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3.  Material und Methoden

3.1 Gewebeproben

Die in dieser Arbeit verwendeten Gewebe stammten überwiegend aus zufällig entnommenen Proben der Gewebebank der Dermatologischen Klinik bzw. Präparaten des Pathologischen Instituts der Charité. Die Gewebeproben wurden jeweils nach der Entnahme in 10%igem gepufferten Formaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Nach Routinebearbeitung durch das histologische Labor und histologischer Diagnostik durch einen Dermatohistopathologen konnte auf die Paraffinblöcke zurückgegriffen werden.

3.2 Gewebearten

Zu den745 Präparaten von humanen Melanomen gehörten 351 primäre Melanome und 394Metastasen. Letztere waren hauptsächlich kutane, subkutane und Lymphknotenläsionen. Es wurden aber auch Metastasen der Leber, des Ösophagus, der Lunge, des Knochens, des Magens, der Nieren, der Nebennieren, des Hirns und der Meningen mit einbezogen. Desmoplastische Melanome wurden nicht untersucht. Teilweise stammten die Proben von Patienten mit mehreren primären Melanomen bzw. Metastasen. In solchen Fällen wurden alle zur Verfügung stehenden Läsionen untersucht. Die nicht vom Melanom stammenden melanozytären Läsionen waren 16 Nävi unterschiedlichen histologischen Typs (siehe unter 4.2 Tabelle 8). Des Weiteren wurden verschiedene nicht-melanozytäre Tumore, wie z.B. Basalzellkarzinome, Astrozytome, Ösophaguskarzinome, ein Bronchialkarzinom (siehe unter 4.3 Tabelle 9) und benigne Gewebe, wie z.B. Melanozyten, Keratinozyten, Plasmazellen, Myofibroblasten (siehe unter 4.1 Tabelle 7) untersucht.

3.3 Herstellung von Paraffinschnitten

Von den in Formaldehyd fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeproben wurden mit Hilfe des Mikrotoms ca. 3 - 5 µm dicke Schnitte angefertigt, welche zur “Entfaltung” zunächst kurz (max. 1 - 2 min) in ein 40 °C warmes Wasserbad und anschließend auf ChemMate-[Seite 15↓]Objektträger gebracht wurden. Nach etwa 12 - 24 Stunden Lufttrocknung bei Raumtemperatur oder Trocknung bei 37 °C in einem Inkubator war die Weiterverarbeitung möglich.

3.4 Entparaffinierung und Gewebevorbehandlung

Vor dem Färbevorgang ist die vollständige Entfernung des Einbettungsmediums zur Vermeidung von Hintergrundfärbung und Überdeckung positiv gefärbter Zellen außerordentlich wichtig.(57) Mittels der Entparaffinierungsmaschine “Omnibus” des Herstellers Quartett wurden folgende Schritte durchlaufen:

2 x 10 min Xylol
10 min absolutes Ethanol
10 min Ethanol (200 ml) mit 20 ml 3%igem H2O2
5 - 10 min fließendes Leitungswasser
5 - 10 min Tris-Waschpuffer

- Waschpuffer = 0,5 M Tris-Puffer, pH 7,6:
6,1 g Tris (Tris hydroxymethyl aminomethan) in 50 ml Aqua dest. lösen und 37 ml 1 N (HCI) hinzufügen. Aqua dest. ad 1 l. Der pH-Wert muß bei 25 °C 7,6 betragen. Gebrauchswaschlösung: 50 ml Stammlösung auf 450 ml 0,9%ige NaCl-Lösung

Von Formaldehyd bzw. auf Formaldehyd basierenden Lösungen ist bekannt, dass in Antigenen sterische Veränderungen, sogenannte Molekülvernetzungen, induziert bzw. insbesondere Zelloberflächenantigene denaturiert werden können. Durch eine Vorbehandlung mit proteolytischen Enzymen kann versucht werden, überschüssige Aldehydvernetzungen aufzuspalten und die verdeckten Antigene freizulegen.(57) Das hierfür am häufigsten verwendete Enzym ist Trypsin.(57)

[Seite 16↓]Vorbehandlung für das Färben mit SM5-1:
- 0,05%iges Trypsin in EDTA-Lösung,
- je 100 µl auf Gewebeschnitte geben
- 15 min bei 37 °C in der feuchten Kammer inkubieren

Eine weitere Vorbehandlung zur Antigenaufdeckung und somit zur Verbesserung und Optimierung der Färbeergebnisse besteht im Erhitzen der Proben in einer Mikrowelle.(58) Während dieser Mikrowellenbehandlung befanden sich die Proben in Citratpuffer (pH 6,0). Für SM5-1 zeigte sich eine optimale Antigenaufdeckung nach 6,5 Minuten bei 530 Watt. Bei A103 (anti-Melan-A/MART-1), T311 (anti-Tyrosinase), HMB-45 und anti-S100 genügte eine Hitzeeinwirkung von 5 Minuten. Nach mindestens 20minütigem Abkühlen bei Zimmertemperatur und 5 Minuten Waschen der Präparate in Tris-Puffer konnte mit dem Färben begonnen werden. Alle Präparate wurden in dieser Weise vorbehandelt.

3.5 Generierung des Antikörpers SM5-1

Der Antikörper SM5-1 stammte aus einer Reihe von Antikörpern, welche aus einem subtraktiven Immunisierungsprotokoll in Vorarbeiten gewonnen wurden.Zwei humane Melanom-Zell-Linien wurden von einem Patienten etabliert. Dabei stammte eine dieser Zell-Linien (SMMU-1) vom Primärtumor, die andere von Zellen einer Lymphknotenmetastase desselben Patienten (SMMU-2). SMMU-2 metastasierte, wenn man sie subkutan in immundefiziente SCID-Mäuse injizierte, während SMMU-1 dies nicht tat. Da beide Zell-Linien vom selben Patienten gewonnen wurden, konnte ein subtraktives Immunisierungsprotokoll zur Antikörpergewinnung genutzt werden.(59)Die gewonnenen Antikörper erkannten spezifisch Antigene, die von SMMU-2, nicht aber von SMMU-1 exprimiert wurden. Dabei wurde Mäusen zunächst SMMU-1 injiziert, um SMMU-1-spezifische B-Lymphozyten zu stimulieren. Diese Mäuse wurden dann mit Cyclophosphamid behandelt, um aktivierte und sich teilende Lymphozyten zu eliminieren. Nach Eliminierung der von SMMU-1 aktivierten Lymphozyten wurden die Mäuse wiederholt mit SMMU-2 immunisiert, um spezifische anti-SMMU-2 Antikörper-produzierende B-Lymphozyten zu induzieren. Milzzellen von diesen immunisierten Mäusen wurden mit SP/20-Zellen in einem standardisierten Fusionsprotokoll fusionert(60) und SMMU-2 spezifische monoklonale Antikörper mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszens sowie FACS-Analysen [Seite 17↓]identifiziert (jeweils Kooperationspartner Prof. YJ. Guo, Cleveland, USA). Wie zu erwarten, reagierten die monoklonalen Antikörper nur mit SMMU-2, aber nicht mit SMMU-1.
Durch o.g. Hybridisierungsmodell wurden mehrere monoklonale Antikörper gewonnen. Nach Voruntersuchungen der verschiedenen erhaltenen Antikörper wurde der Antikörper SM5-1 (Maus IgG1) wegen seiner Reaktivität bei einer kleinen Stichprobe für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Die vorliegende Arbeit zeigt das immunhistochemische Verhalten des monoklonalen Antikörpers SM5-1 im Vergleich zu den in der Routinediagnostik häufig eingesetzten Markern anti-S100, HMB-45, A103 und T311.

3.6 Verwendete Antikörper

Zum Vergleich der Heterogenität bzw. der Homogenität der in der Melanomdiagnostik gebräuchlichen Antikörper mit SM5-1 wurden die in Tabelle 6 gelisteten Antikörper verwendet. Zur Beurteilung des Färbeverhaltens wurden alle getesteten Tumorgewebe auch mit den zur Zeit in der Routine eingesetzten Markern HMB-45 und anti-S100 kontrollierend gefärbt.

Tabelle 6 Verwendete Antikörper

Antikörper

Klon

Herkunft

Konzentration/ Verdünnung

SM5-1

SM5-1

Labor Prof. YJ. Guo, Cleveland, USA

2 µg/ml (gereinigtes IgG1)

anti-Melan-A/

MART-1

A103

Novocastra Laboratories Ltd.; Newcastle, UK

1:50

anti-Tyrosinase

T311

Novocastra Laboratories Ltd.; Newcastle, UK

1:20

HMB-45

HMB-45

DAKO Corporation, Carpinteria, USA

1:50

anti-S100

S1/61/69

Novocastra Laboratories Ltd.; Newcastle, UK

1:20


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3.7  Immunhistochemisches Färben

Immunhistochemische Färbetechniken erlauben die Sichtbarmachung von Gewebe- bzw. Zell-antigenen. Ursprünglich bediente man sich der direkten Technik, bei der Antikörper mit definierten Antigenspezifitäten eingesetzt wurden, an welche Enzyme direkt gekoppelt waren. Mit Einführung der indirekten Methode verbesserte sich die Sensitivität signifikant. In dieser Zweistufenmethode reagierten mehrere emzymmarkierte Sekundärantikörper mit dem antigengebundenen Primärantikörper.(57) Später wurde die Peroxidase-Antiperoxidase- (PAP) Methode eingeführt, bei der in drei Stufen der Primärantikörper, der Brückenantikörper und ein Peroxidase-Antiperoxidasekomplex hintereinander eingesetzt wurden.(61) Schließlich wurde von Hsu und Mitarbeitern die Dreistufen-Avidin-Biotinkomplexmethode entwickelt. Diese bedeutete eine weitere Steigerung der Sensitivität gegenüber den bestehenden Methoden.(62)

3.7.1 Avidin/Streptavidin-Biotin-Methode

Die Avidin/Streptavidin-Biotin-Methode nutzt die starke Affinität von Avidin (Hühnereiweiß) bzw. Streptavidin (Streptomyces avidinii) für das Vitamin Biotin zur Bildung von Komplexen aus enzymmarkierten Avidin/Streptavidin-Biotin-Komplexen mit biotinylierten Sekundär-antikörpern (ABC/SABC-Methode) bzw. zur Kopplung enzymmarkierten Avidins/Streptavidins an biotinylierte Sekundärantikörper (LAB/LSAB-Methode) (siehe Abb. 1).(57) Die LSAB-Methode wurde in der vorliegenden Arbeit angewendet. Als Enzym wird häufig Meerrettichperoxidase eingesetzt. Die Durchführung beinhaltet die Applikation eines Primärantikörpers, eines biotinylierten Brückenantikörpers und des Peroxidase-konjugierten Streptavidins. Zur Sichtbarmachung wird eine Substrat-Chromogenlösung verwendet, wobei an der Stelle des gesuchten Antigens ein Präzipitat entsteht.(57)


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Abbildung 1:
Bei der ABC/SABC-Methode reagiert der Avidin/Streptavidin-Biotin-Komplex mit dem biotinylierten Sekundärantikörper.(57) Bei der LAB/LSAB-Methode reagiert enzymmarkiertes Avidin/Streptavidin mit dem biotinylierten Sekundärantikörper.(57)

3.7.2 Durchführung der immunhistochemischen Färbungen

Verwendet wurde das Large Volume DAKO LSAB 2 Kit, Peroxidase Code Nr. K 675 sowie das AEC-Substrat-Kit Code Nr. K 696.

Vorbereitungen:
- Vorbehandlung der Schnitte (siehe 3.4 ).
- Verdünnung der monoklonalen Primärantikörper mit Verdünnungsmedium (DAKO, Code S3022) (siehe 3.6).

Das immunchemische Färben der Gewebeschnitte erfolgte nach folgendem Protokoll:

  1. Objektträger 5 min in ein Pufferbad stellen, anschließend sorgfältig abtupfen (zusätzlicher Verdünnungseffekt).
  2. Sorgfältiges Überschichten der Gewebeschnitte mit je 100 µl des nach Bedarf verdünnten Primärantikörpers und 50 - 60 min in der feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubieren.
    Anmerkung: Ein Austrocknen der Gewebeschnitte muss während des Färbevorganges unbedingt verhindert werden.
  3. Objektträger 5 min in das Waschpufferbad stellen, anschließend gut abtupfen.[Seite 20↓]
  4. Bedecken der Gewebeschnitte mit je etwa 2 Tropfen des Brückenantikörpers (Anti-Maus-IgG, gelbe Flasche), 10 min bei Raumtemperatur in der feuchten Kammer inkubieren, abspülen im Waschpuffer.
  5. Objektträger 5 min waschen und dann abtupfen.
  6. Bedecken der Gewebeschnitte mit etwa 2 Tropfen des Streptavidin-Peroxidase-Konjugates (rote Flasche), 10 min bei Raumtemperatur in der feuchten Kammer inkubieren, abspülen im Waschpuffer.
  7. Objektträger 5 min waschen und abtupfen.
  8. Gewebeschnitte mit je 100 µl Substrat-Chromogen bedecken und 10 - 30 min in der feuchten Kammer inkubieren. Anschließend im Waschpuffer abspülen.
    Substrat-Chromogen = auf 2 ml Substrat-Puffer wird 1 Tropfen AEC-Chromogen (3-amino-9-ethylcabazol) gegeben.
    direkt vor dem Gebrauch ansetzen, da es nur ca. eine Stunde haltbar ist.
  9. Objektträger 5 min waschen und abtupfen.
  10. Gegenfärben der Präparate in Mayers Hämatoxylin für 1,5 min (Stoppuhr), anschließend 5 min im Waschpuffer „bläuen“.
  11. Objektträger 10 min unter fließendem Leitungswasser abspülen.
  12. Lufttrocknen der Präparate.
  13. Eindecken der Gewebeschnitte mit vorgewärmtem Glycergel DAKO Code Nr. C 563 und Deckgläschen.

3.8 Auswertung der histologischen Schnitte

Die immunhistochemischen Ergebnisse wurden unabhängig voneinander von zwei Untersuchern bestimmt. Die Färbeintensität wurde subjektiv als 0 (negativ), 1+ (schwach), 2+ (mäßig), 3+ (stark) und 4+ (sehr stark) eingeteilt. Der Prozentsatz der positiven Zellen innerhalb einer Läsion wurde semiquantitativ als 0 (0 - 1%), 1 (2 - 24%), 2 (25 - 50%), 3 (51 - 75%) und 4 (76 - 100%) ermittelt.


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3.9  Übersicht verwendeter Materialien und Geräte


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AEC-Substrat-System

DAKO Diagnostika, Hamburg

Antikörper-Verdünnungsmedium

DAKO Diagnostika, Hamburg

anti-Melan-A

Novocastra, Newcastle, UK

anti-S100

Novocastra, Newcastle, UK

anti-Tyrosinase

Novocastra, Newcastle, UK

Aqua dest.

eigene Destillationsanlage

Citrat-Puffer-Konzentrat pH 6,0

BIOCYC GmbH & CO. KG, Luckenwalde

Deckgläschen, 24 x 32 mm

Menzel-Gläser, Braunschweig

Eppendorf-Röhrchen 1,5 ml

Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg

Ethanol, absolutes

J. T. Baker, Mallinckrodt Baker, B. V., Deventer, Niederlande

Feuchte Kammer

Roth, Karlsruhe

Finn-Pipette 1 - 5 ml

Labsystems, Helsinki, Finnland

Glasküvetten

Roth, Karlsruhe

Glycergel-Einschlußmedium

DAKO Diagnostika, Hamburg

Heizplatte Thermolyne nuova II

Dubuque, Iowa, USA

HMB-45

DAKO Corporation, Carpinteria, USA

Inkubator

DDR

Konzentrierte Salzsäure

Krankenhaus-Apotheke Charité, Berlin

Kühlschrank Liebherr Typ 2007 1

Liebherr, Ochsenhausen

Kühlschrank Siemens SC Sikafrost Comfort

Siemens, Berlin

Küvetten-Mikrowellenbehandlung

DAKO Diagnostika, Hamburg

Leitungswasser

 

Lichtmikroskop

Jenalab, DDR

LSAB-Kit, Peroxidase

DAKO Diagnostika, Hamburg

Mayers Hämatoxylin

Dr. K. Hollborn & Söhne, Leipzig

Mikrowelle Micromat 110/120

AEG, Nürnberg

Objektträger 76 x 26 mm

Menzel-Gläser, Braunschweig

Omnibus Midas E

Quartett, DDR

Phosphatgepufferte Salzsäure (PBS)

Krankenhaus-Apotheke Charité, Berlin

Physiologische Kochsalzlösung

Braun, Melsungen

Pipetten

Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg

Pipettenspitzen

Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg

Präparatemappen

Roth, Karlsruhe

Reagiergefäße 0,5 ml

Sarstedt, Nümbrecht

Schlittenmikrotom

Jung, Heidelberg

SM5-1

Prof. YJ. Guo, Cleveland, USA

Stoppuhr

Roth, Karlsruhe

Tris-gepuffertes Kochsalz-Konzentrat

BIOCYC GmbH & Co. KG, Luckenwalde

Trypsin-EDTA

Merck, Darmstadt

Wasserbad

Leica, Wetzlar

Wasserstoffperoxid

Merck, Darmstadt

Xylol

J. T. Baker, Mallinckrodt Baker, B. V., Deventer, Niederlande

Zellstoff

Krankenhaus-Apotheke Charité, Berlin


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22.10.2004