3 Ergebnisse

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3.1  Verhalten vom Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplex nach Stimulation

Aus eigenen Untersuchungen an hippocampalen Neuronen ergab sich, dass deren kurzzeitige Stimulation mit α-Latrotoxin zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Abnahme der Interaktion zwischen Synaptophysin und Synaptobrevin führte. Die Interaktion von SNAP25 mit Synaptobrevin bzw. Syntaxin nahm hierbei allerdings nur geringgradig zu. Auch die Stimulation mit Ca2+-Ionophore bewirkte eine Dissoziation des Komplexes, die jedoch unter Entzug von Calcium ausbleibt. Wurde vor der Stimulation mit α-Latrotoxin und Ca2+-Ionophore die Vesikelexozytose durch Behandlung der Neurone mit Botulinumtoxin A (BoNT/A) blockiert, kam es ebenfalls zu einer Reduktion des Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplexes. Die alleinige Behandlung mit BoNT/A hatte jedoch auch nach mehrtägiger Inkubation keinen Einfluss auf die Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplexbildung. Diese Ergebnisse zeigen erstmalig, dass die durch Exozytosestimuli ausgelöste Dissoziation des Komplexes der finalen Membranfusion voraus geht und von ihr unabhängig ist.

Der Funktionsnachweis von BoNT/A ergab sich einerseits aus dem sichtbaren Shift der SNAP25-Bande in der Elektrophorese und gelang andererseits durch die Darstellung von gespaltenem SNAP25 mit Hilfe des speziellen Antikörpers p1-16. Dieser monoklonale Antikörper erkennt eine Proteinsequenz am Ende von SNAP25, die durch die Spaltung freigelegt wird. Darüber hinaus konnte in eigenen Experimenten mit diesem Antikörper demonstriert werden, dass gespaltenes SNAP25 über die Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Synaptobrevin extrahiert werden kann.

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Unsere Arbeitsgruppe konnte in Versuchen mit Synaptosomen zwar die Labilität des Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplexes durch die reversible Dissoziation nach Behandlung mit hoch konzentrierter NaCl-Lösung bzw. mit β-Mercaptoethanol zeigen, konnte jedoch keine direkte Wirkung von ionischem Calcium auf den Komplex feststellen.

3.2 Einfluss von Cholesterol auf den Komplex

Ein weiteres Ergebnis der durchgeführten Versuche ist der Nachweis, dass die Interaktion von Synaptophysin und Synaptobrevin vom Cholesterolgehalt der Vesikelmembran abhängt. Nach Cholesteroldepletion sowohl mit Filipin bzw. β-MCD in Synaptosomen als auch unter Lovastatinbehandlung in neuronalen Zellkulturen konnte über Immunpräzipitation eine eindeutige Abnahme des Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplexes festgestellt werden. Die Interaktion von Synaptobrevin und SNAP25 blieb in diesen Ansätzen nahezu unverändert. Wurde dagegen Cholesterol den im Wachstum befindlichen hippocampalen Neuronen zugesetzt, steigerte dies nach mehrtägiger Behandlung die Interaktion von Synaptophysin und Synaptobrevin im Vergleich zu unbehandelten Zellkulturen signifikant.

Die Cholesterolabhängigkeit der Komplexbildung konnte von unserer Arbeitsgruppe auch im Tiermodell bestätigt werden. Ebenso konnte die unterschiedliche Extrahierbarkeit von Synaptophysin in Abhängigkeit vom Cholesterolgehalt der Membran gezeigt werden. Eine Analyse des Cholesterolgehaltes der Membranen von embryonischen synaptischen Vesikeln ergab einen 3-fach geringeren Cholesterolanteil im Vergleich zu adulten Vesikeln.

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Zusammenfassend belegen diese Experimente, die wichtige Rolle, die Cholesterol für die Ausbildung des Synaptophysin/Synaptobrevin Komplexes und die Reifung der synaptischen Vesikel spielt.

3.3 Interaktion von Synaptobrevin mit Synaptophysin

Synaptobrevin war nach mehrtägiger Inkubation einer Zellkultur hippocampaler Neurone mit Tetanustoxin (TeNt) erwartungsgemäß nicht mehr detektierbar. Sowohl die Expression von Synaptophysin als auch die Komplexbildung von SNAP25 und Syntaxin blieben hierbei jedoch unverändert. Während beschrieben wurde, dass Synaptobrevin im SNARE-Komplex vor der enzymatischen Spaltung durch Tetanustoxin geschützt ist (Hayashi et al., 1994), konnte unsere Arbeitsgruppe nach Crosslinking und Inkubation von Synaptosomen mit TeNt zeigen, dass Synaptobrevin im Komplex mit Synaptophysin weiterhin durch TeNt angreifbar ist und in diesem im Vergleich zum Monomer sogar bevorzugt gespalten wird.

Dieser Aspekt erwies sich als geeignet um zu eruieren, ob nach der Spaltung eines der Synaptobrevinfragmente in Bindung an Synaptophysin nachweisbar ist. Um dies zu analysieren wurden Synaptosomen nach dem Crosslinking mit TeNt oder BoNT/D behandelt. Dabei zeigte sich in der Elektrophorese ein neuer Komplex aus Synaptophysin und einem der beiden neu entstandenen Synaptobrevinfragmente. Über die unterschiedliche Laufzeit und Darstellbarkeit mit verschiedenen Antikörpern konnte das C-terminale Fragment als das bindende identifiziert werden.

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Unter Verwendung von rekombinant hergestellten Synaptobrevin-Konstrukten mit N- bzw. C-terminalem His-Tag konnte die Interaktion von Synaptobrevin mit den präsynaptischen Proteinen auch direkt überprüft werden. Beide Konstrukte hatten unveränderte Bindungseigenschaften zu den SNARE-Proteinen SNAP25 und Syntaxin als auch zu Synaptophysin. Über den N-terminalen His-Tag fixiertes und mit Hilfe von TeNT gespaltenes Synaptobrevin hat nach Inkubation mit Extrakt aus adulten Synaptosomen SNAP25 und Syntaxin unverändert gebunden. Die Bindung von Synaptophysin nahm durch die Spaltung hingegen ab. Demgegenüber wies das Konstrukt mit dem C-terminalen Tag nach der Spaltung eine verminderte Bindung der SNARE-Proteine auf. Die Bindung von Synaptophysin war im Vergleich zum nicht gespaltenen Synaptobrevin unvermindert. Damit konnte die Bindung von Synaptophysin an Synaptobrevin über dessen C-Terminus bewiesen werden.

3.4 Botulinumtoxin als Werkzeug

Andere Experimente betrafen die Verwendung von Botulinumtoxin als Werkzeug für Untersuchungen der Vesikelexozytose. Als Ergebnis dieser Experimente ergab sich, dass ein an die leichte Kette von BoNT/D gehängtes Protein spezifisch in Neurone transloziert wird und dort seine enzymatische Aktivität entfalten kann. Die Fähigkeit der Konstrukte ins Zytosol zu translozieren hing dabei weniger von der Größe der angehängten Proteine, als vielmehr von der Stabilität ihrer Konformation ab.

BoNT/D, an dessen leichte Kette das Protein GFP angehängt wurde, hat in eigenen Versuchen an hippocampalen Neuronen im Vergleich zu nativem BoNT/D eine geringere Toxizität. Wie sich in der zeitabhängigen Vergiftungsreihe zeigt, beruht dies eher auf einer verlangsamten Translokation ins Zytosol als auf einer gestörten Funktion. Weiterhin konnte man beim Vergleich von rekombinantem scBoNT/D mit nativem, genicktem BoNT/D erkennen, dass allein die enzymatische Trennung der leichten von der schweren Kette (nicking) eine Zunahme der Toxizität um ein Mehrfaches bewirkt.

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BoNT kann nur dann als spezifischer Transporter genutzt werden, wenn durch die Kopplung mit dem Cargo-Protein kein alternativer Aufnahmeweg möglich ist. In eigenen Experimenten konnte gezeigt werden, dass über die Blockade der vesikulären H+-ATPase durch Bafilomycin A1 sowohl die Wirkung von BoNT/D als auch GFP-BoNT/D eindeutig verringert wurde. Dies gibt Anhalt dafür, dass die Verlagerung der katalytischen Domäne ins Zytosol durch saure Kompartimente erfolgt und dieser Pfad bei den Fusionsproteinen nicht verändert ist.


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26.10.2007