1 Einleitung

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Die calciumabhängige Exozytose von Vesikeln an der Synapse ist ein fundamentaler Prozess in der neuronalen Signalübertragung. Damit der Neurotransmitter in den synaptischen Spalt freigesetzt werden kann, müssen Vesikel gebildet und mit dem jeweiligen Molekül gefüllt werden, dann zur präsynaptischen Membran sortiert werden und dort andocken. In einem Zwischenschritt, der Priming genannt wird, werden die Vesikel auf die Calcium-abhängige Exozytose vorbereitet und fusionieren schließlich mit der präsynaptischen Membran.

Die Membranfusion ist ein unspezifischer Prozess, d.h. sie kann durch verschiedene Ursachen ausgelöst werden wie z.B. Druck, Elektroschocks oder Proteininteraktion. Es muss jedoch immer Energie aufgewendet werden, weshalb die Fusion nicht spontan abläuft. Die gesteuerte Fusion von Membranen spielt nicht nur eine Rolle bei der synaptischen Übertragung zwischen Neuronen und an der neuromuskulären Endplatte, sondern auch bei der Freisetzung von sekretorischen Vesikeln, intrazellulären Prozessen an Endosomen oder auch beim Eindringen behüllter Viren in eine Zelle. Die Proteine, die diesen Prozess steuern, scheinen evolutionär konserviert zu sein und finden sich in ähnlicher Art z.B. auch in Hefepilzen (Jahn und Sudhof, 1999).

Ein Schlüsselereignis in der Interaktion zwischen präsynaptischer und Vesikel-Membran ist die Formation des so genannten SNAP-Rezeptor-Protein-Komplexes (SNARE-Komplex), der aus dem Vesikel Assoziierten Membran-Protein 2 (VAMP2, Synaptobrevin) und den Plasmamembranproteinen SNAP25 und Syntaxin besteht (Sollner et al., 1993). Über deren Verdrillung werden die gedockten Vesikel in Position für die Exozytose gebracht (Chapman et al., 1994).

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Den ersten Hinweis auf die Funktion der SNARE-Proteine gaben clostridiale Neurotoxine. Diese katalysieren abhängig vom Serotyp die spezifische Spaltung eines der drei SNARE-Proteine und bringen damit die Exozytose komplett zum Erliegen (Ahnert-Hilger und Bigalke, 1995). Die clostridialen Neurotoxine, zu denen neben den 7 Botulinumtoxinen auch das Tetanustoxin gehört, sind typische Zwei-Domänen Toxine. Die leichte Kette (light chain, LC) enthält die enzymatische Peptidase mit einem der SNARE-Proteine als spezifischem Substrat. Die schwere Kette (heavy chain, HC) ist für die Aufnahme des Toxins in das Neuron entscheidend. Diese Toxine werden schon lange als Werkzeug für die Untersuchung des synaptischen Exozytoseapparates genutzt (Schiavo et al., 1994). Deshalb ist es von großem Interesse, die Funktion der Toxine detailliert zu eruieren, einerseits um damit den Prozess der Vesikelexozytose genauer untersuchen zu können, andererseits zur Evaluation der Verwendbarkeit als spezifischen Transporter für zukünftige Pharmaka.

Mit dem SNARE-Komplex interagieren verschiedene Proteine, von denen bisher nur wenige genau charakterisiert werden konnten. Diese Proteine modulieren die Funktion des Komplexes und beeinflussen unter anderem seine Entstehung, die gezielte Wirkung und seine Wiederauflösung.

Das mit dem 18kDa schweren SNARE-Protein Synaptobrevin interagierende Synaptophysin ist eines der häufigsten Vesikelproteine und weist mit seinen 38kDa und 4 Transmembrandomänen starke antigene Eigenschaften auf. Synaptophysin wird deshalb bereits seit langem als vesikulärer Marker genutzt (Calakos und Scheller, 1994). Seine Funktion ist bisher allerdings nur wenig verstanden.

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Obwohl Deletionsmutanten darauf hinweisen, dass Synaptophysin für die Exozytose scheinbar nicht essentiell ist (Eshkind und Leube, 1995), war nach Injektion von mRNA antisense Nukleotiden und Antikörpern gegen Synaptophysin die Transmitterexozytose eingeschränkt (Alder et al., 1992). Bei gestörter Synaptophysinexpression in neuronalen Zellkulturen ist die Fähigkeit Synapsen zu bilden unter kompetetiven Bedingungen verringert (Tarsa und Goda, 2002). Es konnte auch gezeigt werden, dass Synaptophysinmultimere Ionenkanäle bilden können (Thomas et al., 1988)

Darüber hinaus scheint Synaptophysin in Abhängigkeit von der Reife des Neurons die Verfügbarkeit von Synaptobrevin zu modulieren (Edelmann et al., 1995) und eine Rolle bei der Endozytose und Wiederverwertung der synaptischen Vesikel zu spielen (Daly und Ziff, 2002). Als cholesterolbindendes Protein scheint es für die Biogenese und die hohe Membrankrümmung der synaptischen Vesikel wichtig zu sein (Thiele et al., 2000). Synaptische Vesikel weisen eine überdurchschnittliche Dichte an Cholesterol auf. Cholesterol ist dort aber nicht gleichmäßig verteilt, sondern in so genannten Clustern angehäuft. Die Formation von Proteinen in diesen Zonen ist offenbar für die Funktion des SNARE-Komplexes essentiell (Salaun et al., 2004).

Synaptobrevin ist auf die Formation eines Komplexes beschränkt, es bindet entweder nur Synaptophysin oder im SNARE-Komplex.

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Die Interaktion von Synaptophysin mit Synaptobrevin findet sich ausschließlich in adulten Neuronen und konnte weder mit rekombinanten Proteinen noch in embryonalen oder neuroendokrinen Zellen dargestellt werden. Dies beruht offensichtlich auf einer posttranslationalen Modifikation von Synaptophysin, die über einen unbekannten zytosolischen Faktor induziert wird (Becher et al., 1999).

Ziel der vorliegenden Arbeiten war es, die Abhängigkeit der Interaktion von Synaptophysin und Synaptobrevin von verschiedenen Faktoren in mehreren Modellen zu beschreiben und damit die physiologische Funktion des Komplexes zu evaluieren.

Es interessierte dabei speziell, über welche Strukturen die beiden Proteine miteinander agieren und inwiefern sich der Komplex von Stimulation bzw. Inhibition der Exozytose und vom Cholesterolgehalt der Plasmamembran abhängig zeigt.


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26.10.2007