Aus dem Institut für Integrative Neuroanatomie
der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin

PUBLIKATIONSDISSERTATION

Regulation der Interaktion
der präsynaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin

Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin

vorgelegt von: Clemens Reisinger
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. rer. nat. G. Ahnert-Hilger
2. Prof. Dr. med. A. Draguhn
3. Prof. Dr. med. I. Just

eingereicht: 26. Juni 2005

Datum der Promotion: 16. Januar 2006

Zusammenfassung

Die integralen Vesikelmembranproteine Synaptophysin und Synaptobrevin interagieren in adulten Neuronen. Zusätzlich bildet Synaptobrevin mit den Plasmamembranproteinen Syntaxin und synaptosome-associated protein 25kDa (SNAP25) den SNAP-Rezeptor (SNARE)-Proteinkomplex, der Voraussetzung für die Fusion zwischen synaptischen Vesikeln und präsynaptischer Membran ist. Mit Synaptophysin interagierendes Synaptobrevin bindet jedoch nicht an den SNARE-Proteinen. Es wird daher vermutet, dass der Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplex eine Art Reservepool für Synaptobrevin bei erhöhter neuronaler Aktivität darstellt und die Verfügbarkeit von Synaptobrevin während der Exozytose reguliert. Mit verschiedenen Ansätzen wurde versucht, den auf dem Vesikel befindlichen Komplex genauer zu charakterisieren und in seiner Funktion näher zu beschreiben.

Nach Stimulation mit exozytosevermittelnden Substanzen dissoziierte der Synaptophysin/ Synaptobrevin-Komplex, sowohl unter nativen Bedingungen als auch bei Blockierung des finalen Fusionsereignisses. Dieser Prozess war calciumabhängig, konnte jedoch nicht durch die direkte Wirkung von Calcium ausgelöst werden. Die Untersuchung des Komplexes mit Hilfe von clostridialen Neurotoxinen zeigte, dass Synaptobrevin bevorzugt in Bindung an Synaptophysin und als Dimer gespalten wurde. Die Spaltung des SNARE-Proteins SNAP25 hatte keinen Einfluss auf die Komplexbildung. Die Verringerung des Cholesterolgehaltes der Membran führte zur Abnahme der Interaktion von Synaptophysin und Synaptobrevin, umgekehrt zeigte sich ein Anstieg bei zusätzlicher Cholesterolapplikation. In weiteren Experimenten konnte der C-terminale Teil des Synaptobrevins als für die Bindung zu Synaptophysin entscheidende Abschnitt identifiziert werden. Weiterhin konnte die erfolgreiche Translokation von rekombinanten Konstrukten aus Botulinumtoxin D und einem angekoppelten funktionstüchtigen Protein ins Zytosol gezeigt werden.

Synaptophysin besitzt in adulten Neuronen eine modulatorische Funktion auf die Bereitstellung von Synaptobrevin während der Exozytose. Die Komplexbildung der beiden Proteine wird dynamisch geregelt und korreliert mit der neuronalen Reifung.

Eigene Schlagworte: Synaptophysin, Synaptobrevin, Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex, Syp/Syb-Komplex, SNARE-Komplex, Exozytose, Vesikelfusion, neuronale Stimulation, clostridiale Neurotoxine, Botulinumtoxin, Cholesterol

Abstract

The vesicle associated membrane proteins synaptophysin and synaptobrevin interact in mature neurones. Additionally synaptobrevin forms a complex with the plasma membrane proteins syntaxin and synaptosome-associated protein 25kDa (SNAP25), better known as the SNAP-Receptor (SNARE) complex, which is a prerequisite for fusion of the presynaptic and vesicle membranes. These two protein complexes however are mutually exclusive. It is assumed that the synaptophysin/synaptobrevin complex resembles a reserve pool for synaptobrevin and regulates the availability of synaptobrevin for the fusion process in case of increased synaptic activity. Different approaches where chosen to characterize this protein complex and to examine its function in more detail.

After excessive stimulation the synaptophysin/synaptobrevin complex dissociates, even when the final fusion process is blocked. This step was dependent on the presence of calcium, though it could not be triggered directly by calcium administration. When using clostridial neurotoxins, synaptobrevin was preferentially cleaved in its homodimeric form and in the complex with synaptophysin. Cleavage of SNAP25 had no effect on the complex formation. Depletion of cholesterol content decreases the interaction of synaptophysin with synaptobrevin, while cholesterol treatment increases interaction. Further experiments indicated that synaptophysin binds to the the carboxy-terminal transmembrane part of synaptobrevin. Furthermore it could be shown that proteins attached to botulinum toxin can be delivered to the cytosol of neuronal cells, being fully active.

In mature neurons synaptophysin plays a modulatory role, facilitating the interaction of synaptobrevin with its SNARE partners. The interaction of synaptophysin and synaptobrevin is dynamically controlled and correlates with synaptic maturation.

Keywords:

Keywords: Synaptophysin, Synaptobrevin, synaptophysin-synaptobrevin complex, Syp/Syb complex, SNARE complex, Exocytosis, vesicle fusion, neuronal stimulation, clostridial neurotoxins, botulinumtoxin, cholesterol

Inhaltsverzeichnis



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26.10.2007