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3  Methoden

3.1 Patienten

Die Untersuchung wurde an der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Nephrologie und internistische Intensivmedizin der Charité, Campus Virchow-Klinikum, Berlin durchgeführt, wofür ein positives Votum der zuständigen Ethikkommission eingeholt wurde. Einschlusskriterium für Patienten war ein prähospitaler Herzkreislaufstillstand mit primär erfolgreicher kardiopulmonaler Reanimation und die anschließende Aufnahme auf einer der internistischen Intensivstationen der Klinik. Eine weitere Voraussetzung für den Einschluss war, dass es Augenzeugen des Ereignisses gab und dies dokumentiert wurde, so dass die Zeitspanne bis zum Einsetzen der kardiopulmonalen Reanimation anhand des Notarzt-Protokolls abgeschätzt werden konnte. Ergaben sich fremdanamnestisch oder klinisch Hinweise auf das Vorhandensein einer chronisch-entzündlichen Erkrankung oder eine kurz vor dem Herzstillstand durchgemachte Infektion (< 4 Wochen), so wurden die Patienten nicht eingeschlossen. Ebenso wurden die Verläufe von Patienten, die binnen 72 Stunden nach Aufnahme verstarben, nicht analysiert.

Die initiale Reanimation erfolgte in einem Teil der Fälle durch Laien – sogenannte Ersthelfer – oder auch Angehörige medizinischer Berufsgruppen, die zu diesem Zeitpunkt nicht Teil des organisierten Rettungsdienstes waren und als professionelle Ersthelfer bezeichnet werden [19]. Diese Reanimationen wurden nach dem Eintreffen des Rettungsdienstes von diesem übernommen und fortgeführt. Im übrigen Teil der Fälle erfolgte die Reanimation initial durch den Rettungsdienst ohne eine vorherige Reanimation durch Ersthelfer. Beim Rettungsdienst handelte es sich um RTW-Besatzungen der Berliner Feuerwehr, die im „Basic Life Support“ und der Bedienung eines halbautomatischen externen Defibrillators ausgebildet sind. Beide Gruppen – Patienten mit Reanimation durch Ersthelfer oder durch RTW-Besatzungen – wurden in die Untersuchung eingeschlossen.

Die Reanimation wurde nach den Regeln des Berliner Rettungsdienstes im Verlauf durch eintreffende Notärzte übernommen, die einen „Advanced Cardiac Life Support“ durchführen konnten. Nach Wiederherstellung der spontanen Zirkulation an der Einsatzstelle wurden die Patienten vom Rettungsdienst unter Notarztbegleitung in die [Seite 29↓]Klinik gebracht. In der Regel wurden die Patienten im Verlauf der Reanimationsmaßnahmen orotracheal intubiert und während des Transports und des sich anschließenden Aufenthalts auf der Intensivstation mechanisch beatmet. Die Patienten wurden bis zu Ihrer Entlassung, längstens jedoch 28 Tage, im Verlauf beobachtet.

3.2 Probanden

Als Vergleichskollektiv für die Hypoxie-Exposition diente eine Gruppe freiwilliger Probanden. Insgesamt sieben männliche Personen nahmen an diesem Teil der Untersuchung teil. Alle Teilnehmer waren gesund und insbesondere frei von chronischen Erkrankungen und hatten kürzlich keine Infektionen durchgemacht. Vor der Aufnahme in die Untersuchung wurden die Probanden über das Ziel der Untersuchung und das Versuchsprotokoll aufgeklärt. Von jedem Teilnehmer wurde ein schriftliches Einverständnis eingeholt.

Die Probanden wurden, wie bereits in [145] beschrieben, simulierten Höhenbedingungen von 4000 m in einer Dekompressionskammer ausgesetzt. Dafür wurde der Luftdruck zunächst für 15 Minuten auf 600 Torr reduziert und für die restliche Zeit auf 460 Torr reguliert, was 60% des normalen Atmosphärendrucks von rund 760 Torr entspricht. Die Probanden blieben für insgesamt 6 Stunden in der Kammer. Von jedem Probanden wurden aus einem peripheren Zugang in der V. cubitalis zu verschiedenen Zeitpunkten jeweils 4 ml Blut entnommen. Dies geschah unmittelbar vor Beginn der Untersuchung, dann alle 60 Minuten während des Aufenthalts in der Kammer und direkt nach Ende der Hypoxie-Exposition. Zusätzlich wurden Blutproben 24, 48 und 72 Stunden nach Beginn der Hypoxie entnommen, wofür die Probanden erneut einbestellt wurden. Vorangegangene Untersuchungen bei Freiwilligen hatten ergeben, dass diese Form inspiratorischer Hypoxie den mittleren alveolären Sauerstoffpartialdruck von 100 auf 48,6 Torr verringert [145].

Die praktische Durchführung dieses Teils der Untersuchung erfolgte unter der Leitung von Prof. Dr. Christoph H. Gleiter am Institut für klinische Pharmakologie der Universität Göttingen. Die dort entnommenen Plasma-Proben wurden bei -80 °C eingefrorenen und [Seite 30↓]nach Berlin geschickt, wo sie zusammen mit den Patienten-Proben unter gleichen Bedingungen untersucht wurden.

3.3 Intensivtherapie

Die in die Untersuchung einbezogenen reanimierten Patienten erfuhren die im Rahmen der Routineversorgung nach einem Herzkreislaufstillstand mit kardiopulmonaler Reanimation erforderlichen intensivmedizinischen und -pflegerischen Maßnahmen. Dies beinhaltete ein kontinuierliches Herz-Kreislaufmonitoring und – soweit erforderlich – eine mechanische Beatmung und eine intravenöse Sedierung. Bei einem Teil der Patienten wurde in Abhängigkeit vom klinischen Verlauf außerdem zeitweise eine Nierenersatztherapie durchgeführt. Das Procedere sah vor, dass alle untersuchten Proben – Plasma, Vollblut und andere Materialien – im Rahmen der auf der Intensivstation üblichen Routineuntersuchungen und -blutentnahmen entnommen wurden, so dass keine zusätzlichen Abnahmen durchgeführt werden mussten.

3.3.1 Mechanische Beatmung

Im Anschluss an die kardiopulmonale Reanimation wurden alle Patienten über einen unterschiedlich langen Zeitraum mechanisch invasiv beatmet. Die Beatmung erfolgte dabei überwiegend im druckkontrollierten SIMV-Modus (synchronized intermittent mandatory ventilation), bei dem die Patienten neben der druckkontrollierten Beatmung auch spontane Atemzüge durchführen können, die vom Beatmungsgerät druckunterstützt werden. Während des Weanings wurde die Eigenatmung der meisten Patienten außerdem vorübergehend durch den CPAP-Modus (continuous positive airway pressure) unterstützt. Dabei sorgt das Beatmungsgerät dafür, dass während der Atmung ein einstellbarer positiver Mindestdruck herrscht, der für eine erhöhte funktionelle Residualkapazität und eine verbesserte Compliance sorgt. Im Rahmen dieser mechanischen Beatmung entwickelte ein Teil der Intensivpatienten eine Ventilator-assoziierte Pneumonie, die erfahrungsgemäß den Großteil der nosokomialen Infektionen bei beatmeten Intensivpatienten ausmacht [128].


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3.3.2  Outcome nach kardiopulmonaler Reanimation

Das Outcome nach kardiopulmonaler Reanimation wurde in der Untersuchung anhand der Cerebral Performance Category bestimmt. Prinzipiell unterscheidet die Cerebral Performance Category fünf verschiedene Kategorien, die in Tabelle 3 dargestellt sind.

Tabelle 3 :Cerebral Performance Category [17,19]

Cerebral Performance Category

Bezeichnung

Beschreibung

1

Gute cerebrale Funktion

Wach, aufmerksam, normale Hirnfunktion.

2

Moderate cerebrale Dysfunktion

Wach, aufmerksam, mit einzelnen Hirnfunktionsstörungen.

3

Schwere cerebrale Dysfunktion

Wach, eingeschränkte Wahrnehmung, benötigt Hilfe bei Alltagsaufgaben

4

Coma

Nicht wach, keine Wahrnehmung, keine Interaktion mit der Umwelt

5

Hirntod oder Tod

Apnoe, Areflexie, komatös, stilles EEG, mit oder ohne Herzschlag

Zur vereinfachten Darstellung und Auswertung des Outcome wurden die fünf Kategorien im Rahmen der Untersuchung zu drei zusammengefasst. Erstens die ohne wesentliche neurologische Defizite überlebenden Patienten der Cerebral Performance Category 1 und 2, zweitens die mit Postischämischer Enzephalopathie überlebenden Patienten der Cerebral Performance Category 3 und 4 und drittens die während des Aufenthalts verstorbenen Patienten der Cerebral Performance Category 5. Da sich neurologische Defizite nach initialem Auftreten im Verlauf wieder zurückbilden können, war es wichtig, das endgültige neurologische Outcome erst am Ende der Therapie zu bestimmen, d.h. bei Entlassung aus der Klinik [146].

3.3.3 Bestimmung der Körpertemperatur

Die Körpertemperatur wurde als Körperkerntemperatur gemessen. Die Messung erfolgte dabei entweder mittels eines Blasenkatheters, durch einen arteriellen Katheter in der A. femoralis oder einen pulmonal-arteriellen Katheter (Swan-Ganz-Katheter). Sofern eine Nierenersatztherapie durchgeführt wurde, wurde angestrebt die [Seite 32↓]Körpertemperatur in einem therapiefreien Intervall zu bestimmen, da bedingt durch die Kühlwirkung der extrakorporalen Therapie andernfalls eine falsch niedrige Temperatur gemessen werden kann. Dies war jedoch bei Patienten, die mit kontinuierlicher veno-venöser Hämofiltration behandelt wurden, nicht immer möglich.

3.3.4 Blutentnahmen

Plasmaproben für die Bestimmung der Akute Phase Proteine, von Erythropoetin und Procalcitonin sowie EDTA-Blut für die Messung der Hämoglobin-Konzentration und der Leukozytenzahl wurden von den Patienten unmittelbar nach der Aufnahme (Tag 0) sowie an jedem Morgen gewonnen. Alle Proben waren Teil der Routineblutentnahmen der Intensivstation. Die Bestimmung der nicht routinemäßig erfassten Parameter erfolgte aus den Plasmaresten, die nach der Bestimmung aller Routineparameter verblieben. Aufgrund dieses Procederes stand in einigen Fällen nicht genügend Material zur Verfügung, um alle Parameter zu bestimmen. Außerdem fehlen die Leukozytenzahl und die Hämoglobinkonzentration an den Tagen, an denen diese routinemäßig nicht bestimmt wurden, da dann auch das erforderliche EDTA-Blut nicht abgenommen wurde. Durch die stets gleiche Uhrzeit der morgendlichen Routineblutentnahme wurde – abgesehen von der ersten Entnahme (Tag 0), die unabhängig von der Uhrzeit erfolgte – der Einfluss der zirkadianen Rhythmik minimiert, welche die Akute Phase Reaktion zeigt [147]. Während der ersten Woche wurden die Parameter täglich bestimmt (Tage 1-7) und nach einer weiteren Woche erfolgte eine abschließende Bestimmung (Tag 14). Als Abnahmegefäße wurden mit Li-Heparin bzw. EDTA beschichtete Probenröhrchen (Firma Sarstedt, Nümbrecht) verwendet. Alle Proben wurden unmittelbar nach der Abnahme zentrifugiert und das Plasma in Zentrifugenröhren (Firma Eppendorf, Hamburg) aliquotiert. Direkt im Anschluss wurde das Blutplasma bei -80 °C bis zur Messung eingefroren.

3.3.5 Röntgenaufnahmen

Von den Patienten wurde routinemäßig nach der Aufnahme sowie nach klinischer Notwendigkeit an den weiteren Tagen jeweils eine Röntgen-Thoraxaufnahme erstellt. Aufgrund der besonderen Bedingungen auf der Intensivstation erfolgten diese Aufnahmen im Liegen mit einem mobilen Röntgengerät und fast ausschließlich im [Seite 33↓]anterior-posterioren (a.p.) Strahlengang. Seitliche Aufnahmen wurden nur selten durchgeführt.

Für die Untersuchung wurden die Röntgenbefunde hinsichtlich möglicher Anzeichen einer Ventilator-assoziierten Pneumonie in drei Kategorien eingeteilt. Eine Aufnahme mit einer Verminderung der Strahlentransparenz im Sinne einer Konsolidierung wurde als positiver Befund gewertet, sofern die Transparenzminderung nicht nach einer Bronchoskopie reversibel war und sie sich demzufolge nicht auf eine Atelektase zurückführen ließ. Eine Aufnahme ohne eine solche Transparenzverminderung wurde als negativer Befund gewertet. Sofern keine klare Abgrenzung des Befundes möglich war, wurde dieser als fraglich eingestuft.

3.3.6 Mikrobiologische Untersuchungen

Bei Verdacht auf eine Ventilator-assoziierte Pneumonie oder eine andere Infektion wurde den Patienten routinemäßig Blut für mikrobiologische Untersuchungen durch direkte Venenpunktion – nicht durch einen bereits liegenden Katheter – entnommen. Mit diesem Blut wurden je eine aerobe und eine anaerobe Blutkulturflasche beimpft und 6 Tage lang bei 37 °C im Mikrobiologischen Labor des Campus Virchow Klinikum bebrütet. Jedes kulturelle Wachstum wurde notiert und als positiver Befund gewertet, falls nicht eine offensichtliche Kontamination vorlag (verzögertes Wachstum, typische Standortflora der Haut, Wachstum in nur einer von mehreren Kulturflaschen).

Bei intubierten Patienten wurde neben Blutkulturen auch Tracheal- und Bronchialsekret gewonnen und mikrobiologisch untersucht. Bei der Bewertung des kulturellen Wachstums, das auf Kulturplatten ebenfalls bei 37 °C für 6 Tage erfolgte, wurden nur solche Kulturen als positiv gewertet, die pathogene Keime in relevanter Anzahl ergaben. Alle anderen Kulturen werden als negativ bewertet.

3.4 Infektkriterien

Auf Grundlage klinischer Befunde wie purulentem Trachealsekret, Veränderungen im Gasaustausch und Auskultationsbefund sowie der erhobenen mikrobiologischen Kulturbefunde und der Röntgen-Thoraxbefunde erfolgte eine Beurteilung der Patienten hinsichtlich einer Ventilator-assoziierten Pneumonie [128].


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Die Patienten wurden anhand ihrer Befunde in drei Gruppen mit bewiesener, fraglicher und ausgeschlossener Ventilator-assoziierter Pneumonie unterteilt (siehe Tabelle 4). Eine bewiesene Ventilator-assoziierte Pneumonie wurde bei gleichzeitigem Vorliegen eines positiven Röntgenbefundes und einer positiven mikrobiologischen Kultur festgestellt. Die Diagnose einer fraglichen Ventilator-assoziierten Pneumonie erfolgte, wenn bei entsprechendem klinischen Bild entweder ein positiver oder ein fraglicher Röntgenbefund zusammen mit einer negativen Kultur vorlag oder ein negativer Röntgenbefund zusammen mit einer positiven Kultur auftrat. Daraus resultiert die inhomogenste der drei Patientengruppen, da die fraglichen Infektzeichen sowohl eine Ventilator-assoziierte Pneumonie als auch eine Infektion andere Genese oder gar keine Infektion repräsentieren können. Keine Ventilator-assoziierte Pneumonie wurde diagnostiziert, wenn sich ein negativer Röntgenbefund zusammen mit einer negativen Kultur ergab.

Tabelle 4 :Diagnose einer Ventilator-assoziierten Pneumonie

Ventilator-assoziierte Pneumonie

bewiesen

fraglich

fraglich

ausgeschlossen

Röntgen

positiv

positiv/fraglich

negativ

negativ

Mikrobiologie

positiv

negativ

positiv

negativ

Klinik

positiv/negativ

positiv

positiv

positiv/negativ

3.5 Labormethoden

Insgesamt wurden fünf positive Akute Phase Proteine (CRP, α1-saures Glykoprotein, Serum Amyloid A, Haptoglobin und α1-Antitrypsin) sowie Transferrin, Erythropoetin, Hämoglobin, Procalcitonin und die Leukozytenzahl im Labor bestimmt.

3.5.1 Bestimmung der Akute Phase Proteine

Die Plasmakonzentrationen der drei Typ I Akute Phase Proteine CRP, α1-saures Glycoprotein und Serum Amyloid A, der zwei Typ II Akute Phase Proteine, Haptoglobin und α1-Antitrypsin, und des negativen Akute Phase Proteins Transferrin wurden im Zentrallabor des Campus Virchow Klinikum bestimmt. Die Bestimmung dieser Proteine [Seite 35↓]erfolgte mit immunoturbidimetrischen Methoden. Für CRP wurden Reagenzien der Firma Greiner (Flacht) verwendet, angepasst auf einen Dax 72 (Firma Bayer, München) oder einen Hitachi 911 (Firma Boehringer, Mannheim) Random Access Clinical Chemistry Analyzer. α1-saures Glykoprotein, α1-Antitrypsin, Haptoglobin and Transferrin wurden mit Reagenzien der Firma Dako (Hamburg) untersucht, angepasst an einen Hitachi 911 oder Cobas Mira Plus (Firma Roche, Grenzach) Random Access Clinical Chemistry Analyzer. Kalibratoren von Dako und Greiner wurden zusammen mit dem Referenzmaterial CRM 470 verwendet. Serum Amyloid A wurde mit einem Mikrotiterplatten Sandwich-ELISA unter Verwendung eines Dynatech Readers (Chantilly, Virginia, USA) und spezifisch gegen Serum Amyloid A gerichteter monoklonaler Antikörper (Firma Biosource Cytoscreen, Ratingen) bestimmt. Bei den verwendeten Messverfahren handelt es sich um etablierte Methoden mit klinisch akzeptierten biologischen und analytischen Variationen der gemessenen Parameter innerhalb und zwischen Patienten [148]. Die gemessenen Proteine sind bei der Lagerung bei -18 °C und darunter stabil [53,95,97,98,100]. Die Referenzbereiche der Normalwerte für die sechs Proteine bei der Messung im Zentrallabor sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Tabelle 5 :Referenzbereiche der Akute Phase Proteine

Analyt

Referenzbereich

CRP

< 0,8 mg/dl

α1-saures Glykoprotein

50-120 mg/dl

Serum Amyloid A

nicht festgelegt

Haptoglobin

30-200 mg/dl

α1-Antitrypsin

90-200 mg/dl

Transferrin

200-360 mg/dl

3.5.2 Bestimmung von Erythropoetin

Die Konzentration von Erythropoetin im Plasma wurde im Labor der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Nephrologie und Intensivmedizin mittels eines Radioimmunoassays bestimmt, wie in [149] beschrieben. Dabei wurden ein Kaninchen-[Seite 36↓]Antiserum gegen rekombinantes Erythropoetin und iodiertes humanes Erythropoetin als Tracer (Firma Amersham International, Amersham, UK) eingesetzt. Der Mittelwert der Erythropoetin-Konzentration beträgt bei gesunden, nicht-anämischen Erwachsenen 17,9 U/l mit einem Referenzbereich (5.-95. Perzentile) von 11-31 U/l.

3.5.3 Bestimmung von Procalcitonin

Procalcitonin wurde mittels einer immunoluminometrischen Methode bestimmt (Brahms Diagnostica, Berlin). Entsprechend der Anleitung des Herstellers wurden dabei in einem antikörper-beschichteten Probenröhrchen 20 µl Plasma mit 250 µl Tracer versetzt, 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und nach Waschung die Antigen-Antikörperbindung auf einer Cobas Mira (Firma Behringwerke, Marburg) nephelometrisch bestimmt. Anhand einer Kalibrationskurve, erstellt aus parallel gemessenen Standard-Proben, wurde die Procalcitonin-Konzentration im Plasma bestimmt. Der Referenzbereich umfasst alle Werte kleiner oder gleich 0,5 µg/l und die Nachweisgrenze der Methode liegt bei 0,1 µg/l [102,150,151]. Die Proben können vor der Messung bei -80 °C gelagert werden [124].

3.5.4 Bestimmung von Hämoglobin

Die Hämoglobin-Konzentration des Blutes wurde nach der Aufnahme und an jedem Morgen im Zentrallabor des Campus Virchow Klinikum aus EDTA-Blut bestimmt, das im Rahmen der Routineblutentnahme bei den Patienten entnommen wurde. Der Referenzbereich des Zentrallabors für die Hämoglobin-Konzentration liegt für Männer bei 14-18 g/dl und für Frauen bei 12-16 g/dl. Aufgrund der für die statistische Überprüfung verwendeten nicht-parametrischen Verfahren (siehe Abschnitt 3.6) ist diese Unterscheidung für die Betrachtung des Gesamtverlaufs jedoch unerheblich. Die nicht-parametrischen Verfahren untersuchen lediglich Intrasubjekt-Faktoren, d.h. den Verlauf des Parameters bei den einzelnen Patienten, stellen aber keinen Vergleich der Mittelwerte bzw. Mediane mehrerer Patienten an. Der unterschiedliche Referenzbereich bei Männern und Frauen ist deshalb nur dann relevant, wenn man die Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen an einzelnen Tagen betrachtet.


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3.5.5  Bestimmung der Leukozytenzahl

Die Leukozytenzahl wurde täglich aus im Rahmen der morgendlichen Routineblutentnahme entnommenem EDTA-Blut bestimmt. Der Referenzbereich des Zentrallabors für die Leukozytenzahl liegt bei 3,1 bis 9,5 nl-1.

3.6 Statistik

Für die statistische Auswertung wurde SPSS für Windows in der Version 10.0 eingesetzt. Aufgrund des geringen Stichprobenumfangs und der zu erwartenden Inhomogenität der Patienten bezüglich Alter, Geschlecht und Vorerkrankung konnte nicht von einer Normalverteilung der Daten ausgegangen werden. Deshalb wurden nur nicht-parametrische Testverfahren verwandt. Eine zusätzliche Überprüfung auf Normalverteilung erfolgte nicht, da die nicht-parametrischen Verfahren ihre Gültigkeit auch bei eventuell vorliegender Normalverteilung behalten und so ein einheitlicher Bewertungsmaßstab für alle Ergebnisse gewährleistet werden konnte. Die Darstellung des Schwankungsbereichs der Ergebnisse erfolgte augrund der nicht-angenommenen Normalverteilung durch Angabe der 25. und 75. Perzentile.

Um Unterschiede bei den in Zeitintervallen gemessenen Parametern aufzuzeigen, d.h. bei verbundenen Stichproben, wurde die Friedman Rangvarianzanalyse verwendet. Sofern sich signifikante Unterschiede ergaben, wurde der Wilcoxon-Test angewendet, um aufzuzeigen bei welchen Paaren die Unterschiede bestanden. Für den Vergleich von drei oder mehr Gruppen von Patienten, d.h. von drei oder mehr voneinander unabhängigen Stichproben, kam der Kruskal-Wallis H-Test zum Einsatz. Sofern dieser eine statistische Signifikanz aufzeigte, wurde der Mann-Whitney U-Test verwendet, um zu bestimmen zwischen welchen der Stichproben die signifikanten Unterschiede bestanden. Der Mann-Whitney U-Test wurde außerdem direkt angewendet, wenn ohnehin nur zwei Stichproben untersucht wurden. Um die Korrelationen verschiedener Parameter miteinander zu beurteilen, wurde eine Spearman-Ranganalyse durchgeführt. Aufgrund der niedrigen Fallzahlen wurde eine starke Korrelation gesucht, so dass unabhängig von der Signifikanz erst ein Korrelationskoeffizient von über +0,8 bzw. unter -0,8 als Hinweis auf eine Korrelation angesehen wurde. Ein Koeffizient von +1,0 entspricht dabei einer perfekten positiven Korrelation, während -1,0 einer perfekten negativen und 0,0 keiner Korrelation entspricht.


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19.10.2004