3 Ergebnisse

3.1  Aufbau des humanen H-REV107-1 Gens

Die mRNA des humanen H-REV107-1 Gens ist 1059 bp groß und setzt sich aus vier Exons zusammen. Das Gen befindet sich auf Chromosom 11q12.3 und erstreckt sich über einen Bereich von 39700 Basen.

	Abbildung 3: Aufbau des humanen H-REV107-1 Gens. Die vier Exons sind über eine Länge von 39700 Basenpaaren auf Chromosom 11q12.3 lokalisiert. ATG bezeichnet den Translationsstartpunkt. Die Analyse wurde mit Hilfe der Datenbank „high throughput genome sequencing“ von NCBI durchgeführt. URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

3.2.1  Die H-REV107-1 Genexpression in unbehandelten Zelllinien

Das H REV107 1 Gen wird in normalen Geweben der Ratte und des Menschen ubiquitär exprimiert (Sers et al., 1997; Husmann et al, 1998). Immunhistochemische Analysen humaner Proben aus Tumoren und Normalgeweben, sowie mit Hilfe eines Cancer Profiling Arrays (BDClontech^TM)^.durchgeführte Expressionsanalysen der H REV107 1 mRNA zeigen eine Suppression der Protein- und der mRNA-Expression in Tumoren aus Mamma, Lunge, Ovar und Niere.

Für die spätere Untersuchung der H REV107 1 Regulation werden zunächst verschiedene Säuger-Zelllinien auf ihre H REV107 1 Expression hin untersucht und möglicherweise an der Suppression beteiligte Signalwege analysiert.

Zunächst wird ein Ratten Ovarialkarzinom Modell, bestehend aus ROSE199, einer spontan immortalisierten Ratten Ovarialepithelzelllinie (Adams und Auersperg, 1985) und ROSE199A2/5, ein KRAS-transformiertes Derivat dieser Zelllinie, verwendet (Tchernitsa et al., 2004).

H rev107 1 wird in der immortalisierten Zelllinie ROSE199 deutlich exprimiert, nicht jedoch in der KRAS-transformierten Zelllinie A2/5 (Abb. 4).

	Abbildung 4: a) Northern Blot Analyse der H rev107 1 mRNA Expression in der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 und der KRAS-transformierten Ratten Ovarialkarzinomzelllinie ROSE199A2/5. Der Pfeil zeigt die H rev107 1 spezifische mRNA. b) Photo des mit Ethidiumbromid gefärbten Gels als Ladekontrolle.

Diese Untersuchungen wurden auch in einer humanen Ovarialepithelzelllinie und verschiedenen Ovarialkarzinomzelllinien durchgeführt. HOSE ist eine immortalisierte, humane Ovarialepithelzelllinie (Tsao et al., 1995), OVCAR-3, SKOV-3 und A27/80 sind Ovarialkarzinomzelllinien.

Abbildung 5 a) zeigt die H REV107 1 mRNA Expression in diesen Zelllinien. Die Zelllinien OVCAR-3 und A27/80 exprimieren H REV107 1 nur sehr schwach, in den Zelllinien SKOV-3 und HOSE wird H REV107-1 stark exprimiert (geschlossener Pfeil). Der offene Pfeil oberhalb der H REV107 1 Bande zeigt die schwache Expression eines nicht näher identifizierten Gens. Diese mRNA ist etwa 6.5 kb groß. Die H REV107 1-spezifische Sonde scheint an dieses Gen zu binden, obwohl sie laut Abgleich mit der NCBI-Datenbank „non-redundant genes“ spezifisch für das H REV107 1 Gen sein sollte. Dieses Signal wurde auch schon früher beobachtet und ist in der Literatur beschrieben (Husmann et al., 1998). Möglicherweise handelt es sich um ein Splice-Produkt des H REV107 1 Gens.

Bei einer Wiederholung des Versuchs (Abb. 5b) wird neben den bereits genannten Zelllinien auch die Teratokarzinomzelllinie PA-1 (Zeuthen et al., 1980) untersucht. Für die Zelllinien HOSE, SKOV-3, A27/80 und OVCAR-3 wurden die bereits bekannten Ergebnisse bestätigt. Die Teratokarzinomzelllinie PA-1 zeigt eine mittelstarke H REV107 1 Genexpression.

	Abbildung 5: a) Northern Blot Analyse der H REV107 1 mRNA Expression in der immortalisierten Ovarialepithelzelllinie HOSE und den Ovarialkarzinomzelllinien SKOV-3, OVCAR-3 und A27/80. Der geschlossene Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische Bande. Der offene Pfeil zeigt die Bande des nicht näher spezifizierten Gens. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande. b) Northern Blot Analyse der H REV107 1 mRNA Expression in der immortalisierten Ovarialepithelzelllinie HOSE, den Ovarialkarzinomzelllinien SKOV-3, OVCAR-3 und A27/80 sowie der Teratokarzinomzelllinie PA-1. Der obere Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische Bande. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.

Diese Ergebnisse zeigen, dass H REV107 1 nicht in allen humanen Zelllinien gleich stark exprimiert wird. Ein Grund für die H REV107 1 Suppression kann ein aktivierter RAS-Signalweg sein, da im Unterschied zur Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199, die KRAS transfizierte Ratten Ovarialkarzinomzelllinie ROSE199 A2/5 kein H REV107 1 exprimiert. Ob auch in den humanen Zelllinien ein aktivierter RAS-Signalweg für die Suppression der H REV107 1 Expression verantwortlich ist, wird mit Inhibitoren der RAS-Signalwege getestet.

In der HRAS transformierten Ratten Fibroblastenzelllinie FE8 (Sers et al., 1997; Hajnal et al., 1994) wird H rev107 1, ebenso wie in der KRAS-transformierten Ratten Epithelzelllinie ROSE199 A2/5, nicht mehr exprimiert. Um einen Zusammenhang zwischen der H-rev107-1 Expression und aktivierten RAS-Signalwegen zu ermitteln, werden der PI3K-Signalweg mit dem spezifischen Inhibitor LY294002 und der MEK/ERK-Signalweg mit dem spezifischen Inhibitor PD98059 gehemmt (Vlahos et al., 1994; Waters et al., 1995). Die aus den so behandelten Zellen isolierte RNA wird in einem Northern Blot Hybridisierungsassay untersucht. Hierfür werden zuerst die bereits zu Beginn des Kapitels beschriebenen Ratten Zelllinien ROSE199 und ROSE199A2/5 benutzt. Da H rev107 1 in ROSE199 exprimiert ist, wird diese Zelllinie als unbehandelte Vergleichszelllinie mit untersucht.

Das Ergebnis in Abbildung 6 a) zeigt, dass eine 48-stündige Behandlung der Zelllinie ROSE199A2/5 mit dem spezifischen Inhibitor von MEK1 PD98059 bei einer Konzentration von 50 μg/ml zu einer Aufregulation der H rev107 1 Genexpression führt. Das spezifische Signal ist scheinbar nicht so stark wie das H rev107 1-spezifische Signal in der Zelllinie ROSE199, allerdings zeigt die Kontrollhybridisierung, dass keine gleichmäßige RNA Beladung vorliegt. Die Behandlung der Zelllinie mit 10 μg/ml LY294002 zeigt keine Änderung der H rev107 1 Genexpression.

Abbildung 6 b) zeigt die Abhängigkeit der H REV107 1 Genexpression von der Aktivität des MEK-Signalwegs in der humanen Teratokarzinomzelllinie PA-1. Die unbehandelte Zelllinie exprimiert H REV107 1 in einem mittelstarken Maße. Durch Inhibierung des MEK-Signalwegs wird die H REV107 1 Genexpression verstärkt, hingegen hat die Hemmung des PI3K-Signalwegs durch LY294002 zeigt keinen Einfluss auf die Stärke der H REV107 1 Genexpression. In den Zelllinien OVCAR-3 und A27/80 zeigt die Behandlung mit PD98059 bzw. LY294002 keinen Einfluss auf die H REV107 1 Genexpression.

Diese Experimente belegen, dass in der KRAS-transformierten Ratten Zelllinie ROSE199A2/5 die Hemmung der H REV107 1 Genexpression auf das aktivierte RAS-Protein zurückzuführen ist. Der verantwortliche Signalweg verläuft über die Kinase MEK. Der selbe Mechanismus ist auch für die teilweise Hemmung der H REV107 1 Expression in der Teratokarzinomzelllinie PA-1 verantwortlich, da diese ein mutiertes NRAS Gen enthält, das für ein aktiviertes NRAS Protein kodiert. In anderen Zelllinien muss es aber weitere Mechanismen der H REV107 1 Suppression geben, da in diesen die Hemmung der RAS-Signalwege keinen Einfluss auf die H REV107 1 Genexpression hat. Ein möglicher Mechanismus der Hemmung der Genexpression ist die Hypermethylierung des Promoters.

	Abbildung 6: a) Northern Blot Analyse der H rev107 1 mRNA Expression in der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 und der KRAS-transformierten Ratten Ovarialkarzinomzelllinie ROSE199A2/5. ROSE199A2/5 wird 48 h mit dem MEK1 Inhibitor PD98059 (50 μg/ml), und 48 h mit dem PI3K Inhibitor LY294002 (10 μg/ml) behandelt. Der obere Pfeil zeigt die H rev107 1-spezifische Bande. Der untere Pfeil zeigt, zur Kontrolle der RNA-Beladung, die 28S-spezifische Bande. b) Northern Blot Analyse der H REV107 1 mRNA Expression in der humanen Teratokarzinomzelllinie PA-1. Die Zelllinie wird 48 h mit dem MEK1 Inhibitor PD98059 (50 μg/ml) und 48 h mit dem PI3K Inhibitor LY294002 (10 μg/ml) behandelt. Der obere Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische Bande. Der untere Pfeil zeigt, zur Kontrolle der RNA-Beladung, die 28S-spezifische Bande.

Durch die Methylierung von CpG-Inseln kann die Expression eines Gens unterdrückt werden. Diese Methylierung lässt sich durch Behandlung der Zelllinie mit dem Reagenz 5-Aza-2´-Desoxycytidin wieder aufheben.

Die Abbildung 7 zeigt, dass die Behandlung der Ovarialkarzinomzelllinien OVCAR-3, A27/80, OAW und SKOV-3 mit 5-Aza-2´-Desoxycytidin keinen Einfluss auf die H REV107 1 Genexpression hat.

In einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Jörn Walter aus Saarbrücken wird in verschiedenen Zelllinien und Gewebeproben der Einfluss des Methylierungsgrades des H REV107 1 Promoters und des ersten Introns auf die Expression untersucht. In den hier untersuchten Zelllinen muss aber ein anderer Mechanismus für die Hemmung der H REV107 1 Expression verantwortlich sein.

	Abbildung 7: Die obere Abbildung zeigt die H REV107 1 Expression in einem Northern Blot Hybridisierungsassay. Die untere Abbildung zeigt das mit Ethidiumbromid angefärbte Gel als Ladungskontrolle. Die ersten vier Spuren zeigen das Ergebnis für die Zelllinie OVCAR-3, die nächsten vier Spuren für die Zelllinie A27/80, die folgenden vier Spuren für die Zelllinie OAW und die letzten vier Spuren für die Zelllinie SKOV-3. Die RNA wird aus unbehandelten, aus nur mit IFN-γ behandelten (48 Stunden, 100 U/ml), aus nur mit 5-Aza-2´-Desoxycytidin (48 Stunden, 1 μmol) oder aus mit IFN-γ (48 Stunden, 100 U/ml) und 5-Aza-2´-Desoxycytidine (48 Stunden, 1 μmol) behandelten Zellen isoliert (siehe + / - in der Legende). Im Falle der Behandlung mit 5-Aza-2´-Desoxycytidin wird das Medium nach 24 Stunden gewechselt. Der obere Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische Bande.

3.3.1  Expression von H REV107 1 nach der Applikation von IFN-γ

Seit 1995 ist bekannt, dass in Ratten Astrocyten die H rev107 1 Expression durch IFN-γ aktiviert werden kann (Kuchinke et al., 1995). IFN-γ ist ein Zytokin, das unter anderem in der vireninduzierten Zellantwort eine Rolle spielt. Eine wichtige Eigenschaft des IFN-γ ist die Aktivierung der STAT-Signalwege und der damit verbundenen Stimulation weiterer Gene. Um zu untersuchen, in wieweit die H REV107 1 Expression auch in anderen Zelllinien durch IFN-γ aktiviert werden kann, werden verschiedene Ratten und humane Zelllinien mit IFN-γ behandelt und die H REV107 1 Genexpression in einem Northern Blot Hybridisierungsassay untersucht.

Die Behandlung der ROSE Zellen mit 500 U bzw. 1000 U/ml IFN-γ führt in ROSE199 zu einem starken, konzentrationsabhängigen Anstieg der H rev107 1 Genexpression. Bei gleicher Behandlung der ROSE199A2/5 Zellen ist kein Anstieg der H rev107 1 Genexpression feststellbar (Abb. 8).

	Abbildung 8: Northern Blot Analyse der H rev107 1 mRNA Expression in der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 und der KRAS-transformierten Ratten Ovarialkarzinomzelllinie ROSE199A2/5. Die Zellen sind unbehandelt oder wurden für 48 Stunden mit 500 U/ml oder 1000 U/ml IFN-γ behandelt . Der Pfeil zeigt die H rev107 1-spezifische mRNA. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.

IFN-γ initiiert durch Bindung an seinen Rezeptor eine spezifische Signalkaskade. Dies führt zur Trans-Phosphorylierung und Aktivierung des JAK1/JAK2-Komplexes und der nachfolgenden Phosphorylierung von STAT1. STAT1 löst sich von seinem Rezeptor und bildet STAT1-Homodimere. Diese translokalisieren in den Nukleus und induzieren die Expression von Zielgenen, die eine GAS-Bindungsstelle in ihrem Promoter besitzen (Ihle und Kerr, 1995). IRF-1 besitzt eine GAS-Bindungsstelle in seinem Promoter und wird durch IFN-γ induziert (Harada et al., 1994). IRF-1 ist selbst ein Transkriptionsfaktor, der neben seiner Rolle in der Immunantwort auch als Tumorsuppressor aktiv sein kann und das Zellwachstum inhibiert (Tanaka et al., 1996).

	Abbildung 9: Vereinfachte Darstellung des STAT-Signalwegs. Das STAT-1 Homodimer bindet im Zellkern an die GAS-Bindungsstelle eines Promoters und aktiviert die Expression des zugehörigen Gens (Ramana et al., 2002).

Eine Korrelation zwischen der H REV107 1 und der IRF 1 Expression würde einen Hinweis auf eine mögliche Abhängigkeit des H REV107 1 Gens von der IRF-1 Aktivität geben. Dazu werden Northern Blots erst mit einer H REV107 1-spezifischen und anschließend mit einer IRF 1-spezifischen Sonde hybridisiert.

In der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 wird die Irf 1 Genexpression durch Behandlung mit IFN-γ in einer dosisabhängigen Weise induziert, die mit der Induktion der H rev107 1 Genexpression korreliert (Abb. 10). In der KRAS-transformierten Zelllinie ROSE199A2/5 zeigt sich keine Änderung der Irf 1 Genexpression. Offenbar ist die Induzierbarkeit von Irf 1 in diesen Zellen gehemmt. Das gleiche Bild zeigt sich bei der Aktivierung der H rev107 1 Expression durch IFN-γ. Auch hier erfolgt keine Aufregulation der Genexpression.

	Abbildung 10: Northern Blot Analyse der H rev107 1 und der Irf-1 mRNA Expression in der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 und der KRAS-transformierten Ratten Ovarialkarzinomzelllinie ROSE199A2/5. Die Zellen sind unbehandelt oder 48 h mit 500 U oder 1000 U IFN-γ/ml behandelt. Die beiden oberen Pfeile zeigen die H rev107 1 und die Irf 1 spezifische mRNA. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der untere Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.

Eine direkte Abhängigkeit der H rev107 1 Expression von der Irf 1 Expression ist damit jedoch nicht bewiesen.

Um zu überprüfen, ob die IFN-γ abhängige Induktion der H rev107 1 Expression nicht parallel, sondern in direkter Abhängigkeit von der Irf-1 Genexpression verläuft, wird ein NIH3T3 Zellsystem benutzt, welches ein Fusionskonstrukt aus Irf-1 und dem humanen Östrogen-Rezeptor (hER) stabil exprimiert (KA-1 Zelllinie) (Kirchhoff und Hauser, 1999). Von diesem Plasmid aus wird ein inaktives Irf-1/hER Fusionsprotein translatiert, welches erst durch Zugabe von Östrogen und der damit verbundenen Konformationsänderung des Rezeptors in eine aktive Irf-1 Form übergeht. Durch gleichzeitige Zugabe von Cycloheximid, einem Proteinsyntheseinhibitor, können Zwischenschritte ausgeschlossen werden, die über eine IRF-1-induzierte Expression und anschließende Translation weiterer Gene zu einer H rev107 1 Expression führen könnten. Bei Genen, deren Expression durch Aktivierung des IRF-1 Proteins unter diesen Bedingungen induziert wird, handelt es sich also um direkte Zielgene des Transkriptionsfaktors IRF-1.

In einem Northern Blot Hybridisierungsassay (Abb. 11) wird die H rev107 1 Genexpression in der unbehandelten Zelllinie (Irf-1 inaktiv), in der mit Östrogen behandelten Zelllinie (1 μmol, 48 Stunden; Irf-1 aktiv, weitere Proteinsynthese möglich) und in der mit Östrogen und Cycloheximid behandelten Zelllinie (Östrogen 1 μmol, Cycloheximid 50 μmol, gemeinsam 48 Stunden; Irf-1 aktiv, keine Proteinsynthese möglich) verglichen.

Dieses Experiment zeigt, dass es durch die Zugabe von Östrogen und der damit verbundenen Aktivierung von Irf-1, zu einer Induktion des H rev107 1 Gens kommt. Eine weitere Proteinsynthese ist dazu nicht nötig. H-rev107-1 ist ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors Irf-1.

	Abbildung 11: Northern Blot Analyse der H rev107 1 mRNA Expression in der Zelllinie KA-1. Die Zellen sind unbehandelt bzw. für 48 Stunden mit Östrogen (1 μmol) oder mit Östrogen (1μmol) und Cycloheximid (50 μmol) behandelt. Der Pfeil zeigt die H rev107 1-spezifische mRNA. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.

Auf Grund des funktionellen Zusammenhangs zwischen der Irf-1 Aktivierung und der H rev107 1 Expression wird jetzt in den humanen Ovarialkarzinomzelllinien die Abhängigkeit von H REV107 1 von IFN-γ und IRF-1 genauer analysiert.

Zunächst werden die zuvor auf H-REV107-1 Expression untersuchten Ovarialkarzinomzelllinien SKOV-3, OVCAR-3, A27/80, die immortalisierte Ovarialepithelzelllinie HOSE und die Teratokarzinomzellline PA-1 in einem Northern Blot Hybridisierungsassay auf die Expression von IRF 1 hin untersucht (Abb. 12).

Die Stärke der IRF 1 Genexpression korreliert, mit Ausnahme der Zelllinie PA-1, mit der Expressionsstärke des H REV107 1 Gens. HOSE und SKOV-3 zeigen eine hohe, OVCAR-3 und A27/80 eine deutlich schwächere IRF 1 Genexpression. Die Zelllinie PA-1, die nur eine mittelstarke H REV107 1 Genexpression zeigt, weist sehr wenig IRF 1 auf.

	Abbildung 12: Northern Blot Analyse von H REV107 1 und IRF 1 in der immortalisierten Ovarialepithelzelllinie HOSE, den Ovarialkarzinomzelllinien SKOV-3, OVCAR-3 und A27/80 sowie der Teratokarzinomzelllinie PA-1. Die beiden oberen Pfeile zeigen die H REV107 1- und die IRF 1-spezifische Bande. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der untere Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.

Möglicherweise ist die, im Vergleich zu HOSE, in OVCAR-3 und A27/80, sehr geringe Menge IRF 1 mRNA für die Hemmung der H REV107 1 Expression verantwortlich. In der Zelllinie PA-1 scheint die H REV107 1 Expression nicht von einer IRF 1 Expression abhängig zu sein.

Um die Abhängigkeit der H REV107 1 von der IRF 1 Expression weiter zu analysieren, wird jetzt die IFN-γ vermittelte Induktion der Genexpression untersucht. Dazu wird die in der Ratten Zelllinien gemachte Beobachtung, dass die H rev107 1 Genexpression durch IFN-γ induzierbar ist und diese Expression mit der Irf 1 Genexpression korreliert, auch in humanen Ovarialkarzinomzelllinien und in einer Nierenkarzinomzelllinie überprüft. Auch hier werden die zuvor mit einer H REV107 1-spezifischen Sonde hybridisierten Northern Blots erst von der H-REV107-1 Sonde gereinigt und anschließend mit einer IRF 1-spezifischen Sonde hybridisiert.

Das Ergebnis wird in der Abbildung 13a gezeigt. Durch Behandlung mit IFN-γ ist in der Zelllinie OVCAR-3 die H REV107 1 Expression deutlich induzierbar, während in der Zelllinie A27/80 die H REV107 1 Expression nur schwach induzierbar ist. Sowohl die Induzierbarkeit als auch die relative Menge der IRF 1 Genexpression korreliert deutlich mit der H REV107 1 Expression. Eine Wiederholung des Experiments zeigt das selbe Ergebnis.

Als weitere Zelllinie wird die Ovarialkarzinomzelllinie SKOV-3 getestet. Wie in Abbildung 13b zu sehen ist, exprimiert bereits die unbehandelte Zelllinie gut nachweisbare Mengen der H REV107 1 mRNA. Bei der Behandlung der Zelllinie mit 500 U/ml IFN-γ ist die Zunahme der H REV107 1 mRNA, sowie die damit korrelierende Induzierbarkeit der IRF 1 Expression, deutlich zu sehen. Auf dem Northern Blot der Ladungskontrolle wird deutlich, dass in der Spur SKOV-3 + IFN-γ (1000 U/ml) sehr viel weniger mRNA aufgetragen worden ist. Eine Extrapolation der Mengen lässt den Schluss zu, dass auch bei Zugabe von 1000 U/ml IFN-γ von einer Korrelation zwischen der Zunahme der H REV107 1 und IRF 1 Genexpression ausgegangen werden kann.

Die unbehandelten, humanen Nierenkarzinomzelllinien RCC26 endo und RCC26 exo zeigen eine schwache H REV107 1 und IRF 1 Expression. Bei der Zelllinie RCC26 exo handelt es sich um ein Derivat der Zelllinie RCC 26 endo, erzeugt durch die stabile Transfektion eines INF-γ-Expressionsplasmids (Jung et al., 1998). Durch eine 48stündige Behandlung der Zelllinien mit 500 U bzw. 1000 U/ml IFN-γ wird sowohl die H REV107 1 als auch die IRF 1 Genexpression deutlich induziert (Abb. 13c).

Die bisherigen Untersuchungen zeigen eine Korrelation zwischen der Expression der H REV107 1 und der IRF 1 mRNA. Dies gilt aber nur für den Zeitpunkt 48 Stunden nach Behandlung der jeweiligen Zelllinie mit IFN-γ. Als nächstes soll die zeitabhängige Korrelation der mRNA Mengen über einen längeren Zeitraum untersucht werden.

	Abbildung 13: a) Northern Blot Analyse der H REV107 1 und IRF 1 mRNA Expression in den Ovarialkarzinomzelllinien OVCAR-3 und A27/80. Die Zellen sind unbehandelt bzw. 48h mit 500 U oder 1000 U IFN-γ/ml behandelt. Die beiden oberen Pfeile zeigen die H REV107 1- und die IRF 1-spezifische mRNA. Der untere Pfeil zeigt, zur Kontrolle der RNA-Beladung, die 28S-spezifische Bande. b) Northern Blot Analyse der H REV107 1 und IRF 1 mRNA Expression in der Ovarialkarzinomzelllinie SKOV-3 . Die Zellen sind unbehandelt bzw. 48h mit 500 U oder 1000 U IFN-γ/ml behandelt. Die beiden oberen Pfeile zeigen die H REV107 1- und die IRF 1-spezifische mRNA. Der untere Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande. c) Northern Blot Analyse der H REV107 1 und IRF 1 mRNA Expression in den Nierenkarzinomzelllinien RCC26 endo und RCC26 exo. Die Zellen sind unbehandelt bzw. 48h mit 500 U oder 1000 U IFN-γ pro ml Kulturmedium behandelt. Die beiden oberen Pfeile zeigen die H REV107 1- und die IRF 1-spezifische mRNA. Der untere Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.

Für die Analyse der zeitlichen Abhängigkeit der H-REV107-1 Expressionen nach Induktion des IFN-γ Signalwegs werden die humanen Ovarialkarzinomzelllinien A27/80 und OVCAR-3 mit 100 bzw. 1000 U/ml IFN-γ behandelt. Nach Behandlung mit 100 U/ml IFN-γ wird zu den Zeitpunkten 3, 6, 9, 12 und 24 Stunden die mRNA aus den behandelten Zellen isoliert. Nach der Behandlung mit 1000 U/ml IFN-γ wird die mRNA der behandelten Zellen zu den Zeitpunkten 3, 6, 9 ,12, 24, 48, 72 und 96 Stunden isoliert.

Im Fall der Zelllinie A27/80 erfolgt nach Applikation von 100 U/ml IFN-γ nach sechs Stunden eine schwache Aufregulation der H REV107 1 Genexpression (Abb. 14). Diese bleibt bis zum Zeitpunkt "12 Stunden" erhalten und lässt dann wieder nach. Die Aufregulation der IRF 1 Genexpression ist bereits nach drei Stunden sichtbar, allerdings ist die Menge noch sehr gering. Nach sechs Stunden sieht man eine deutliche Aufregulation der IRF 1 mRNA. Diese bleibt bis zum Zeitpunkt "12 Stunden" erhalten. Während man nach 24 Stunden noch eine geringe Menge der H REV107 1 mRNA sehen kann, ist die mRNA des Gens IRF 1 nicht mehr erkennbar.

Die Induktion der IRF 1 Genexpression korreliert mit der Induktion der H REV107 1 Genexpression. Dabei zeigt die IRF 1 mRNA einen geringfügigen, zeitlichen Vorlauf zur H REV107 1 Expression.

Bei Behandlung der Zelllinie A27/80 mit 1000 U/ml IFN-γ sieht man nach drei Stunden eine Aufregulation der H REV107 1 und IRF 1 Genexpression. Diese erreicht ihr erstes, relativ schwaches Maximum zum Zeitpunkt "9 Stunden". Zum Zeitpunkt "12 Stunden" ist die H REV107 1 mRNA nicht mehr sichtbar, parallel dazu hat die Menge der IRF 1 mRNA ebenfalls abgenommen. Nach 24 Stunden der Induktion erfolgt eine erneute, sehr starke Aufregulation der Expression der beiden Gene. Hier liegt ein, im Vergleich zum ersten, viel stärkeres, zweites Maximum. Zum Zeitpunkt "48 Stunden" hat die Expressionsstärke der Gene wieder stark nachgelassen. Diese Entwicklung setzt sich fort, so dass zum Zeitpunkt "72 Stunden" H REV107 1 und zum Zeitpunkt "96 Stunden" beide Gene nicht mehr detektierbar sind. Bei der Behandlung der Zelllinie A27/80 mit 1000 U/ml IFN-γ besteht ebenfalls eine deutliche Korrelation zwischen der Expression der Gene H REV107 1 und IRF 1, wobei die Induktion beider Gene ein wellenförmiges Verhalten zeigt.

	Abbildung 14: Northern Blot Analyse der H REV107 1 und IRF 1 mRNA Expression zu verschiedenen Zeitpunkten in der humanen Ovarialkarzinomzelllinie A27/80. Die Zellen sind über einen Zeitraum von 24 Stunden (100 U/ml) bzw. 96 Stunden (1000 U/ml) mit 100 U/ml oder 1000 U/ml IFN-γ pro ml Kulturmedium behandelt. Der obere Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische, der mittlere Pfeil die IRF 1-spezifische und der untere Pfeil die 28S-spezifische mRNA.

In der Zelllinie OVCAR-3 beginnt bei der Behandlung mit 100 U/ml IFN-γ nach drei Stunden die Aufregulation der H REV107 1 und IRF 1 Genexpression (Abb. 15) und erreicht zum Zeitpunkt "12 Stunden" ein deutliches Maximum. Zum Zeitpunkt "24 Stunden" hat die Expression der beiden Gene wieder stark nachgelassen und befindet sich auch unter dem Expressionsniveau des Zeitpunkts "3 Stunden". Die Expression der Gene verläuft parallel. Die Induktion der H REV107 1 und IRF 1 Genexpression setzt gleichzeitig ein. Im Vergleich zu der Zelllinie A27/80 erreicht die Expression der H REV107 1 und der IRF 1 mRNA ein höheres Niveau und hält länger an.

Nach Behandlung mit 1000 U/ml IFN-γ, sieht man bei den Zelllinien OVCAR-3 und A27/80 einen deutlichen Unterschied im Verlauf der IRF 1 Expression. Die H REV107 1 Genexpression ist, wie im Fall der Induktion mit 100 U/ml IFN-γ, bereits nach drei Stunden sichtbar und nimmt langsam weiter zu, bis sie zum Zeitpunkt "9 Stunden" ein Maximum erreicht. Danach sinkt die mRNA Menge wieder unter das Niveau des Zeitpunkts "3 Stunden". Zum Zeitpunkt "48 Stunden" erreicht sie ein zweites, aber schwächeres Maximum. Anschließend nimmt die Menge der mRNA wieder ab, bis sie sich zum Zeitpunkt "96 Stunden" wieder auf dem Niveau der unbehandelten Zelllinie befindet. Die Induktion der IRF 1 mRNA verhält sich so, dass bereits nach drei Stunden ein starkes Maximum erreicht ist, von dem aus die mRNA Menge kontinuierlich abnimmt. Zum letzten gemessenen Zeitpunkt "96 Stunden" ist die Menge der induzierten IRF 1 mRNA nur noch sehr gering, im Vergleich zur unbehandelten Zelllinie aber deutlich sichtbar.

Der Verlauf der Expression beider Gene korreliert bei der Behandlung mit 1000 U/ml IFN-γ nicht so deutlich wie bei den anderen gemessenen Zeitkurven. Zwar zeigen beide Gene bereits nach drei Stunden eine Aufregulation ihrer Genexpression, doch fällt sie bei IRF 1 im Vergleich zur Induktion mit 100 U/ml IFN-γ sehr stark aus. Während die H-REV107-1 Expression zum Zeitpunkt "9 Stunden" ein Maximum hat, fällt die Menge der IRF 1 mRNA bereits nach drei Stunden wieder kontinuierlich ab. Dagegen zeigt die Induktion der H REV107 1 mRNA zum Zeitpunkt "48 Stunden" noch ein zweites, schwächeres Maximum, um dann bis zum Zeitpunkt "96 Stunden" auf das Niveau der Genexpression der unbehandelten OVCAR-3 Zelllinie abzusinken. In der Zelllinie OVCAR-3 sieht man im Fall der Applikation von 1000 U/ml IFN-γ keine Korrelation im Verlauf der H REV107 1 und der IRF 1 Expression. Die Zelllinie verhält sich in diesem Fall deutlich anders als die Zelllinie A27/80.

	Abbildung 15: Northern Blot Analyse der H REV107 1 und IRF 1 mRNA Expression zu verschiedenen Zeitpunkten in der humanen Ovarialkarzinomzelllinie OVCAR-3. Die Zellen sind über einen Zeitraum von 24 Stunden (100 U) bzw. 96 Stunden (1000 U) mit 100 U oder 1000 U IFN-γ pro ml Kulturmedium behandelt worden. Der obere Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische, der mittlere Pfeil die IRF 1-spezifische und der untere Pfeil die 28S-spezifische mRNA.

Die Frage nach der Korrelation der H REV107 1 Expression von der IRF 1 Genexpression, lässt sich mit einem klaren Ja beantworten.

1. Bei den Zelllinien HOSE und SKOV-3 ist dies bereits im unbehandelten Zustand deutlich zu sehen. Hier werden sowohl H REV107 1 als auch IRF 1 auf hohem Niveau exprimiert. In den Zelllinien OVCAR-3, A27/80, RCC26 und SKOV-3 korrelieren die IFN-γ induzierte H REV107 1 und IRF 1 Expression. In A27/80 und OVCAR-3 zeigt die zeitabhängige Induktion der H REV107 1 und der IRF 1 Expression abhängig von der IFN-γ Dosis einen parallelen Verlauf.
2. Die Überexpression des hER/IRF-1 Expressionsplasmids in der Zelllinie KA-1 führt zu einer direkten Expression des H REV107 1 Gens.

Dies zeigt, dass H REV107 1 mit hoher Wahrscheinlichkeit ein Zielgen von IRF-1 ist. Nur für die Zelllinie PA-1 konnte keine Korrelation zwischen der Expression der beiden Gene gezeigt werden. Möglicherweise verhindert hier die RAS-abhängige Hemmung der H REV107 1 Expression eine Aktivierung der Expression durch IFN-γ bzw. über IRF-1.

Die IFN-vermittelte Signaltransduktion kann durch das RAS Onkoprotein auf verschiedenen Ebenen gestört werden. Onkogenes KRAS reicht aus, um die Genexpression von STAT-1 und STAT-2 zu inhibieren. Des weiteren zeigen IFN-γ induzierbare Gene in einer Zelllinie mit endogen mutiertem KRAS, im Vergleich zu einer Zelllinie ohne KRAS Mutation, eine stark verminderte Expression. Eine Inaktivierung des onkogenen KRAS führt zu einer verstärkten Expression der IFN-γ induzierbaren Gene, die dem Expressionsniveau der Zelllinie ohne KRAS Mutation entspricht (Klampfer et al., 2003). Das geschieht möglicherweise auf Grund einer Wechselwirkung zwischen dem MEK/ERK-Signalweg und IRF-1. In der Literatur sind Beispiele beschrieben, die zeigen, dass IRF-1 hemmend auf den MEK/ERK-Signalweg wirken kann Während aktiviertes IRF-1 die Hemmung des Zellwachstums in NIH3T3 Zellen bewirkt, führt die gleichzeitige Aktivierung von IRF-1 und dem MEK/ERK-Signalweg zur Apoptose der NIH3T3 Zellen (Kirchhoff und Hauser, 1999). Die Aktivierung des hER/IRF-1 Fusionproteins in NIH3T3 Zellen, die mit verschiedenen Onkogenen (z.B. c myc) transformiert waren, führt zu einer Reversion des malignen Phänotyps. In Nacktmäusen führt die Aktivierung von IRF-1 zu einer Suppression der transformierten Zellen (Kroger et al., 2003).

IRF-1 ist ein Zielgen des STAT1-Signalwegs und vermittelt einen Teil der IFN-γ Antwort, indem es als Transkriptionsfaktor weitere Zielgene aktiviert. H REV107 1 ist ein Zielgen von IRF-1 und lässt sich ebenfalls durch IFN-γ induzieren. Außerdem wird die H REV107 1 Genexpression durch aktiviertes RAS unterdrückt. Auf Grund der in der Literatur beschriebenen Daten, die eine Interaktion zwischen dem STAT-Signalweg und dem MEK-Signalweg nachweisen, wird eine mögliche Korrelation zwischen der Aktivität des MEK-Signalwegs und der Expression von IRF-1 überprüft.

In der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 wird die Irf 1 Genexpression durch Behandlung mit IFN-γ induziert, in der KRAS-transformierten Zelllinie ROSE199A2/5 zeigt sich hingegen keine Änderung der Irf 1 bzw. der H rev107 1 Genexpression nach Applikation von IFN-γ (Abb. 10). Die IFN-γ vermittelte Induktion von Irf 1 ist in diesen Zellen offenbar gehemmt. Allerdings kann in dieser Zelllinie die H rev107 1 Genexpression durch Inhibition des MEK-Signalwegs mit PD98059 wieder hergestellt werden. Es zeigt sich, dass ROSE199A2/5 im unbehandelten Zustand genauso viel Irf 1 wie ROSE199 exprimiert. Durch Inhibierung des MEK-Signalwegs mit PD98059 wird in der ROSE199A2/5 Zelllinie Irf 1 stärker exprimiert als in ROSE199 (Abb. 16). Auch H rev107 1 wird in beiden Zelllinien nach Behandlung mit PD98059 verstärkt exprimiert. Allerdings liegt für H rev107 1 das Expressionsniveau in der Zelllinie ROSE199 höher, wobei H rev107 1 in ROSE199 auch im unbehandelten Zustand exprimiert wird.

	Abbildung 16: Northern Blot Analyse der H rev107 1 und der Irf 1 mRNA Expression in der Ratten Ovarialepithelzelllinie ROSE199 und der KRAS-transformierten Ratten Ovarialkarzinomzelllinie ROSE199A2/5. ROSE199 und ROSE199A2/5 wird 48h mit dem MEK Inhibitor PD98059 (50 μg/ml) und 48h mit dem PI3K Inhibitor LY294002 (10 μg/ml) behandelt. Die oberen Pfeile zeigen die H rev107 1 und die Irf 1 spezifische Bande. Anschließend wird der selbe Blot zur Kontrolle der RNA-Beladung mit einer 28S Sonde hybridisiert. Der untere Pfeil zeigt die 28S-spezifische Bande.

Die Hemmung des MEK-Signalwegs führt zu einer Induktion der H rev107 1 und der Irf 1 Genexpression. Beide Zelllinien zeigen im unbehandelten Zustand eine gleichstarke Irf 1, jedoch nur ROSE199 eine H rev107 1 Expression. Auf Grund der viel stärkeren Aktivierung des MEK-Signalwegs in der KRAS-transformierten Zelllinie ROSE199A2/5, wird außerdem die H rev107 1 Expression auf eine Weise negativ beeinflusst, die durch die verstärkte Expression von Irf 1 nur teilweise wieder aufgehoben werden kann. Daher soll jetzt die Auswirkung einer Hemmung des MAPK-Signalwegs mit PD98059 bei gleichzeitiger Aktivierung der IRF 1 Expression durch IFN-γ auf die H REV107 1 Expression untersucht werden.

Wie Abbildung 17 zeigt, wird, durch gleichzeitige Zugabe von 50 μmol PD98059 und 1000U/ml IFN-γ, die Induktion der H rev107 1 Genexpression um ein Vielfaches verstärkt.

	Abbildung 17: Oben: Northern Blot Analyse der H rev107 1 mRNA Expression in der KRAS-transformierten Ratten Ovarialkarzinomzelllinie ROSE199A2/5. Die Zellen sind unbehandelt, 48 Stunden mit 500 U oder 1000U/ml IFN-γ, 48 Stunden mit 50 μmol PD98059 oder 48 Stunden gleichzeitig mit 50 μmol PD98059 und 1000U/ml IFN-γ behandelt worden. Der Pfeil zeigt die H rev107 1-spezifische mRNA. Unten: Photo des mit Ethidiumbromid gefärbten Gels als Ladekontrolle.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Wechselwirkung zwischen einem IFN-γ induzierten Signalweg und dem MEK-Signalweg für die Expression von H rev107 1 von Bedeutung ist. Der aktivierte MEK-Signalweg scheint die IFN-γ induzierte H rev107 1 Expression zu verhindern. Durch die Blockade des MEK-Signalwegs wird diese Hemmung wieder aufgehoben. Die Induktion der H rev107 1 Expression durch die Behandlung der Zelllinie mit PD98059 und IFN-γ führt zu einem synergistischen Effekt.

Ähnlich wie in ROSEA2/5 wurde auch in der Ovarialkarzinomzelllinie A27/80 nach Induktion mit IFN-γ keine nennenswerte Aufregulation der H REV107 1 Genexpression beobachtet. Daher wird getestet, ob auch hier ein Synergieeffekt bei der Induktion der H REV107 1 Genexpression durch gleichzeitige Behandlung der Zellen mit IFN-γ und PD98059 nachweisbar ist.

Wie in Abbildung 18 zu sehen ist, kann nach gleichzeitiger Applikation von IFN-γ und PD98059 keine Verstärkung der H REV107 1 Genexpression beobachtet werden. Es gibt keinen Synergieeffekt.

	Abbildung 18: Northern Blot Analyse der H REV107 1 mRNA Expression in der humanen Ovarialkarzinomzelllinie A27/80. Die Zellen sind unbehandelt, 48 Stunden mit 500 U/ml oder 1000U/ml IFN-γ behandelt oder 48 Stunden mit 50 μmol PD98059 bzw. gleichzeitig mit 50 μmol PD98059 und 1000U/ml IFN-γ behandelt. Der Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische mRNA. Als Ladungskontrolle dient das Photo des mit Ethidiumbromid gefärbten Gels.

In den Zelllinien ROSE199A2/5 und A27/80 ist eine deutliche Wechselwirkung zwischen dem MEK-Signalweg und dem IFN-γ-induzierten Signalweg zu sehen. Hier führt die Blockade des MEK-Signalwegs bei gleichzeitiger Induktion des IFN-γ-induzierten Signalwegs zu einer Aufregulation der H REV107 1 Genexpression. Die alleinige Zugabe von PD98059 reicht aus, um die H rev107 1 Expression zu induzieren. Dieser Effekt kann mit der alleinigen Zugabe von IFN-γ nicht erreicht werden.

Abhängigkeit der H REV107 1 Genexpression von TNF-α-Signalwegen

Um auch die Rolle anderer Zytokine in der H REV107 1 Regulation zu analysieren, wurden im Rahmen einer Kollaboration humane Nierenkarzinomzelllinien getestet. Abbildung 19 zeigt die H REV107 1 Expression in der humanen Nierenkarzinomzelllinie MZ1257 nach Induktion mit verschiedenen Zytokinen. Die Behandlung der Zellen mit IFN-α führt zu keiner Induktion der H REV107 1 Genexpression. Die Behandlung der Zelllinie mit TNF-α und mit IFN-γ führt zu einer deutlichen Induktion der H REV107 1 Genexpression.

	Abbildung 19: Northern Blot Analyse der H REV107 1 mRNA Expression in der humanen Nierenkarzinomzelllinie MZ1257. Die Zellen sind unbehandelt oder 48 Stunden mit 1000 U IFN-α, 1000 U IFN-γ bzw. 500 U TNF-α pro ml behandelt. Der Pfeil zeigt die H REV107 1-spezifische mRNA. Als Ladungskontrolle dient die Northern Blot Analyse des selben Blots mit einer GAPDH Sonde.

TNF-α aktiviert unter anderem den Transkriptionsfaktor NFκB. Die Aktivierung der H REV107 1 Expression durch TNF-α ist, neben der Abhängigkeit der Expression von IFN-γ, eine weitere Information, die bei der Analyse der regulatorischen Elemente des H REV107 1 Promoters berücksichtigt wird. In den folgenden Schritten sollen die funktionellen Bereiche des H REV107 1 Promoters identifiziert und eine Verbindung zwischen diesen Bereichen und den, für die Expression des Gens verantwortlichen Signalwegen, hergestellt werden.

3.4.1  Identifizierung relevanter genomischer Bereiche aus einer Genbank

In einem ersten Schritt wird am Deutschen Ressourcenzentrum in Heidelberg eine humane Genbank mit einer H REV107 1-spezifischen Sonde analysiert. Das humane Genom ist für solche Zwecke in eine Phagen Bibliothek kloniert. Jeder Einzelne dieser 19500 bp großen pPAC4 Phagen enthält ein mehrere Megabasen großes Stück humanen Genoms. Insgesamt decken diese Stücke das gesamte, humane Genom ab.

Für die Hybridisierung wird dem Ressourcenzentrum ein 387 bp großer Abschnitt der H REV107 1 cDNA zur Verfügung gestellt (Abb. 20). Dieser Abschnitt liegt am äußersten 5´-Ende der H REV107 1 cDNA, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass ein positiver Phagenklon nicht nur die kodierenden Bereiche des H REV107 1 Gens, sondern auch den dazugehörigen, oberhalb des 5´-Endes der H REV107 1 cDNA liegenden, Promoter beinhaltet. In einem Kolonie Hybridisierungsassay zeigen zwölf Phagen mit der H-REV107-1 Sonde ein positives Signal.

	Abbildung 20: cDNA Sequenz des H REV107 1 Gens. Die Primer, die zur Herstellung der spezifischen Sonde verwendet wurden, sind in fetten Buchstaben dargestellt.

Bei einer Wiederholung der Hybridisierung zeigen in einem Southern Blot Hybridisierungsassay, nach Restriktion mit den Enzymen BamH1 und Not1, fünf dieser zwölf Phagen (P1-3, P1-8, P1-10, P1-11 und P1-12) ein stark positives Signal.

	Abbildung 21: Southern Blot Hybridisierung mit der, aus den Phagen 1-3, 1-8, 1-10 und 1-12, isolierten Phagen-DNA, die vor der Hybridisierung mit den angegebenen Enzymen geschnitten wurde. Als Sonde wird ein 387 bp großes Fragment der H REV107 1 cDNA benutzt (Abb. 20). Die Pfeile zeigen die stark positiven DNA-Fragmente, die in einer Größenordnung von 7 kb (untere Pfeile) bis mehr als 15 kb (obere Pfeile) liegen.

Für weitere Experimente wird der Phage 1-8, der eine sehr starke Hybridisierung mit der H REV107 1 cDNA zeigt, ausgewählt. Um für die Subklonierung der potentiellen Promoter-DNA ein positives Fragment kleinerer Größe zu finden, wurde die Restriktion der DNA mit weiteren Enzymen wie EcoRI, XhoI, HindIII, PstI und PvuI wiederholt, und diese anschließend in einem Southern Blot Hybridisierungsassay mit der H REV107 1 Sonde hybridisiert. Die Restriktion mit den verschiedenen Enzymen ergibt positive DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe (Abb. 22).

	Abbildung 22: Southern Blot Hybridisierung mit der aus dem Phagen 1-8 isolierten DNA, die vor der Hybridisierung mit den angegebenen Enzymen geschnitten wurde. Als Sonde wird ein Teil der H REV107 1 cDNA benutzt. Die Pfeile zeigen die stark positiven DNA-Fragmente.

Das gesuchte Fragment sollte nicht zu klein sein, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass die vollständige Promotersequenz enthalten ist. Ein 5.5 kb großes DNA-Fragment, das nach Restriktion des Phagen 1-8 mit dem Enzym EcoRI entsteht, zeigt ein deutliches Signal und wird für eine weitere Charakterisierung ausgewählt. Dazu soll es in den Vektor Bluescript II KS+ kloniert werden.

Das mit EcoRI geschnittene DNA-Fragment wird aus dem mit Ethidiumbromid gefärbten Gel ausgeschnitten, mit Hilfe des QiaExII Kits (Qiagen) aus der Agarose isoliert und aufgereinigt. Eine Probe dieser DNA wird in einem erneuten Southern Blot Hybridisierungsassay überprüft, um sicherzustellen, dass aus der Vielfalt der Fragmente das Richtige isoliert wurde.

	Abbildung 23: In einem Southern Blot Hybridisierungsassay wird mit Hilfe der H-REV107-1 Sonde überprüft, ob die zuvor aus dem „low-melting“ Agarose Gel isolierte DNA-Bande das H REV107 1 Gen enthält. Der linke Pfeil zeigt das stark positive Signal des zuvor aus dem Phagen P1-8 isolierten, ca. 5.5 kB großen DNA-Fragments. Der rechte Pfeil zeigt im Vergleich dazu die 3.7 kb große DNA-Bande des linearisierten Bluescript II KS+ Vektors, die ebenfalls ein positives Signal zeigt.

Das aus dem Phagen isolierte, 5.5 kB große DNA-Fragment wird nun in den ebenfalls mit EcoRI geschnittenen Vektor BluescriptII KS+ kloniert. Das Konstrukt wird in E.coli Ultracompetente XL-2 blue bzw. E.coli SURE2 Bakterien transformiert, Klone werden kultiviert und die Konstrukte aus diesen isoliert. Die isolierte DNA wird zur Kontrolle mit EcoRI geschnitten und die Proben in einem weiteren Southern Blot Hybridisierungsassay untersucht. Abbildung 24 zeigt eine Auswahl positiver Klone mit einem Fragment der Größe 5.5 kB. Unterhalb der 5.5 kB großen Bande sieht man die 3.7 kB große Bande des linearisierten Vektors. Ganz links ist zum Vergleich das 5.5kB große Original-Fragment aufgetragen, das aus dem Phagen P1-8 isoliert wurde. Auffällig ist hierbei die vergleichsweise schwache, spezifische Hybridisierung des subklonierten Fragments im Vergleich zur Hybridisierung des isolierten Fragments und dem Hintergrund-Signal des Vektors.

	Abbildung 24: In einem Southern Blot Hybridisierungsassay werden die Bluescript KS+ Plasmide, die ein subkloniertes H REV107 1 Fragment enthalten, nach Verdau mit EcoRI, mit der H-REV107-1Sonde hybridisiert. Der linke Pfeil zeigt die zum Vergleich aufgetragene, 5.5 kb große Ausgangs-DNA. 1-7 sind positive, mit EcoRI verdaute Bluescript Klone.

Die aus den positiven Klonen isolierte DNA, die aus dem Vektor Bluescript II KS+ und einem H REV107 1 spezifischen Insert bestehen soll, wird sequenziert. Die klassische Sequenzierung (SequiTherm EXCEL2, Primer M13 fwd, M13 rev, hrev107fwd, H-rev107 5´-rev) ergibt stets eine durcheinandergewürfelte Sequenz, die nur fragmentweise mit der Sequenz der Datenbank (HTGS, NCBI) übereinstimmt.

Offenbar liegt nach der Subklonierung in Bluescript H REV107 1 DNA vor, jedoch nicht in der Sequenzabfolge, wie auf Grund der Sequenz aus der Datenbank, erwartet. Dabei ist unklar, ob bereits die genomischen Fragmente der Bakteriophagen bei der Herstellung der Genbank im Ressourcenzentrum in Heidelberg durch Rekombination durcheinandergeraten sind. Deshalb wird mittels Southern Blot Analyse ein Restriktionsvergleich der genomischen DNA aus menschlichen Lymphozyten und der DNA aus den Bakteriophagen durchgeführt. Bei allen Proben sollte die H-REV107-1 Sonde eine gleich große Bande markieren. Abbildung 25 zeigt, dass die genomische DNA der vom Ressourcenzentrum isolierten Bakteriophagen offenbar der DNA aus den Lymphozyten entspricht. Die drei DNA-Proben aus den Lymphozyten zeigen nach Restriktion mit PstI bzw. mit EcoRI jeweils ein positives Signal auf gleicher Höhe wie die, mit den selben Enzymen geschnittene, DNA des Phagen. Auf Grund der Konzentrationsunterschiede zeigen die positiven Fragmente der, aus den menschlichen Lymphozyten gewonnenen, genomischen Proben (RF-1, MCF-1 und C4-1) ein sehr schwaches Signal, das auf dem Original-Blot aber gut erkennbar ist. Die Konzentrationsunterschiede ergeben sich aus dem erheblichen Größenunterschied zwischen dem humanen Gesamt-Genom und dem nur einige Megabasen „kleinen“ DNA-Fragment, das in den Bakteriophagen kloniert wurde.

	Abbildung 25: In einem Southern Blot Hybridisierungsassay werden die, mit je einem Restriktionsenzym geschnittenen, verschiedenen Proben humaner Gesamt-DNA und die DNA des Phagen P1-8 mit der H-REV107-1 Sonde hybridisiert. Die Pfeile zeigen die, jeweils gleich großen, positiven Signale der verschiedenen Proben.

In einer zweiten Sequenzierungsstrategie wird das „Genome Priming System“-Kit benutzt, bei dem mit Hilfe einer Transposase Primer-Bindungsstellen mit einer zufälligen Verteilung in den zu sequenzierenden Klon eingeführt werden. Durch Sequenzierung einer genügend hohen Anzahl an Klonen erreicht man eine vollständige Überlappung der Sequenzfragmente, die computergestützt zu einer Gesamtsequenz zusammengesetzt werden. Auch die hier resultierende Sequenz deckt sich nur bruchstückhaft mit der Sequenz aus den Datenbanken.

Das Durcheinanderwürfeln bzw. Einfügen von Deletionen in die zu replizierende, eukaryontische DNA durch das E.coli Reparatursystem ist ein bekanntes Problem (Joyce, 1992). Eukaryontische DNA besitzt häufig sekundäre Strukturen, wie z.B. Z-DNA, oder es kommt zur Bildung einer kreuzförmigen DNA-Struktur, die von inversen Sequenzwiederholungen herrührt. Diese sekundären Strukturen werden von den Bakterien durch verschiedene Mechanismen verändert. Das UV Reparatursystem (uvrC)und das SOS Reparatursystem (umuC) sind beide in der Reparatur der DNA involviert. Beide Gene wurden aus dem Genom des Bakterienstamms E.coli SURE® entfernt, was in einer 10-20fachen Zunahme der Stabilität inverser Wiederholungen in eingeführter DNA resultiert. Die Mutation der Gene sbcC und recJ, die eine Rolle in der Rekombination von DNA spielen, führt zu einer Zunahme der Stabilität von Z-DNA Strukturen. Die zusätzliche Mutation des Gens recB vermindert die homologe Rekombination in großem Maße und führt zu einem Rekombinations-defizienten Phänotyp (http://www.stratagene.com/products/).

Trotz der Verwendung der E.coli SURE® 2 Bakterien wurde die inserierte Sequenz durcheinandergewürfelt. Der Grund hierfür kann die, im zu klonierenden Promoterbereich liegende Alu-Sequenz sein. Diese inverse Sequenz der humanen Alu-Sc Unterfamilie befindet sich zwischen den Basen –999 und –716 und ist in der Abbildung 26 durch fette Buchstaben markiert. Die repetitiven Alu-Sequenzen finden sich über das gesamte humane Genom verteilt.

Auf Grund dieser Schwierigkeit, soll jetzt mit Hilfe der PCR der H REV107 1 Promoter direkt aus der genomischen DNA amplifiziert werden. Dazu muss die Promotersequenz möglichst genau identifiziert werden.

3.5.1  in silico Bestimmung der Promotersequenz

Im Rahmen des „Humanen Genom Projektes“ wurde mittlerweile der Chromosomenabschnitt 11q12.3, auf dem sich das H REV107 1 Gen befindet, sequenziert. Dadurch ist es möglich, den entsprechenden Sequenzbereich mit Hilfe des 5´-Endes der H REV107 1 cDNA in der „High Throughput Genome Sequences“ (HTGS) Datenbank von NCBI zu identifizieren. Die der Datenbank entnommene Sequenz wird mit Hilfe spezieller Software weiter analysiert.

Dazu werden 1085 Basenpaare der genomischen Sequenz 5´-aufwärts des 1.Exons sowie 419 Basenpaare des 1.Exons mit den Promoteranalyse-Programmen FirstEF, ConPro und McPromoter untersucht. Des weiteren vergleicht das Programm PromoterInspector die Sequenz der H REV107 1 cDNA mit der genomischen Sequenz aus einer internen Datenbank. Es untersucht hierbei einen Sequenzbereich, der 29 kB groß ist und sowohl 5´ als auch 3´ des ersten Exons von H REV107 1 liegt.

Die Programme FirstEF, ConPro und PromoterInspector definieren potentielle Promoterbereiche. McPromoter definiert einen Bereich für potentielle Transkriptionsstartpunkte. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 26 zusammengefasst. Der von FirstEF vorgeschlagene Promoterbereich liegt zwischen den Basenpaaren – 873 und – 1442 und umfasst 569 Basen (Bereich zwischen den Pfeilen # 1). Der von ConPro vorgeschlagene Promoterbereich umfasst 599 Basenpaare, beginnt bei Basenpaar - 1027 (Pfeil # 2) und endet beim von ConPro vorgeschlagenem, Transkriptionsstartpunkt (Pfeil # 4). Innerhalb des gesamten 29 kB großen Bereichs, der von PromoterInspector untersucht worden ist, wird nur ein potentieller Promoter identifiziert. Er liegt zwischen den Basen – 376 bis – 627 5´ des H REV107 1 Startcodons ATG (Bereich zwischen den Pfeilen # 3).

Die Programme ConPro und McPromoter definieren auch potentielle Transkriptionsstartpunkte (Pfeil # 4 ConPro; Pfeil # 5 McPromoter). Diese liegen alle in unmittelbarer Nähe der Startbase des längsten, experimentell gefundenen H REV107 1 cDNA Klons 12-1 (Pfeil # 7). Neben diesem Klon 12-1, dessen Startpunkt beim Basenpaar -404 liegt, wurden noch weitere cDNA Klone experimentell gefunden (Husmann, Sers, nicht veröffentlichte Daten). Der Klon 3-1 beginnt bei -212, der Klon 9-1 bei –16 (Abb. 27).

Die japanische Datenbank DataBaseTSS (DBTSS; http://dbtss.hgc.jp/index.html; Suzuki et al., 2002) zeigt einen, mit der Methode der Oligo-Capped PCR experimentell ermittelten, maximalen TSP für H REV107 1 (Pfeil # 6) (Suzuki und Sugano, 2003). In den meisten Experimenten werden die cDNA-Klone durch eine Erst-Strang PCR vom 3´-Ende des Gens aus synthetisiert, da man an diesem Ende das poly-A Signal des Gens als Bindungsstelle für den Synthese-Primer benutzen kann. Der genaue 5´-Startpunkt des Gens kann so jedoch nicht ermittelt werden, da die Strangsynthese oft vorher abbricht und es keine universelle Primerstelle gibt, die eine Erst-Strang Synthese vom 5´-Ende des Gens erlauben würde. Die Methode der Oligo-Capped PCR schützt das 5´-Ende der mRNA und verlängert es um eine Primer-Bindungsstelle. Dies erlaubt eine vollständige Synthese der cDNA vom 5`-Ende des Gens. Der so ermittelte Startpunkt liegt 15 Basen 5´ des Startpunktes der längsten, verfügbaren H REV107 1 cDNA.

Alle in silico ermittelten Ergebnisse weisen daraufhin, dass der als Promoterbereich vermutete Sequenzbereich den Promoter des H REV107 1 Gens enthält. Allerdings werden durch die Programme PromoterInspector und FirstEF zwei sich nicht überlappende Bereiche vorgeschlagen. Da die Methode der Oligo-Capped PCR das experimentell verlässlichste Ergebnis liefert und sich dieses gut mit den eigenen experimentellen Daten deckt, wird der hier ermittelte, maximale Transkriptionsstartpunkt (DBTSS) übernommen. Vermutlich hat H REV107 1 aber mehrere Transkriptionsstartpunkte. Dies soll mit der Methode der Primer Extension überprüft werden.

	Abbildung 26: Schematische Darstellung potentieller H-REV107-1 Promoterbereiche und Transkriptionsstartpunkte nach in silico Analyse Von verschiedenen Promoteranalyse – Programmen vorgeschlagene, potentielle Promoterbereiche und Transkriptionsstartpunkte (TSP), sowie die in der NCBI Datenbank "alu" identifizierte Alu-Sequenz. Pfeile: 1) FirstEF (Promoterbereich), 2) ConPro (Promoterstartpunkt), 3) PromoterInspector (Promoterbereich), 4) ConPro (TSP), 5) McPromoter (TSP-Bereich), 6) DataBaseTSS (TSP), (7) 12-1 cDNA (TSP). Fett gedruckt: bp -716 bis –999 (Alu-Sequenz).

Die Klonierung des H REV107 1 Gens hat zu mehreren cDNA-Klonen geführt. Diese tragen die Bezeichnung 12-1, 3-1 und 9-1. Der längste dieser Klone ist der Klon 12-1. Mit Hilfe der radioaktiven Primer Extension wird versucht, einen oder mehrere Transkriptionsstartpunkte festzulegen. Dabei wird mit einem 3´- 5´ gerichtetem Primer eine PCR aus der H REV107 1 mRNA durchgeführt. Die amplifizierte DNA trennt man auf einem Polyacrylgel auf. Auf einer parallel aufgetragenen Sequenzleiter lässt sich dann die Größe der PCR-Produkte ablesen.

Diese Analyse zeigt wie erwartet eine Reihe von Transkriptionsstartpunkten für H-REV107-1. Die Startpunkte, die anhand der Sequenz eindeutig identifizierbar sind, sind in der Abbildung 27 eingetragen und tragen die Nummern 1-6. Die Nummer 4 entspricht dabei dem Startpunkt des cDNA-Klons 9-1. Keiner der gefundenen Startpunkte entspricht der Größe des Klons 12-1 oder dem Ergebnis aus der Datenbank DBTSS, aber alle liegen innerhalb eines 428 bp großen Bereichs.

Um den H-REV107-1 Promoter noch genauer eingrenzen zu können werden die Bereiche 5`der beiden längsten Transkripte (DBTSS, 12-1) auf mögliche Core Promoter Elemente hin analysiert.

	Abbildung 27: Schematische Darstellung verschiedener, experimentell bestimmter, Transkriptionsstartpunkte des H REV107 1 Gens. 9-1, 3-1 und 12-1 zeigen die Startpunkte der cDNA-Klone, die Nummern 1–6 die Ergebnisse der Primer Extension und DBTSS den Startpunkt des längsten Klons aus der DBTSS-Datenbank.

Der Core Promoter eines Gens ist als der Bereich definiert, an den sich der basale Transkriptions-Komplex der RNA PolymeraseII anlagert und der ausreicht, um eine korrekte Transkription zu initiieren. Jeder Signalweg, der über die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren zur Expression eines Gens führt, verläuft letztlich über den RNA PolymeraseII-Komplex. Dabei kommt diesem keine statische, sondern eine dynamische Rolle bei der Regulation der Genexpression zu.

Der Core Promoter Bereich umfasst ca. 70 Basenpaare (– 35 bp bis + 35 bp) 5´ und 3´ des Transkriptionsstartpunktes (Butler und Kadonaga, 2002). In diesem Kapitel 1.6.3 folgt die Nummerierung der DNA-Sequenz der Nomenklatur für Core Promoter Elemente. Das bedeutet, dass nicht die Base A des Startcodon ATG als +1 gezählt wird, wie es bei der Nummerierung der genomischen Sequenz üblich ist. Bei der Positionsbeschreibung der Core Promoter Elemente wird der Transkriptionsstartpunkt als +1 bezeichnet, da sich der Abstand und die Funktion der Core Promoter Elemente auf diesen Startpunkt beziehen. Im Gegensatz dazu befindet sich das ATG Triplett des Translationsstartpunktes bei jedem Gen in einer anderen Entfernung zum Transkriptionsstartpunkt und den zugehörigen Core Promoter Elementen.

Innerhalb dieses 80 bp großen Bereichs befinden sich verschiedene Elemente, die in verschiedenen Promotoren in variablen Kombinationen vorhanden sein können. Dazu gehört die TATA-Box, das Initiator Element (Inr), das "TFIIB-Recognition Element" (BRE), das "Downstream Core Promoter Element" (DPE), das CT-Signal, das "Motif Ten Element" (MTE) und das "Downstream Core Element" (DCE).

Die TATA-Box befindet sich meist ca. 25 – 30 Basenpaare 5´ vom Transkriptionsstartpunkt (TSP), besitzt die Consensus-Sequenz TATAAA, wobei ein bis zwei Abweichungen von dieser Sequenz die Funktion nicht beeinträchtigen müssen und wird vom TATA-Box bindenden Protein (TBP) gebunden (Singer et al., 1990). Das Element BRE schließt sich, falls vorhanden, direkt 5´ an die TATA-Box an und wird vom Faktor TFIIB sequenz-spezifisch gebunden. Die Consensus-Sequenz lautet (G/C)-(G/C)-(G/A)-CGCC. Interessanterweise wurde für BRE und die Bindung des Faktors TFIIB sowohl eine Aktivierung als auch eine Repression der Genexpression gezeigt (Lagrange et al., 1998; Evans et al., 2001). Das Inr-Element ist neben der TATA-Box das zweite Element, das zu einer genauen Lokalisation der RNA Polymerase II Maschinerie führt und so den TSP festlegt. Die Consensus-Sequenz lautet (C/T)-(C/T)_-1-A₊₁-N-(T/A)-(C/T)-(C/T), wobei die häufiger zu findende Base C an Position –1 und die Startbase A (+1) das CAP-Signal bilden. Hauptsächlich bindet der TFIID-Komplex an das Inr-Element, wobei die Untereinheiten TAF_II150 und TAF_II250 mit der DNA interagieren (Chalkley und Verrijzer, 1999). Das CT-Signal liegt direkt 3´ vom Inr-Element im Sequenzbereich +6 bis +12 und wurde durch bioinformatische Sequenzanalysen identifiziert (Larsen et al., 1995). Die Consensus-Sequenz lautet C-T-N-C-N-G. Über die Bedeutung des CT-Signals liegen noch keine experimentellen Daten vor. Das Downstream Promoter Element (DCE) liegt genau +28 bis +32 vom Transkriptionsstartpunkt. Bereits eine Base mehr oder weniger zwischen dem DPE und dem TSP führt zu einem deutlichen Aktivitätsverlust des Elements. Die Consensus-Sequenz lautet (A/G)₊₂₈-G-(A/T)-(C/T)-(G/A/C). Dazu kommt eine geringfügige Präferenz für die Base G an Position +24 (Kutach und Kadonaga, 2000). In einem DPE-abhängigen Promoter kann das Element aber nicht allein, sondern nur in Zusammenhang mit dem Inr-Element gesehen werden. Der Grund hierfür, sowie für den unbedingt notwendigen Abstand von 28 Basen zum Transkriptionsstartpunkt, ist, dass auch DPE von den Untereinheiten TAF_II60 und TAF_II40 des TFIID-Komplex gebunden wird (Burke und Kadonaga, 1997). Ein weiteres Element ist das "Multiple Start Site Element Downstream" (MED-1). Dieses Motiv soll für multiple Startpunkte innerhalb eines 5´ von ihm liegenden Bereichs verantwortlich sein. Die Consensus-Sequenz lautet GCTCCC. Im Promoter des P-Glykoproteingens führt die Mutation des Elements zu einer Verminderung der Expression und zu einer Reduktion der Transkriptionsstartpunkte (Ince und Scotto, 1995). Im Thymidylat Synthase Promoter der Maus konnte kein Einfluss des Elements auf die Transkription des Gens gezeigt werden (Rudge und Johnson, 1999).

Das H REV107 1 Gen besitzt verschiedene Startpunkte. Zunächst wird die Region um die beiden längsten Transkriptionsstartpunkte DBTSS und 12-1 auf das Vorhandensein der beschriebenen Elemente untersucht. Dazu werden zuerst die Initiator-Elemente der beiden Transkripte an Hand ihrer Sequenz identifiziert. Die weiteren Elemente werden auf Grund ihres in der Literatur beschriebenen Abstands zum Initiator-Element identifiziert. Dies führt für die Transkripte DBTSS und 12-1 zu einem interessanten Ergebnis (Abb. 28). Beide Transkripte besitzen eine eigene Startbase +1 innerhalb ihres Initiator-Elements. Diese liegen in einem Abstand von 14 Basenpaaren zueinander. Daher führen die, für die einzelnen Elemente in der Literatur definierten, Abstände zwischen der Startbase und dem jeweiligen Element zu unterschiedlichen Sequenzbereichen. Deswegen ergeben sich für die beiden Transkripte zwei unterschiedlich aufgebaute, potentielle Core Promotoren.

Dies zeigt sich z.B. bei dem Element DPE. Das Transkript DBTSS besitzt dieses Element im definierten Abstand +28. Die Übereinstimmung mit der Consensus-Sequenz beträgt 60%, zuzüglich der Übereinstimmung mit der Base G an Position +24. Dies würde den Promoter als einen Inr-DPE Promoter klassifizieren. Die Sequenz, ausgehend vom Transkriptionsstartpunkt 12-1, enthält kein DPE-Element. Dafür befindet sich hier ein CT-Signal, im, in der Literatur definierten, Bereich +6 bis +11, wobei fünf von sechs Basen der Consensus-Sequenz entsprechen. Dieses Signal lässt sich nicht im Abstand zum Transkriptionsstartpunkt DBTSS finden.

Die 5´ des Inr-Elements liegenden Elemente können für beide Transkriptionsstartpunkte aufgeführt werden, da für diese keine festen Abstände zur Startbase definiert sind. Obwohl das H REV107 1 Gen keine TATA-Box besitzt, kommt das Element BRE vor. Dieses Element soll sich direkt 5´ der TATA-Box anschließen und wird vom Faktor TFIIB gebunden. Im Fall des H REV107 1 Promoters kommt dieses Element doppelt, direkt aufeinander folgend vor, wobei in beiden Elementen sechs der sieben Basen der Consensus-Sequenz entsprechen. Dies wurde bisher noch für keinen Promoter beschrieben.

Die TATA-Box liegt stets 5´ im Bereich –25 bis –30 von der Startbase +1. Diese TATA-Box kann in synthetischen Promotoren durch andere Elemente substituiert werden, wie es für SP-1, AP-1, ATF (Mitglied der CREB-Familie) und TEF-1 gezeigt wurde (Conaway und Conaway, 1991). Im Fall des Transkripts mit dem Startpunkt DBTSS befindet sich in diesem Bereich eine Bindungsstelle für einen Transkriptionsfaktor der CREB-Familie. Dieser könnte die Funktion der TATA-Box übernehmen, wobei das anschließende, doppelt vorkommende BRE-Element 3´ von dieser Bindungsstelle folgen würde.

	Abbildung 28: Schematische Darstellung potentieller Core Promoter Elemente für die Transkriptionsstartpunkte DBTSS und 12-1. Die Nummerierung bezieht sich in dieser Abbildung auf die jeweilige Base A des Transkriptionsstartpunkts. Die Base 5´ der Startbase erhält die Bezeichnung -1. CREB (Bindungsstelle für einen Faktor der CREB-Familie), BRE (TFIIB Recognition Element), Inr (Initiator Element, beinhaltet das CAP-Signal CA [-1,+1]), CT-Signal, DPE (Downstream Promoter Element) und MED-1 (Multiple Start Site Element Downstream)

Die unterschiedliche Anordnung von Core Promoter Elementen um die Initiator-Elemente der beiden H REV107 1 Transkripte DBTSS und 12-1 kann eine wichtige Rolle in der Regulation des Gens spielen. Das Vorhandensein zweier Core Promotoren inklusive zweier Initiator Elemente kann zum Aufbau zweier, verschiedener RNA Polymerase II Komplexe führen. Diese könnten wiederum durch die Wechselwirkungen mit unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren unterschiedlich gut stabilisiert werden. Die Stabilität des RNA Polymerase II Komplexes ist ein Kriterium, welches das Expressionsniveau eines Gens bedingt. Die Regulation des H REV107 1 Gens könnte so zum Beispiel gewebespezifisch durch das Angebot verschiedener Transkriptionsfaktoren gesteuert werden.

Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wird das Augenmerk auf dem regulatorischen Bereich des proximalen H REV107 1-Promoters liegen. Dieser schließt sich 5´ des Core-Promoters an und beinhaltet die Bindungsstellen für die, von Signalwegen aktivierten, Transkriptionsfaktoren.

In der weiteren Bezeichnung der Sequenz bezieht sich die Nummerierung der Basen wieder auf das Startcodon ATG. Der Bereich 1085 Basenpaare 5´ des ATG und 419 Basenpaare des 1.Exons enthält mit größter Wahrscheinlichkeit den H REV107 1 Promoter und wird für die weitere Analyse verwendet. Die Sequenz des Promoters wird mit Hilfe der Software MatInspector von Genomatix (http://www.genomatix.de/) analysiert. Diese vergleicht die zu untersuchende Sequenz mit einer Transkriptionsfaktoren-Datenbank, in der die Bindungssequenzen der Transkriptionsfaktoren gespeichert sind.

Eine Bindungssequenz setzt sich aus der Kern-Sequenz (Core) und der Matrix-Sequenz zusammen. Eine Kern-Sequenz ist das Basenmotiv, an das der Transkriptionsfaktor bindet und wird in der folgenden Tabelle mit großen Buchstaben dargestellt. Die Basen, die die Kern-Sequenz umgeben, bilden die Matrix-Sequenz. Da zwischen dem bindenden Transkriptionsfaktor und den umgebenden Basen Wechselwirkungen stattfinden, sind auch diese Basen von Bedeutung. Alle Basen, die für die Analyse einen hohen Informationswert besitzen, werden in der Tabelle in fetten Buchstaben dargestellt. Das sind meistens alle Basen des Kernelements, aber oft auch Basen aus der Matrix-Sequenz. Für die Bestimmung des Gewichtungsfaktors der Core- oder der Matrix-Sequenz ist dabei entscheidend, wie häufig in bereits in vivo nachgewiesenen Bindungsstellen die jeweilige Base im selben Abstand 5´ oder 3´ zu den anderen Basen vorkommt. Ist zum Beispiel bei allen in vivo bestätigten IRF-1-Bindungsstellen die Base A in einem Abstand von drei Basen 5´ zur Kern-Sequenz zu finden, so bedeutet dies für jede Base A einer zu untersuchenden Sequenz, die ebenfalls in drei Basen Abstand in 5´-Richtung von einem IRF-1-Element gefunden wird den maximalen Gewichtungsfaktor 1.0. Aus diesen Häufungen ergibt sich für die Kern- bzw. die Matrix-Sequenz ein Wert für die Übereinstimmung der in der Datenbank beschriebenen Sequenzen mit der untersuchten Promotersequenz.

Von besonderem Interesse sind die potentiellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen, deren Transkriptionsfaktoren Ziele von Signalwegen sind, die die Regulation von H REV107 1, entsprechend der vorangegangenen Analyse, mit hoher Wahrscheinlichkeit beeinflussen, z.B. ISRE/IRF und STAT-1 im Fall von IFN-γ, sowie cRel (eine Untereinheit von NFκB) im Fall von TNF-α.

Tabelle 14: Potentielle Transkriptionsfaktorenbindungsstellen im Bereich von –335 bis –997 vom Translationsstartpunkt der H REV107 1 Promotersequenz. (Die Bezeichnung #1 und #2 im Falle von cRel und CCAAT stammt nicht aus der Datenbank, sondern dient der Übersichtlichkeit.)

Nach Abschluss der in silico Identifizierung der Promotersequenz, der Bestimmung der Transkriptionsstartpunkte, sowie der Analyse potentieller Core Promoter Elemente und Transkriptionsfaktorbindungsstellen, sollen die funktionellen Bereiche des Promoters in vitro identifiziert werden. Dazu wird zuerst die Promotersequenz in ein Reporterplasmid kloniert, um anschließend den Promoter in Reporter Assays zu charakterisieren.

3.6.1  Klonierung des H-REV107-1 Promoters in den SEAP Reportersystem-Vektor

Die in der Datenbank „High Throughput Genome Sequences“ des NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) identifizierte, 5´ der H REV107 1 cDNA liegende Sequenz soll mittels PCR amplifiziert werden. Dazu werden Primer gewählt, die ein 980 Basenpaare großes DNA-Fragment umschließen, das mit dem 5´-Ende der H REV107 1 cDNA um 403 Basenpaare überlappt (Primer A ; Primer 4, Abb. 29). Auf Grund der außergewöhnlich AT-reichen Sequenz 5´ des Primers A ist es nicht möglich, diesen weiter in 5´ Richtung zu verschieben.

Der Primer A und der Primer 4 werden um die Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme Kpn1 und EcoR1 verlängert. Mit diesen Primern wird mittels PCR aus der genomischen DNA des Phagen P1-8 ein DNA-Fragment amplifiziert. Die an den Enden eingebauten Schnittstellen werden mit den entsprechenden Restriktionsenzymen geschnitten und das Fragment in den SEAP 2 basic Vektor (Clontech) ligiert.

Aus diesem DNA Abschnitt werden mit den 5´→ 3´ Primern B, C, D und dem 3´→ 5´ Primer 2 noch weitere, verkürzte DNA Abschnitte amplifiziert. Wie aus der Abbildung 29 ersichtlich ist, werden diese weiteren Primer so gelegt, dass durch die Sequenzverkürzung potentielle Transkriptionsfaktorbindungsstellen wegfallen. So liegt der Primer B 3´ von der ISRE/IRF-1-Bindungsstelle und der Primer D 3´ der beiden AP-Bindungsstellen. Insgesamt werden fünf verschiedene Konstrukte hergestellt, deren Sequenz mittels Sequenzierung bestätigt wird.

Diese Strategie führt direkt zur Herstellung der beschriebenen Promoterkonstrukte. Diese Sequenz ist kürzer als die aus dem Phagen isolierte, 5.5 kB große Sequenz ist und enthält vermutlich nicht alle notwendigen Bereiche, die zur Aktivierung der Rekombinationereignisse in den Bakterien benötigt werden.

	Abbildung 29: Schematische Darstellung der regulatorischen Region des H-REV107-1 Gens mit potentiellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen. Der Translationsstartpunkt ist mit A+1TG gekennzeichnet. Oberhalb des Primers A befindet sich der nicht amplifizierbare Bereich. Die jeweiligen Primer sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Die potentiellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen sind unterstrichen. Die Bindungsstelle für STAT-1 überlappt mit den Bindungsstellen cRel #1 und cRel #2 und ist mit einer gestrichelten Linie gekennzeichnet. Der gestrichelte Pfeil max. TSP zeigt den Transkriptionsstartpunkt der längsten H REV107 1 cDNA (DBTSS).

Tabelle 15: Zusammenfassung der mittels PCR hergestellten Promoterkonstrukte. Beginn und Ende der jeweiligen Konstrukte sind auf den Translationsstartpunkt +1 bezogen.

NIH3T3 Zellen werden mit den Konstrukten transfiziert und die Aktivität, wie in Material und Methoden beschrieben, bestimmt. Die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert (Aktivität SEAP / Aktivität Renilla) von drei oder sechs Transfektionen. Die jeweiligen Mittelwerte der Aktivität der Konstrukte wird relativ zum Mittelwert der Aktivität des Vektors SEAP-Basic angegeben. Diese Berechnung der Werte gilt für alle folgenden Reporter Assays.

Das Konstrukt A-4, das auch einen großen Teil des 5´-untranslatierten H REV107 1 cDNA Bereichs abdeckt, besitzt die größte Aktivität. Das Konstrukt A-2, welches den gesamten Promoterbereich bis zum längsten Transkriptionsstartpunkt enthält, hat eine relativ niedrige Aktivität. Überraschend ist, dass B-2, welches um 23 bp, die das ISRE Element enthalten, verkürzt wurde, eine deutlich stärkere Aktivität hat. Dies deutet daraufhin, dass in dem Bereich A bis B ein Element sitzt, das die Aktivität des Promoters senkt. Dabei dürfte es sich mit hoher Wahrscheinlichkeit um das Element IRF-1/ISRE handeln. Das Konstrukt C-2 besitzt eine niedrige Aktivität, entsprechend der Aktivität des Konstrukts A-2. D-2 zeigt wiederum eine höhere Aktivität als C-2. Diese Aktivitätssteigerung kann auf Grund der Größe des Fragments keinem Element zugeordnet werden (Abb. 30).

	Abbildung 30: Aktivität der verschiedenen Promoter-Konstrukte im SEAP II Reporter Assay in NIH3T3 Zellen. Die Aktivitäten sind relativ zum Wert der Aktivität des Leervektors SEAP-Basic angegeben.

Tabelle 16: Zahlenwerte zur Abbildung 30. In der Zelllinie NIH3T3 wurde der Mittelwert der Luciferase-Aktivität der einzelnen Konstrukte relativ zum Mittelwert der Luciferase Aktivität des Leervektors SEAP-Basic gemessen. Jede Transfektion wurde mindestens dreimal durchgeführt. Die Standardabweichung ergibt sich aus der Mittelung der Werte, die Fehlerfortpflanzung wurde beim Errechnen der relativen Werte berücksichtigt. Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-4 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.

In weiteren Versuchen zeigt sich, dass der SEAP2 Reporter Assay nicht zuverlässig arbeitet. Bei Ko-Transfektionen von Promoter-Konstrukten mit Expressionsplasmiden bzw. deren Leervektoren ergeben sich Aktivitäten, die diesen Assay in Frage stellen.

Als Beispiel ist die Ko-Transfektion des Konstrukts A-4 mit dem Expressionsplasmid pDCR-RAS gezeigt. Während die Aktivität des Konstrukts A-4 bei Ko-Transfektion mit dem pDCR-RAS Plasmid gleich bleibt, führt die Ko-Transfektion des Leervektors pDCR zu einer deutlich gesteigerten Aktivität (Abb. 31). Die Ko-Transfektion des Leervektors sollte aber keinen Einfluss auf die Aktivität des Konstrukts A-3 besitzen.

	Abbildung 31: Aktivität des SEAP II Promoterkonstrukts A-4, nach Ko-Transfektion eines RAS Expressionsplasmids (A-4 + RAS) bzw. des entsprechenden Leervektors pDCR (A-4 + pDCR) in NIH3T3 Zellen.

Auf Grund dieser störenden Wechselwirkungen zwischen den SEAP Konstrukten und ko-transfizierten Expressionsplasmiden, die keine zuverlässigen Aussagen aus den Experimenten mehr zulassen, wird ein zuverlässigerer Reporter Assay ausgesucht. Dazu werden die Fragmente in das Reportervektor-System pGL3 von Promega kloniert.

3.7.1  Klonierung des H-REV107-1 Promoters in den Dualen Luciferase Vektor pGL3

Der Vorteil des pGL3 Vektorsystems von Promega ist die Entfernung eventuell vorhandener Transkriptionsfaktorbindungsstellen aus der Sequenz des pGL3 Vektors. Jede Sequenz enthält potentielle Transkriptionsfaktorbindungsstellen, die im pGL3 Vektor durch gezielten Austausch einzelner Basen weitestgehend eliminiert wurden.

Das pGL3-System basiert auf der Messung zweier unterschiedlicher Luciferase Aktivitäten, der Luciferasen aus Renilla (Renilla reniformis) und Firefly (Photinus pyralis). Dabei steuert der zu untersuchende Promoter die Expression des Firefly Luciferase Gens, während das Renilla Luciferase Gen vom konstitutiv aktiven Promoter der Thymidin Kinase des Herpes Simplex Virus gesteuert wird. Die Proteine der Firefly Luciferase und der, als interne Transfektionskontrolle dienenden Renilla Luciferase, befinden sich gemeinsam im Zellextrakt. Dieser Zellextrakt wird in einem Röhrchen in das Luminometer eingebracht. Jetzt wird zuerst die Substanz Beetle Luciferin eingespritzt und so die Aktivität der Firefly Luciferase messbar gemacht. Nach einer festgelegten Zeit wird diese Leuchtreaktion durch Einspritzen des „Stop & Glo“-Substrats unterdrückt und gleichzeitig die Aktivität der Renilla Luciferase durch das hierin enthaltende Coelenterazine angeregt. So werden beide Aktivitäten in einem Ansatz, zeitlich von einander getrennt, gemessen.

Da im pGL3-Basic Vektor zwar ebenfalls die Kpn1-, jedoch nicht die EcoR1-Schnittstelle vorhanden ist, müssen mit Hilfe der PCR neue Fragmente mit geänderten Schnittstellen (Kpn1, Sma1) amplifiziert und in den Vektor pGL3-Basic kloniert werden. Dazu werden der Primer A und der Primer 3 um die Sequenz der Restriktionselemente (Kpn1, Sma1) verlängert. Mit diesen Primern wird mittels PCR aus dem Konstrukt SEAP A-4 ein DNA-Fragment amplifiziert. Die an den Enden eingebauten Schnittstellen werden mit den entsprechenden Restriktionsenzymen geschnitten und in den pGL3-Basic Vektor (Promega) ligiert. Das klonierte Fragment ist 692 bp groß und reicht bis in den 5´-untranslatierten Teil der H REV107 1 cDNA hinein (Abb. 33). Im Vergleich zum Primer 4, der im SEAP System verwendet wird, liegt der Primer 3, der für das pGL3 System benutzt wird, 288 bp weiter zum 5´-Ende der cDNA hin verschoben. Das hieraus resultierende Konstrukt enthält immer noch die potentiellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen cRel#1, cRel #2 und STAT-1, die potentiellen Elemente des Core-Promoters sowie den maximalen Transkriptionsstartpunkt aus der Datenbank DBTSS und den Transkriptionsstartpunkt des längsten, zur Verfügung stehenden, H REV107 1 cDNA Klons 12-1. Damit sollte keine, für die Aktivität des Promoters relevante, Sequenz verloren gehen. Gleichzeitig wird das Risiko artifizieller Ergebnisse verringert, da zusätzliche DNA, zwischen dem Promoter und dem Startcodon der jeweiligen Luciferase, die Aktivität des Konstrukts beeinflussen könnte. In einem ersten Test wird geprüft, ob in verschiedenen Zelllinien die Aktivität des Konstrukts mit den unterschiedlichen H REV107 1 Genexpressionsniveaus dieser Zelllinien übereinstimmt (Abb. 32). In den humanen Zelllinien SKOV-3 und PA-1 zeigt das Promoter-Konstrukt die höchste Aktivität. In der Maus Zelllinie NIH3T3 zeigt das Konstrukt eine mittlere Aktivität, während es in den humanen Ovarialkarzinomzelllinien A27/80 und OVCAR-3, entsprechend dem endogenen H REV107 1 Expressions-Niveau nur eine geringe Aktivität zeigt.

	Abbildung 32: Aktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts (A-3) in verschiedenen Zelllinien im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega). Die Aktivitäten sind relativ zur Aktivität des Leervektors pGL3-Basic angegeben.

Tabelle 17: Zahlenwerte zur Abbildung 32. In den Zelllinien NIH3T3, SKOV-3, PA-1, A27/80 und OVCAR-3 wurde der Mittelwert der Luciferase-Aktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts A-3 relativ zum Mittelwert der Luciferase Aktivität des Leervektors pGL3-Basic gemessen. Jede Transfektion wurde mindestens dreimal durchgeführt. Die Standardabweichung ergibt sich aus der Mittelung der Werte, die Fehlerfortpflanzung wurde beim Errechnen der relativen Werte berücksichtigt. Diese Vorgehensweise gilt für alle pGL3 Promoter Assays und wird bei den folgenden Darstellungen nicht mehr beschrieben. Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 in der Zelllinie NIH3T3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte des Konstrukts A-3 in den weiteren Zelllinien beziehen sich auf diese 100%.

Die Aktivität des Konstrukts A-3 entspricht in etwa der Situation in den verschiedenen Zelllinien. Die Größe des Konstrukts A-3 reicht offenbar aus, um zelltypische Aktivitäten des H REV107 1 Promoters aufzuzeigen.

Zur weiteren Analyse des H REV107 1 Promoters werden die folgenden Konstrukte mit Hilfe der PCR hergestellt. Die Sequenzen werden jeweils mittels Sequenzierung bestätigt.

	Abbildung 33: Schematische Darstellung der regulatorischen Region des H-REV107-1 Gens mit potentiellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen und Primer Positionen. Die zur Herstellung der Konstrukte verwendeten Primer sind mit Pfeilen gekennzeichnet. In 5´→3´-Richtung sind das die Primer A bis F, in 3´→5´-Richtung die Primer 1 bis 3. Die potentiellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen sind unterstrichen. Die STAT-1 Bindungsstelle überlagert sich mit den Bindungsstellen cRel #1 und cRel #2 und ist mit einer gestrichelten Linie gekennzeichnet. Der gestrichelte Pfeil TSP zeigt den Transkriptionsstartpunkt der längsten H REV107 1 cDNA an. Dieser wurde aus der DBTSS Datenbank ermittelt. +1 zeigt den Translationsstartpunkt ATG an.

Neben dem Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 werden fünf vom 5´-Ende und zwei vom 3´-Ende her verkürzte Konstrukte hergestellt. Ausgehend vom Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 werden die weiteren Konstrukte vom 5´-Ende her so verkürzt, dass zuvor in silico identifizierte, potentielle Transkriptionsfaktor-Bindungselemente abgeschnitten werden. So wird z.B. beim Übergang von Konstrukt A-3 zum Konstrukt B-3 durch Verkürzen der Sequenz um 23 Basen die Transkriptionsfaktorbindungsstelle ISRE entfernt.

	Abbildung 34: Schematische Darstellung der im pGL3 System hergestellten Promoter-Konstrukte. A-3 zeigt den Gesamtpromoter mit den potentiell funktionellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen. Auf den weiteren Konstrukten sind nur Bindungsstellen eingezeichnet, die nicht mehr auf dem nächstkürzeren Konstrukt vorhanden sind. Die Zahlen vor und nach dem jeweiligen Konstrukt zeigen die Entfernung zum Translationsstartpunkt +1 an.

Die Aktivität der verschiedenen Konstrukte wird zunächst in NIH3T3 im Dualen Luciferase Assay gemessen. Die Aktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts A-3 wird immer auf 100 % gesetzt. Wie Abbildung 35 zeigt, ergibt der Einsatz der Promoterkonstrukte zwei deutliche Ergebnisse. Zum Ersten einen Anstieg der Aktivität nach Deletion des äußersten 5´-Endes des Promoters beim Übergang vom Konstrukt A-3 zu B-3 um ca. 25 %. Beim Übergang von Konstrukt B-3 zu Konstrukt C-3 erhöht sich die Aktivität um weitere 10 %. Danach sinkt die Aktivität mit zunehmender Verkürzung der Konstrukte. Die Verkürzung des Fragmentes zum Konstrukt D-3 senkt die Aktivität um 37%. Der nächste Deletionsschritt (Konstrukt E-3) senkt die Aktivität um 17%.

Das zweite, bedeutende Ergebnis ist, dass das kleinste Konstrukt F-3, dessen Startpunkt bereits hinter dem Transkriptionsstartpunkt liegt, keine Promoteraktivität mehr zeigt. Die Aktivität sinkt um 99%. In dem beim Übergang von E-3 zu F-3 entfernten Bereich sollte ein essentieller Teil des Core Promoters liegen.

Bei den Konstrukten A-2 und A-1 wurde der Promoter nicht vom 5´- Ende sondern vom 3´-Ende her verkürzt. Hier liegt der Endpunkt des Inserts nicht bei Basenpaar -305 sondern bei Basenpaar -405. Die Aktivität des Promoterkonstrukts A-2 entspricht der Aktivität des größten verwendeten Konstrukts A-3. Das Konstrukt A-1 zeigt eine Promoteraktivität die 45% niedriger liegt als die Aktivität von A-3 bzw. A-2.

	Abbildung 35: Aktivität der verschiedenen Promoterkonstrukte in der Zelllinie NIH3T3 im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega). Oberhalb der Balken sind die im Vergleich zum vorherigen Balken entfernten Transkriptionsfaktorbindungsstellen aufgeführt. Die Aktivitäten sind relativ zum Wert der Aktivität des Leervektors pGL3-Basic angegeben.

Tabelle 18 Zahlenwerte zum Reporter Assay in NIH3T3 Zellen (Abb. 35). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.

Die Transfektion der Zelllinie SKOV-3 führt zu einem ähnlichen Ergebnis wie bei der Zelllinie NIH3T3 (Abb. 36). Auch hier erfolgt eine Zunahme der Aktivität beim Übergang vom Konstrukt A-3 zum Konstrukt B-3 und das Konstrukt F-3 zeigt keine Promoteraktivität mehr. Im Unterschied zu NIH3T3 liegt aber hier die Aktivität von D-3 um 40% über der Aktivität von A-3. E-3 zeigt dafür eine deutlich geringere Aktivität von nur 33% der Aktivität von A-3. Auch die Konstrukte A-2 und A-1 besitzen in SKOV-3 eine deutlich niedrigere Promoteraktivität als in NIH3T3, nur 22% (A-2) und 8% (A-1).

	Abbildung 36: Aktivität der verschiedenen Promoterkonstrukte in der Zelllinie SKOV-3 im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega). Oberhalb der Balken sind die im Vergleich zum vorherigen Balken entfernten Transkriptionsfaktorbindungsstellen aufgeführt. Die Aktivitäten sind relativ zum Wert der Aktivität des Leervektors pGL3-Basic angegeben.

Tabelle 19: Zahlenwerte zum Reporter Assay in SKOV-3 Zellen (Abb. 36). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.

Dagegen verhalten sich in der Zelllinie A27/80 die Konstrukte etwas anders (Abb. 37). Auffallend ist vor allem die Abnahme der Promoteraktivität beim Übergang von A-3 nach B-3. Auch die Aktivität der folgenden Konstrukte C-3 bis E-3 liegen alle unterhalb der Aktivität von A-3. Besonders D-3 zeigt im Vergleich zu den Zelllinien SKOV-3 und NIH3T3 eine sehr geringe Aktivität von nur 45% der Aktivität von A-3. F-3 besitzt wiederum keine Promoteraktivität mehr mit nur 7% der Aktivität von A-3. A-2 verhält sich, entsprechend dem Experiment in der Zelllinie SKOV-3, mit einer Rest-Aktivität von 19%.

	Abbildung 37: Aktivität der verschiedenen Promoterkonstrukte in der Zelllinie A27/80 im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega). Oberhalb der Balken sind die im Vergleich zum vorherigen Balken entfernten Transkriptionsfaktorbindungsstellen aufgeführt. Die Aktivitäten sind relativ zum Wert der Aktivität des Leervektors pGL3-Basic angegeben.

Tabelle 20 Zahlenwerte zum Reporter Assay in A27/80 Zellen (Abb. 37). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.

Um die Bedeutung der ISRE/IRF-1-Bindungsstelle genauer zu untersuchen, wurden in verschiedenen Zelllinien die Aktivitäten der Konstrukte A-3 und B-3 wiederholt verglichen. Die Aussagen dieser Experimente ergaben jedoch keinen reproduzierbaren, signifikanten Unterschieden zwischen A-3 und B-3 (Abb. 38).

	Abbildung 38: Aktivität der Promoterkonstrukte A-3 und B-3 in der Zelllinie OVCAR-3, PA-1 und A27/80 im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega). Oberhalb der Balken ist die im Vergleich zum vorherigen Balken entfernte Transkriptionsfaktorbindungsstelle IRF-1/ISRE aufgeführt.

Tabelle 21: Zahlenwerte zum Reporter Assay in OVCAR-3, PA-1 und A27/80 Zellen (Abb. 38). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde jeweils gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.

Insgesamt scheint die Methode der transienten Transfektion nicht ausreichend zu sein, um die Rolle der ISRE-Bindungsstelle für die Aktivität des Promoters zu bestimmen.

Trotzdem zeigen die Experimente erste Ergebnisse, die Rückschlüsse auf wichtige, regulatorische Elemente des H REV107 1 Promoters zulassen. So führt der Übergang von E-3 zu F-3 zum vollständigen Verlust der Promoteraktivität. In diesem Bereich liegen die Elemente der basalen Promoter Aktivität. Dieses Ergebnis zeigen die hier untersuchten Zelllinien NIH3T3, SKOV-3 und A27/80. In den folgenden Experimenten soll der Einfluss verschiedener Signalwege auf die Aktivität des Promoterkonstrukts untersucht werden.

Die weiteren Experimente zur Untersuchung des H REV107 1 Promoters werden hauptsächlich in der Zelllinie NIH3T3 durchgeführt, da der Promoter in einem Umfelds analysiert werden soll, der einer normalen Zelle am ehesten entspricht. NIH3T3 ist hier, neben HOSE, die einzige nicht maligne Zelllinie. NIH3T3 lässt sich aber, im Gegensatz zu HOSE, sehr gut transfizieren. Die Tumorzelllinien A27/80, OVCAR-3, SKOV-3 und PA-1 besitzen alle deregulierte Signalwege. H REV107 1 wird in der Zelllinie SKOV-3 exprimiert und scheint hier keine Funktion als Wachstums-Suppressor auszuüben. In den Zelllinien OVCAR-3 und A27/80 ist die Promoteraktivität sehr schwach. Dies kann zu Problemen bei der Interpretation von Daten führen, wenn die Aktivitätsänderungen auf Grund der geringen Gesamtaktivitäten nicht deutlich sichtbar werden.

Die Zelllinie NIH3T3 wird nach Transfektion mit dem Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 mit verschiedenen Reagenzien behandelt, die zur Induktion definierter Signalwege führen. IFN-γ aktiviert den STAT-Signalweg, TNF-α den NFκB-Signalweg und cAMP den Transkriptionsfaktor CREB. Nogalamycin stimuliert die Phosphorylierung des GC-Box-bindenden Transkriptionsfaktors SP-1 und steigert die Bindung von SP-1 an die DNA. (Rafty L. A., Nucleic Acids Research, 2001, 29, 5).

	Abbildung 39: Induktion von NIH3T3 Zellen mit verschiedenen Reagenzien und Messung der Aktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts A-3. Die Behandlung erfolgt für 24 Stunden und beginnt 4 Stunden nach der Transfektion der Zellen mit dem Promoterkonstrukt. Die Konzentrationen bezeichnen die Endkonzentrationen im Medium. Die Aktivitäten sind relativ zum Wert der Aktivität des Leervektors pGL3-Basic angegeben.

Wie Abbildung 39 zeigt, führt die Aktivierung des STAT-Signalwegs (IFN-γ) zu einer Aktivitätszunahme des Promoters von 22%. Nach Behandlung der Zellen mit TNF-α steigt die Aktivität des Konstrukts um 78%. Dieser deutliche Anstieg zeigt eine klare Abhängigkeit des H REV107 1 Promoters von einem durch TNF-α induzierten Signalweg. Die Behandlung der Zellen mit cAMP und die damit verbundene Aktivierung des CREB-Signalwegs führt zu einer Steigerung der Aktivität um 32%. Nogalamycin hingegen vermindert die Aktivität des Promoterkonstrukts um 52%.

Tabelle 22 Zahlenwerte zum Reporter Assay in NIH3T3 Zellen (Abb. 39). Der Wert für das unbehandelte Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Messungen beziehen sich auf diese 100%.

Nur die Induktion des Promoterkonstrukts A-3 mit TNF-α führt zu einer deutlich gesteigerten Promoteraktivität. Durch die Induktion der Deletionskonstrukte soll jetzt untersucht werden, ob die induzierte Aktivitätssteigerung einem bestimmten Sequenzabschnitt zugeordnet werden kann. Dazu werden die Deletionskonstrukte A-3 bis F-3 in NIH3T3 Zellen transfiziert und mit 1000U/ml TNF-α behandelt. Das Ergebnis ist in Abbildung 40 dargestellt. Die Induktion der Zelllinie mit TNF-α führt zu einer höheren Aktivität der Promoterkonstrukte A-3 bis D-3. Erst beim Konstrukt E-3 existiert trotz Behandlung mit TNF-α keine gesteigerte Promoteraktivität mehr. Ob dies bedeutet, dass in dem Bereich zwischen D-3 und E-3 eine, für die Steigerung der Aktivität durch TNF-α verantwortliche, Bindungsstelle liegt, kann daraus nicht abgeleitet werden.

Da die Aktivität des Konstrukts E-3, sowohl im TNF-α induzierten als auch im unbehandelten Zustand, nur noch bei 14% der Ausgangsaktivität liegt, besteht auch die Möglichkeit, eine möglicherweise vorhandene Induktion nicht mehr sichtbar ist. Eine Analyse des Sequenzbereiches zwischen D-3 und E-3 mit dem Programm MatInspector zeigt keine bekannte TNF-α abhängige Bindungsstelle. Auch bei der Aktivität des Konstrukts F-3, die mit 3% Restaktivität gegen Null geht, zeigt sich kein Unterschied mehr zwischen der mit TNF-α induzierten und der nicht induzierten Messung.

	Abbildung 40: Aktivität verschiedener Promoterkonstrukte in der unbehandelten oder mit TNF-α (1000 U/ml) behandelten Zelllinie NIH3T3 im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega). Oberhalb der Balken sind die im Vergleich zum vorherigen Konstrukt entfernten Transkriptionsfaktorbindungsstellen aufgeführt. Die Aktivitäten sind relativ zum Wert der Aktivität des Leervektors pGL3-Basic angegeben.

Tabelle 23: Zahlenwerte zum Reporter Assay in NIH3T3 Zellen (Abb. 40). Der Wert für das in unbehandelte NIH3T3 Zellen transfizierte Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.

Die Aktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts wird durch TNF-α induziert. Dieses Ergebnis entspricht der beobachteten Induktion der endogenen H REV107 1 Expression durch TNF-α in der Nierenkarzinomzelllinie MZ1257 (Abb. 19) und deutet auf eine Abhängigkeit des H REV107 1 Promoters vom NFκB-Signalweg hin. Die Aktivitäten der Deletionskonstrukte lassen aber keinen direkten Rückschluss auf die Position einer involvierten Transkriptionsfaktorbindungsstelle zu. IFNγ und cAMP zeigen nur eine schwache Induktion der Promoteraktivität.

Die Experimente mit den Deletionskonstrukten zeigen Bereiche, die eine regulatorische Funktion für den Promoter besitzen. Diese Ergebnisse sollen nicht nur Sequenzbereichen, sondern definierten Transkriptionsfaktorbindungsstellen zugeordnet werden. Dazu werden einzelne Bindungsstellen durch den Austausch von Basen spezifisch mutiert und die verbleibende Promoteraktivität des Konstrukts bestimmt.

Die in silico Analyse der Promotersequenz mit der Software MatInspector von Genomatix (siehe Kapitel 3.6.4) führte zu einer Liste von potentiellen Transkriptionsfaktorenbindungsstellen. Diese wird mit den bisherigen Ergebnissen verglichen.

1) Ein essentieller Teil des Core Promoters liegt vermutlich im Sequenzbereich –491 bis –414, entsprechend dem Bereich zwischen den Primern E und F. Die Deletion dieses Bereichs führt zu einem vollständigen Aktivitätsverlust des Reporterkonstrukts. Der Bereich enthält die potentiellen, regulatorischen Elemente GC-Box, CREB-1 Element und CCAAT-Box#1.

2) Zwischen den Basen – 991 und – 973, entsprechend dem Bereich zwischen den Primern A und B, liegt ein negativ-regulatorisches Element. Hier befindet sich das Element ISRE/IRF-1.

3) Die Induzierbarkeit des Promoterkonstrukts A-3 durch IFN-γ, TNF-α und cAMP legt nahe, dass die Bindungsstellen für IRF-1 (Basen -989 bis –977), STAT (Basen -341 bis –353), cRel (eine Untereinheit von NFκB, Basen –347 bis -358) und CREB (Basen –450 bis –439) für die Regulation des Promoters eine wichtige Rolle spielen.

Diese Transkriptionsfaktorbindungsstellen werden mit Hilfe des „Quik Change Site-Directed Mutagenesis“-Kits (Stratagene) verändert. Dabei werden ein oder zwei Basen so ausgetauscht, dass bei einer Wiederholung der in silico Analyse die zuvor gefundene Transkriptionsfaktorbindungsstelle auch mit weniger stringenten Suchkriterien nicht mehr gefunden wird. Hierbei wird sorgfältig darauf geachtet, dass durch die eingeführten Mutationen keine weiteren Bindungsstellen zerstört bzw. neue Bindungsstellen geschaffen werden. Neben den bereits erläuterten Bindungsstellen wird auch das Element CCAAT-Box #2, das sich direkt 5´ von dem Element CCAAT-Box #1 und dem Transkriptionsstartpunkt DBTSS befindet, und die Elemente AP-1 und AP-4, die sich im Sequenzbereich zwischen den Primern C und D befinden, mutiert.

Nach Transfektion der mutierten Konstrukte in die Zelllinie NIH3T3 zeigt sich im Dualen Luciferase Assay, welche Transkriptionsfaktorbindungsstellen eine funktionelle Rolle in der Promoteraktivität spielen (Abb. 41).

Tabelle 24: Tabelle der in die potentiellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen eingeführten Mutationen. Im Vergleich werden die Erkennungssequenzen (ES) des Wildtyps (wt) und der mutierten Form (mt) gezeigt. Eingeführte Mutationen sind mit großen Buchstaben gekennzeichnet. Die Position gibt die Position der Bindungsstelle innerhalb des Promoters an. (Translationsstart = +1)

Besonders stark ist die durch Mutation der Bindungsstelle cRel #1 erzielte Aktivitätsabnahme. Hier beträgt die Restaktivität des Konstrukts cRel #1 mt nur 9% der Ausgangsaktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts A-3. Die Mutation der, in direkter Nachbarschaft liegenden, Bindungsstelle cRel #2 (Konstrukt cRel #2 mt) führt zu einer Restaktivität von 35%, die gemeinsame Mutation der cRel Bindungsstellen (Konstrukt cRel #1 + cRel #2 mt) zeigt eine Restaktivität von 7%. Dies zeigt, dass die erste cRel Bindungsstelle eine höhere Funktionalität für den H REV107 1 Promoter besitzt als die zweite cRel Bindungsstelle, und dass diese Bindungsstelle essentiell für die Aktivität des Promoters ist.

Von ebenfalls wesentlicher Bedeutung für die Aktivität des Promoters ist die Bindungsstelle CREB. Die Mutation dieses Sequenzmotivs (Konstrukt CREB-1 mt) führt ebenfalls zu einer starken Abnahme der Promoterleistung, hier ergibt sich eine Restaktivität von nur 37%.

Die Mutation in der Bindungsstelle CCAAT-Box #1 (Konstrukt CCAAT #1 mt) zeigt keine signifikante Abnahme der Aktivität, die Mutation der Bindungsstelle CCAAT-Box #2 (Konstrukt CCAAT #2 mt) überhaupt keine Abnahme der Aktivität. Die gemeinsame Mutation der beiden CCAAT-Bindungsboxen (Konstrukt CCAAT #1 mt + CCAAT #2 mt) führt zu einer Abnahme der Promoteraktivität um 50%. Dies erreicht auch die Mutation der GC-Box (Konstrukt GC-Box mt). Die gemeinsame Mutation der AP-1 und der AP-4 Bindungsstelle (Konstrukt AP-1 mt + AP-4 mt) führt zu einer Restaktivität des Promoters von 60%.

	Abbildung 41: Aktivität mutierter Promoterkonstrukte sowie des methylierten Gesamtpromoter-Konstrukts (A-3 methyliert) in der Zelllinie NIH3T3

Tabelle 25: Zahlenwerte zum Reporter Assay in NIH3T3 Zellen (Abb. 41). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.

Die Mutation von STAT (Konstrukt STAT mt) führt zu keiner signifikanten Abnahme der Promoteraktivität. Auch die Mutation von IRF-1 (Konstrukt IRF mt) senkt die Aktivität des Promoters nicht, im Gegenteil die Aktivität nimmt um etwa 40% zu. Dies ist bemerkenswert, da die Transkriptionsfaktorbindungsstelle für IRF-1 auf dem 5´-Ende des Promoters liegt. Dies entspricht genau dem Abschnitt, der bei der Deletion von A-3 nach B-3 verloren geht.

Auch im Deletionsassay konnte in der Zelllinie NIH3T3 eine Zunahme der Promoteraktivität um 25% festgestellt werden. Obwohl eine klare Induktion der endogenen H REV107 1 Expression durch IFN-γ und IRF-1 festgestellt werden kann, lässt sich in vitro im transienten Assay und in Abwesenheit von IFN-γ keine direkte, stimulierende Rolle des Elements IRF-1/IRSE nachweisen.

Die Promoteraktivitäten des Konstrukts A-3 mit einigen mutierten Bindungsstellen werden auch in den Zelllinien SKOV-3 und OVCAR-3 untersucht. Hier zeigt sich ein Aktivitätsverlust nach cRel Mutation, der den in NIH3T3 Zellen beobachteten Ergebnissen entspricht. Die Mutation der IRF-Bindungsstelle hat hier keinen Einfluss.

	Abbildung 42: Aktivität der mutierten Promoterkonstrukte in den Zelllinien a)SKOV-3 und b) OVCAR-3 im Dualen Luciferase Reporter Assay (Promega).

Tabelle 26: Zahlenwerte zum Reporter Assay in SKOV-3 3 und OVCAR-3 Zellen (Abb. 42). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde jeweils gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.

Die Mutation einer oder beider cRel Bindungsstellen führt zu einer starken Abnahme der Promoteraktivität. cRel ist eine von mehreren möglichen Untereinheiten des Transkriptionsfaktors NFκB, dessen Aktivität durch vielfältige Bedingungen induziert wird und der in zahlreichen, sowohl apoptopischen als auch anti-apoptopischen, Signalwegen eine Rolle spielt. Als Beispiel wird der Signalweg, der über den TNF-Rezeptor zur Aktivierung von NFκB führt, gezeigt (Abb. 43). TNF-α bindet an den TNF-Rezeptor-1. An den Rezeptor assoziierte Proteine leiten das Signal bis zu TRAF2. Dieses aktiviert die Kinase NIK, welche wiederum den Kinase Komplex IKK aktiviert. IKK setzt sich aus IKKα, IKKβ und IKKγ zusammen. IKK phosphoryliert IκB, das NFκB, durch Maskierung des NFκB-eigenen „Nuclear Localisation Signals“, als Suppressor im Zytosol bindet. Auf Grund der Phosphorylierung von IκB spaltet sich der NFκB-IκB-Komplex auf und IκB wird vom Proteasom abgebaut. Das freie NFκB wandert in den Zellkern und bindet an die entsprechenden Bindungsstellen in den Promotoren von Zielgenen.

NFκB besteht selbst aus zwei Untereinheiten. Diese Untereinheiten stammen aus der Rel-Proteinfamilie und bilden Homo- oder Heterodimere. Zu den Mitgliedern der Familie gehören p50 (NFκB1), p52 (NFκB2), Rel-A (p65), Rel-B und cRel. Die am häufigsten vorkommende Form des NFκB ist das Heterodimer aus Rel-A (p65) und p50. Alle Mitglieder der Familie besitzen eine 300 Aminosäuren lange Rel Homologie Domäne, Rel-A, Rel-B und cRel besitzen außerdem eine transaktivierende Domäne. p50 und p52 werden aus den Vorläuferproteinen p105 und p100 durch proteolytischen Abbau gebildet. Über die Spezifität der NFκB-Isoformen ist sehr wenig bekannt. Mäuse mit einer homozygoten Deletion der verschiedenen Rel Gene besitzen jedoch charakteristische Phänotypen (de Martin et al., 1999; Baeuerle und Baltimore, 1996).

Das dominant negative Protein dn-IκB kann auf Grund der Mutation von Serin 32 und 36 zu Alanin nicht mehr phosphoryliert werden (Franek et al., 2001). Da die Maskierung von NFκB nicht aufgehoben werden kann, inhibiert dn-IκB jede DNA-Bindungsaktivität der Proteine der NFκB-Familie vollständig (Baeuerle und Baltimore, 1996).

	Abbildung 43: Schematische Darstellung des NFκB-Signalwegs. Die Aktivierung des TNF-Rezeptors führt zum proteasomalen Abbau von IκB und zur Translokation von NFκB in den Kern (de Martin et al, 1999).

Um zu überprüfen, ob H REV107 1 ein Zielgen von NFκB ist, werden verschiedene Ko-Transfektionen mit dominant-negativem dn-IκB durchgeführt. Die Behandlung der Zellen mit TNF-α erhöht die Aktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts A-3 im Reporter Assay um etwa 50% (Abb. 44). Ko-Transfektionen des NFκB-Inhibitors dn-IκB senken hingegen die Aktivität des Promoters um 50%. Die Aktivität des mit TNF-α behandelten cRel #1 mt Konstrukts, indem das erste der beiden cRel Motive mutiert ist, liegt bei etwa 20% und damit deutlich höher als die Aktivität von 9%, die das gleiche Konstrukt ohne Behandlung mit TNF-α zeigt (Abb. 41). Dies bedeutet möglicherweise, dass die Induktion durch TNF-α über eine zweite Bindungsstelle laufen kann. Allerdings liegt auch die Aktivität des Konstrukts cRel #1 mt, nach Ko-Transfektion von dn-IκB, mit 13% über der Aktivität von 9% des Konstrukts cRel #1 mt. Diese niedrigen Werte bedeuten alle, dass der Promoter unter diesen Umständen keine Aktivität mehr besitzt. Eine weitergehende Interpretation der Daten ist daher nicht seriös. Trotzdem besteht die Möglichkeit, dass die Bindungsstelle cRel #2 die Funktion der Bindungsstelle cRel #1 zumindest teilweise ersetzen kann.

	Abbildung 44: Einfluss des TNF-α-Signalweges bzw. des NFκB-Inhibitors dn-IκB auf die Aktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts A-3 ohne und mit Mutation der cRel #1 Bindungsstelle. Die Behandlung der Zellen mit 1000 U TNF-α/ml erfolgte für 48 Stunden.

Tabelle 27: Zahlenwerte zum Reporter Assay in unbehandelten oder mit TNF-α (1000U/ml) behandelten NIH3T3 Zellen (Abb. 44). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte der weiteren Konstrukte beziehen sich auf diese 100%.

Die Methylierung von CpG-Inseln kann zu einer Inaktivierung einzelner Elemente eines Promoters führen. Daraus kann eine vollständige Suppression der Genexpression resultieren. Da dies auch beim H REV107 1 Promoter der Fall sein kann, wird die Promotersequenz mit Hilfe des Analyseprogramms CPGPLOT (http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/) untersucht. Die vom Programm als überdurchschnittliche CpG-Häufungen erkannten Bereiche sind in der folgenden Sequenz mit fetten Buchstaben dargestellt (Abb. 45). Dies betrifft fast den gesamten Bereich des Promoters. Zur Orientierung sind sowohl der maximale Transkriptionsstartpunkt TSP als auch der Translationsstartpunkt +1 eingezeichnet. Allerdings haben die Northern Blot Hybridisierungsassays keine Suppression der Genexpression durch Methylierung gezeigt, da die Behandlung der Zelllinien OVCAR-3, A27/80, OAW und SKOV-3 mit 5-Aza-2´-Desoxycytidine nicht zur Aufregulation der H REV107 1 Expression führt (Abb. 7).

	Abbildung 45: Analyse der H REV107 1 Promotersequenz mit CPGPLOT. Es zeigt sich, dass die gesamte Promotersequenz bis in den 5´-Bereich des Gens hinein sehr CpG-reich ist.

Um zu testen, ob der H REV107 1 Promoter überhaupt durch Methylierung inaktiviert werden kann, wird das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 mit Hilfe der Methylase SssI in vitro methyliert und anschließend in NIH3T3 Zellen transfiziert. Die Aktivität des methylierten Konstrukts erreicht nur 30% des Wertes des nicht-methylierten Konstrukts A-3 (Abb. 46).

	Abbildung 46: Aktivität des, mit der Methylase SssI methylierten, Promoterkonstrukts A-3 methyliert im Vergleich zum nicht methylierten Konstrukt A-3.

Tabelle 28: Zahlenwerte zum Reporter Assay in NIH3T3 Zellen (Abb. 46). Der Wert für das Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 wurde gleich 100% gesetzt. Die Werte des methylierten A-3 Konstrukts bezieht sich auf diese 100%.

Dies zeigt, dass eine Methylierung des Promoters möglich ist und dass dies zu einer Inaktivierung der Genexpression führen kann. Diana Busch aus der Arbeitsgruppe von Prof. Jörn Walter (Saarbrücken) untersucht den Methylierungsstatus des ersten Introns des H REV107 1 Gens. Die Zelllinien HOSE, OAW42 sowie Proben aus humanem Blut zeigen keine relevante Methylierung des ersten Introns. In der Zelllinie OVCAR-3 hingegen ist das erste Intron an allen CpG-Inseln methyliert. Eine weiterführende Untersuchung des Methylierungsgrades des H REV107 1 Promoters in verschiedenen Zelllinien steht noch aus.

Die verschiedenen Experimente mit dem Dualen Luciferase System zeigen die funktionelle Bedeutung einiger Bindungsstellen im H-REV107-1 Promoter. Die cRel #1 Bindungsstelle ist für die Aktivität des Promoters sehr wichtig. Dies zeigt der hohe Aktivitätsverlust nach Mutation der Bindungsstelle. Des weiteren aktiviert die Behandlung mit TNF-α, einem Aktivator des NFκB-Signalwegs, die Gesamtpromoter Aktivität. Eine weiteres, wichtiges Element des Promoters ist die CREB Bindungsstelle. Die Mutation dieser Bindungsstelle führt ebenfalls zu einem deutlichen Aktivitätsverlust des Promoterkonstrukts.

Die STAT Bindungsstelle zeigt im Dualen Reporter Assay keine funktionelle Bedeutung für die Promoteraktivität. Bei der IRF-1/ISRE Bindungsstelle scheint es sich um Repressor Element zu handeln. Sowohl die Deletion als auch die Mutation dieser Bindungsstelle führt zu einer Aktivitätssteigerung des Promoterkonstrukts, d.h. die durch IFN-γ beobachtete mRNA Expression des H REV107 1 Gens lässt sich mit transienten Promoter Assays nicht nachvollziehen.

Nachdem jetzt die potentiellen, funktionellen Bereiche des Promoters definiert sind, sollen die an diese Elemente bindenden Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. Zur Analyse dieser in vitro an den Promoter bindenden Proteine wird ein Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) durchgeführt. Bei diesem werden die gesammelten Kernproteine einer Zelllinie mit ³²P-markierten DNA-Abschnitten, auf denen sich die Sequenz für eine Transkriptionsfaktorbindungsstelle befindet, inkubiert. Sollten sich im Zellkern Transkriptionsfaktoren befinden, die an diese Bindungsstelle binden, so trennt sich in einem Polyacrylamidgel der entstandene Komplex auf Grund seiner geringeren Laufgeschwindigkeit von den ungebundenen Oligonukleotiden ab.

Tabelle 29: Übersicht über die im Verlauf der Experimente verwendeten Oligonukleotide

Auf Grund der Ergebnisse der Reporter Assays werden die Bindungsstellen für cRel und CREB-1 ausgewählt, um in einem Electrophoretic Mobility Shift Assay untersucht zu werden. Mit diesem soll geprüft werden, ob in vitro Transkriptionsfaktoren an diese DNA-Sequenzen binden. Da das im EMSA benutzte cRel-Oligonukleotid nicht nur die beiden cRel Bindungsstellen, sondern auch die überlappende, potentielle STAT-Bindungsstelle beinhaltet, werden die aus der Literatur bekannten STAT-Bindungsstellen als Kontrolle im EMSA eingesetzt. Das Oligonukleotid, das die beiden cRel Bindungsstellen des H REV107 1 Promoters enthält, wird so im Vergleich zu den in der Literatur beschriebenen NFκB- und STAT-Bindungsstellen getestet. Außerdem wird das Oligonukleotid, das die CREB Bindungsstelle des H REV107 1 Promoters beinhaltet, im Vergleich zu einer in der Literatur beschriebenen CREB Bindungsstelle getestet.

Die bisherigen, für die Bindungsstellen im H REV107 1 Promoter benutzten Bezeichnungen cRel und CREB-1 beruhen auf der Analyse der Software MatInspector. Ob die Kernproteine cRel bzw. CREB-1 tatsächlich an diese Sequenzmotive binden, sollen die weiteren in diesem Kapitel beschriebenen Versuche zeigen.

Neben den Kernextrakten unbehandelter NIH3T3 Zellen werden auch Kernextrakte aus Zellen gesammelt, die zuvor mit TNF-α bzw. cAMP inkubiert worden sind. Diese Behandlung soll die Signalwege aktivieren und zu einer verstärkten Bindung der Kernproteine an die DNA führen. TNF-α sollte die Bindung von NFκB (inklusive der Untereinheit cRel) und cAMP die Bindung von CREB-1 an die DNA aktivieren. Ob die Kernproteine aus unbehandelten oder behandelten Zellen gewonnen wurden, ist unterhalb der jeweiligen Abbildung vermerkt.

3.8.1  Analyse der potentiellen cRel-Bindungsstelle

Die Abbildung 47 zeigt die Ergebnisse zweier Electrophoretic Mobility Shift Assays. Die verschiedenen Banden zeigen die radioaktiv markierten Oligonukleotide, die von Kernproteinen gebunden wurden. Die Signale kann man als Bandenmuster der jeweiligen Kernextrakte in Kombination mit den verwendeten Oligonukleotiden lesen. Im Versuch zur Abbildung 47a) wurden Kernproteine unbehandelter Zellen und in Abbildung 47b) Kernproteine TNF-α behandelter Zellen verwendet.. Die Behandlung der Zellen mit TNF-α führt im Fall des Oligonukleotids NFκB zu einer Veränderung des Bandenmusters. Das Signal, welches bei den unbehandelten Zellen am unteren Rand des Gels sichtbar ist, verschwindet im Experiment der mit TNF-α behandelten Zellen. Dafür ist hier das sich weiter oben befindende Signal sehr viel stärker als im Vergleich zu dem Experiment mit den unbehandelten Zellen. Die aus dem Oligonukleotid cRel (H-REV107-1) und den Kernproteinen gebildeten Komplexe zeigen keinen signifikanten Unterschied zwischen den Experimenten der TNF-α behandelten und den unbehandelten Zellen. Auch die mit den verschiedenen STAT-Oligonukleotiden durchgeführten Experimente zeigen keinen signifikanten Unterschied in ihrem Bandenmuster.

Wäre das Bandenmuster der Spur cRel (H-REV107-1) mit einem der Bandenmuster der anderen Spuren identisch, so könnte man schlussfolgern, dass in diesen Fällen die selben Kernproteine an die Oligonukleotide binden.

Da die bindenden Kernproteine für die, aus der Literatur entnommenen, Oligonukleotidsequenzen bekannt sind, hätte man die Suche nach den an die Sequenz cRel (H-REV107-1) bindenden Kernproteine bereits einschränken können.

In den verschiedenen Spuren zeigen sich jedoch deutliche Unterschiede in den Bandenmustern der Protein-Oligonukleotid Komplexe. Dies ist aber nicht überraschend, da die dem Promoter entnommene und die aus der Literatur bezogenen Sequenzen unterschiedlich sind. Es lässt sich annehmen, dass an die unterschiedlichen Sequenzen auch unterschiedliche Kernproteine binden. Bereits ein kleiner Unterschied in der Sequenz kann das Bindungsvermögen von einem Mitglied einer Transkriptionsfaktorenfamilie zu einem anderen Mitglied der selben Familie verschieben. Obwohl durch TNF-α Zugabe die Aktivität des H REV107 1 Promoter deutlich gesteigert wird, lässt sich in den EMSA Experimenten kein verändertes, TNF-α abhängiges Bandenmuster erkennen.

In weiteren Versuchen wird genauer untersucht, ob und welche Mitglieder der NFκB-Familie an die Bindungsstelle des H REV107 1 Promoters binden.

	Abbildung 47: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 10 μg Kernproteine a) unbehandelter NIH3T3 Zellen bzw. b) mit 500 U/ml TNF-α behandelter NIH3T3 Zellen auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten.

Ob Kernproteine spezifisch nur an eine bestimmte Sequenz binden, oder ob nicht das selbe Kernprotein unspezifisch an verschiedene Sequenzen bindet, lässt sich feststellen, indem man einen Überschuss an unmarkierten, spezifischen oder unspezifischen Oligonukleotiden als Kompetitoren einsetzt.

Wird ein unmarkiertes Oligonukleotid in großem Überschuss eingesetzt, so werden die Kernproteine proportional zum verwendeten Verhältnis unmarkiertes zu markiertem Oligonukleotid an dieses binden, da die Kernproteine nicht zwischen unmarkierten und markierten Oligonukleotiden unterscheiden. Die gebildeten Komplexe aus Kernprotein und unmarkiertem Oligonukleotid sind auf Grund des fehlenden ³²P auf dem Röntgenbild nicht zu sehen, die entsprechende Bande verschwindet.
Dieses Verfahren wird nun benutzt, um die Spezifität der verschiedenen Signale innerhalb einer Spur zu überprüfen. Das Ergebnis ist in Abb. 48 dargestellt. Die erste Spur cRel (H-REV107-1) zeigt das Bandenmuster der gebildeten Kernprotein-cRel (H-REV107-1) Oligonukleotid Komplexe. Es ist eine deutliche Bande zu sehen. In der dritten Spur cRel (H-REV107-1) + Kompetitor NFκB (Literatur) wird untersucht, ob sich diese Bande durch den Einsatz des Kompetitors NFκB (Literatur) verdrängen lässt. Dies ist nicht der Fall. Das bedeutet, die an die Sequenz des Oligonukleotids cRel (H-REV107-1) bindenden Kernproteine binden nicht an die Sequenz des Oligonukleotids NFκB (Literatur). In der darauf folgenden Spur cRel (H-REV107-1) + Kompetitor (H-REV107-1) wird als positive Kontrolle gezeigt, dass die Bindung der Kernproteine an das radioaktiv markierte Oligonukleotid cRel (H-REV107-1) von dem identischen, unmarkierten Oligonukleotid cRel (H-REV107-1) verdrängt wird.

	Abbildung 48: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 7 μg Kernproteine unbehandelter NIH3T3 Zellen auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. Die Kompetitoren sind im 100-fachen Überschuss eingesetzt worden.

In einem weiteren Ansatz wird der Umkehrschluss überprüft. In der zweiten Spur NFκB (Literatur) führt die Bindung der Kernproteine an das Oligonukleotid NFκB (Literatur) zu vier, relativ schwachen Signalen. Durch den Einsatz des Kompetitors cRel (H-REV107-1) in der Spur NFκB (Literatur) + Kompetitor cRel (H-REV107-1) werden diese Banden nicht ausgelöscht, d.h. das Oligonukleotid NFκB (Literatur) wird nicht aus seinem Komplex mit den Kernproteinen gedrängt.

Die Positiv-Kontrolle ist in der Spur NFκB (Literatur) + Kompetitor NFκB (Literatur) zu sehen. Hier sind keine Banden mehr zu sehen, da der Überschuss an unmarkierten Oligonukleotid NFκB (Literatur) das radioaktiv markierte Oligonukleotid NFκB (Literatur) aus den Komplexen mit den Kernproteinen verdrängt. Diese Experimente zeigen klar, dass die Oligonukleotide cRel (H-REV107-1) und NFκB (Literatur) von verschiedenen Kernproteinen gebunden werden, da jeweils das eine Oligonukleotid nicht in der Lage ist, das jeweils andere Oligonukleotid aus dessen Oligonukleotid-Kernprotein Komplex zu verdrängen.

Die gleichen Experimente, die die Bindung von Kernproteinen an die Sequenz des Oligonukleotids cRel (H-REV107-1) nachweisen konnten, werden jetzt mit dem Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) durchgeführt. Das der H REV107 1 Promotersequenz entsprechende CREB (H-REV107-1) Oligonukleotid wird mit dem, in der Literatur als Bindungsmotif für den Transkriptionsfaktor CREB-1 beschriebenen, Oligonukleotid CREB (Literatur) verglichen.

Die Ergebnisse zweier EMSA Assays sind in Abbildung 49 dargestellt. Während in dem Experiment zur Abbildung 49a) die Kernproteine unbehandelter NIH3T3 Zellen verwendet werden, ist in der Abbildung 49b) das Ergebnis der Bindung von Kernproteinen aus mit cAMP behandelten NIH3T3 Zellen an die entsprechenden Oligonukleotide zu sehen. In beiden Fällen sieht man deutliche Unterschiede zwischen den Bandenmustern der Oligonukleotid-Kernprotein Komplexe.

Das Bandenmuster des Oligonukleotids CREB (Literatur) zeigt zwei, das Bandenmuster des Oligonukleotids CREB (H-REV107-1) drei Signale, wobei auch die Positionen der einzelnen Signale unterschiedlich sind. Dies zeigt, dass die Oligonukleotide CREB (H-REV107-1) und CREB (Literatur) von Kernproteinen verschiedener Größe gebunden werden. Auf Grund der deutlich unterschiedlichen Signale ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass es sich bei dem an das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) bindende Kernprotein nicht um CREB-1 handelt. Die Behandlung der Zellen mit cAMP führt im Fall des CREB (Literatur) Oligonukleotids zu keiner Veränderung der Signale. In beiden Experimenten (behandelt und unbehandelt), sieht man zwei in etwa gleich starke Signale. Beim Einsatz des CREB (H-REV107-1) Oligonukleotids bewirkt die vorausgegangene Behandlung der Zellen mit cAMP eine Verschiebung der Signalintensität. In dem Experiment, bei dem Kernextrakte unbehandelter Zellen verwendet wurden, zeigen die beiden unteren Banden ein Signal gleicher Intensität, die obere Bande ein Signal mit einer etwas schwächeren Intensität. Die Verwendung von Kernextrakt aus cAMP-behandelten Zellen führt zu einer stärkeren Signalintensität der oberen Bande, während die mittlere Bande eine schwächere Intensität zeigt. Die Signalstärke der unteren Bande bleibt unverändert.

In weiteren Versuchen wird genauer untersucht, ob und welche Mitglieder der CREB-Familie an die Bindungsstelle des H REV107 1 Promoters binden.

	Abbildung 49: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 10 μg Kernproteine a) unbehandelter NIH3T3 Zellen oder b) cAMP behandelter Zellen (Endkonzentration: 200 μmol) auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten.

Jetzt wird untersucht, ob die hier bindenden Kernproteine eine spezifische Bindung an die Oligonukleotid-Sequenz eingehen, oder ob es sich um eine unspezifische Bindung handelt. Dazu werden die Oligonukleotide CREB (Literatur) und CREB (H-REV107-1) jeweils mit unmarkierten Kompetitoren und Kernproteinextrakt inkubiert. Dabei wird überprüft, ob das Oligonukleotid CREB (Literatur) in der Lage ist, die Kernproteine aus der Bindung an das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) zu verdrängen. Wäre dies der Fall, so wäre die Bindung der Kernproteine an die Sequenz CREB (H-REV107-1) nicht spezifisch bzw. würden die selben Kernproteine an die beiden Oligonukleotide binden. Als positive Kontrolle soll das unmarkierte Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) die Bindung der Kernproteine an das markierte Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) unterbinden. Die Verwendung des Oligonukleotids CREB mutiert (H-REV107-1) ergibt eine zusätzliche, negative Kontrolle.

Da die Basen, die laut Analyse-Software MatInspector spezifisch für die Bindung des Oligonukleotids an die Transkriptionsfaktoren der CREB-Familie sein sollen, so mutiert sind, dass das Programm keine Bindung mehr voraussagt, sollte dieser Kompetitor auch nicht in der Lage sein, die Bindung zwischen CREB (H-REV107-1) und den Kernproteinen zu stören. Die Einführung der selben Mutationen in die im Reporter-Assay verwendeten Konstrukte, führte zu einer Abnahme der Promoteraktivität um 63%.

Abbildung 50a) zeigt das Ergebnis dieser Experimente. In den ersten vier Spuren wird das markierte Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) eingesetzt. Die erste Spur zeigt die Bindung der Kernproteine an das Oligonukleotid. In der zweiten Spur wird als Kompetitor das unmarkierte Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) verwendet. Als Folge dessen verschwindet eine Bande vollständig (oberer Pfeil), eine zweite Bande ist nur noch schwach zu sehen (unterer Pfeil).

In der nächsten Spur sieht man das Ergebnis nach Verwendung des mutierten Oligonukleotids CREB mt (H-REV107-1) als Kompetitor. Hier verschwindet keine Bande vollständig, da die Kernproteine offenbar deutlich schlechter an das mutierte Oligonukleotid binden. In der vierten Spur sind ebenfalls alle Banden zu sehen. Es findet keine Verdrängung durch den Kompetitor CREB (Literatur) statt.

Die nächsten vier Spuren zeigen das Ergebnis des umgekehrten Versuchansatzes. Hier wird als markiertes Oligonukleotid das Oligonukleotid CREB (Literatur) eingesetzt und durch Zugabe verschiedener Kompetitoren die Spezifität der Bindung der Kernproteine an dieses Oligonukleotid untersucht.

Das Bandenmuster, das in der fünften Spur die Bindung der Kernproteine an das Oligonukleotid CREB (Literatur) zeigt, unterscheidet sich deutlich vom Bandenmuster der Bindung der Kernproteine an das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1). Es binden verschiedene Kernproteine an die beiden Oligonukleotide. Dies wird durch die weiteren Ergebnisse bestätigt. Die Verwendung des Kompetitors CREB (Literatur) führt zu einer deutlich schwächeren Bande im Bandenmuster (Pfeil rechts, sechste Spur). Wird der Kompetitor CREB (H-REV107-1) eingesetzt (siebte Spur), so ist die Bande wieder deutlich zu sehen.

Dies belegt, dass die Oligonukleotide CREB (Literatur) und CREB (H-REV107-1) von verschiedenen Kernproteinen gebunden werden. Die letzte Spur zeigt das Ergebnis nach Verwendung des Kompetitors CREB mt (H-REV107-1). Dass auch hier keine Banden verschwinden, d.h. die Bindung der Kernproteine an das markierte Oligonukleotid CREB (Literatur) nicht gestört wird, dient als in vitro Beweis dafür, dass durch die eingeführten Mutationen keine neuen Bindungsstellen entstanden sind, an die jetzt die Kernproteine binden könnten. Dies entspricht der Aussage der Analyse-Software MatInspector.

In Abbildung 50b) ist gezeigt, welche Unterschiede durch die Verwendung des Wildtyp bzw. des mutierten Oligonukleotids CREB (H-REV107-1) entstehen. Beim Einsatz des mutierten Oligonukleotids CREB mt (H-REV107-1) (linke Spur) verschwinden im Vergleich zum nicht mutierten CREB (H-REV107-1) Oligonukleotid (rechte Spur) zwei Banden (Pfeile).

Diese Banden entsprechen den Kernproteinen, die genau an die Basen binden, die mutiert wurden. Dies sind die selben Basen, deren Mutation zu der zuvor beschriebenen Abnahme der Promoteraktivität im Reporter Assay geführt haben. Das bedeutet, dass die hier bindenden Kernproteine mit hoher Wahrscheinlichkeit die Transkriptionsfaktoren sind, die im Reporter Assay auf Grund der eingeführten Mutationen nicht mehr binden konnten und so zum beobachteten Verlust der Promoteraktivität beitrugen.

	Abbildung 50: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 10 μg Kernproteine unbehandelter NIH3T3 Zellen auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. a) Kompetitoren sind im 100fachen Überschuss eingesetzt. Die Pfeile zeigen auf die Spots der radioaktiven, gebundenen Oligonukleotide, die durch Einsatz nicht-markierter, identischer Oligonukleotide, aber nicht durch den Einsatz nicht-markierter, mutierter bzw. unspezifischer Oligonukleotide verdrängt werden. b) Die Pfeile zeigen auf die Banden, die bei Verwendung des mutierten Oligonukleotids CREB mt (H-REV107-1) verschwinden.

Die bisher mittels EMSA durchgeführten Experimente führen zu folgenden Ergebnissen:

1. Die Sequenzmotive für die Transkriptionsfaktorbindungsstellen cRel und CREB, die der Sequenz des H REV107 1 Promoters entnommen sind, binden Kernproteine aus NIH3T3 Zellen. Bei dem Kernprotein, das an die Transkriptionsfaktorbindungsstelle CREB bindet, handelt es sich mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht um CREB-1, da die Bandenmuster für CREB (H-REV107-1) und CREB (Literatur) deutliche Unterschiede aufweisen und bekannt ist, dass an das Oligonukleotid CREB (Literatur) das Kernprotein CREB-1 bindet. Dies wird durch die Experimente mit Kompetitoren bestätigt, da der Kompetitor CREB (Literatur) nicht die Bindung von Kernproteinen an das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) und der Kompetitor CREB (H-REV107-1) nicht die Bindung der Kernproteine an das Oligonukleotid CREB (Literatur) beeinflusst. Für cRel sehen die Ergebnisse ähnlich aus. In der Literatur ist keine cRel-spezifische Bindungsstelle beschrieben, so dass hier als Vergleich die in der Literatur beschriebene Bindungsstelle für NFκB benutzt wird.
2. Das Oligonukleotid cRel (H-REV107-1) beinhaltet neben den beiden cRel Bindungsstellen auch eine überlappende Bindungsstelle für STAT-1. Da sich in Northern Blot Hybridisierungsassays gezeigt hat, dass die Expression des Gens H REV107 1durch IFN-γ induziert werden kann, soll eine mögliche Funktionalität dieser Bindungsstelle nicht ausschlossen werden, auch wenn sich diese im Reporter Assay nicht gezeigt hat. Daher wird das Bandenmuster des Oligonukleotids cRel (H-REV107-1) mit den Bandenmustern der in der Literatur beschriebenen Oligonukleotide für NFκB und den verschiedenen Mitgliedern der STAT-Familie verglichen. Es zeigt sich keine Übereinstimmung. Auch ist das als Kompetitor eingesetzte NFκB (Literatur) Oligonukleotid nicht in der Lage, die Bindung des Oligonukleotids cRel (H-REV107-1) an das Kernprotein zu verdrängen.
3. Im nächsten Schritt sind mutierte CREBmt (H-REV107-1) Oligonukleotide verwendet worden. Dieses wird von den Kernproteinen, die das nicht-mutierte CREB (H-REV107-1) Oligonukleotid gebunden haben, nicht erkannt. Der Austausch der entsprechenden Basen führt in der Analysesoftware MatInspector dazu, dass die Sequenz nicht mehr als CREB Bindungsstelle identifiziert wird, im Reporter Assay zu einem Verlust der Promoteraktivität von über 60 % und im EMSA zur Abwesenheit der Kernprotein-Oligonukleotid-Komplexe, die bei Verwendung des Oligonukleotids CREB (H-REV107-1) zu sehen sind.

Ob cRel oder ein anderes Mitglied der NFκB-Familie bzw. welches Mitglied der CREB-Familie an die verwendeten Sequenzmotive binden, soll mit Hilfe von Antikörpern und dem hierbei zu beobachtenden „Supershift“ geklärt werden.

Zur genauen Identifizierung der gebundenen Kernproteine wird dem Kernprotein-Oligonukleotid Gemisch jeweils ein spezifischer Antikörper zugegeben. Der Antikörper bindet je nach Spezifität ein oder mehrere Mitglieder einer Proteinfamilie. Wenn es zu einer Bindung des Komplexes an den Antikörper und damit zu einem Nachweis für die Identität des darin gebundenen Kernproteins kommt, zeigt sich das durch einen so genannten „Supershift“ des Spots. Dieser ergibt sich daraus, dass der Kernprotein-Antikörper-Oligonukleotid Komplex deutlich größer ist als der Kernprotein-Oligonukleotid Komplex. Daher bewegt sich dieser Komplex langsamer durch das Gel und zeigt im Verhältnis zum DNA-Protein Komplex ohne Antikörper ein nach oben verschobenes Signal.

Tabelle 30: Zum spezifischen Nachweis gebundener Transkriptionsfaktoren eingesetzte Antikörper

Die Oligonukleotide cRel (H-REV107-1) und NFκB (Literatur) werden mit Kernextrakt und verschiedenen Antikörpern inkubiert. Die Abbildung 51a) zeigt das Ergebnis der Inkubation mit den Antikörpern cRel (C) und NFκB p65 (A).

Im Vergleich zur Inkubation ohne Antikörper (erste Spur; cRel (H-REV107-1)) zeigt die Inkubation des Oligonukleotid-Kernprotein Komplexes cRel (H-REV107-1) mit den Antikörpern cRel (C) und NFκBp65 (A) keinen Supershift (zweite bzw. dritte Spur). Im Fall des Oligonukleotids NFκB (Literatur) kommt es mit beiden Antikörpern zu einem Supershift.

Das bedeutet, dass die von den beiden Antikörpern erkannten Proteine cRel p75 und NFκB p65 an die NFκB (Literatur) Sequenz, aber nicht an die cRel (H-REV107-1) Sequenz binden.

	Abbildung 51: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 10 μg Kernproteine unbehandelter NIH3T3 Zellen auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. Die Pfeile zeigen auf „Supershifts", die auf die Bindung spezifischer Antikörper an die Oligonukleotid-Kernprotein Komplexe beruhen.

Beim nächsten EMSA Assay werden die Oligonukleotide cRel (H-REV107-1) und NFκB (Literatur) mit den Antikörpern RelB, cRel 272X, NFκB p50 und NFκB p52 inkubiert (Abb.51b). Der cRel (H-REV107-1) Oligonukleotid-Kernprotein Komplex zeigt mit keinem dieser Antikörper der NFκB-Familie eine Wechselwirkung und damit auch keinen „Supershift“ (zweite bis fünfte Spur). Der NFκB (Literatur) Oligonukleotid-Kernprotein Komplex zeigt mit dem Antikörper NFκB p50 (neunte Spur; NFκB (Literatur) + Ab NFκB p50) einen deutlichen Supershift. Mit den Antikörpern RelB (siebte Spur) und cRel (achte Spur) kommt es zu sehr schwachen Supershifts. Es wird deutlich, dass keiner der, zur Verfügung stehenden und getesteten, Antikörper aus der NFκB-Familie an den Komplex aus Kernproteinen und dem Oligonukleotid cRel (H-REV107-1) bindet.

Um herauszufinden, welches Kernprotein in vitro an das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) bindet, werden die Oligonukleotid-Kernprotein Komplexe mit verschiedenen Antikörpern der CREB-Proteinfamilie inkubiert.

Die Abbildung 52 zeigt das Ergebnis eines Experiments, in dem die Oligonukleotide CREB (H-REV107-1) und CREB (Literatur) nur mit Kernproteinextrakt oder mit Kernproteinextrakt und den Antikörpern, die spezifisch gegen CREB-1, CREM-1, ATF-1, ATF-2 und ATF-3 gerichtet sind, inkubiert werden. Der Antikörper gegen CREB-1 erkennt auch die Proteine CREM-1 und ATF-1.

Im Fall des Oligonukleotids CREB (H-REV107-1) führt die Zugabe des spezifischen Antikörpers ATF-2 zu einem deutlichen „Supershift“ (dritte Spur; CREB (H-REV107-1) + Ab ATF-2 6233X). der geschlossene Pfeil zeigt auf die neue Bande, die auf dem „Supershift“ beruht. Der offene Pfeil zeigt den spezifischen Oligonukleotid-Kernprotein Komplex. Dieses Signal wird, auf Grund der Bindung des Antikörpers, weiter nach oben verschoben. Bei dem Kernprotein, das an das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) bindet, handelt es sich also um ATF-2. Die Inkubation des Oligonukleotid-Kernprotein Komplexes mit den Antikörpern CREB-1 (zweite Spur) und ATF-3 (vierte Spur) führt zu keiner Veränderung des Bandenmusters. Diese Transkriptionsfaktoren binden nicht an das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1).

Im Falle des Oligonukleotids CREB (Literatur) (fünfte bis achte Spur) zeigt sich kein Veränderung des Bandenmusters durch die Zugabe der Antikörper.

	Abbildung 52: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 10 μg Kernproteine cAMP behandelter NIH3T3 Zellen (Endkonzentration: 200 μmol) auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. Der geschlossene Pfeil zeigt auf den „Supershift“, der auf der Bindung des für ATF-2 spezifischen Antikörper an den Oligonukleotid-Kernprotein Komplex beruht. Der offene Pfeil zeigt den spezifischen Oligonukleotid-Kernprotein Komplex (ohne dem gebundenen Antikörper).

Bei einer Wiederholung des Experiments wird neben dem Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) und CREB (Literatur) auch das mutierte Oligonukleotid CREB mt (H-REV107-1) verwendet und die bisherigen Ergebnisse in einem Experiment zusammengefasst. Die Abbildungen 53a) und 53b) zeigen die Ergebnisse der gleichen Versuchsansätze in der gleichen Reihenfolge, in 53a aus unbehandelten, in 53b aus cAMP-behandelten Zellen. In der ersten Spur sieht man das Bandenmuster, das durch Bindung der Kernproteine an das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) entsteht. Der Einsatz des in der Bindungssequenz mutierten Oligonukleotids CREB mt (H-REV107-1) führt zum Verschwinden der Banden, da die Kernproteine nicht mehr an das Oligonukleotid binden. Die beiden offenen Pfeile links neben der ersten Spur zeigen auf die beiden Signale, die bei der Verwendung des mutierten Oligonukleotids CREB mt (H-REV107-1) nicht mehr zu sehen sind.

Die dritte und die fünfte Spur zeigen die Ergebnisse nach Inkubation der Oligonukleotid-Protein Komplexe mit den Antikörpern die gegen die Proteine CREB-1, ATF-1, CREM-1 (dritte Spur) und ATF-3 (fünfte Spur) gerichtet sind. Die Antikörper CREB-1, ATF-1, CREM-1 und ATF-3 erkennen die Kernproteine nicht und binden nicht an die Oligonukleotid-Kernprotein Komplexe. Es kommt zu keiner Veränderung des Bandenmusters.

In der vierten Spur sieht man das Ergebnis des Experiments nach Inkubation des Oligonukleotid-Kernprotein Komplexes mit dem Antikörper ATF-2. Der Antikörper ATF-2 bindet an den Komplex und verschiebt so den sonst weiter unten zu sehenden Komplex (offener Pfeil) nach oben (geschlossener Pfeil). Bei dem Transkriptionsfaktor, der an das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) bindet, handelt es sich um ATF-2, da der Antikörper ATF-2 sc-6233X für das Protein ATF-2 spezifisch ist und nur dieses erkennt.

In der sechsten und vorletzten Spur sieht man das Ergebnis nach Inkubation des CREB (Literatur) Oligonukleotids mit dem Kernextrakt und in der siebten und letzten Spur das Ergebnis nach Inkubation desselben Oligonukleotids mit dem Kernextrakt und dem Antikörper ATF-2. Während der Unterschied in den Bandenmustern zwischen der ersten Spur CREB (H-REV107-1) und der sechsten Spur CREB (Literatur) nochmals deutlich macht, dass hier verschiedene Kernproteine an das jeweilige Oligonukleotid binden, führt die Zugabe des Antikörpers ATF-2 in der siebten Spur auch zu keinem „Supershift“.

Bei der Bindungsstelle CREB (H-REV107-1) handelt es sich also nicht, wie von der Analysesoftware MatInspector vorgeschlagen, um eine CREB Bindungsstelle, sondern um eine ATF-2 Bindungsstelle.

Auch wenn die Verwendung der Kernextrakte aus unbehandelten bzw. behandelten Zellen zu keinem unterschiedlichen Bandenmuster führen, so ist das Signal des "Supershifts" in der Abbildung b) sehr viel stärker als in der Abbildung a). Außerdem zeigt Abbildung 53, dass die Behandlung mit cAMP zu einer Verstärkung des Signals der oberen der drei Banden führt. Diese Bande entspricht der Bindung des Proteins ATF-2 an das Oligonukleotid, da diese Bande durch die Bindung des Antikörpers ATF-2 und dem damit einhergehenden „Supershift“ nach oben verschoben wird. Möglicherweise führt die Behandlung der Zellen mit cAMP zu einer verstärkten Bindung von ATF-2 an die Promotersequenz. Dies ist auch eine Erklärung für die Erhöhung der Aktivität des Promoterkonstrukts A-3 um 30% nach Behandlung der Zellen mit cAMP (Abb. 39).

Des weiteren fällt auf, dass durch die Mutation der für die Bindung des Transkriptionsfaktors wichtigen Basen zwei Banden verschwinden. Allerdings beruht nur die obere der Banden auf die Bindung des Transkriptionsfaktors ATF-2 an das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1). Es ist unklar, welches weitere Kernprotein an das Oligonukleotid bindet und so für die untere der Banden verantwortlich ist. Da die hier eingeführte Mutation aber der im Reporter Assay verwendeten Mutation entspricht, ist der dort gesehene Effekt des Aktivitätsverlustes des Promoters möglicherweise auch auf die fehlende Bindung dieses zweiten Proteins zurückzuführen. Dazu müsste es sich aber bei diesem zweiten Kernprotein um einen aktivierenden Transkriptionsfaktor handeln. Falls es sich um einen solchen Transkriptionsfaktor handelt, bleibt offen, zu welchem Anteil ATF-2 und zu welchem Anteil das unbekannte Kernprotein für die aktivierenden Eigenschaften verantwortlich ist.

	Abbildung 53: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 10 μg Kernproteine a)unbehandelter bzw. b) cAMP behandelter NIH3T3 Zellen (Endkonzentration: 200 μmol) auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. Die jeweils ersten offenen Pfeile zeigen auf die Signale, die durch den Einsatz des mutierten Oligonukleotids CREB mt (H-REV107-1) nicht mehr vorhanden sind. Der geschlossene Pfeil zeigt auf den „Supershift“, der auf der Bindung des ATF-2 spezifischen Antikörper an den Oligonukleotid-Kernprotein Komplex beruht. Der unterhalb des geschlossenen Pfeils liegende offene Pfeil zeigt auf die Stelle, an der sich zuvor die Bande des Oligonukleotid-Kernprotein Komplex (ohne dem gebundenen Antikörper) befand.

Nachdem die Bindung des Transkriptionsfaktors ATF-2 an das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) mit Kernproteinextrakt der Zelllinie NIH3T3 gezeigt worden ist, werden jetzt auch weitere Zelllinien im Electrophoretic Mobility Shift Assay untersucht. Hierzu wird das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) mit den Kernextrakten der unbehandelten Zelllinien SKOV-3, A27/80 und OVCAR-3 sowie der schon gezeigten Zelllinie NIH3T3 mit oder ohne ATF-2 Antikörper inkubiert (Abb. 54). In allen Zelllinien kommt es zu einem Supershift, wenn auch bei weitem nicht so deutlich wie im Falle des NIH3T3 Kernextrakts.

	Abbildung 54: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 5 μg Kernproteine unbehandelter Zellen auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. Die Pfeile zeigen auf „Supershifts", die auf die Bindung des ATF-2 Antikörpers an die Oligonukleotid-Kernprotein Komplexe beruhen.

Auch die Wiederholung des Experiments, jetzt mit dem Kernextrakt cAMP behandelter Zellen, zeigt erneut den zuvor gesehenen „Supershift“.

	Abbildung 55: Electrophoretic Mobility Shift Assay. In jeder Spur werden 5 μg Kernproteine cAMP behandelter Zellen auf ein 4% Polyacrylamidgel aufgetragen. Gezeigt sind nur die spezifischen Banden, die weiter unterhalb der Banden laufende Front ungebundener Oligonukleotide ist abgeschnitten. Die Pfeile zeigen auf „Supershifts", die auf die Bindung des ATF-2 Antikörpers an die Oligonukleotid-Kernprotein Komplexe beruhen.

Aus den Ergebnissen der Electrophoretic Mobility Shift Assays folgt für die Bindungsstelle cRel (H-REV107-1):

1. An das Oligonukleotid cRel (H-REV107-1) binden Kernproteine.
2. Die hier bindenden Kernproteine sind nicht identisch mit den Kernproteinen, die an die Oligonukleotide NFκB (Literatur), STATα (Literatur), STAT 1+3 (Literatur) oder STAT 1+5 (Literatur) binden. Dies zeigen die unterschiedlichen Bandenmuster sowie die nicht stattfindende Verdrängung der cRel (H-REV107-1) Oligonukleotid-Kernprotein-Bindung bei der Verwendung der zuvor genannten Oligonukleotide als Kompetitoren.
3. Bei dem Kernprotein, das das cRel (H-REV107-1) Oligonukleotid bindet, handelt es sich nicht um p50, p52, RelA (p65) oder cRel, da die gegen diese Proteine gerichteten Antikörper zusammen mit dem Oligonukleotid cRel (H-REV107-1) zu keinem „Supershift" führen. Dass diese Antikörper für eine Verwendung in einem EMSA zu gebrauchen sind, zeigt der „Supershift“ der Antikörper mit den NFκB (Literatur) Oligonukleotid-Kernprotein Komplexen. Der Antikörper RelB führt auch mit dem NFκB (Literatur) Oligonukleotid zu keinem Supershift. Dies kann daran liegen, dass das Kernprotein RelB nicht an dieses Oligonukleotid bindet, oder dass der Antikörper für diese Art der Experimente nicht zu gebrauchen ist.

Aus den Ergebnissen der Electrophoretic Mobility Shift Assays folgt für die Bindungsstelle CREB (H-REV107-1):

1. An das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) binden Kernproteine.
2. Die hier bindenden Kernproteine sind nicht identisch mit den Kernproteinen, die an das Oligonukleotid CREB (Literatur) binden. Dies zeigen die unterschiedlichen Bandenmuster sowie die nicht stattfindende Verdrängung der CREB (H-REV107-1) Oligonukleotid-Kernprotein-Bindung bei der Verwendung von CREB (Literatur) als Kompetitor. Auch der umgekehrte Ansatz mit CREB (Literatur) als markiertes Oligonukleotid und CREB (H-REV107-1) als Kompetitor führt nicht zu einer Verdrängung des vorhandenen Komplexes.
3. Die schon zuvor im Reporter Assay, innerhalb der potentiellen CREB-Bindungsstelle, eingesetzten Mutationen führt zum Verlust zweier Banden. Die Verwendung des mutierten Oligonukleotids als Kompetitor führt nicht zur Verdrängung des Oligonukleotids CREB (H-REV107-1) aus seinem Komplex. Dies bedeutet, dass die eingeführten Mutationen spezifisch für die Bindung an die CREB (H-REV107-1)-Bindungsstelle sind. Das Verschwinden zweier Banden lässt darauf schließen, das zwei verschiedene Kernproteine auf Grund der eingebrachten Mutationen, nicht mehr an das Oligonukleotid binden können. In wieweit jedes einzelne dieser Kernproteine zu dem im Reporter Assay beobachteten Aktivitätsverlust des Promoters von 63% beiträgt, kann nicht gesagt werden.
4. Bei dem größeren dieser beiden Kernproteine handelt es sich um den Transkriptionsfaktor ATF-2. Dies zeigt der beobachtete „Supershift" nach Zugabe des gegen das Protein ATF-2 gerichteten Antikörpers. Damit ist gezeigt, dass ATF-2 an das CREB (H-REV107-1) Oligonukleotid bindet. Das zweite, kleinere Kernprotein kann mit den eingesetzten Antikörpern nicht identifiziert werden. Da für das CREB (Literatur) Oligonukleotid die Bindung des Transkriptionsfaktors CREB-1 beschrieben ist, aber dieses Oligonukleotid als Kompetitor keinen Einfluss auf den CREB (H-REV107-1) Oligonukleotid-Kernprotein Komplex hat, bindet der Transkriptionsfaktor CREB-1 mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht an das CREB(H-REV107-1) Oligonukleotid
5. Der Antikörper CREB-1 hat zusammen mit dem Oligonukleotid CREB (Literatur) keinen "Supershift" ergeben. Anscheinend funktioniert der Antikörper nicht in einem EMSA. Da dieser Antikörper auch die Transkriptionsfaktoren ATF-1 und CREM-1 erkennt, kann über eine mögliche Bindung dieser Mitglieder der CREB Proteinfamilie an das Oligonukleotid CREB (H-REV107-1) keine Aussage gemacht werden. Ob der Antikörper ATF-3 in einem EMSA nicht einsetzbar ist, oder ob dieser Transkriptionsfaktor an keines der beiden Oligonukleotide bindet, kann nicht gesagt werden.

Zum Zeitpunkt des Abschlusses dieser Arbeit, stehen in den Datenbanken neue, bisher nicht veröffentlichte, Sequenzen zur Verfügung. Um offene Fragen zu klären, werden diese, zum Beginn der Arbeit noch nicht bekannten, DNA-Bereiche 5´ und 3´ des im Reporterassay untersuchten H-REV107-1 Promoters analysiert. Dabei werden die Sequenzen auf das Vorhandensein von Bindungsstellen hin untersucht, die durch IFN-γ-, TNF-α- oder cAMP-induzierbare Transkriptionsfaktoren gebunden werden können. Ebenso werden die jetzt zur Verfügung stehenden Promotoren der Spezies Mensch, Maus und Ratte miteinander verglichen.

3.9.1  Der DNA-Bereich 5´ der untersuchten Promotersequenz

Ein Ergebnis, dessen Daten nicht in einen vollständigen Zusammenhang gebracht werden konnten, ist die Regulation des humanen H REV107 1 Gens durch IFN-γ. Während endogenes H REV107 1 durch IFN-γ positiv reguliert wird, kann dies mit Hilfe der Promoterkonstrukte nicht gezeigt werden.

Die H-REV107-1 Promoter-DNA, die mit Hilfe der PCR amplifiziert wurde, konnte auf Grund des 419 Basenpaaren langen, 77% TA-haltigen Sequenzbereichs nur bis zum Basenpaar -996 amplifiziert werden. Das bedeutet, dass mögliche Einflüsse auf den Promoter, die von weiter entfernt liegenden Enhancern, Silencern oder Boundarie-Elementen ausgehen, nicht untersucht wurden. Piskurich et al. haben ein IFN-γ induzierbares Element beschrieben, das 4 kB 5´ des zugehörigen Promoters liegt (Piskurich et al., 1998). Auf dem verwendeten Gesamtpromoter-Konstrukt befinden sich nur zwei potentielle Bindungsstellen, die durch den STAT-1 bzw. den IRF-1 Signalweg reguliert werden können.

Die neu zur Verfügung stehende Sequenz wird mit dem Programm MatInspector bis zum Basenpaar -7300 (Transkriptionsstartpunkt = +1) auf folgende potentiellen Bindungsstellen hin untersucht.

• Mitglieder der CREB-Familie inkl. ATF-2
• Mitglieder der IRF-Familie
• Mitglieder der STAT-Familie
• Mitglieder der NFκB Familie

Tabelle 31: Potentielle Transkriptionsfaktorbindungsstellen im Bereich –1000 bp bis – 7300 bp

Für die Mitglieder der CREB-Familie existiert keine weitere potentielle Bindungsstelle. Dies unterstreicht die Bedeutung der bereits nachgewiesenen ATF-2 Bindungsstelle für die H REV107 1 Regulation. Es existieren aber vier weitere NFκB-Bindungsstellen, die für eine NFκB-abhängige Aktivierung der H REV107 1 Genexpression verantwortlich sein könnten. Die IFN-γ abhängige H REV107 1 Expression könnte über eine oder mehrere der sieben potentiellen STAT-Bindungsstellen bzw. eine oder mehrere der fünf IRF-Bindungsstellen reguliert werden

Besonders erwähnenswert ist die IRF-1 Bindungsstelle. Diese befindet sich im Bereich –1638 bp bis -1630 bp und damit nur 640 Basenpaare 5´ der bereits untersuchten, in vitro offenbar nicht aktiven IRF-1/IRF-2/ISRE Bindungsstelle.

Für einige Gene ist gezeigt, dass auch Sequenzbereiche 3´ des Transkriptionsstartpunkts für die Regulation eines Gens von Bedeutung sein können. Dass sich auch in diesem Bereich regulatorisch aktive Bindungsstellen befinden können, beschreibt die Arbeit von Takaoka et al. Diese zeigt, dass für die Regulation des β₄-Integrin Gens eine Enhancer-Region innerhalb des 1. Introns im Bereich +1905 bp bis +2933 bp von Bedeutung ist. Welche Bindungsstelle hier die entscheidende ist, wurde nicht untersucht (Takaoka et al., 1998). Ob H REV107 1 von einer 3´ liegenden Enhancer-Region reguliert wird, ist nicht gezeigt. Um die fehlende Aktivierung des Promoterkonstrukts durch IFN-γ zu erklären, wird hier die Sequenz des 1. Exons und ein Teil des 1. Introns auf das Vorhandensein von IFN-γ abhängigen Bindungsmotiven hin untersucht. Hierfür wurde ein 5000 bp großer Sequenzabschnitt analysiert.

Es existieren eine ganze Reihe von potentiell aktiven Bindungsstellen (Tab. 32). Ob eine von diesen einen Einfluss auf die Regulation des H-REV107-1 Gens besitzt ist nicht untersucht. Es besteht aber die Möglichkeit, dass Elemente, die sich 5´ oder 3´ von der im Promoterassay untersuchten Sequenz befinden, einen Einfluss auf die IFN-γ abhängige Regulation des H REV107 1 Gens besitzen.

Tabelle 32: IFN-γ abhängige, potentielle Bindungsstellen 3´ des H REV107 1 Transkriptionsstart-punkts

H rev107 1 wurde in Ratten Zelllinien primär als Zielgen des Ras-Onkogens und später als ein durch den Mek/ERK-Signalweg supprimiertes Gen identifiziert. Diese Beobachtungen konnten in den humanen Zellen weder in den Expressions-Analysen noch an Hand der Promoterstudien reproduziert werden. Um die unterschiedlichen Ergebnisse aus humanen und Ratten Zellen besser zu verstehen, werden die Promotersequenzen der homologen H REV107 1 Gene aus Mensch, Maus und Ratte verglichen. Dazu werden die Regionen 2000 bp 5´ des jeweiligen Transkriptionsstartpunkts untersucht. Während zum Maus Promoter bereits Daten publiziert sind (Roder et al., 2002), sind zum Promoter der Ratte noch keine Daten veröffentlicht. Damit die drei Promotoren untereinander vergleichbar sind, beziehen sich die Sequenzangaben auf den Transkriptionsstartpunkt. Dieser wird gleich +1 gesetzt. Das ist besonders für die folgende Beschreibung der Positionen der potentiellen Bindungsstellen wichtig.

Der Vergleich der Sequenzen zeigt eine Homologie von 80% zwischen dem Promoter der Maus und der Ratte. Dieser Bereich erstreckt sich im Promoter der Maus vom Basenpaar +183 bis zum Basenpaar –1426. Im Ratten-Promoter ist dieser Bereich von einem 378 bp langem DNA-Bereich ohne Homologie zur Maus unterbrochen. Die Homologie zum Maus Promoter erstreckt sich vom Basenpaar +198 bis zum Basenpaar –696 und vom Basenpaar -1076 bis zum Basenpaar -1884. Der Promoter des Menschen zeigt keine Homologie mit den Promoterbereichen der beiden anderen Spezies. Ein weiterer Unterschied zwischen den Promotoren aus Ratte und Maus und dem Promoter des Menschen ist das Vorhandensein eines TATA-Box ähnlichen Elements in Maus und Ratte. Dieses Element befindet sich in beiden Promotoren an der Position –43 bp bis –39 bp. Im menschlichen Promoter findet man an ähnlicher Position die funktionelle ATF-2 Bindungsstelle (-33 bp bis –22 bp).

Eine Untersuchung der drei Sequenzen mit dem Programm MatInspector auf das Vorhandensein potentieller Motive der Transkriptionsfaktoren Familien IRF, STAT, NFκB und CREB ergibt eine unterschiedliche Verteilung möglicher Bindungsstellen.

Tabelle 33: Potentielle Transkriptionsfaktorbindungsstellen im Maus Promoter

Tabelle 34: Potentielle Transkriptionsfaktorbindungsstellen im humanen Promoter

Tabelle 35: Potentielle Transkriptionsfaktorbindungsstellen im Ratten Promoter

	Abbildung 56: Schematischer Vergleich der Promotoren des Menschen-, Maus- und Ratten H REV107 1 Gens.

Der humane H-REV107-1 Promoter besitzt die wenigsten der gesuchten Elemente (ein ATF-2, zwei IRF-1 und ein STAT-1 Element). Diese sind relativ gleichmäßig über den Promoter verteilt. Trotz der Sequenzhomologie zwischen dem Maus und dem Ratten Promoter ist besonders auffallend, dass keine große Ähnlichkeit hinsichtlich der untersuchten Bindungsmotive herrscht. Abgesehen von dem TATA-Box-ähnlichen Element (Ratte und Maus: –43 bp bis –39 bp) sind nur die Motive IRF-7 (Ratte: -1683 bp bis –1665 bp; Maus: -1225 bp bis –1207 bp) und IRF-1 (Ratte: -1814 bp bis –1796 bp; Maus: -1355 bp bis –1337 bp) konserviert.

Der Promoter der Ratte besitzt die meisten der untersuchten Motive. Diese kommen in zwei Sequenzbereichen gehäuft vor. Im zusätzlichen, 378 bp langem Sequenzbereich –697 bp bis –1075 bp befinden sich drei NFκB, ein STAT und ein IRF-7 Motiv, wobei die drei NFκB Bindungsstellen in einem Cluster nahe beieinander liegen. Ein weiteres STAT-Element befindet sich an der Position -564 bp bis –582 bp. Damit liegt es zwar im Bereich der Homologie zum Maus Promoter, ist in diesem aber nicht vorhanden. Im Bereich zwischen den Basenpaaren –1665 bis –1870 liegen drei Bindungsmotive der IRF-Familie sowie eine STAT-Bindungsstelle, dicht beieinander. Der Promoter der Ratte besitzt somit möglicherweise eine IFN-abhängige und eine, im Vergleich zum Maus Promoter zusätzliche, NFκB-abhängige, regulatorische Region. Der Maus Promoter besitzt auffallend viele Bindungsstellen für Mitglieder der IRF-Familie (fünf, außerdem ein NFκB- und ein CREB-Motiv) die alle im Bereich zwischen den Basenpaaren –1207 und –1703 liegen. Die Experimente in der Maus-Zelllinie KA-1 zeigen eine direkte und starke Abhängigkeit der H rev107 1 Expression von Irf-1. Diese Regulation verläuft wahrscheinlich über eine oder mehrere dieser Bindungsstellen. Im humanen Promoter fehlt diese Häufung von IRF-Bindungsstellen. Von den zwei vorhandenen IRF-1 Motiven war nur eine IRF-1 Bindungsstelle in der Sequenz des Gesamt-Promoterkonstrukts enthalten. Möglicherweise war die IFN-γ vermittelte Regulation des humanen H-REV107-1 Promoters mit der einzelnen IRF-1 Bindungsstelle in den Promoter Experimenten nicht nachzuweisen.