als interne Transfektionskontrolle wurde ein Renilla-Luciferase Plasmid ko-transfiziert. Innerhalb jedes Experiments wurde neben den zu untersuchenden Reporterkonstrukten auch der Leervektor transfiziert. Weitere 24 Stunden später wurden die Zellen mit dem Dualen Luciferase Reporter Assay System Kit (Promega) aufgearbeitet. Nach dem Absaugen des Mediums wurden die auf Eis stehenden Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend 500 μl PLB Puffer zugegeben. Die Zellen wurden mit einem Zellschaber abgelöst und in Mikrozentrifugationsröhrchen überführt. Die Zellmembranen wurden in drei Gefrier-Tauzyklen aufgebrochen, die festen Bestandteile mittels Zentrifugation abgetrennt (30s, 10000xg). 20 μl des Zelllysates wurden in Luminometer-Röhrchen gegeben und die Lumineszens wie folgt gemessen:

• Zugabe von 25 μl LAR II
• 10 Sekunden Messzeit der Lumineszens der Firefly-Luciferase
• 2 Sekunden Wartezeit
• Zugabe von 25 μl Stop and Glow
• 10 Sekunden Messzeit der Lumineszens der Renilla-Luciferase

Die Berechnung der Werte erfolgte mit der Software Excel. Der Wert aus jeder einzelnen Transfektion ergab sich aus dem Quotienten Firefly-Luciferase (Aktivität des Konstrukts) durch Renilla-Luciferase (Transfektionskontrolle). Jede Transfektion wurde innerhalb eines Experiments sechsmal durchgeführt. Der Mittelwert von sechs Messungen wurde durch den Mittelwert der korrespondierenden Leervektor-Messungen dividiert. So erhielt man den Wert für die Aktivität des zu messenden Konstrukts relativ zum Wert des Leervektors. Die Fehlerfortpflanzung wurde dabei berücksichtigt. Wurden Promoter-Konstrukte mit Chemikalien behandelt oder eine Ko-transfektion durchgeführt, so wurden auch die Transfektionen des Leervektor-Plasmids entsprechend behandelt bzw. ebenfalls ko-transfiziert. Der Wert des Plasmids A-3, das die gesamte Promotersequenz enthält, wurde anschließend als 100% gesetzt und die weiteren Werte relativ dazu angegeben.

70%-konfluent gewachsene Zellen wurden auf Eis dreimal mit kaltem PBS gewaschen, in kaltem PBS mit einem Gummischaber abgekratzt und bei 3000 x g 10 Minuten abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 2ml 1% NP-40 enthaltenen Puffer A (10 mM HEPES [pH 7.8], 15 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 0.1 mM EDTA [pH 8.0]) resuspendiert und 5 Minuten auf Eis stehen gelassen. Der Überstand wurde abzentrifugiert und das Pellet mit 2 ml 1% NP-40 enthaltenen Puffer A gewaschen. Das Pellet wurde in 100 μl Puffer C (25 mM HEPES [pH 7.6], 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA [ph 8.0], 10 % Glycerin) aufgenommen und die Salzkonzentration bezogen auf das Gesamtvolumen auf 0.4 M NaCl eingestellt. Nach 60 Minuten auf Eis wurde das Pellet bei 12000 x g abzentrifugiert und der Proteinextrakt in 20 μl Aliquots bei – 80 °C eingefroren.

Je 5 μg komplimentärer, einzelsträngiger Oligonukleotide (MWG-Biotech) wurden in 40 μl Annealing-Puffer (50 mM Tris-Cl [pH 8.0], 70 mM NaCl) für 10 Minuten auf 90 °C erhitzt und bei Raumtemperatur langsam abgekühlt. 200 ng des doppelsträngigen Oligonukleotids wurden mit einer Polynukleotidkinase (New England Biolabs) nach Angaben des Herstellers am 5`-Ende mit ATP [γ-³²P] (10 mCi/ml) markiert. 1 μl des markierten Oligonukleotids (20000 Zerfälle pro s je μl) wurde mit 10 μg Kernextrakt, 2 μg poly[dI-dC] (1 μg/μl) und 2 μg BSA in 20 μl 2xUB-Puffer, sowie je nach Experiment, mit 1 μl Antikörper oder einem 100fachen bzw. 1000fachen Überschuss an nicht markiertem Oligonukleotid für 30 Minuten bei Raumtemperatur (45 Minuten bei 4°C für Experimente mit Antikörper) inkubiert. Die Proben wurden auf einem 4-prozentigem SDS-freiem Acrylamidgel bei 200 V für 2 Stunden aufgetrennt. Das Gel wurde anschließend bei 70°C unter Vakuum für 2 Stunden getrocknet, in Plastikfolie eingeschweißt und über Nacht bei –70°C auf einen Röntgenfilm exponiert.