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5.  Diskussion

Arbeiten anderer Autoren zeigten, dass die Antikörper anti-S100 und HMB-45, welche hauptsächlich in der immunhistochemischen Melanomdiagnostik Anwendung finden, hinsichtlich Spezifität und Sensitivität Defizite aufweisen. So ist anti-S100 sehr unspezifisch für das Melanom, hat jedoch eine Sensitivität von 83 - 100%.(40-45) HMB-45 hingegen hat nur eine Sensitivität von 67 - 93%, ist jedoch für die Unterscheidung zwischen Melanomen und nicht-melanozytären Neoplasmen geeignet.(33;34;39) Da sich beide Antikörper sehr gut ergänzen, werden sie bei der immunhistochemischen Diagnostik des Melanoms zumeist parallel eingesetzt.(63) Außerdem wurde gezeigt, dass sich einige Melanommetastasen der sicheren immunhistochemischen Diagnostik entziehen.(33;34) Es wäre von Vorteil, wenn es einen Antikörper gäbe, welcher die für die Melanomdiagnostik nutzbaren Eigenschaften von anti-S100 und HMB-45 vereinen und die bestehenden Defizite ausgleichen würde. Der Antikörper SM5-1, der durch ein subtraktives Immunsierungsprotokoll eines humanen Melanommausmodells in Vorarbeiten generiert wurde, könnte den gewünschten Anforderungen entsprechen. Vor diesem Hintergrund wurde SM5-1, dessen Antigen noch näher charakterisiert werden muss, immunhistochemisch untersucht und analysiert. Hierfür wurden verschiedene normale Gewebe, Nävi, nicht-melanozytäre Tumore sowie zwei unterschiedliche Melanomstichproben untersucht. SM5-1 wurde zunächst mit HMB-45 und anti-S100 an 250 primären und 151 metastasierten Melanomen und in einer zweiten Stichprobe mit Melan-A/MART-1 und Tyrosinase an 101 primären und 243 metastasierten Melanomen verglichen.

5.1 Spezifität des Antikörpers SM5-1

Um die Spezifität des Antikörpers SM5-1 für melanozytäre Läsionen beurteilen und sie mit den bekannten Antikörpern HMB-45 und anti-S100 vergleichen zu können, wurden normale Haut, verschiedene normale humane Gewebe, Sekrete und Zellen (siehe 4.1 Tabelle 7) sowie melanozytäre Nävi (siehe 4.2 Tabelle 8) und nicht-melanozytäre Tumore (siehe 4.3 Tabelle 9) mit dem Antikörper SM5-1 immunhistochemisch gefärbt und lichtmikroskopisch ausgewertet.
[Seite 38↓]Bei den Untersuchungen der normalen Haut waren das Färbeverhalten von SM5-1 bei normalen und aktivierten Melanozyten, Keratinozyten sowie Langerhanszellen von speziellem Interesse. Diese Zellen waren alle negativ für SM5-1. Nur einige wenige normale Zellen oder Drüsensekrete wurden durch SM5-1 gefärbt (siehe 4.1 Tabelle 7) und sind mit den unspezifischen Färbungen von HMB-45(63), jedoch keineswegs mit denen von anti-S100(44;45) vergleichbar.
Des Weiteren wurden verschiedene Näviarten mit dem Antikörper SM5-1 untersucht (siehe 4.2 Tabelle 8). Es zeigten sich bei allen Proben starke Färbungen für SM5-1. Dabei stellte sich heraus, dass alle 16 untersuchten Nävi stark und homogen an den Nävuszellen gefärbt wurden, basale nicht-aktivierte Melanozyten waren jedoch negativ. Dies ist besonders interessant, da bei den Reaktivitätsuntersuchungen mit normalem humanen Gewebe SM5-1 sowohl für normale Melanozyten als auch für aktivierte Melanozyten negativ war. Durch die positiven Färbungen von SM5-1 bei den untersuchten melanozytären Nävi wurde gezeigt, dass dieser Antikörper nicht spezifisch für Melanome ist. Auch für HMB-45 und anti-S100 ist bekannt, dass sie Nävi färben.(64;65) Somit ist der Antikörper SM5-1 keinem der beiden anderen Antikörper in diesem Punkt überlegen.
Von den 84 Beispielen der 40 verschiedenen untersuchten nicht-melanozytären Neoplasien (siehe 4.3 Tabelle 9) wurde keine Gewebeprobe mit SM5-1 oder HMB-45 gefärbt. Anti-S100 war hingegen in einigen Tumoren, die vom Hirn, den Nerven, der Schilddrüse und der Brust stammten, positiv. Diese Ergebnisse bestätigen, dass eine positive Färbung mit anti-S100 nicht auf Zellen von melanozytärer Herkunft beschränkt ist und unterstreichen die schon oft dokumentierte Unspezifität dieses Antikörpers für das Melanom.(43-48) Im Färbeverhalten gegenüber nicht-melanozytären Tumoren entspricht somit der Antikörper SM5-1 dem Antikörper HMB-45. Aus diesen Ergebnissen kann man zunächst schließen, dass SM5-1, ähnlich dem Antikörper HMB-45, eine höhere Spezifität als anti-S100 für melanozytäre Läsionen hat.


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5.2  Sensitivität des Antikörpers SM5-1 für primäre und metastasierte Melanome

Um Aussagen über die Sensitivität des Antikörpers SM5-1 für primäre und metastasierte Melanome treffen und diese mit der Immunreaktivität von HMB-45 und anti-S100 vergleichen zu können, wurden 250 primäre Melanome und 151 Melanommetastasen immunhistologisch mit SM5-1, HMB-45 und anti-S100 untersucht (siehe 4.4 Tabelle 10).
Bei den primären malignen Melanomen wurden durch SM5-1 99% der untersuchten Gewebe, unabhängig vom histologischen Typ (superfiziell spreitend, nodulär, lentigo maligna, akro- lentiginös) oder vom Clark Level (siehe Abb. 2b und 2c Seite 30) gefärbt. Auch HMB-45 (99%) und anti-S100 (97%) zeigten eine ähnliche Sensitivität. Demzufolge ist der Antikörper SM5-1 bezüglich der Sensitivität gegenüber primären Melanomen mit den Antikörpern HMB-45 und anti-S100 gleichrangig.
Bei Stichprobe I, bestehend aus 151 Melanommetastasen, reagierten 96% zumeist stark und homogen mit SM5-1. Dieses Ergebnis konnte in derselben Stichprobe auch für den Antikörper anti-S100 gefunden werden. Jedoch blieben bei der Antigenaufdeckung durch den Antikörper HMB-45 eine signifikante Anzahl von Metastasen (17%) unerkannt. Diese Beobachtung ist auch aus früheren Untersuchungen bekannt.(33;34) Hier ergibt sich für SM5-1 ein klarer diagnostischer Vorteil gegenüber HMB-45. Da alle HMB-45-negativen Metastasen positiv für SM5-1 waren, könnte man diesen neuen Antikörper gezielt für die Aufdeckung dieser einsetzen bzw. durch einen generellen Einsatz von SM5-1 bei der immunhistochemischen Diagnose des Melanoms bei den ersten Färbungen eine sicherere Diagnose stellen. So könnte das für HMB-45 bekannte Defizit, dass sich einige Melanommetastasen der immunhistologischen Diagnostik entziehen(33;34), durch den Antikörper SM5-1 ausgeglichen werden.
Da Melanompatienten ein erheblich erhöhtes Risiko für die Ausbildung eines sekundären primären Tumors, z.B. Lungenkarzinom(66) haben, ist es von großer Wichtigkeit jede Läsion oder suspekte parenchymale Läsion bei Melanompatienten zu analysieren und identifizieren. In einer Studie konnte eine zweite pulmonale Neoplasie bei 3 von 50 Melanompatienten durch Nutzung von zwei unterschiedlichen Antikörpern mittels immunzytochemischer Diagnostik identifiziert [Seite 40↓]werden.(67) Basierend auf der begrenzten Sensitivität von HMB-45 für richtig erkannte Metastasen fehlt möglicherweise die korrekte Diagnose in solchen Fällen, wenn HMB-45 allein benutzt wird. Die Nutzung von SM5-1 könnte den Gebrauch einer Reihe von Antikörpern in solchen Fällen unnötig machen und möglicherweise ein nützlicher Zusatz in der Diagnostik des humanen Melanoms, insbesondere in der Metastasendiagnostik, sein.
Der Antikörper SM5-1 wurde mittels eines subtraktiven Immunsisierungsprotokolls entwickelt. Interessanterweise ist die Reaktivität für primäre Melanome, für deren Metastasen sowie für Nävi vergleichbar, obwohl die Mäuse zunächst mit Antigenen von primären Melanomen und später dann mit metastasierten Zellen sensibilisiert wurden, um danach Antikörper gegen metastasenassoziierte Antigene zu gewinnen. Wenn auch mit SM5-1 ein wertvoller Antikörper mit diesem Protokoll erzeugt wurde, wurde das ursprüngliche Ziel, der Erzeugung eines Antikörpers gegen metastasenassoziierte Antigene, nicht erreicht. Das Epitop, welches durch SM5-1 erkannt wird, ist nicht auf metastasierte melanozytäre Zellen beschränkt, sondern wird ubiquitär auf melanozytären Läsionen exprimiert. Es unterscheidet sich offenbar von jenem, welches mit HMB-45 reagiert. Dies lässt sich damit begründen, dass HMB-45-negative Metastasen positiv für SM5-1 sind und SM5-1 nicht mit aktivierten Melanozyten reagiert, wie es bei HMB-45 der Fall ist(36)(siehe 4.1 Tabelle 7). Außerdem hat HMB-45 ein vorherrschendes zytoplasmatisches Färbemuster, wohingegen SM5-1 das Zytoplasma und die Zellmembran färbt. Ferner reagierte SM5-1 in Vorarbeiten mit einem 200 - 225 kDa großen Molekül im Westernblot, während HMB-45 zwei Banden erkennt, eine bei einer Größe von 10 kDa und eine andere bei 100 kDa.(68) In weiteren Untersuchungen müssten die genauen Merkmale des Antigens geklärt werden, welches durch SM5-1 erkannt wird. Von speziellem Interesse sollte die Fähigkeit von SM5-1 sein, zuverlässig Metastasen des malignen Melanoms bei Patienten zu erkennen, die schwach differenzierte Tumore tragen.


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5.3  Antigenexpression von SM5-1, Melan-A/MART-1 und Tyrosinase in primären und metastasierten Melanomen

Die erst seit wenigen Jahren charakterisierten Antikörper anti-Tyrosinase T311 und A103 mit den jeweils korrespondierenden Antigenen Tyrosinase und Melan-A/MART-1 sind weniger sensitiv als die beiden Antikörper anti-S100 und HMB-45, werden jedoch auch in der immunhistologischen Routinediagnostik des Melanoms eingesetzt.(24;28;31;49;52;53) In diesem Teil der Arbeit wurde an einer separaten Melanomstichprobe mit einem großem Anteil an Melanommetastasen (n = 243) der Antikörper SM5-1 mit den Antikörpern T311 und A103 verglichen sowie auf weitere Charakteristika im Färbeverhalten untersucht. Insgesamt wurden in dieser Stichprobe 344 verschiedene Melanomgewebe untersucht.
Bei den primären Melanomen (n = 101, siehe 4.6 Tabelle 11) waren bei den untersuchten Fällen alle Antikörper etwa gleich effektiv, mit Färbungen bei 90% (T311), 95% (SM5-1) und 97% (A103). Auch hier wurde das Färbeverhalten nicht durch den histologischen Typ (superfiziell spreitend, nodulär, lentigo maligna, akro-lentiginös) oder den Clark Level beeinflusst. SM5-1 zeigte erneut keine signifikanten Vorteile beim Färben von Primärtumoren im Vergleich mit den verwendeten Antikörpern T311 und A103.
Ein ganz anderes Bild gab es bei den Metastasen, bei denen eine sehr große Anzahl von Läsionen (n = 243) analysiert wurde. Bei dieser Metastasenstichprobe war für SM5-1 eine Reaktivität von 91% zu sehen (siehe 4.7 Tabelle 11). Obwohl dies etwas weniger ist als die 96%, welche im ersten Teil dieser Arbeit bei der anderen Metastasenstichprobe gefunden wurde, ist die Sensitivität noch sehr bemerkenswert. Im Gegensatz zu SM5-1 lagen die Färbungen für Metastasen für A103 bei nur 77% und für T311 bei 63%, wodurch eine große Anzahl von Läsionen mit A103 und T311 mittels Immunhistochemie unaufgedeckt blieb. Die 77% für A103 stimmten mit den von Jungbluth gefundenen 81% überein(28), sind aber weniger als die in anderen Berichten gefundenen 86% - 89%.(50;69) Die 63% positiver Färbungen mit T311 bei Metastasen sind weniger als die bisher berichteten 75 - 100%.(31;50;53;69-71) Warum die hier gefundenen Ergebnisse im Fall von T311 nicht mit der veröffentlichten Literatur korrelierten, ist unklar. Technische Gründe sind sehr unwahrscheinlich, weil 68% der primären und 29% der metastasierten Läsionen mit diesem Antikörper stark oder sehr stark gefärbt wurden. Außerdem wurden verschiedene Antigenerkennungsmethoden getestet. Eine Behandlung von 5 Minuten bei [Seite 42↓]530 W in einer Mikrowelle in Verbindung mit Citratpuffer hat sich als optimal gezeigt. Andererseits hat keine der bisherigen Studien eine so große Anzahl von Läsionen (n = 243) untersucht, was sicher zu einer erhöhten Genauigkeit beiträgt. Im einzelnen ist früher von 19(53), 20(71), 30(69), 62(70) und 72(50) untersuchten Läsionen berichtet worden. Diese relativ kleinen Zahlen machen Aussagen über den Prozentsatz positiver Tumorproben offenkundig schwierig. In der Originalveröffentlichung(24) des Antikörpers T311 wurden 16 Melanomproben getestet und nur 11 waren für T311 positiv. Wenn man hier einen Prozentsatz ermittelte, betrüge dieser 68%, was mit den hier gefundenen Ergebnissen übereinstimmt. Man könnte argumentieren, dass die relativ geringe Positivität von T311 bei den hier verwendeten Metastasenproben das Ergebnis einer außergewöhnlich hohen Anzahl amelanotischer Proben sein könnte. Obwohl die Proben nicht unter diesem Gesichtspunkt untersucht wurden, ist dies wahrscheinlich irrelevant, weil gezeigt wurde, dass die meisten der amelanotischen Proben sowohl für Tyrosinase mRNA, als auch für T311 positiv sind.(24)
In dieser Arbeit konnten von 56 A103-negativen Läsionen 52 (93%) durch Färbung mit SM5-1 korrekt als Melanomläsionen identifiziert werden (siehe 4.8 Tabelle 12). Von den 89 T311-negativen Läsionen waren 81 (91%) für SM5-1 positiv. 38 Metastasen (15%) waren sowohl für A103, als auch für T311 negativ, aber 35 (92%) davon färbten sich mit SM5-1 positiv. Diese Ergebnisse deuten nicht nur auf eine höhere Sensitivität von SM5-1 für Melanommetastasen im Vergleich zu A103 und T311, sondern unterstreichen auch den Wert von SM5-1 für die korrekte Identifizierung von Tumoren, welche keine Melanom-assoziierten Antigene (MAA) besitzen.
In Stichprobe I, bei der SM5-1 mit dem hochspezifischen Antikörper HMB-45, welcher das MAA gp100 erkennt(23), verglichen wurde, stellte sich ebenso heraus, dass alle 45 HMB-45-negativen Metastasen von SM5-1 korrekt als Melanome identifiziert wurden. Die Frage, ob negative Metastasen für HMB-45, Melan-A/MART-1 und Tyrosinase von SM5-1 erkannt werden können, war daher interessant. Da alle Läsionen sowohl mit anti-S100 gefärbt, als auch auf Grund histomorphologischer Kriterien von erfahrenen Dermatohistopathologen eindeutig als Melanommetastasen identifiziert wurden, konnte diese Frage mit ja beantwortet werden.


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5.4  Färbeintensitäten von SM5-1, A103 und T311

Um das immunhistochemische Verhalten des Antikörper SM5-1 genauer kennen zu lernen, wurde das Färbeverhalten nach Färbeintensität und –muster beurteilt und mit den Antikörpern A103 und T311 verglichen.
Bei der Analyse der Färbeintensität(siehe 4.9 Tabelle 13) hatte SM5-1 eine leicht betontere Färbung als die anderen untersuchten Antikörper und war bei 75% aller primären Melanome und 64% aller Metastasen stark oder sehr stark positiv. A103 (67% primär, 35% metastasiert) und T311 (68% primär, 29% metastasiert) hatten für den gleichen Grad der Färbeintensität einen wesentlich geringeren Prozentsatz erreicht. Gesamtfärbung und Färbeintensität von A103 und T311 bei primären Melanomen stimmten mit früheren Berichten überein.(49;51;53)
Auch die durchschnittliche Intensität der Färbung in den metastasierten Läsionen wurde analysiert (siehe 4.9 Tabelle 13). Bei Melan-A/MART-1 waren 23% komplett negativ und 42% schwach bis mäßig gefärbt. Nur 35% der Läsionen waren stark oder sehr stark gefärbt. Noch auffallender waren die Ergebnisse bei Tyrosinase. Während 37% komplett negativ waren, waren weitere 34% schwach bis mäßig positiv und nur 29% wiesen eine starke oder sehr starke Färbung auf. Bei SM5-1 waren 9% negativ, 27% schwach oder mäßig und 64% stark oder sehr stark gefärbt. Anders ausgedrückt,155 von 243 Metastasen färbten sich mit SM5-1 stark oder sehr stark, während dies bei A103 bzw. T311 nur in 85 bzw. 70 Fällen erfolgte. Somit zeigte sich für SM5-1 eine klare Überlegenheit zu den anderen untersuchten Antikörpern in Bezug auf die Intensität der Färbungen. Insbesondere galt dieses für durch SM5-1 gefärbte Metastasen.

5.5 Färbemuster von SM5-1 innerhalb einer Tumorzellpopulation im Vergleich zu A103 und T311

Bei der Analyse des Prozentsatzes der gefärbten Tumorzellen innerhalb einer Tumorzellpopulation (siehe 4.8 Tabelle 12) färbten alle drei Antikörper die Mehrheit, d.h. mehr als 50% der Tumorzellen. Hierbei zeigte sich jedoch SM5-1 mit 85% der Läsionen im Vergleich zu A103 mit 68% und T311 mit 63% überlegen. Dies stimmte mit der früher untersuchten guten Färbung von A103 und T311 überein.(31;51;53;72;73) Generell wird die immunhistologische Analyse primärer Läsionen durch unzureichende Sensitivität der verfügbaren Melanomantikörper nicht [Seite 44↓]gestört. Dies wurde durch diese Ergebnisse bestätigt. Auch bei der Beurteilung des Färbemusters des Antikörpers SM5-1 innerhalb einer Tumorzellpopulation, war dieser den anderen beiden Antikörpern überlegen. Es wurden durchschnittlich 20% mehr Zellen innerhalb einer Tumorzellpopulation gefärbt.

5.6 Konkordanter Antigenverlust bei primären und metastasierten Melanomen

Es war zu beobachten, dass 38 (15,6%) der 243 Metastasen einen konkordanten Verlust von Melan-A/MART-1 und Tyrosinase hatten. Dahingegen war rechnerisch eine Negativität von 8,4% zu erwarten. Eine gleichzeitige Negativität von Melan-A/MART-1, Tyrosinase und SM5-1 wurde aber nur bei 1,2% der Metastasen beobachtet, was den Wert des Einsatzes von SM5-1 bei Tumorantigen-negativen Läsionen unterstreicht.
Der konkordante Verlust der melanozytären Differentierungsantigene (MDA) gp100, Melan-A/MART-1 und Tyrosinase wurde von Slingluff et al. beschrieben.(74;75) Dieser Verlust scheint das korrespondierende Antigen von SM5-1 nicht zu betreffen, weshalb dieses sehr wahrscheinlich kein MDA ist. Es ist bisher nicht bekannt, ob es als Tumorabstoßungsantigen dient und ob zytotoxische T-Zellen dieses Antigen erkennen können bzw. ob es somit einen eventuellen Stellenwert für die Immuntherpapie des Melanoms mittels Vakzinierung haben könnte.

5.7 Schlussfolgerungen über den Antikörper SM5-1

Aus bisher bekannten Untersuchungen über Antikörper, die der immunhistochemischen Melanomdiagnostik dienten und den hier vorgestellten Ergebnissen kann man schließen, dass der neue hier untersuchte Antikörper SM5-1 mehrere Vorteile gegenüber den vorher bekannten und untersuchten Antikörpern in der Immunhistochemie von Melanomen hatte. So war SM5-1 spezifischer für Melanome als anti-S100 und sensitiver für metastasierte melanozytäre Läsionen als der gebräuchliche Antikörper HMB-45 und die Antikörper A103 und T311. Des Weiteren zeigte SM5-1 einen besonderen Vorteil bei der Färbeintensität für Melanommetastasen und bei der Anzahl der gefärbten Zellen einer Tumorzellpopulation. Diese Schlussfolgerungen wurden zum Teil durch eine weitere Studie unterstützt, in der die Expression von gp100, Melan-[Seite 45↓]A/MART-1, Tyrosinase und S100 bei primären und metastasierten Melanomen verglichen wurde.(76) Die Autoren fanden, dass die Sensitivität von anti-S100 die Sensitivität aller anderen Antikörper überschritten hatte. Da SM5-1 die gleiche hohe Sensitivität wie anti-S100 hat, aber für melanozytäre Läsionen spezifisch ist, während anti-S100 unspezifisch ist, kann der Gebrauch des Antikörpers SM5-1 als Antikörper der ersten Wahl für die immunhistochemische Melanomdiagnostik empfohlen werden. Es ist ebenso vorstellbar, dass mit einem radioaktiven Agens gekoppeltes SM5-1 für die Ausbreitungsdiagnostik bei Melanompatienten dienen kann. Für eine weitere genauere Charakterisierung muss jedoch noch das zugehörige Antigen untersucht werden.


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22.10.2004