2 Methoden

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2.1  Proteingewinnung, Modellsysteme

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Für die Untersuchungen konnten verschiedene Modellsysteme genutzt werden. Zellkulturen hippocampaler Neurone wurden aus Mäuseembryonen gewonnen und bis zu 14 Tage (days in vitro, DIV) kultiviert. Die Behandlung mit verschiedenen Zusätzen erfolgte über den im jeweiligen Experiment angegebenen Zeitraum. Die Reaktion wurde auf Eis gestoppt, die Zellen geerntet und in Puffer mit Proteinaseinhibitoren resuspendiert, homogenisiert, zentrifugiert und extrahiert.

Physiologisch intakte synaptische Endigungen (Synaptosomen) und synaptische Vesikel wurden mittels Homogenisation und mehrerer Zentrifugationsschritte aus dem frischpräparierten Cortex adulter bzw. embryonaler Ratten gewonnen.

Für einige Versuche wurde rekombinantes Synaptobrevin verwendet, das in E. coli vom Stamm M15 exprimiert wurde. Die Konstrukte mit Amino- (N-) bzw. Carboxy- (C-) terminalem 6 Histidin (His)-Tag wurden in den pQE-28a bzw. pQE-30 Vektoren von Quiagen einkloniert und diese in E. coli transfiziert. Stellte sich während der Kultivierung unter photometrischer Messung die stationäre Phase ein, wurde den Kulturen Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) zugefügt und diese nach weiterem Wachstum sedimentiert. Unter Zusatz von Proteinaseinhibitoren wurde das Pellet in Lyse-Puffer resuspendiert, nach Inkubation mit Lysozym und DNase auf Eis mechanisch lysiert und anschließend mit Triton X-100 extrahiert. Die Isolierung und Aufreinigung der His-getagten Proteine erfolgte über Bindung an Nickel- Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA) Säulen und Elution mit Imidazol. Zum Entfernen des für die Versuche störenden Imidazol wurde das Eluat dialysiert.

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Die Proteinmenge wurde jeweils mittels BicinChoninic Acid (BCA)-Test ermittelt.

2.2 Toxine und Stimulantien

Um den Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplex in seiner Funktion während der Exozytose genauer untersuchen zu können, wurden verschiedene Toxine und Stimulantien als Hilfsmittel benutzt.

Die verwendeten Stimulantien α-Latrotoxin und Ca2+-Ionophore A23187 lösen in vitro eine Exozytose aus. Während α-Latrotoxin über einen bisher noch nicht genau geklärten Mechanismus konzentrationsabhängig und Ca2+-unabhänig zu einer massiven Exozytose der Neurotransmitter führt, wirkt die Ca2+-Ionophore, welche den Transport von Ionen durch die Lipidmembran ermöglicht, schwächer und nur bei Vorhandensein von Calciumionen.

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Zur Exozytoseuntersuchung verwendeten wir die clostridialen Neurotoxine Tetanustoxin (TeNt) sowie Botulinumtoxin (BoNT) A, B und D. Die Toxine spalten je nach Typ spezifisch eines der SNARE-Proteine und unterbinden damit die Exozytose vollständig. In einzelnen Versuchen wurde nur die leichte Kette des TeNt verwendet. Das in den Versuchen verwendete Botulinumtoxin A wirkt spezifisch auf SNAP25, während Tetanustoxin sowie Botulinumtoxin B und D die Spaltung von Synaptobrevin katalysieren.

Rekombinant hergestellte Konstrukte, bestehend aus Botulinumtoxin vom Serotyp D (BoNT/D) und verschiedenen, an das N-terminale Ende gekoppelten „Cargo“-Proteinen (unter anderen Green Fluorescent Protein, GFP) wurden in Kontinuität (als single chain, scBoNT) exprimiert. In vivo wird das Toxin zwischen der leichten und der schweren Kette proteolytisch gespalten („nicked“ BoNT), so dass diese nur noch durch eine Disulfidbrücke und nicht-kovalente Bindungen zusammenhängen. Die Spaltung konnte bei allen rekombinanten Toxinen künstlich herbeigeführt werden, ohne dabei die fusionierten Proteine freizusetzen.

Der Vergleich von BoNT/D und GFP-BoNT/D in genickter und ungenickter Form erfolgte in hippocampalen Neuronen in verschiedenen Konzentrationen nach 1 bis 6 DIV. Zur Blockade des natürlichen Aufnahmeweges wurde Bafilomycin A1 verwendet.

2.3 Cholesterol

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Die Verminderung der Cholesterolkonzentration wurde unter Verwendung von Lovastatin in Neuronen sowie mit Filipin und β-Methylcyclodextrin (β-MCD) bei synaptischen Vesikeln erreicht. Alternativ wurden die Konzentration durch Zugabe von Cholesterol zu den Zellkulturen am 1. DIV (days in vitro) erhöht und die Neurone bis zum DIV 5 bzw. 11 kultiviert.

2.4 Immunpräzipitation, Crosslinking, Bead-Versuch, Western Blot, Quantifizierung

Die Immunpräzipitation erfolgte durch Inkubation von Triton X-100 Extrakt mit monoklonalem Antikörper und anschließender Separierung über G-Sepharose. Das über Zentrifugation gewonnene Pellet wurde gewaschen. Danach wurden Pellet und Überstand in Probenpuffer resuspendiert und getrennt ausgewertet.

Zum Crosslinking der synaptischen Proteine verwendeten wir Disuccinimidylsuberat (DSS).

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Rekombinantes Synaptobrevin mit N- bzw. C-terminalem His-Tag wurde an Ni-NTA Säulen fixiert und wahlweise mit der isolierten leichten Kette des Tetanustoxins (TeNt-LC) gespalten. Nicht gebundene Proteine und Fragmente wurden durch Waschen entfernt. Die Säulen wurden daraufhin mit dem Extrakt vesikulärer Membranen (lösliche Proteine) inkubiert und nach mehreren Waschschritten eluiert. Die gebundenen Proteine wurden über das Westernblot Verfahren dargestellt.

Die molekulargewichtabhängige Auftrennung der Proteine erfolgte über SodiumDodecylSulfat-PolyAcrylamidGelElektrophorese (SDS-Page) mit Trenngelen zwischen 10% und 15%. Die Proteine wurden im SemiDry Blot-Verfahren auf Nitrocellulose transferiert und über Immundetektion mit Enhanced Chemiluminiscence (ECL) ausgewertet. ECL-Filme wurden eingescannt und die Proteinbanden mit Scan Pack 3.0 densitometrisch quantifiziert. Die statistische Auswertung erfolgte über den Stundent’s T-Test.

2.5 Antikörper

Zur Analyse der Immunoblots und für die Immunpräzipitation wurden monoklonale Antikörper gegen Synaptobrevin 2 (Klon 69.1), Synaptophysin (Klon 7.2), Syntaxin1a/b (Klon HPC-1), SNAP25 (Klon 71.1) sowie durch BoNT/A gespaltenes SNAP25 (Klon p1-16) verwendet. Polyklonale Antikörper wurden zur Darstellung von Synaptophysin (Klon G96) und Synaptobrevin (Klon 106.5) genutzt. Als sekundäre Antikörper kamen mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelte Pferd anti-Maus und Ziege anti-Hase Seren zum Einsatz.

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Synaptobrevin 2/VAMP 2 ist die am meisten vorkommende der 3 Isoformen, und wird im Folgenden nur noch als Synaptobrevin bezeichnet.


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26.10.2007