Diskussion

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Tumorsuppressor Gene sind die funktionellen Gegenspieler der Onkogene. Während aktivierte Onkogene für die maligne Transformation einer Zelle verantwortlich sind, unterbinden Tumorsuppressor Gene das unkontrollierte Wachstum. Die Tumorsuppressor Gene werden dabei in zwei Klassen unterteilt. Die Klasse I Tumorsuppressor Gene sind auf Grund dauerhafter Beschädigung ihrer Struktur in ihrer Funktion gehemmt. Dagegen ist die Hemmung der Klasse II Tumorsuppressor Gene reversibel. Ein Beispiel für den reversiblen Verlust einer Genaktivität ist das Fehlen eines für die Expression entscheidenden Transkriptionsfaktors. Ist der Transkriptionsfaktor wieder vorhanden, kann das Tumorsuppressor Gen transkribiert werden. Auf Grund solcher und anderer reversibler Mechanismen sind Klasse II Tumorsuppressor Gene aus medizinischer Sicht von großem Interesse für die Tumorbekämpfung. Bei diesen Genen können durch Aktivierung der Genexpression die Tumor-supprimierenden Mechanismen der Zelle wieder hergestellt werden. Das Gen H REV107 1 ist ein Klasse II Tumorsuppressor Gen. Damit ist es potentiell in einem therapeutischen Ansatz von Bedeutung. Um jedoch die Funktion von H REV107 1 gezielt wieder herstellen zu können, müssen zuerst die Mechanismen der Expressionshemmung bekannt sein. Hierfür bedarf es eines grundlegenden Verständnisses der H REV107 1 Regulation. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der H REV107 1 Genexpression in verschiedenen malignen und nicht malignen Zelllinien, sowie die Analyse des H REV107 1 Promoters. Dabei gilt der Schwerpunkt der Untersuchung Ovarialkarzinomzelllinien, da in diesem Tumortyp bereits ein Verlust der H REV107 1 Expression in situ gezeigt wurde. Ergänzend wird die H REV107 1 Expression auch in Tumorzelllinien anderen Ursprungs analysiert.

4.1  Bindungsstellen-unabhängige Promoterstudien

4.1.1  Der Core-Promoter des humanen H REV107 1 Gens

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Das allgemeine Bild, das heute von der Regulation der Genexpression durch einen Promoter gezeichnet wird, sieht folgendermaßen aus: Auf Grund der Zusammensetzung der im Core-Promoter vorhandenen Elemente, binden die basalen Transkriptionsfaktoren TFIIA, TFIIB, TFIID; TFIIE, TFIIF und TFIIH. Für viele der basalen Transkriptionsfaktoren sind mehrere Untereinheiten beschrieben. So besteht der Faktor TFIID aus dem TATA-Box Binding Protein und dreizehn weiteren Untereinheiten, den TBP assoziierten Faktoren (TAFs). Diese werden als TAFII250, TAFII70 etc. bezeichnet. Diese unterschiedlichen Faktoren bilden gemeinsam mit der RNA Polymerase II den RNA Polymerase II Transkriptionskomplex. Dieser, für verschiedene Core-Promotoren unterschiedlich zusammengesetzte Komplex, interagiert mit den Transkriptionsfaktoren, die an die Bindungsstellen des proximalen Promoters binden (Smale, 2001). Durch diese Interaktion stabilisieren die Transkriptionsfaktoren den RNA Polymerase II Komplex und erhöhen die Transkriptionsrate. Dies bedeutet, dass Transkriptionsfaktoren die den proximalen Promoter binden, nur dann für die Regulation der Genexpression verantwortlich sind, wenn sie mit dem basalen Transkriptionskomplex interagieren können. Enthält dieser Untereinheiten, die mit dem betreffenden Transkriptionsfaktor nicht interagieren, so besitzt dieser bei der Regulation des Gens keine Funktion. Bei der Induktion einer effizienten Transkription kommt es auf das Zusammenspiel zwischen dem RNA Polymerase II Komplex und den Faktoren, die an den proximalen Promoter gebunden sind, an.

4.1.2 Die Bestimmung des Transkriptionsstartpunkts

Um die Frage des Transkriptionsstartpunktes zu beantworten, wurde der H-REV107-1 Promoter mit verschiedenen Methoden untersucht. Mit Hilfe der Primer Extension wurde versucht, den Transkriptionsstartpunkt zu bestätigen bzw. zusätzliche Transkriptionsstartpunkte zu finden. Weiterhin wurde der Transkriptionsstartpunkt mit Hilfe der Datenbank DBTSS bestimmt. Die aus der Primer Extension und DBTSS Analyse erhaltenen Ergebnisse wurden mit den Startpunkten der vier ursprünglichen klonierten cDNA-Klone (12-1, 9-1, 8-1 und 3-1) verglichen (Husmann et al, 1998). Dabei zeigte sich, dass der Startpunkt des längsten cDNA Klons 12-1 nur 14 Basen 3´ des maximalen Startpunkts der Datenbank DBTSS lag.

Die Ergebnisse der Promoterassays scheinen den DBTSS Startpunkt zu bestätigen. So geht beim Deletionsschritt vom Konstrukt E-3 zu F-3 nur der DBTSS Transkriptionsstartpunkt verloren, nicht der Startpunkt 12-1. Die Aktivität der Promoterkonstrukte verringert sich aber von 72% (E-3) auf 1% (F-3) der Gesamtaktivität. Mit der Sequenzverkürzung von E-3 nach F-3 geht allerdings neben dem Startpunkt DBTSS auch die Bindungsstelle ATF-2 verloren. Da ATF-2 eine aktive Bindungsstelle ist, kann der Verlust der Promoteraktivität des Konstrukts F-3 auch mit dem Verlust dieser Bindungsstelle zusammenhängen. Ein weiteres Promoterkonstrukte-Paar, anhand derer Aussagen über die Funktionalität des Transkriptionsstartpunkte getroffen werden können, sind die Konstrukte A-3 und A-2. Während das Gesamt-Promoterkonstrukt A-3 beide Transkriptionsstartpunkte enthält, ist das Konstrukts A-2 vom 3´ Ende her verkürzt, so dass der Startpunkt 12-1 entfernt ist. In beiden Konstrukten ist die ATF-2 Bindungsstelle enthalten. Die Entfernung des 3´ Endes führt zu keiner Aktivitätsabnahme des Konstrukts A-2. Der entfernte Transkriptionsstartpunkt 12-1 ist also offenbar nicht bedeutend für die Promoteraktivität.

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Fasst man diese Ergebnisse mit dem Ergebnis der oligo-capped Datenbank zusammen, dann kann der Startpunkt DBTSS mit großer Wahrscheinlichkeit, als der maximale Transkriptionsstartpunkt angesehen werden. Ob weitere Startpunkte, evtl. zelltypspezifisch vorhanden sind müsste detaillierter untersucht werden.

4.2 Die Signalweg-abhängige Regulation von H REV107 1

4.2.1  Die Suppression der H rev107 1 Expression über den MEK/ERK-Signalweg

Das Tumorsuppressorgens H-rev107-1 wird in der immortalen Zelllinie 208F und in der spontanen Revertante F9 exprimiert, ist aber in der HRAS-transformierten Ratten Fibroblastenzelllinie FE8 supprimiert. Es. Dieser rein korrelative Zusammenhang zwischen der Überexpression von RAS und der Hemmung der H rev107 1 Expression, wurde in dieser Arbeit um eine wichtige Komponente erweitert. Es wurde gezeigt, dass es auch in der Ratten Ovarial-Oberflächenepithelzelllinie ROSE199 zu einer Suppression der H rev107-1 Genexpression kommt, nachdem diese mit einem KRAS Expressionsplasmid transformiert wurde (ROSE199 A2/5). Durch die Hemmung der Kinase MEK-1 mittels PD98059 erfolgte eine Re-Expression von H rev107 1. Das KRAS vermittelte Signal, welches zur Suppression der H rev107 1 Genexpression führt, verläuft über MEK-1.

In der Arbeit von Bonello und Khachigian wurde gezeigt, dass die Expression von PDGFR- durch eine ERK1/2 abhängige Phosphorylierung des Sp-1 Transkriptionsfaktors supprimiert wird. Damit wirkt Sp-1 in diesem Fall als Repressor (Bonello und Khachigian, 2004). Baker et al. konnten zeigen, dass Ets-2 durch Interaktion mit Brg-1 und dem SNF/SWI-Ko-Repressor das BRCA 1 Gen negativ reguliert (Baker et al., 2003).

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Da sowohl SP-1 als auch Ets-2 in Abhängigkeit des Mek/Erk-Signalwegs aktiviert werden können, könnten vorhandene, potentielle Ets-2 bzw. Sp-1 Bindungsstellen im Ratten H-rev107-1 Promoter, die Suppression des Gens durch den aktivierten Ras-Signalweg erklären. In den 2000 Basen 5´ des Transkriptionsstartpunkts des Ratten H rev107 1 Gens kommen zwei potentielle Sp-1 Bindungsstellen, aber keine Ets-2 Bindungsstelle vor. Die Sp-1 Motive befinden sich in den Bereichen -70bp bis –84bp und –911bp bis –925bp. Das erste Motiv liegt damit in unmittelbarer Nähe des Transkriptionsstartpunkts, das zweite Motiv liegt in dem, im Vergleich zum Maus Promoter, zusätzlichen DNA-Abschnitt. Ob eines dieser Sp-1 Motive einen negativen regulatorischen Einfluss auf die H rev107 1 Expression besitzt, ist unbekannt.. Eine weitere Möglichkeit ist die MEK/ERK-vermittelte, indirekte Suppression von H rev107 1 (s.u.).

Interessanterweise zeigt auch eine humane Zelllinie dieses H-REV107-1 Regulationsmuster. Die humane Teratokarzinomzelllinie PA-1 besitzt ein aktiviertes NRAS Onkoprotein. Sie zeigt im unbehandelten Zustand ein mittleres H REV107 1 Expressionsniveau, das nach Behandlung mit LY294002 keine Änderung aufweist. Eine Behandlung mit PD98059 führt auch hier zu einer Aktivierung der H-REV107-1 Genexpression. Dies zeigt, dass H-REV107-1 sowohl in humanen als auch in Ratten Zelllinien durch einen aktivierten MEK/ERK-Signalweg in der Expression supprimiert werden kann. Dies geschieht unabhängig von der RAS-Isoform. Der humane H-REV107-1 Promoter besitzt allerdings keine Ets-2 oder Sp-1 Bindungsstellen.

Neben dem durch MAPK induzierten Expressionsverlust, muss es aber noch weitere Mechanismen geben, die die H-REV107-1 Genexpression inhibieren, da nur in PA-1 eine Abhängigkeit von H REV107 1 vom MEK/ERK-Signalweg nachgewiesen werden konnte.

4.2.2 Die Induktion der H REV107 1 Expression über IFN-γ induzierte Signalwege und durch IRF-1

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Bereits seit 1995 ist bekannt, dass die H rev107 1 Genexpression durch Behandlung von Ratten Astrozytenzellen mit IFN-γ induziert wird (Kuchinke et al., 1995). Auch die Behandlung der Ovarialkarzinomzelllinien A27/80, OVCAR-3 und SKOV-3, der immortalisierten Ratten Ovarialepithelzelllinien ROSE199 und ROSE199A2/5 sowie der Nierenkarzinomzelllinien RCC26 und MZ-1257 mit IFN-γ führt zu einer Aufregulation von H REV107 1.

Das Zytokin IFN-γ reguliert ein weitreichendes Set an unterschiedlichen Genen (Der et al., 1998). IFN-γ wird auf Grund von Virusinfektionen, dsRNA, Wachstumsfaktoren oder anderen Zytokinen induziert und hauptsächlich von Th-1 Lymphozyten und natürlichen Killer-Zellen sezerniert. Es besitzt antiproliferative, antivirale und immunmodulatorische Aktivitäten, zusätzlich kann es auch Apoptose induzieren (Barber, 2000). Saito et al. zeigten, dass IFN-γ das Wachstum von Melanom-, Myelom-, Nieren-, Brust- und Ovarialkarzinomzelllinien hemmt (Saito et al., 1986). In Tiermodellen ist IFN-γ eine essentielle Komponente in der Abwehr von transplantierten, humanen Ovarialtumoren (Malik et al., 1991) und verstärkt in malignen Mäusezellen die Suppression des Tumorwachstums durch das Immunsystem (Kaplan et al., 1998). In der Tumortherapie wurde es in Rahmen von Studien in der Behandlung von Ovarialkarzinomen eingesetzt (Windbichler et al., 2000).

Die Behandlung von Zellen mit IFN-γ kann neben dem JAK/STAT-Signalweg noch weitere Signalwege aktivieren. Unter anderem werden die Kinase Fyn, ein Mitglied der Src-Familie (Uddin et al., 1997), das RAS GTPase-aktivierende Protein 1 (RAP-1), und die MAP Kinasen Pyk2 und ERK1/2 (Takaoka et al., 1999) durch IFN-γ aktiviert (Alsayed et al., 2000). ERK2, kann genauso wie p38, die transaktivierenden Eigenschaften von STAT-1 durch Phosphorylierung der Aminosäure Serin 727 in der Transkriptions-Aktivierungs-Domäne (TAD) aktivieren.

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Der Transkriptionsfaktor IRF-1 ist eines der wichtigsten Zielgene von IFN-γ, da IRF-1 für die Expression vieler, durch IFN-γ induzierter, Gene verantwortlich ist. Die Analyse der IRF 1 Expression in Ovarialkarzinomzelllinien liefert ein heterogenes Bild. Die immortalisierte, nicht maligne Zelllinie HOSE exprimiert IRF-1 auf hohem Niveau. OVCAR-3 und SKOV-3 zeigen eine deutlich geringere und die Zelllinien PA-1 und A27/80 nur eine sehr schwache IRF-1 Expression. Diese Verteilung entspricht, mit Ausnahme der Zelllinie PA-1, dem Expressionsniveau der H REV107 1 mRNA in diesen Zellen. In PA-1 ist das H REV107 1 Expressionsniveau im Vergleich höher als das IRF-1 Expressionsniveau. Dies spricht dafür, dass im Falle der Teratokarzinomzelllinie PA-1 die H-REV107-1 Expression nicht über den STAT-1, sondern über den MEK/ERK-Signalweg, reguliert wird.

Nach Induktion mit IFN-γ erfolgt in den Zelllinien OVCAR-3, SKOV-3 und A27/80 ein deutlicher Anstieg der IRF 1 mRNA Menge entsprechend der zu beobachtenden Aufregulation der H REV107 1 Expression. Das selbe gilt für die Nierenkarzinomzelllinie RCC26, die im unbehandelten Zustand eine schwache IRF 1 Expression und nach Behandlung mit IFN-γ eine starke IRF 1 Expression zeigt. Auch hier korreliert die IRF 1 mit der H REV107 1 Expression.

Diese Korrelation zwischen der H-REV107-1 und der IRF-1 Genexpression in den humanen Zelllinien deutet einen funktionellen Zusammenhang der Regulation beider Gene an. Dies wird auch durch die zeitabhängige Induktion der beiden Gene in den Zelllinien A27/80 und OVCAR-3 nach Behandlung der Zellen mit IFN-γ gezeigt. Beide Gene werden zeitlich korrelierend exprimiert, wobei die Induktion der IRF 1 Expression zu Beginn der Zeitreihe stärker einsetzt als die Induktion der H REV107 1 Expression. Die Abstände zwischen den gemessenen Zeitpunkten sind aber zu groß, um festzustellen, ob die IRF-1 Expression vor der H-REV107-1 Expression induziert wird.

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Durch die Verwendung von NIH3T3 Zellen, die mit einem humanen Östrogen Rezeptor – IRF-1 Fusionsprotein stabil transfiziert wurden, konnte gezeigt werden, dass H rev107 1 in den Maus Zellen ein direktes Zielgen von IRF-1 ist. Das Experiment wurde sowohl mit, als auch ohne Zugabe von Cycloheximid durchgeführt. In beiden Fällen wurde die H rev107—1 Expression stark induziert. Cycloheximid ist ein Proteinsynthease-Inhibitor, d.h. nach Zugabe von Cycloheximid kann transkribierte mRNA nicht mehr zum Protein translatiert werden. Die H rev107 1 Expression wird somit unmittelbar durch das aktivierte IRF-1 induziert.

IRF-1 zeigt viele Aktivitäten, vor allem in den Bereichen Wachstumskontrolle, Zellzykluskontrolle, Tumorsuppression und Apoptose. Eine wichtige Funktion des IRF-1 ist seine Eigenschaft als Tumorsuppressor. Durch die Expression von IRF-1 können Onkogen-transformierte Zellen revertiert werden (Tanaka et al., 1994). Ebenso werden IRF-1-defiziente embryonale Maus Fibroblasten durch die alleinige Transfektion mit aktiviertem HRAS transformiert, während Wildtyp-Fibroblasten mindestens mit zwei aktivierten Onkogenen transfiziert werden müssen, um eine Transformation zu erreichen (Tanaka et al., 1994). In Studien ist gezeigt, dass IRF-1 in der Entwicklung von humanen Tumoren eine Rolle spielt. Die Deletion von IRF-1 auf dem Chromosom 5q31.1 ist eine der am Häufigsten beobachteten genetischen Anomalien bei Leukämie bzw. beim präleukemischen Myelodysplastischen Syndrom (Mecucci et al., 1985; Willman et al., 1993). Auch in ösophagealen und gastritischen Tumoren ist der Verlust eines IRF-1 Allels häufig anzutreffen, wobei oftmals das zweite IRF-1 Allel durch Punktmutation inaktiviert ist (Tamura et al., 1996; Nozawa et al., 1998). Ein weiterer Mechanismus der IRF-1 Inaktivierung ist das Exonskipping, bei dem mRNA mit fehlendem Exon 2 bzw. fehlendem Exon 2 und 3 exprimiert wird, was zum Verlust des korrekten AUG Start-Codons führt (Harada et al., 1994). Ein Verlust der IRF-1 Expression in Ovarialtumoren ist bisher aber nicht bekannt.

IRF-1 spielt in NIH3T3 Zellen eine Rolle in der Regulation des Zellzyklus. Dabei ist die IRF-1 Expression in der G1-Phase am höchsten. Nach Serum Stimulation nimmt sie rasch ab und kurz vor und während der DNA Synthese wieder zu (Harada et al., 1993). Primäre Fibroblasten aus IRF-1-/- defizienten Mäusen sind nicht mehr in der Lage, einen, durch DNA Schaden induzierten, Zellzyklus-Stop auszuführen. Die mRNA Expression des Zellzyklus-Inhibitors p21 ist von der Aktivierung durch IRF-1 und p53 abhängig (Tanaka et al., 1996). Dies könnte die Erklärung für den Einfluss des IRF-1 auf den G1-Zellzyklus-Stopp sein.

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Möglicherweise ist auch das IRF-1 Zielgen H-REV107-1 für eine oder mehrere der, von IRF-1 vermittelten, Aktivitäten verantwortlich. In OVCAR-3 führt die Behandlung der Zellen mit IFN-γ zur Aktivierung der IRF 1 Expression, welches wiederum die H-REV107-1 Expression aktiviert. Die Expression von H-REV107-1 in OVCAR-3 führt zur Apoptose der Zellen. Als mögliche Schlussfolgerung resultiert hieraus, dass H-REV107-1 ein Zielgen von IRF-1 ist, dessen Aktivierung in Ovarialkarzinomen Apoptose vermittelt.

Auf Grund dieser Schlussfolgerung wurde der H-REV107-1 Promoter im Promoter Reporter Assay auf eine Abhängigkeit vom IFN-γ Signalweg untersucht. Neben der Stimulation der endogenen H REV107 1 Expression durch IFN-γ lässt sich auch die Promoteraktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts A-3 mit IFN-γ um 22% steigern. Bei der in silico Analyse des H-REV107-1 Gesamtpromoter-Konstrukts fallen zwei potentielle Zielelemente für den IFN-γ Signalweg bzw. den IRF-1 Transkriptionsfaktor auf. Das eine ist die potentielle IRF-1/IRF-2/ISRE Bindungsstelle zwischen den Basen –989 und –977 am 5` Ende des untersuchten Promoterbereichs. Das andere ist die potentielle STAT-Bindungsstelle –353 und –341 am 3´Ende des untersuchten Promoterbereichs.

Die Mutation des IRF-1/IRF-2/ISRE Elements führt in NIH3T3 Zellen überraschend zu einer Zunahme der Promoteraktivität um 40%. Dies deutet auf eine Repressor-Bindungsstelle hin und entspricht der ebenfalls beobachteten Zunahme der Aktivität nach Deletion dieser Region. Möglicherweise bindet der als Suppressor beschriebene Faktor IRF-2 dieses Element (Harada et al., 1989). IRF-2 besitzt die selbe DNA-Bindungsdomäne wie IRF-1, verfügt aber nicht über dessen Aktivierungsdomäne. Seine Eigenschaft als Repressor führt zu einer autoinhibitorischen Regulation der durch IRF-1 aktivierten Genexpression. Das wurde für die IRF-1 Zielgene p21 und 2 5A Synthetase gezeigt (Coccia et al., 1999). Diese Hemmung der aktivierenden Eigenschaften von IRF-1 durch IRF-2 kann auch eine Erklärung für die in Intervallen verlaufende Aktivierung der H REV107 1 Genexpression sein, die in der zeitabhängigen Induktion der H REV107 1 Expression beobachtet wurde.

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Das IRF-2 Expressionsniveau ist im Verlauf des Zellzyklus, in Abwesenheit von IFN-γ, konstant (Harada et al., 1993). IRF-2 wird in vitro durch die Kinasen PKA, PKC und Casein KinaseII phosphoryliert. Die MAP Kinasen JNK1, p38 und ERK2 phosphorylieren IRF-2 nicht. In wiefern der Phosphorylierungsstatus die inhibitorische Aktivität von IRF-2 definiert, ist aber nicht untersucht. Für IRF-1 wird bisher nur die Menge des Proteins und nicht der Phosphorylierungsstatus als aktivitätsbestimmender Schritt bezeichnet (Pine et al., 1990). Es bleibt auch unklar, ob IRF-2 auch in nicht IFN-γ stimulierten Zellen an den H-REV107-1 Promoter bindet. Eine konstitutive Bindung an einen Promoter ist für IRF-2 nicht beschrieben.

Das Problem, die direkte Aktivierung des H REV107 1 Gens durch den Transkriptionsfaktor IRF-1 mit Hilfe des Promoterassays nachzuweisen, kann verschiedene Ursachen haben.

Die Promoterassays wurden als transiente Transfektionen durchgeführt. Ein Nachteil der transienten Transfektion ist, dass dem Reporterplasmid die natürliche Umgebung im Chromatin fehlt. Im transienten System kommen die von den Histonen, die in einem aktiven Zustand (Azetyliert und De-Methyliert) oder in einem inaktiven Zustand (De-Azetyliert und Methyliert) vorliegen können, ausgehenden Einflüsse auf den Promoter nicht zu tragen. Außerdem ist die Unzuverlässigkeit möglicher Ko-Transfektionen ein Nachteil.

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Als Alternative kann man die Promoterassays als stabile Transfektion durchführen. Ein Problem bei der stabilen Transfektion, bei der die transfizierte DNA in die DNA der Wirtzelle integriert wird, ist jedoch, dass der Ort der Integration nicht vorgegeben werden kann.

Jeder Klon integriert den Promoter an einer anderen Stelle in seine DNA. Der Einfluss von Enhancern und Silencern kann in diesen Fällen weder vorhergesagt noch belegt werden. So kann die positive Regulation des Reportergens eines ausgewählten Klons gar nicht auf den integrierten Promoter selbst, sondern auf dessen Nachbarschaft zu in der Nähe sich befindenden Enhancer-Regionen beruhen.

Auch das Fehlen des sehr T/A-haltigen Sequenzbereichs 5´ der IRF-1/IRF-2/ISRE-Bindungsstelle sowie der 5´ dieser Region vorhandenen, zweiten IRF-1-Bindungsstelle im untersuchten Promoterkonstrukt, kann ein Grund dafür sein, dass die einzelne IRF-1/IRF-2 Bindungsstelle nicht aktiv ist. Möglicherweise benötigt die untersuchte IRF-1/IRF-2/ISRE Bindungsstelle die Anwesenheit der weiter 5´ liegenden Bindungsstelle, so dass diese gemeinsam als Modul funktionieren. Eine andere Möglichkeit ist, dass der zwischen den beiden Bindungsstellen sich befindende, 419 Basenpaare lange Sequenzbereich mit einem AT-Gehalt von 77% eine aktive Bedeutung in der Funktion der, direkt 3´ folgenden, IRF-1 Bindungsstelle besitzt. Sollte dieser Sequenzbereich eine Sekundärstruktur ausbilden, könnte zum einen die IRF-1 Bindungsstelle aktiviert werden, zum anderen würden die beiden IRF-1 Bindungsstellen räumlich näher aneinander rücken. Eine Methode, die zu weiteren Ergebnissen führen könnte, ist die Chromatin Immunopräzipitation (ChIP). Hierbei wird die Bindung von Transkriptionsfaktoren an einen Promoter in situ analysiert, wobei die Chromatin-DNA Struktur nicht gestört wird. Damit könnte nach IFN-γ Zugabe die Bindung von IRF-1 an den H-REV107-1 Promoter analysiert werden.

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Das Element ISRE wird von einem heterotrimeren Komplex gebunden, der aus STAT1α, STAT2 und p48 besteht. Dieser als ISGF3 bezeichnete Komplex wird nach Induktion der Zelle mit den Interferonen TypI, IFN-α bzw. IFN-β, gebildet. Da sich in ersten Experimenten keine Abhängigkeit der H REV107 1 Expression von den Interferonen TypI zeigte, wurde der Einfluss dieser Zytokine auf den H-REV107-1 Promoter nicht weiter untersucht.

Die Mutation und Inaktivierung der STAT-Bindungsstelle führt zu keiner veränderten Aktivität des Promoterkonstrukts. Diesem Element kann bisher keine funktionelle Bedeutung zugeordnet werden.

4.2.3 Die Wechselwirkung zwischen den über MEK verlaufenden und den von IFN-γ induzierten Signalwegen

Da die H rev107 1 Expression in ROSE199 und ROSE199A2/5 sowohl IFN-γ induzierbar als auch vom MEK/ERK-Signalweg abhängig ist, wurden diese Zelllinien auf mögliche "Cross-Talks", also die Wechselwirkungen zwischen den zwei Signalwegen, hin untersucht. Die Analyse eines möglichen "Cross-Talks" zwischen dem IFN-γ und dem MEK/ERK-Signalweg führt zu einem interessanten Ergebnis. Während in der KRAS-transformierten Zelllinie ROSE199A2/5 nach Induktion mit IFN-γ die H rev107 1 Genexpression nur minimal und nach Inkubation mit dem MEK Inhibitor PD98059 die H- rev107 1 Genexpression auf ein mittleres Niveau angehoben wird, erfolgt bei gleichzeitiger Behandlung der Zelllinie mit IFN-γ und PD98059 eine sehr viel stärkere Induktion der H rev107 1 Genexpression.

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Die Analyse der H REV107 1 Expressionen deuten auf eine Wechselwirkung zwischen dem MEK/ERK- und dem IFN-γ-abhängigen STAT-1-Signalweg hin. Klampfer et al. haben gezeigt, dass aktiviertes KRAS die STAT 1 und STAT 2 Genexpression inhibiert. Dies führt zu einer verminderten Expression einer Reihe von IFN-γ induzierbaren Genen. Durch Hemmung der KRAS Aktivität lässt sich die STAT 1 und STAT 2 Expression wieder herstellen (Klampfer et al., 2003). Diese Abhängigkeit gibt eine mögliche Erklärung für den beobachteten, synergistischen Effekt auf die H REV107 1 Expression nach gleichzeitiger Hemmung des MEK-Signalwegs und Aktivierung des IFN-γ-Signalwegs. Der in der Zelllinie ROSE199A2/5 aktivierte RAS-Signalweg unterdrückt möglicherweise die STAT-1 Expression. Durch Behandlung der Zelllinie mit PD98059 wird der MEK-Signalweg unterdrückt, STAT 1 wird wieder exprimiert und kann durch IFN-γ aktiviert werden.

Die Analyse der Irf 1 Expression zeigt außerdem, dass in ROSE199A2/5 nach Behandlung mit dem MEK Inhibitor PD98059 Irf 1 wieder exprimiert wird. Aus der Kombination dieser Ergebnisse resultiert für die Ratten Ovarialepithelzellen folgendes Modell (Abb.57):

In ROSE199 wird H rev107 1 über Irf-1 gesteuert. Nach Transformation der Zellen durch aktiviertes KRAS wird der Mek/Erk-Signalweg konstitutiv aktiviert und hemmt dadurch Stat-1. Die Hemmung von Stat-1 führt wiederum zu einem Verlust der Irf 1 Expression (Ohmori et al., 1997; Bottrel et al., 1999). Dadurch wird letztendlich die H rev107 1 Expression verhindert. Für dieses Modell sprechen die von Klampfer et al. gefundenen Ergebnisse und die Tatsache, dass Irf 1 ein Zielgen von Stat ist. Zum Nachweis dieses Modells sollte z.B. das Stat-1 Expressionsniveau und der Stat-1 Phosphorylierungsstatus in Abhängigkeit von PD98059 in einem Western Blot Assay überprüft werden.

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Abbildung 57: Ein möglicher, gemeinsamer Einfluss des MEK-1 und des IFN-γ induzierten Signalwegs auf die H REV107 1 Expression

4.2.4 Die Induktion der H REV107 1 Expression über den TNF-α induzierten Signalweg

Die Inkubation der Nierenkarzinomzelllinie MZ1257 mit dem Zytokin TNF-α führt zu einer Induktion der endogenen H REV107 1 Expression. Auch die Aktivität des Gesamtpromoter-Konstrukts A-3 wird durch Induktion mit TNF-α deutlich gesteigert.

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Bei der Analyse des H-REV107-1 Promoters fallen im Sequenzbereich + 65 bis + 75 zwei potentielle, TNF-α abhängige Bindungsstellen auf. Hierbei handelt es sich um Bindungsstellen für die NFκB-Untereinheit cRel. Der Transkriptionsfaktor NFκB wird durch TNF-α aktiviert (Abb.58).

Die Mutation der beiden cRel-Bindungsstellen führt zum höchsten Aktivitätsverlust des Reporterplasmids, wobei die Restaktivität der mutierten cRel #1 Bindungsstelle mit 9% niedriger liegt als die Restaktivität der Bindungsstelle cRel #2 (37%). Die gemeinsame Mutation beider cRel-Bindungsstellen führt zu einer Restaktivität von 7%. Dieser hohe Verlust der Promoteraktivität zeigt eine große, funktionelle Bedeutung dieses Sequenzbereichs.

Weiterhin ist die Aktivität des Gesamtpromoters eindeutig von der Translokation eines oder mehrerer der NFκB-Familienmitglieder in den Zellkern abhängig. Dies zeigt der Aktivitätsverlust des Reporterplasmids A-3 nach Ko-Transfektion eines Expressionplasmids für den Inhibitor IkappaB-ΔN zeigt. Das Protein IkappaB-ΔN inhibiert vollständig die DNA-Bindungsaktivität aller Proteine der NFκB-Familie, indem es die Translokation der NFκB-Familienmitglieder in den Zellkern verhindert (Baeuerle und Baltimore, 1996).

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Die Transfektionsrate einer Ko-Transfektion liegt nie bei 100%. Das bedeutet, dass einige Zellen zwar das Konstrukt A-3, aber nicht das Plasmid IkappaB-ΔN aufgenommen haben. Die im Reporter Assay gemessene Aktivität ist die Summe der Aktivitäten der einfach- und der doppelt-transfizierten Zellen. Der Beitrag der nur mit A-3 transfizierten Zellen zur Gesamtaktivität führt dazu, dass „nur“ eine Abnahme der Aktivität von 60% gemessen wird, während die Abnahme der Aktivität im Fall der mutierten Bindungsstelle cRel #1 90% beträgt.

Damit ist aber noch nicht nachgewiesen, dass diese Abhängigkeit über die cRel Bindungsstelle läuft. In den durchgeführten EMSA Experimenten wurden Antikörper verschiedener Firmen eingesetzt, die gegen die NFκB-Proteine p50, p52, RelA, RelB und cRel gerichtet waren. Es konnte aber keines dieser Proteine als der, an cRel #1 bindenden, Faktor nachgewiesen werden. Da IkappaB-ΔN die Expression aller NFκB-abhängigen Gene inhibiert, besteht die Möglichkeit, dass H REV107 1 indirekt über NFκB Proteine reguliert wird.

Abbildung 58: Der NFκB-Signalweg führt zur Aktivierung von Zielgenen. Dies wird durch den Repressors dnIκB verhindert. dnIκB bindet NFκB, lässt sich aber, im Gegensatz zum Wildtyp-IκB, nicht durch Phosphorylierung aus dem IκB-NFκB Komplex trennen. NFκB bleibt im Zytosol gebunden und die Transkription der Zielgene wird unterbunden.

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Eine alternative Erklärung für die Abnahme der Promoteraktivität nach der Mutation der potentiellen cRel Bindungsstelle beruht auf der Position der Bindungsstelle im 5´untranslatierten Bereich von HREV107 1. Das cRel-Motiv liegt +65 bis +76 Basenpaare 3´ des Transkriptionsstartpunktes. In diesem Bereich bindet auch die RNA II Polymerase an den Core Promoter. An die als cRel bezeichnete Sequenz könnte also auch ein noch nicht näher definierter Faktor binden, der zur Transkriptionsmaschinerie der RNA II Polymerase gehört (z.B. eine TAF-Untereinheit). Dies würde erklären, warum im EMSA zwar eine deutliche Proteinbindung nachgewiesen wurde, aber kein Mitglied der NFκB-Familie identifiziert werden konnte.

4.2.5 Die Wechselwirkungen zwischen dem TNF-α und dem IFN-γ induzierten Signalweg

Ein wichtiges Gen, dessen Expression durch NFκB induziert wird, ist IRF 1 (Pine, 1997; Mori et al., 1999). Der IRF-1 Promoter besitzt neben einem STAT Element auch eine aktive NFκB-Bindungssequenz (Tanaka und Taniguchi, 2000). Die Aktivierung der H REV107 1 Genexpression durch TNF-α könnte also indirekt über IRF 1 verlaufen. Die Überexpression von IkappaB-ΔN führt möglicherweise zur Suppression der IRF 1 Expression und dadurch auch zur Suppression von H REV107 1. Dies erklärt die beobachtete Abhängigkeit der H-REV107-1 Promoteraktivität von TNF-α und NFκB, ohne dass ein Protein der NFκB Familie an die vorhandenen cRel-Bindungsstellen bindet.

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Eine weitere Verknüpfung zwischen dem NFκB-Signalweg und den IFN-γ abhängigen Signalwegen bildet die MAP Kinase PKR (Abb.59). Diese wird durch TNF-α und IFN-γ aktiviert und aktiviert selbst NFκB durch Phosphorylierung. Das aktivierte NFκB transloziert in den Zellkern. Die ebenfalls von PKR aktivierte Kinase p38 aktiviert innerhalb des Zellkerns die transkriptionelle Aktivität von STAT-1 und NFκB (Norris und Baldwin, 1999). Aktiviertes NFκB induziert die IRF 1 Expression über die NFκB-Bindungsstelle im IRF-1 Promoter (Kumar et al., 1997; Zhang et al., 1998). IRF-1 induziert die p38 Genexpression und schafft damit eine positive Rückkopplung.

Abbildung 59: Mögliche Wechselwirkungen zwischen dem TNF-α und dem IFN-γ induzierten Signalweg, die zur H REV107 1 Expression führen. PKR aktiviert NFκB, dass in den Zellkern translokalisiert. Dort aktiviert die Kinase p38 die transaktivierenden Eigenschaften von NFκB.

4.2.6 Die Induktion der H REV107 1 Expression durch den cAMP-abhängigen Signalweg und den Faktor ATF-2

Eine in silico Analyse des Promoters zeigt eine potentielle CREB-Bindungsstelle -25 bis -30 Basenpaare 5´ des Transkriptionsstartpunkts. Die Behandlung der, mit dem Gesamtpromoter-Konstrukt A-3 transfizierten, NIH3T3 Zelllinie mit cAMP führt zu einer um 32% gesteigerten Aktivität des Konstrukts. cAMP aktiviert die Mitglieder der CREB-Familie (Lalli und Sassone-Corsi, 1994).

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Die Mutation der CREB-Bindungsstelle verringert hingegen die Aktivität des Promoters um 63%. Dies deutet auf eine wichtige Funktion dieser Bindungsstelle hin.

Im EMSA Assay konnte die Bindung des Faktors ATF-2 eindeutig nachgewiesen werden. Eine Beteiligung der anderen Mitglieder der CREB-Familie, CREB-1, CREM-1, ATF-1 und ATF-3 kann nur für CREB-1, auf Grund des unterschiedlichen Bindungsmusters des in der Literatur beschriebenen CREB-1 Oligonukleotids, ausgeschlossen werden. Die Antikörper gegen CREB-1, CREM-1, ATF-1 und ATF-3 zeigten auch in den, als Positivkontrolle durchgeführten, EMSA Versuchen keinen "Supershift".

Das cyclische AMP Responsive Element (CRE; palindromische Sequenz: TGACGTCA) kommt in vielen Promotoren hoch konserviert vor (Bokar et al., 1988). Innerhalb der CREB Familie werden neben Homo- auch spezifische Heterodimere gebildet. So bildet ATF-3 mit ATF-2, nicht aber mit CREB-1 Heterodimere. (Hai et al., 1989). Neben den eigenen Familienmitgliedern bilden CREB Proteine auch mit den Mitgliedern der Jun/Fos-Familie spezifische Heterodimere, die unterschiedliche Affinitäten zu den CRE bzw. AP-1 Bindungsstellen besitzen. So bilden ATF-2 und ATF-3 nur mit Jun Heterodimere, während ATF-4 mit Jun, Fos und Fra-1 Heterodimere bildet. CREB-1 bildet überhaupt keine interfamiliären Heterodimere. CREM-1 wurde in diesen Arbeiten nicht untersucht. Der ATF-2/cJun Komplex bindet mit abnehmender Affinität an die CRE (TGACGTCA) > ENK-2 (TGCGTCA) > AP-1 (TGACTCA) Bindungsstellen, während z.B. ATF-3 an die CRE, ENK-2 und AP-1 Bindungsstelle mit der gleichen Affinität bindet (Hai und Curran, 1991). Die Sequenz der Bindungsstelle innerhalb des H-REV107-1 Promoters lautet: TGACCTCA und liegt damit zwischen der CRE Bindungsstelle (Austausch einer Base: G zu C) und der AP-1 Bindungsstelle (Insertion einer Base C). Der Versuch, die Bindung des cJUN-Proteins im EMSA nachzuweisen, führte jedoch zu keinem Ergebnis.

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Die Transkriptionsfaktoren-Familie spielt neben der cAMP-vermittelten auch in der Calcium- und Virusinduzierten Transkriptionsregulation eine wichtige Rolle (Roesler et al., 1988). Biologische Funktionen des cAMP-Signalwegs sind bei der hormonellen Antwort, der Differenzierung, der Proliferation (Della Fazia, 1997) und bei kardiologischen Prozessen nachgewiesen (Muller, 2000).

Der Transkriptionsfaktor ATF-2 wird ubiquitär exprimiert, ein besonders hohes mRNA Niveau zeigt sich im Gewebe des Gehirns. Das Protein besitzt ein C-terminales, DNA-bindendes Basic Domain/Leucin Zipper (bZIP) Motiv und eine N-Terminale Trans-Aktivierungsdomäne (TAD). Im nicht aktiven Zustand interagiert die bZIP Domäne intramolekular mit der TAD und inhibiert so die trans-aktivierende Eigenschaft von ATF-2 (Li und Green, 1996).

In der undifferenzierten, polypotenten, embryonalen Krebszelllinie F9 (EC) wird der Faktor UTF-1 als ein aktivierender Ko-Faktor von ATF-2 beschrieben. Dabei dient dieser Faktor zur Demaskierung der Trans-Aktivierungsdomäne des ATF-2. Interessanterweise interagiert dieser Co-Faktor auch mit TAFII70, einem Bestandteil des TFIID-Komplexes (Fukushima et al., 1998). Es wird angenommen, dass auch in differenzierten Zelllinien noch nicht identifizierte Ko-Faktoren existieren, die ähnlich wie UTF-1 eine Brücke zwischen der Transaktivierenden Domäne des ATF-2 und dem TFIID-Komplex bilden. Die Arbeit von Fukushima et al. zeigt einen direkten Zusammenhang zwischen ATF-2 und der RNA Polymerase II. Wird ein ATF-2 Konstrukt eingesetzt, das auf Grund einer deletierten bZIP Domäne konstitutiv aktiv ist, so interagiert die Transaktivierende Domäne des ATF-2 direkt mit der basalen Transkriptionsmaschinerie (Fukushima et al., 1998).

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Für das ATF-2 Element wurde gezeigt, dass diese Bindungsstelle gemeinsam mit einem Inr-Element einen funktionsfähigen Promoter darstellt, der ausreicht, um die Gentranskription einzuleiten (Conaway und Conaway, 1991). Ein Core-Promoter kann eine TATA-Box plus einem Initiator (Inr)-Element oder eines der beiden Elemente besitzen. Besitzt ein Promoter ein Inr-Element, so kann sich 3´ von diesem, in einem genau definierten Abstand von 28 Basen, ein Downstream Promoter Element (DPE) befinden. Das ATF-2 Element kann die Funktion der TATA-Box innerhalb des Core-Promoters ersetzen. Anstatt des Faktors TBP, der an die TATA-Box bindet, übernimmt der Faktor ATF-2 die Stabilisierung des RNA Polymerase II Komplexes. Dies geschieht durch die Wechselwirkung mit der Untereinheit TAFII70 des basalen Transkriptionsfaktors TAFIID.

Im humanen H-REV107-1 Promoter befindet sich das ATF-2 Element in genau an der Position zum Transkriptionsstartpunkt, an dem sich ansonsten die TATA-Box befindet. Damit ist die räumliche Voraussetzung gegeben, dass ATF-2 durch die Stabilisierung des RNA Polymerase II-Komplexes aktiv zur verstärkten Expression und damit zur Regulation des H REV107 1 Gens beiträgt.

Ein besonders gut untersuchter Promoter ist der Promoter des Virus-induzierbaren IFN-β Gens. Du und Maniatis konnten innerhalb dieses Promoters eine ATF/CREB Bindungsstelle identifizieren (Du und Maniatis, 1992). Falvo et al. zeigten, dass zum Enhanceosom, das für die Viren-induzierte IFN-β Expression verantwortlich ist, die Proteine ATF-2/c-Jun und IRF-3 gehören. IRF-3 und ATF-2/c-Jun binden dabei gemeinsam an den Promoter. Die Orientierung der jeweiligen Bindungsstellen ist entscheidend für die Funktion des bindenden Komplexes (Falvo et al., 2000). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktivität eines Promoters auch von den Abständen und der Orientierung verschiedener Bindungsstellen zueinander abhängig ist.

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Allgemeingültige Regeln für die Anordnung verschiedener Elemente zueinander sind noch nicht bekannt. So zeigt auch der Vergleich der Promotoren verschiedener, IFN-γ-abhängiger Gene hinsichtlich der Sequenz der IFN-γ abhängigen Bindungsstellen, oder der Anordnung der einzelnen Elemente zueinander, keine Gemeinsamkeiten mit dem H-REV107-1 Promoter (Indoleamine Dioxygenase, PKR, MHC ClassII, SOCS 3, tRNA Synthetase und IFN ; Robinson et al., 2003; Tanaka und Samuel, 1994; Giroux et al., 2003; Gatto et al., 2004; Liu et al., 2004). Für eine tiefergehende Analyse von Übereinstimmungen ist ein algorithmisches Modell von Nöten, mit Hilfe dessen gemeinsame Strukturen innerhalb verschiedener Promotoren gefunden werden können.

4.2.7 Ein Modell der H REV107 1 Regulation

Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Eckpunkte der H-REV107-1 Regulation erarbeitet:

  1. Die Expression von H REV107 1 wird durch cAMP, IFN-γ und TNF-α induziert.
  2. Der Faktor IRF-1 ist für eine direkte Aktivierung der H rev107 1 Expression verantwortlich.
  3. Ein aktiver MEK/ERK-Signalweg kann die H rev107 1 Expression unterdrücken.
  4. Die Abwesenheit von NFκB im Zellkern senkt die H-REV107-1 Promoteraktivität.
  5. Der Faktor ATF-2 bindet an das ATF-2 Element im H-REV107-1 Promoter.

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Im Folgenden sollen die schon zuvor aufgeführten, Teil-Zusammenhänge in mögliches umfassendes Modell der H REV107 1 Regulation eingebracht werden (Abb. 60).

JNK und p38 aktivieren den, nachgewiesener Weise an den H-REV107-1 Promoter bindenden, Transkriptionsfaktor ATF-2. JNK und p38 werden ihrerseits von der IFN-γ und TNF-α induzierbaren Kinase PKR aktiviert. TNF-α induziert außerdem die Aktivität des Transkriptionsfaktors NFκB. Dies kann über den klassischen NIK-Signalweg oder über den PKR-Signalweg geschehen.

Durch die Kinasen-vermittelte Phosphorylierung des NFκB-Suppressors IκB wird NFκB freigesetzt und wandert in den Zellkern. Dort wird seine transaktivierende Eigenschaft durch die p38-vermittelte Phosphorylierung aktiviert. IFN-γ induziert neben PKR auch die Aktivität von STAT-1. Das nach erfolgter Phosphorylierung gebildete STAT-1-Dimer wandert in den Zellkern. Hier wird die transaktivierende Eigenschaft von STAT-1 ebenfalls durch p38-vermittelte Phosphorylierung aktiviert. Der aktivierte Transkriptionsfaktor STAT-1 induziert gemeinsam mit NFκB die IRF 1 Genexpression (gestrichelte Pfeile).

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Die IRF 1 Genexpression kann aber auch von jeweils nur einem der beiden Transkriptionsfaktoren induziert werden. IRF-1 aktiviert als Transkriptionsfaktor wiederum die p38 Genexpression (gestrichelter Pfeil).

Abbildung 60: Mögliche Signalwege, die ausgehend von einer Induktion durch IFN-γ und TNF-α zu einer Aktivierung der H-REV107-1 Genexpression führen. Dabei steht die Kinase PKR im Mittelpunkt, die die Aktivitäten von p38, JNK, STAT-1 und NFκB postiv reguliert.

Die direkte Induktion der H REV107 1 Genexpression erfolgt durch ATF-2 und IRF-1. Ob auch NFκB die H REV107 1 Genexpression direkt induziert, oder ob NFκB über die Aktivierung der IRF 1 Genexpression an der Regulation von H REV107 1 beteiligt ist, bleibt unklar. Es bleibt natürlich die Möglichkeit bestehen, dass auf Grund mangelhafter Antikörper der Nachweis einer Bindung von NFκB an die cRel-Bindungsstelle, nicht möglich war.

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Ein Beispiel, bei dem NFκB gemeinsam mit IRF-1 für die Transkription eines Gens verantwortlich ist, ist das MHC Klasse I Gen (Drew et al., 1995). Sicher ist, dass NFκB neben ATF-2 und IRF-1 die Regulation von H REV107 1 mitbestimmt. Eine zentrale Kinase, die die Aktivität dieser drei Transkriptionsfaktoren kontrollieren kann, und sowohl von IFN-γ als auch von TNF-α induziert wird, ist PKR.

4.2.8 Die H REV107 1 Expression in der Antwort der Zelle auf eine Vireninfektion

Die Behandlung von Zellen mit INF-γ induziert die H REV107 1 Expression. INF-γ ist ein Zytokin das in der Antwort des Körpers auf eine Vireninfektion von großer Bedeutung ist. Wird eine Virusinfektion erkannt, so produzieren und sezernieren erst T-Helfer Zellen, später auch die anderen aktivierten Zellen, IFN-γ. Dieses steuert durch die Aktivierung der Oberflächenrezeptoren benachbarter Zellen die Immunantwort dieser Zellen. Auch IRF-1 und PKR, die beide durch IFN-γ aktiviert werden, spielen in der Immunantwort eine wichtige Rolle. Auf Grund der gezeigten Regulation von H REV107 1 durch IFN-γ und IRF-1 besteht die Möglichkeit, dass H-REV107-1 in der Immunantwort der Zelle auf eine Virusinfektion von Bedeutung ist. ATF-2 ist hingegen als ein Transkriptionsfaktor beschrieben, der die virale Expression aktiviert. Adam et al. konnten zeigen, dass unter anderem ATF-2 für die Expression des Bovinen Leukämie Virus verantwortlich ist (Adam et al., 1996). Genauso ist ATF-2 für die virale Expression des T-Zellen Leukämie Virus Typ1 verantwortlich (Xu et al., 1996) Offenbar bedienen sich die Viren der Transkriptionsfaktoren, die im Zuge der anti-viralen Antwort aktiviert werden.

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Ein möglicher Zusammenhang zwischen der Immunantwort der Zelle auf eine Virusinfektion und der H REV107 1 Expression wurde in der Arbeitsgruppe von Dr. Christine Falk (GSF München) untersucht. Dazu wurde in primären, humanen Fibroblasten das Niveau der H REV107 1 Expression vor und nach einer CMV-Infektion analysiert. Tatsächlich zeigt sich nach der Infektion der Zellen eine stark erhöhte H REV107 1 mRNA Expression (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse, die wegen fehlender Mittel zur Zeit nicht weiter verfolgt werden können, zeigen eine weitere, interessante Möglichkeit auf, in der H-REV107-1 von Bedeutung sein kann.

4.2.9 Die Methylierung des Promoters sowie die mögliche Bedeutung der GC-Box

Die Suppression eines Promoters durch Hypermethylierung ist ein häufig beschriebenes Ereignis. Die mögliche in vivo Methylierung des H-REV107-1 Gens wird von der Arbeitsgruppe Prof. J. Walter aus Saarbrücken untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass der zum Grossteil aus CpG-Inseln bestehende H-REV107-1 Promoter in der Zelllinie OVCAR-3 methyliert ist. Dies kann ein Grund für eine Suppression der H-REV107-1 Genexpression in dieser Zelllinie sein, wie die um 70% reduzierte Promoteraktivität des methylierten Gesamtpromoter-Konstrukts A-3 zeigt. Die Behandlung der Zelllinien mit 5-Aza-2´-Deoxycytidine zur Aufhebung einer möglichen Methylierung des Promoters führt nicht zu der Aufregulation des H REV107 1 Gens. Welchen Einfluss eine möglicherweise vorhandene Methylierung des H-REV107-1 Promoters auf die endogene Genexpression hat, muss in weiteren Untersuchungen der Arbeitsgruppe Prof. Walter noch gezeigt werden.

4.3  Ausblick

In weiteren Arbeiten sollten die für die Regulation des H REV107 1 Gens aufgestellten Modelle überprüft werden. Dabei sind auf Besonderheiten in der Regulation von H REV107 1 in Mensch, Maus und Ratte zu achten.

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Die Funktion des H REV107 1 Gens als Tumorsuppressor ist besonders im Hinblick auf seine potentielle Bedeutung in der Bekämpfung von Tumoren von Bedeutung. Daher sollte die H REV107 1 Regulation vor allem im humanen System weiter untersucht werden. Das Modell, dass der Kinase PKR eine zentrale Rolle in der H REV107 1 Regulation zuschreibt, muss noch bestätigt werden. Des weiteren können mit Western Blot Assays die Phosphorylierung verschiedener Faktoren, innerhalb der vorgeschlagenen Signalwege, in Abhängigkeit von IFN-γ, TNF-α bzw. cAMP untersucht werden. Außerdem ist die Auswirkung der Überexpression verschiedener Faktoren der Signalwege auf die H REV107 1 Expression von Interesse. Abgesehen von der Bedeutung von H-REV107-1 in der Tumorsuppression sollte auch die Funktion von H-REV107-1 in der Antwort der Zelle auf eine virale Infektion weiter untersucht werden. Auch hier spielen die Viren-induzierbare Kinase PKR, sowie IFN-γ eine zentrale Rolle.

Im Ratten Modell sollte vor allem die mögliche Suppression der H rev107 1 Expression durch den aktivierten MEK/ERK-Signalweg untersucht werden. Dabei könnte mit Hilfe Phospho-spezifischer Antikörper überprüft werden, ob der aktive MEK/ERK-Signalweg zu einer Hemmung der STAT-1 Aktivität führt. Dazu sollte der Phosphorylierungsstatus von STAT-1 in ROSE199, sowie in mit PD98059 behandelten Rose199A2/5 Zellen untersucht werden. Des weiteren zeigt der Ratten Promoter eine Region mit mehreren NFκB-Bindungsstellen, die im Promoter der Maus und des Menschen nicht vorkommt. Daher sollte auch eine mögliche Regulation des Ratten H rev107 1 Gens in Abhängigkeit von TNF-α bzw. NFκB untersucht werden.

Im Maus Modell sollte die gezeigte IRF-1 Abhängigkeit der H rev107 1 Expression weiter untersucht werden. Dafür spricht auch das gehäufte Vorkommen von IRF-Bindungsstellen im Maus Promoter. Ein direktes Ergebnis würde die Untersuchung von IRF-1 defizienten NIH3T3 Zellen auf die Expression von H rev107 1 bringen.

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Falls es gelingt, einen größeren Bereich des humanen H-REV107-1 Promoters zu klonieren, sollte zumindest noch die zweite, 5´ der in dieser Arbeit verwendeten Promoterregion liegende, IRF-1 Bindungsstelle untersucht werden. Um die Schwächen der transienten Transfektion zu umgehen, sollten auch die Methoden der stabilen Transfektion und des ChIP-Assays zur Anwendung kommen. Dabei sollte auch die Wechselwirkung zwischen ATF-2 und dem RNA PolmeraseII Komplex in vivo untersucht werden, da es sich, bei einem positiven Nachweis, beim H-REV107-1 Promoter um den ersten endogenen Promoter handelt, für den der Ersatz der TATA-Box durch ATF-2 in vivo nachgewiesen wäre. Auch weitere Elemente des Core-Promoters sollten auf ihre Funktionalität hin untersucht werden. Von besonderem Interesse ist dabei vor allem das, in direkter Nachbarschaft zur ATF-2 Bindungsstelle doppelt vorkommende, BRE-Element.


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12.10.2006