Die in dieser Arbeit verwendeten Gewebe stammten überwiegend aus zufällig entnommenen Proben der Gewebebank der Dermatologischen Klinik bzw. Präparaten des Pathologischen Instituts der Charité. Die Gewebeproben wurden jeweils nach der Entnahme in 10%igem gepufferten Formaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Nach Routinebearbeitung durch das histologische Labor und histologischer Diagnostik durch einen Dermatohistopathologen konnte auf die Paraffinblöcke zurückgegriffen werden.

Zu den745 Präparaten von humanen Melanomen gehörten 351 primäre Melanome und 394Metastasen. Letztere waren hauptsächlich kutane, subkutane und Lymphknotenläsionen. Es wurden aber auch Metastasen der Leber, des Ösophagus, der Lunge, des Knochens, des Magens, der Nieren, der Nebennieren, des Hirns und der Meningen mit einbezogen. Desmoplastische Melanome wurden nicht untersucht. Teilweise stammten die Proben von Patienten mit mehreren primären Melanomen bzw. Metastasen. In solchen Fällen wurden alle zur Verfügung stehenden Läsionen untersucht. Die nicht vom Melanom stammenden melanozytären Läsionen waren 16 Nävi unterschiedlichen histologischen Typs (siehe unter 4.2 Tabelle 8). Des Weiteren wurden verschiedene nicht-melanozytäre Tumore, wie z.B. Basalzellkarzinome, Astrozytome, Ösophaguskarzinome, ein Bronchialkarzinom (siehe unter 4.3 Tabelle 9) und benigne Gewebe, wie z.B. Melanozyten, Keratinozyten, Plasmazellen, Myofibroblasten (siehe unter 4.1 Tabelle 7) untersucht.

Von den in Formaldehyd fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeproben wurden mit Hilfe des Mikrotoms ca. 3 - 5 µm dicke Schnitte angefertigt, welche zur “Entfaltung” zunächst kurz (max. 1 - 2 min) in ein 40 °C warmes Wasserbad und anschließend auf ChemMate^™-Objektträger gebracht wurden. Nach etwa 12 - 24 Stunden Lufttrocknung bei Raumtemperatur oder Trocknung bei 37 °C in einem Inkubator war die Weiterverarbeitung möglich.

Vor dem Färbevorgang ist die vollständige Entfernung des Einbettungsmediums zur Vermeidung von Hintergrundfärbung und Überdeckung positiv gefärbter Zellen außerordentlich wichtig.⁽⁵⁷⁾ Mittels der Entparaffinierungsmaschine “Omnibus” des Herstellers Quartett wurden folgende Schritte durchlaufen:

2 x 10 min Xylol
10 min absolutes Ethanol
10 min Ethanol (200 ml) mit 20 ml 3%igem H₂O₂
5 - 10 min fließendes Leitungswasser
5 - 10 min Tris-Waschpuffer

- Waschpuffer = 0,5 M Tris-Puffer, pH 7,6:
6,1 g Tris (Tris hydroxymethyl aminomethan) in 50 ml Aqua dest. lösen und 37 ml 1 N (HCI) hinzufügen. Aqua dest. ad 1 l. Der pH-Wert muß bei 25 °C 7,6 betragen. Gebrauchswaschlösung: 50 ml Stammlösung auf 450 ml 0,9%ige NaCl-Lösung

Von Formaldehyd bzw. auf Formaldehyd basierenden Lösungen ist bekannt, dass in Antigenen sterische Veränderungen, sogenannte Molekülvernetzungen, induziert bzw. insbesondere Zelloberflächenantigene denaturiert werden können. Durch eine Vorbehandlung mit proteolytischen Enzymen kann versucht werden, überschüssige Aldehydvernetzungen aufzuspalten und die verdeckten Antigene freizulegen.⁽⁵⁷⁾ Das hierfür am häufigsten verwendete Enzym ist Trypsin.⁽⁵⁷⁾

Vorbehandlung für das Färben mit SM5-1:
- 0,05%iges Trypsin in EDTA-Lösung,
- je 100 µl auf Gewebeschnitte geben
- 15 min bei 37 °C in der feuchten Kammer inkubieren

Eine weitere Vorbehandlung zur Antigenaufdeckung und somit zur Verbesserung und Optimierung der Färbeergebnisse besteht im Erhitzen der Proben in einer Mikrowelle.⁽⁵⁸⁾ Während dieser Mikrowellenbehandlung befanden sich die Proben in Citratpuffer (pH 6,0). Für SM5-1 zeigte sich eine optimale Antigenaufdeckung nach 6,5 Minuten bei 530 Watt. Bei A103 (anti-Melan-A/MART-1), T311 (anti-Tyrosinase), HMB-45 und anti-S100 genügte eine Hitzeeinwirkung von 5 Minuten. Nach mindestens 20minütigem Abkühlen bei Zimmertemperatur und 5 Minuten Waschen der Präparate in Tris-Puffer konnte mit dem Färben begonnen werden. Alle Präparate wurden in dieser Weise vorbehandelt.

Der Antikörper SM5-1 stammte aus einer Reihe von Antikörpern, welche aus einem subtraktiven Immunisierungsprotokoll in Vorarbeiten gewonnen wurden.Zwei humane Melanom-Zell-Linien wurden von einem Patienten etabliert. Dabei stammte eine dieser Zell-Linien (SMMU-1) vom Primärtumor, die andere von Zellen einer Lymphknotenmetastase desselben Patienten (SMMU-2). SMMU-2 metastasierte, wenn man sie subkutan in immundefiziente SCID-Mäuse injizierte, während SMMU-1 dies nicht tat. Da beide Zell-Linien vom selben Patienten gewonnen wurden, konnte ein subtraktives Immunisierungsprotokoll zur Antikörpergewinnung genutzt werden.⁽⁵⁹⁾Die gewonnenen Antikörper erkannten spezifisch Antigene, die von SMMU-2, nicht aber von SMMU-1 exprimiert wurden. Dabei wurde Mäusen zunächst SMMU-1 injiziert, um SMMU-1-spezifische B-Lymphozyten zu stimulieren. Diese Mäuse wurden dann mit Cyclophosphamid behandelt, um aktivierte und sich teilende Lymphozyten zu eliminieren. Nach Eliminierung der von SMMU-1 aktivierten Lymphozyten wurden die Mäuse wiederholt mit SMMU-2 immunisiert, um spezifische anti-SMMU-2 Antikörper-produzierende B-Lymphozyten zu induzieren. Milzzellen von diesen immunisierten Mäusen wurden mit SP/20-Zellen in einem standardisierten Fusionsprotokoll fusionert⁽⁶⁰⁾ und SMMU-2 spezifische monoklonale Antikörper mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszens sowie FACS-Analysen identifiziert (jeweils Kooperationspartner Prof. YJ. Guo, Cleveland, USA). Wie zu erwarten, reagierten die monoklonalen Antikörper nur mit SMMU-2, aber nicht mit SMMU-1.
Durch o.g. Hybridisierungsmodell wurden mehrere monoklonale Antikörper gewonnen. Nach Voruntersuchungen der verschiedenen erhaltenen Antikörper wurde der Antikörper SM5-1 (Maus IgG1) wegen seiner Reaktivität bei einer kleinen Stichprobe für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Die vorliegende Arbeit zeigt das immunhistochemische Verhalten des monoklonalen Antikörpers SM5-1 im Vergleich zu den in der Routinediagnostik häufig eingesetzten Markern anti-S100, HMB-45, A103 und T311.

Zum Vergleich der Heterogenität bzw. der Homogenität der in der Melanomdiagnostik gebräuchlichen Antikörper mit SM5-1 wurden die in Tabelle 6 gelisteten Antikörper verwendet. Zur Beurteilung des Färbeverhaltens wurden alle getesteten Tumorgewebe auch mit den zur Zeit in der Routine eingesetzten Markern HMB-45 und anti-S100 kontrollierend gefärbt.

Antikörper

Klon

Herkunft

Konzentration/ Verdünnung

SM5-1

SM5-1

Labor Prof. YJ. Guo, Cleveland, USA

2 µg/ml (gereinigtes IgG1)

anti-Melan-A/

MART-1

A103

Novocastra Laboratories Ltd.; Newcastle, UK

1:50

anti-Tyrosinase

T311

Novocastra Laboratories Ltd.; Newcastle, UK

1:20

HMB-45

HMB-45

DAKO Corporation, Carpinteria, USA

1:50

anti-S100

S1/61/69

Novocastra Laboratories Ltd.; Newcastle, UK

1:20

Tabelle 6 Verwendete Antikörper

Die immunhistochemischen Ergebnisse wurden unabhängig voneinander von zwei Untersuchern bestimmt. Die Färbeintensität wurde subjektiv als 0 (negativ), 1+ (schwach), 2+ (mäßig), 3+ (stark) und 4+ (sehr stark) eingeteilt. Der Prozentsatz der positiven Zellen innerhalb einer Läsion wurde semiquantitativ als 0 (0 - 1%), 1 (2 - 24%), 2 (25 - 50%), 3 (51 - 75%) und 4 (76 - 100%) ermittelt.