4.  Ergebnisse

Es wurden unterschiedliche normale Gewebe, Nävi, nicht-melanozytäre Tumore sowie zwei Melanomstichproben unterschiedlicher Größe auf ihre Immunreaktivität mit dem Antikörper SM5-1 untersucht. Melanomstichprobe I umfasste mit 250 primären Melanomen und 151 Melanommetastasen insgesamt 401 Proben. Melanomstichprobe II bestand aus 344 Proben, welche sich in 101 Primärtumore und 243 Metastasen aufteilte. Bei Stichprobe I wurde die Reaktivität des Antikörpers SM5-1 mit HMB-45 und anti-S100 und bei Stichprobe II mit A103 und T311 verglichen.
In jedem Fall wurde die Diagnose durch erfahrene Dermatohistopathologen gestellt. Neben den Färbeergebnissen, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, wurden alle Proben der Stichprobe II auch mit HMB-45 und anti-S100 gefärbt. Dies war besonders hilfreich bei negativen Fällen für einen oder mehrere der untersuchten Antikörper.

Normale Haut, einschließlich der Tumorläsionen anliegenden Haut, wurde von SM5-1 nicht gefärbt. Von speziellem Interesse war die Negativität von normalen und aktivierten Melanozyten, Keratinozyten, und Langerhanszellen. Die meisten anderen normalen Zellen waren ebenfalls negativ für SM5-1. Eine Färbung zeigte sich lediglich bei einigen Ausnahmen wie Plasmazellen, einigen Myofibroblasten und perivaskulären dendritischen Zellen, Sekreten der ekkrinen Drüsen und Schweißdrüsen und der Prostata sowie sezernierendem Epithel der Thyroidea und des Larynx (siehe Tabelle 7).

[Seite innerhalb Tabelle 24↓]

Tabelle 7 Reaktivität von SM5-1 mit normalem humanem Gewebe

--- = negativ; + = positiv

Es wurden an allen untersuchten 16 Nävi (6 Compound, 5 dysplastische, 2 blaue, 3 kombinierte Nävi) starke Färbungen mit SM5-1 beobachtet. Der Antikörper zeigte nur an den Nävuszellen ein homogenes Färbeverhalten, während nicht-aktivierte basale Melanozyten negativ waren. Ein Beispiel wird in Abb. 2a (siehe Seite 30) gezeigt. HMB-45 und anti-S100 reagierten ebenfalls mit allen Nävi (siehe Tabelle 8).

Tabelle 8 Reaktivität von SM5-1, HMB-45 und anti-S100 mit melanozytären Nävi bei in Paraffin fixierten Proben

Um die Reaktivität von SM5-1 mit anderen Malignomen als dem Melanom zu untersuchen, wurde eine große Auswahl anderer Tumore auf von SM5-1 erkannte Epitopexpression getestet. Die Gewebe beinhalteten Tumore, die von der Haut, den Nerven, dem Gehirn, dem Gastrointestinaltrakt und anderen stammen. Die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen der 40 verschiedenen nicht-melanozytären Tumore sind in Tabelle 9 gezeigt. Keine der in Paraffin eingebetteten Tumorgewebeproben reagierte mit SM5-1. HMB-45 war für diese Tumore auch in allen Fällen negativ. Für anti-S100 wurden in einigen Gehirntumoren, Nerventumoren, Brustkarzinomen, Schliddrüsenkarzinomen, malignen Histiozytosen und Chordomenpositive Färbungen gefunden.

[Seite innerhalb Tabelle 26↓]

Tabelle 9 Reaktivität von SM5-1, HMB-45 und anti-S100 mit nicht-melanozytären Tumoren bei in Paraffin fixierten Proben (n = 84)

[Seite innerhalb Tabelle 27↓]

Fortsetzung Tabelle 9

Die Resultate der immunhistochemischen Analyse der Melanomproben der Stichprobe I sind in Tabelle 10 zusammengefasst. Von 250 primären Melanomen waren 248 (99%) positiv für SM5-1. Demzufolge war das Färben nicht vom histologischen Typ (oberflächlich spreitend, nodulär, lentigo maligna, akro-lentiginös) oder vom Clark Level abhängig, da alle histologischen Entitäten unter den 250 Primärtumoren vertreten waren. Zwei Beispiele sind in Abb. 2b (Melanoma in situ) und Abb. 2c (noduläres malignes Melanom) gezeigt (Abbildungen siehe Seite 30). Allgemein wurde die Reaktivität von SM5-1 in einer starken membranösen und zytoplasmatischen Verteilung gefunden. Alle untersuchten Gewebeproben wurden auch hier mit anti-S100 und HMB-45 gefärbt und färbten ebenso die weitaus größte Zahl der primären Tumore (HMB-45 99%, anti-S100 97%).

Tabelle 10 Reaktivität von SM5-1, HMB-45 und anti-S100 mit primären Melanomen und Melanommetastasen bei in Paraffin eingebetteten Proben.

In Stichprobe I wurden 151 Metastasen untersucht, welche hauptsächlich kutane, subkutane oder Lymphknotenmetastasen waren. Es waren aber auch 18 Melanommetastasen verschiedener Organe einbezogen. SM5-1 färbte 96% (146/151) (siehe Tabelle 10)dieser Läsionen und zeigte [Seite 29↓]meistens eine starke und homogene Reaktivität. Ein Beispiel einer Lymphknotenmetastase ist in Abb. 2d (siehe Seite 30) gezeigt. Während anti-S100 einen Prozentsatz von 96% (146/151) an positiven Färbungen zeigte, reagierte HMB-45 nur in 83% (126/151). Alle 25 HMB-45-negativen Melanommetastasen waren positiv für SM5-1. In Fällen fehlender Färbung für HMB-45 war die Färbung für SM5-1 manchmal weniger stark betont, aber dennoch stets auffindbar (siehe Abb. 3, Seite 30). In Fällen, in denen HMB-45 und SM5-1 positiv waren, lagen die Epitope für SM5-1 und HMB-45 an verschiedenen Tumorzellpopulationen innerhalb des Tumors. Im Allgemeinen waren die Färbungen für SM5-1 stark und schlossen die Mehrheit der neoplastischen Zellen ein.

	Abbildung 2: Immunfärbungen von melanozytären Tumoren mit SM5-1. Beachtenswert ist das homogene Färben der Compound-nävuszellen, während die nicht aktivierten basalen Melanozyten negativ sind (A: Vergr. x200). Bei dem In-situ-Melanom (B: Vergr. x82,5), dem nodulären Melanom (Clark IV, Breslow 2,16 mm; C: Vergr. x92) und der Lymphknotenmetastase eines Melanoms (D: Vergr. x250) reagiert SM5-1 mit der vollständigen Tumorzell-population.

	Abbildung 3: Lymphknotenmetastase eines malignen Melanoms, immungefärbt mit SM5-1 (A: Vergr. x200) und HMB-45 (B: Vergr. x200). Die Färbung von SM5-1 ist homogen und intensiv, während durch HMB-45 keine Zellen markiert wurden.

Im Folgenden wurden Melanomproben aus Stichprobe II mit den Antikörpern SM5-1, A103 und T311 gefärbt und analysiert. Die mittels immunhistochemischer Diagnose erlangten Daten für primäre Melanome sind in Tabelle 11 (oberer Teil) zusammengefasst. 96/101 (95%) der primären Melanome waren positiv für SM5-1. Dementsprechend gab es keine Beeinflussung der Färbung durch den histologischen Typ (superfiziell spreitend, nodulär, lentigo maligna, akro-lentiginös) oder den Clark Level. A103 und T311 reagierten bei einer sehr großen Mehrheit der untersuchten Melanomproben mit einer Positivität von 98/101 (97%) und 91/101 (90%).

Tabelle 11 Reaktivität von SM5-1, A103 und T311 beim primären und metastasierten Melanom bei in Paraffin eingebetteten Proben

Die in dieser Arbeituntersuchten Gewebe, waren hauptsächlich kutane, subkutane oder Lymphknotenmetastasen, aber beinhalteten auch Metastasen der Lunge, der Speiseröhre, der Niere, der Nebenniere, des Knochens, des Gehirns, der Meningen, und der Mukosa. SM5-1 färbte 91% (222/243) der Läsionen, während A103 in 77% (187/243) und T311 in 63% (154/243) der Fälle positiv waren (siehe Tabelle 11, unterer Teil). Von den 56 für A103 negativen Läsionen konnten 52 korrekt als Melanomläsionen durch SM5-1 Färbungen identifiziert werden. Von den 89 für Tyrosinase negativen Läsionen waren 81 positiv für SM5-1.

In Tabelle 12 ist die Expression von SM5-1, A103 und T311 als prozentuale Positivität zusammengefasst. Bei den primären Melanomen (n = 101) zeigten 85% der von SM5-1 gefärbten Zellen eine relativ homogene Expression mit Färbungen über 50% der Tumorzellpopulation. Dieses differiert zu A103 und T311, wo nur 68% bzw. 63% der Fälle Färbungen von mehr als 50% der Zellen aufwiesen.

SM5-1 hat im allgemeinen die Läsionen homogener gefärbt. Bei 80% aller Metastasen lag dort eine Positivität von 50% oder mehr vor. A103 und T311 zeigten ein signifikant heterogeneres Färbemuster. Mit nur 58% für A103 bzw. 48% für T311 lag hier der Prozentsatz der mehr als 50% positiv gefärbten Tumorzellen der metastasierten Läsionen. Bei 60% der Läsionen waren mehr als 75% der Zellen für den Antikörper SM5-1 positiv, während bei A103 nur 34% und bei T311 nur 30% positiv für diesen Grad waren. Bei diesen Ergebnissen muss jedoch berücksichtigt werden, dass auch die negativen Läsionen, welche für A103 und T311 erheblich höher waren, mit in diese Berechnung eingegangen sind. Wenn nur die positiv gefärbten metastasierten Läsionen betrachtet werden, färbte SM5-1 88% der Proben zu mehr als 50%, während A103 und T311 75% bzw. 76% der Proben zu mehr als 50% färbten. Einen Färbegrad von mehr als 75% der Zellen innerhalb einer Läsion wiesen SM5-1 bei 66%, A103 bei 44% und T311 bei 47% auf (siehe Tabelle 12, unterer Teil).

[Seite innerhalb Tabelle 33↓]

Tabelle 12 Reaktivität von SM5-1, A103 und T311 beim primären und metastasierten Melanom in Prozent der positiven Zellen

Negativ = 0 - 1% der positiven Zellen innerhalb einer Tumorläsion
< 25% = 2 - 24% der positiven Zellen innerhalb einer Tumorläsion
25 - 50% = Prozentsatz der positiven Zellen innerhalb einer Tumorläsion
51 - 75% = Prozentsatz der positiven Zellen innerhalb einer Tumorläsion
> 75% = 76 - 100% der positiven Zellen innerhalb einer Tumorläsion
Der Färbegrad wurde semiquantitativ durch 2 unabhängige Untersucher ermittelt.

Ein Beispiel für die Analyse der Färbeintensitäten ist in Abb. 2 (siehe Seite 30) gezeigt. Bei vier verschiedenen Melanomproben wurde die Färbeintensität als schwach (A), mäßig (B), stark (C) oder sehr stark (D) eingestuft. Bei den primären Melanomen war die Färbeintensität für alle drei Antikörper etwa gleich (siehe Tabelle 13 oberer Teil). Eine starke oder sehr starke Färbung wurde in 75%, 67% und 68% der Läsionen, die mit SM5-1, A103 und T311 gefärbt wurden, gesehen. Somit zeigte die Mehrzahl der primären Läsionen eine starke Expression der jeweiligen Antigene. Es wurde ein wichtiger Unterschied zwischen den drei Antikörpern bei den Gewebeproben der metastasierten Läsionen gefunden (siehe Tabelle 13, unterer Teil). Ein großer Anteil färbte stark oder sehr stark mit SM5-1 (64%). Bei A103 hingegen war dies nur für 35% und bei T311 nur für 29% so. Somit zeigten 65% der Läsionen bei A103 keine oder nur schwache Färbungen. Dasselbe gilt für T311, welches eine Abwesenheit oder ein schwaches bis mäßiges Färben bei 71% aufzeigte. Im Allgemeinen gab es eine strenge Korrelation zwischen Prozentsatz der Positivität und Färbeintensität bei SM5-1. Von den 58 sehr stark positiven Metastasen hatten 55 auch eine Positivität von mehr als 75% der Zellen. Auch bei T311 korrelierten die Färbeintensität und der Prozentsatz der gefärbten Zellen gut. Von den 23 schwach positiven A103-Läsionen waren nur 16 positiv mit mehr als 75% der Zellen.

[Seite innerhalb Tabelle 35↓]

Tabelle 13 Färbeintensitäten von SM5-1, A103 und T311 beim primären und metastasierten Melanom

Subjektive Einteilung der Färbeintensität mittels Lichtmikroskopie:
Negativ = keine Färbung
1+ = schwache Färbung
2+ = mäßige Färbung
3+ = starke Färbung
4+ = sehr starke Färbung

Da die Sensitivität aller Antikörper bei primären Melanomen sehr hoch ist, war der konkordante, d.h. der gleichzeitige Verlust der Antigene sehr unregelmäßig und wurde nur in einem negativen Fall für Melan-A/MART-1 und Tyrosinase beobachtet. Diese Läsion war positiv für SM5-1 (siehe Tabelle 14 oberer Teil). Für Melan-A/MART-1 und Tyrosinase waren 15,6% der Metastasen negativ, während der erwartete Verlust nur 8,4% war. Dieser erwartete Verlust wurde durch Multiplikation der Melan-A/MART-1-Negativität mit der Tyrosinase-Negativität der 243 Läsionen (0,231 x 0,367 = 8,4%) berechnet. Es waren 38 Metastasen negativ für A103 [Seite 36↓]und T311. Davon waren 35 Proben (92,1%) positiv für SM5-1. Dies demonstriert den Wert von SM5-1 für die Identifizierung negativer Läsionen für melanozytäre Differenzierungsantigene (MDA). Der gleichzeitige Verlust von SM5-1 und Melan-A/MART-1 bzw. SM5-1 und Tyrosinase war innerhalb des erwarteten Grades oder geringfügig geringer (Tabelle 14, unterer Teil). Alle Metastasen wurden auch hier mit HMB-45 und anti-S100 gefärbt, um die richtige Diagnose zu bestätigen.

Tabelle 14 Melanommetastasen mit konkordantem Verlust von zwei oder mehr Antigenen- durch SM5-1, Melan-A/MART-1 oder Tyrosinase erkannt