4 Diskussion

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Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass der Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplex in Abhängigkeit von der synaptischen Aktivität dynamisch reguliert wird. Verschiedenartige Kurzzeitstimulationen lösen über einen bisher nicht identifizierten Ca2+-abhängigen Schritt die Dissoziation des Synaptophysin/ Synaptobrevin-Komplexes aus. Die Veränderung der Interaktion der beiden Proteine durch den Exozytosestimulus ist auch durch BoNT/A nicht blockierbar, ist also unabhängig von der finalen Membranfusion. Dies ist mit der These vereinbar, dass der Komplex einen Reservepool zur Bereitstellung von Synaptobrevin für den SNARE-Komplex darstellt und in Vorbereitung auf die Exozytose von bislang unbekannten Faktoren moduliert wird. Allerdings weist die fehlende Interaktion von Synaptophysin und Synaptobrevin in embryonalen und neuroendokrinen Zellen (Becher et al., 1999) darauf hin, dass Synaptophysin noch andere Aufgaben neben der Interaktion mit Synaptobrevin hat.

Während die direkte Zugabe von Ca2+ in Versuchen mit synaptosomalen Extrakten zu einer Abnahme der Komplexmenge führte (Daly und Ziff, 2002;Prekeris und Terrian, 1997), hatte es in unseren Experimenten mit Extrakt aus synaptischen Vesikeln keinen Effekt. Dies lässt vermuten, dass das in den Synaptosomen enthaltene Zytosol einen zusätzlichen Faktor enthält, der die calciumabhängige Dissoziation vermittelt.

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Eine von der Exozytose unabhängige Dissoziation des Komplexes nach α-Latrotoxin Stimulation konnte auch mittels Fluorescence Resonance Energy Transfer Analyse gezeigt werden (Pennuto et al., 2002). Dagegen fand sich bei Untersuchungen mit membranpenetrierendem Crosslinkingverfahren an Synaptosomen ein Anstieg des Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplex nach Stimulation (Khvotchev und Sudhof, 2004). Diese Arbeitsgruppe wies weiterhin nach, dass die Komplexbildung von der Intaktheit der Membran abhängt und damit die Extraktion mit von uns genutzten Detergenzien die Bindungseigenschaften der Proteine verändern könnte. Andererseits fand in diesen Versuchen das Crosslinking während der Stimulation statt. Im theoretischen Falle eines hohen turn over des Komplexes mit kombinierter Assoziation und Dissoziation, würde durch das Crosslinking die Trennung verhindert und eine Nettodissoziation wäre damit maskiert. In diesem Sinne könnte man vermuten, dass Synaptophysin vor der Exozytose von Synaptobrevin abdissoziert und während oder nach der Endozytose wieder an das vesikuläre SNARE-Protein zu binden um die gezielte schnelle Wiederaufnahme und Sortierung von Synaptobrevin in die Vesikel zu ermöglichen. Dafür spricht auch, dass Synaptophysin in der Lage ist die Wiederaufnahme von Synaptobrevin 2 in synaptische Vesikel zu bewirken (Pennuto et al., 2003).

Die Beobachtung, dass es nach Langzeitstimulation zu einer Steigerung des Synaptophysin/ Synaptobrevin-Komplexes kommt (Hinz et al., 2001) kann auch damit erklärt werden, dass der Komplex als Reservepool fungiert und unter diesen Bedingungen hochreguliert wird. Da Synaptophysin auch eine Rolle bei der schnellen Endozytose spielt (Daly und Ziff, 2002), ist die Zuteilung von Synaptobrevin zu synaptischen Vesikeln durch diese Interaktion denkbar.

Der Entzug von Cholesterol führt zur Inhibition der regulierten Exozytose (Kato et al., 2003). Wir konnten zeigen, dass Cholesterol in synaptischen Vesikeln und Zellkulturen auch einen Einfluss auf die Interaktion von Synaptophysin und Synaptobrevin hat. Die Verringerung des Cholesterolgehaltes der Membranen vermindert die Komplexbildung, bei Substitution mit Cholesterol ist sie erhöht. Da der Cholesterolgehalt der Membranen während der neuronalen Entwicklung steigt, korreliert die Komplexmenge dementsprechend mit der synaptischen Reifung.

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Synaptophysin ist ein Cholesterol-bindendes Protein (Thiele et al., 2000) und ist im Gegensatz zu anderen synaptischen Proteinen nach Cholesteroldepletion schlechter löslich. Es könnte daher an der Bildung von Membranclustern beteiligt sein, die Anordnung und Interaktion von vesikulären Proteinen fördern.

Die Abhängigkeit der Komplexbildung vom Cholesterolgehalt der Membran gibt außerdem Anhalt für eine Interaktion der beiden Vesikelproteine im Bereich der Transmembranregion. Alternativ wäre auch eine notwendige Annäherung über Membrancluster denkbar. Um die für die Interaktion benötigte Domäne zu spezifizieren, führten wir verschiedene Bindungsstudien mit rekombinantem kompletten als auch mit gespaltenem Synaptobrevin durch. Über zwei verschiedene Ansätze konnten wir zeigen, dass hauptsächlich der C-Terminus des Synaptobrevin für die Bindung zwischen den beiden Vesikelproteinen sorgt.

Der Nachweis, dass der Komplex unter hoher Salzkonzentration und reduzierende Bedingungen dissoziiert, spricht für eine Interaktion der Proteine in der zytosolischen Domäne. In Kombination mit den Bindungsstudien lasst dies vermuten, dass es sich um den Bereich nahe der Transmembranregion handelt.

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Nicht im Einklang mit unseren Ergebnissen scheint die Tatsache, dass Synaptobrevin, welches über den N-Terminus am SNARE-Komplex partizipiert, nicht in der Lage ist Synaptophysin zu binden. Weiterhin bewirkt die Einführung von N-terminalen Synaptobrevinfragmenten (AS 1-32) die Aufhebung der Bindung an Synaptophysin (Washbourne et al., 1995) und in Immunfluoreszenzversuchen erwies sich der zytoplasmatische Teil von Synaptobrevin 2 als essentiell für die Synaptophysin-abhängige Sortierung zu synaptischen Vesikeln (Pennuto et al., 2003). Jedoch verwenden diese Versuche kompetetive Bedingungen und konnten keine direkte Bindung nachweisen.

Die Untersuchung der Wirkungsweise von Botulinumtoxin verhilft zu neuen Techniken, um Proteine gezielt in Zellen zu transportieren. Unsere Darstellung der veränderten Toxizität in Abhängigkeit vom nicking oder angehängten Proteinen ist hilfreich für weitere Versuche, in denen eine effektive Wirkung der Toxine angestrebt wird bzw. ermöglicht eine effektive Translokation ohne toxische Nebeneffekte.

Der Nachweis, dass die Kopplung von Proteinen an proteolytisch inaktive clostridiale Toxine ein geeignetes Mittel für den Transport in das Zytosol neuronaler Zellen darstellt, ist aus mehreren Gründen von Vorteil. Einerseits kann man dieses Modul als spezifischen Transporter für noch zu entwickelnde Pharmaka verwenden, andererseits erhält man damit ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Prozesse an der Synapse. Mit Hilfe dieses Transporters wäre es z.B. möglich den Faktor, der die Bindung zwischen Synaptophysin und Synaptobrevin in adulten Neuronen vermittelt, sollte er sich denn als Protein herausstellen, ins Zytosol anderer Zellen zu translozieren und diese daraufhin auf veränderte Eigenschaften zu untersuchen.

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In eigenen wie auch in den zitierten Studien zeigte sich eine veränderte Interaktion zwischen Synaptophysin und Synaptobrevin in Abhängigkeit von Stimulation, neuronaler Reifung, Bestandteilen der Zellmembran oder des Zytosols und anderen Faktoren. Damit zeugen die Arbeiten vom modulierenden Charakter von Synaptophysin. Was diese Modulation bewirkt ist weiterhin ungewiss. Beeinflusst der Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplex die Ausbildung des SNARE-Komplexes positiv oder negativ? Fungiert er als Reservepool für die effektive Bereitstellung von Synaptobrevin oder verhindert er, dass Synaptobrevin nach ATP-verbrauchender Auflösung des SNARE-Komplexes wieder in diesen eintritt?

In den vorliegenden Arbeiten finden sich überwiegend Hinweise auf den positiv modulatorischen Effekt von Synaptophysin. Die Dissoziation des Komplexes vor der Exozytose ermöglicht Synaptobrevin leichter in den für die Exozytose essentiellen SNARE-Komplex einzutreten. Auch das Ergebnis, dass die Interaktion von Synaptophysin mit dem C-terminalen Part erfolgt, stützt die Theorie der Bereitstellung von Synaptobrevin für den SNARE-Komplex. Die Bindungsdomäne am N-terminalen Ende des Proteins, das für die Interaktion mit dem Membrankomplex verantwortlich ist, wäre damit frei verfügbar.

Mit Hilfe unserer Arbeiten konnte der Komplex der Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin genauer charakterisiert werden, der genaue Nachweis seiner funktionellen Bedeutung steht noch aus.

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Anmerkung: In der Zusammenfassung wurden die Ergebnisse aus den Veröffentlichungen, die nicht direkt aus meinen Versuchen hervorgingen verkürzt erläutert. Eigene Ergebnisse wurden detailliert dargestellt.


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26.10.2007