Veröffentlichungen

Diese Publikationsdissertation basiert auf folgenden Veröffentlichungen:

“The synaptophysin/synaptobrevin interaction crit i cally depends on the cholesterol co n tent.”

Mitter D, Reisinger C, Hinz B, Hollmann S, Y e lamanchili SV, Treiber-Held S, Ohm TG, Her r mann A, Ahnert-Hilger G.

Journal of Neurochemistry,

January 2003, Volume 84, Issue 1, Page 35-42

Reprinted with permission from Blackwell Publishing

“The synaptophysin/synaptobrevin complex dissociates ind e pendently of ne u roexocytosis.”

Reisinger C, Yelamanchili SV, Hinz B, Mitter D, Becher A, Bigalke H, Ahnert-Hilger G.

Journal of Neurochemistry,

July 2004, Volume 90, Issue 1, Page 1-8

Reprinted with permission from Blackwell Publishing

“Botulinum neurotoxin type D enables cytosolic delivery of enzymat i cally active cargo proteins to neurones via unfolded translocation i n termediates.”

Bade S, Rummel A, Reisinger C, Karnath T, Ahnert-Hilger G, B i galke H, Binz T.

Journal of Neurochemistry,

December 2004, Volume 91, Issue 6, Page 1461-1472.

Reprinted with permission from Blackwell Publishing

“The C-terminal transmembrane region of synaptobrevin binds syna p tophysin from adult v e sicles.”

Yelamanchili SV, Reisinger C, Becher A, Sikorra S, Bigalke H, Binz T, A h nert-Hilger G.

European Journal of Cell Biology,

April 2005, Volume 84, Issue 4, Page 467-75.

for a printed version contact Elsevier Publishing

Erklärung über den Anteil an den Publikationen

The synaptophysin/synaptobrevin complex dissociates independently of neuroexoc y tosis. - Reisinger C, Yelamanchili SV, Hinz B, Mitter D, Becher A, Bigalke H, Ahnert-Hilger G.

Zwei Drittel dieser Publikation entstammen eigener Arbeiten, diese sind im Folgenden aufgeführt:

Der Nachweis der konzentrationsabhängigen Wirkung von Botulinumtoxin A wurde in hippocampalen Neuronkulturen bei Applikation von 0,1pM bis 100pM Toxin erbracht. Die Auswertung erfolgte nach Sedimentierung der Neurone und Auftrennung der Proteine über SDS-Page und Westernblot sowie durch Immundetektion mit Antikörper gegen SNAP25 und gegen die durch Spaltung freigelegte Sequenz am Ende von SNAP25 (Antikörper p1-16). Die proteolytische Abspaltung von 9 Aminosäuren ist erkennbar am Shift (erhöhte Wanderungsgeschwindigkeit des gekürzten SNAP25) und über den Antikörper p1-16. Die Versuche führten zu den Abbildungen 2a und zeigen, dass die Nachweisgrenze der Wirksamkeit von BoNT/A nach 8 Tagen Inkubation bei 2pM liegt.

Des Weiteren wurde in Synaptosomen die Wirkung von BoNT/A in Konzentrationen von 20nM bis 100nM getestet. Dies wurde einerseits nativ und andererseits analog zu dem in Abbildung 1b gezeigten Versuch mit durch Dithiotreitol (DTT) präaktiviertem Toxin in mit SLO-permeabilisierten Synaptosomen durchgeführt. (Ergebnisse nicht gezeigt). Hier zeigte sich, dass die minimale Konzentration für die proteolytische Spaltung von SNAP 25 durch BoNT/A in Synaptosomen nach 2h in beiden Ansätzen 100nM beträgt.

Der neu eingeführte Antikörper p1-16 wurde in mehreren Versuchen evaluiert und zeigte sich zu 100% spezifisch (kein Signal bei intaktem SNAP25).

Die Immunpräzipitation über den Antikörper gegen Synaptobrevin von mit BoNT/A inkubierten hippocampalen Neuronen führte zur Abbildung 2b. Hierbei fand sich keine quantitative Änderung im Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplex. Zusätzlich wird die unveränderte Bindung von dem um 9 Aminosäuren gekürzten SNAP25 an Synaptobrevin dargestellt.

Die Behandlung von hippocampalen Neuronen mit BoNT/A in Gegenwart und Abwesenheit von LTX und die anschließende Auswertung über Immunpräzipitation führte zu den Abbildungen 3c. Bei gleichem Versuchsaufbau und nach Stimulation mit einer Ca2+-Ionophore entstand Abbildung 4. Diese Versuche zeigen, dass kurzzeitige Stimulationen zu einer Abnahme des Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplexes führen, welche nicht durch BoNT/A Behandlung antagonisiert werden kann und somit unabhängig von der Membranfusion ist.

The synaptophysin/synaptobrevin interaction critically depends on the chole s terol content. - Mitter D, Reisinger C, Hinz B, Hollmann S, Yelamanchili SV, Treiber-Held S, Ohm TG, Her r mann A, Ahnert-Hilger G.

Diese Arbeit beruht zu etwa einem Viertel auf eigenen Resultaten:

Das Ergebnis nach Zugabe von in Ethanol gelöstem Cholesterol zu hippocampalen Neuronen in der Wachstumsphase und die anschließende Darstellung des Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplexes über Immunpräzipitation ist in Abbildung 5b und c gezeigt. Hier zeigt sich eine signifikante Zunahme in der Interaktion der beiden Proteine im Vergleich zu Kontrolle.

In nicht gezeigten Studien wurde die Bindung von Synaptobrevin zu Synaptoporin nach Cholesterolzugabe geprüft. Es wurden außerdem eigene Versuche zur Depletion von Cholesterol mit β-MCD in hippocampalen Neuronen durchgeführt, die zur selben Schlussfolgerung wie die in den Abbildungen 2 gezeigten Versuche führten. Damit konnte nach Entzug von Cholesterol eine Abnahme der Komplexbildung nachgewiesen werden wohingegen die Zugabe eine Erhöhung der Komplexbildung bewirkte.

The C-terminal transmembrane region of synaptobrevin binds synaptophysin from adult vesicles. - Yel a manchili SV, Reisinger C, B e cher A, Sikorra S, Bigalke H, Binz T, Ahnert-Hilger G.

Ca. ein Drittel dieser Veröffentlichung konnte in eigenen Versuchen dargestellt werden, diese sind im Einzelnen:

In eigenen Vorarbeiten wurde auf der Basis eines bereits vorhandenen Synaptobrevin-Klons mit N-terminalem HisTag über Einklonierung der vorhandenen DNA in einen neuen Vektor, ein Synaptobrevin mit C-terminalem HisTag hergestellt, der in den gezeigten Versuchen jedoch keine Verwendung fand.

Sowohl N- als auch C-terminal getagtes Synaptobrevin wurden an Nickelbeads gebunden, wahlweise über TeNt gespalten und mit Extrakt aus Vesikelmembranen inkubiert. Die Auswertung der Eluate ist in Abbildung 3a zu sehen. Weitere Versuche zeigten mit Abbildung 4b übereinstimmende Ergebnisse in Bezug auf Syntaxin und SNAP25. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass komplettes Synaptobrevin mit HisTag wie erwartet sowohl SNAP25 und Syntaxin als auch Synaptophysin bindet und dass einerseits die N-terminale Hälfte nur noch SNAP25 und Syntaxin bindet, während andererseits die C-terminale Hälfte nur Synaptophysin bindet.

Botulinum neurotoxin type D enables cytosolic delivery of enzymatically active cargo pr o teins to neurones via unfolded translocation intermediates. - Bade S, Rummel A, Reisinger C, Karnath T, Ahnert-Hilger G, Bigalke H, Binz T.

Einen Anteil von etwa einem Fünftel konnte ich zu dieser Publikation beitragen:

Der Vergleich von verschiedenen BoNT/D-Konstrukten in hippocampalen Neuronen ist in Abhängigkeit von der Wirkdauer in Abbildung 4 dargestellt. Zusätzlich wurde in nicht gezeigten Versuchen die Konzentrationsabhängigkeit beschrieben. Hier zeigte sich, dass mit einem Cargoprotein gekoppeltes Toxin zwar schwächer aber durchaus wirksam ist.

In ähnlichen Ansätzen war die BoNT-Wirkung über eine Hemmung der vesikulären H+-ATPase durch Bafilomycin antagonisierbar, was in Abbildung 6 zu sehen ist. Diese Experimente zeigen, dass die Verlagerung der katalytischen Domäne ins Zytosol durch saure Kompartimente, sowohl bei dem nativem als auch dem Fusionsprotein geschieht.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
XDiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
26.10.2007