Einleitung

Bindegewebe-abbauende Proteasen

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Der Begriff „Invasivität“ beschreibt die Fähigkeit von Zellen anatomische Barrieren (z.B. die Basalmenbran, das Bindegewebe) zu überwinden. Physiologisch spielt die Invasivität von Zellen bei der Einnistung der Blastozyste, bei der Angiogenese oder der Leukozytenwanderung bei der Entzündung eine Rolle. Die rheumatoide Arthritis und die Tumorbildung und -ausbreitung zählen zu den pathologischen Prozessen, die mit der Invasivität von Zellen verknüpft sind. Weiterhin müssen auch alle Mikroorganismen ein invasives Potential besitzen, um in den Wirtsorganismus zu gelangen. Eine Voraussetzung für die Invasion von Zellen ist der Abbau der extrazellulären Matrix. Dies geschieht in erheblichem Maße durch Proteasen, die dadurch zu einem interessanten Forschungsobjekt für die Entwicklung von Arzneistoffen werden.

Extrazelluläre Matrix

Der Raum zwischen den Zellen, das Interstitium, ist mit interstitieller Flüssigkeit und in vielen Geweben mit komplex zusammengesetzten Interzellularsubstanzen ausgefüllt. Diese Interzellularsubstanzen, die in ihrer Gesamtheit als extrazelluläre Matrix (extracellular matrix, ECM) bezeichnet werden, nehmen in einigen Geweben nur einen kleinen Raum, in anderen Geweben einen sehr großen Raum ein. Besonders ausgeprägt ist die extrazelluläre Matrix im Binde- und Stützgewebe, wo sie auch der eigentliche Funktionsträger des Gewebes ist. Aufgaben der extrazellulären Matrix sind u.a. die Herstellung der mechanischen Verbindung zwischen den Zellen (Verschiebeschicht), die Wasserspeicherung, der Transport und Austausch von Stoffwechselprodukten sowie die Bewegung von mobilen Zellen. Der fixe zelluläre Anteil des lockeren Bindegewebes besteht hauptsächlich aus den Fibroblasten und Fibrozyten. Während die Fibrozyten zeitweise inaktive Bindegewebszellen darstellen, produzieren und sezernieren die Fibroblasten die makromolekularen Bestandteile des extrazellulären Raumes. Diese Moleküle lassen sich vier Prototypen zuordnen: Kollagene, Elastin, Proteoglykane und Strukturglykoproteine.

Kollagene sind Skleroproteine, die eine beträchtliche Zugfestigkeit aufweisen. Es werden aufgrund der Aminosäuresequenz der Einzelketten und der Zusammensetzung der einzelnen Ketten mindestens 14 Kollagen-Typen unterschieden (Typ I - XIV), die in die fibrillären und nichtfibrillären Kollagene unterteilt werden können. Ein charakteristisches Merkmal aller Kollagentypen ist, dass zumindest ein Teil des Moleküls aus drei (identischen oder nichtidentischen) Polypeptidketten besteht, die die sich wiederholende Tripeptid-Sequenz Gly-X-Y besitzen und in Form einer Tripelhelix umeinander gewunden sind. Bei den am häufigsten vorkommenden Kollagentypen I, II und III sind alle drei Ketten über den gesamten Bereich in Form der Helix gewunden. Bei allen weiteren Kollagentypen werden neben den fibrillären auch globuläre Anteile gefunden. So ist die Tripelhelix des Kollagen IV, welches für die Basalmembran spezifisch ist, durch etwa 20 nichthelikale Abschnitte unterbrochen, in denen die Kette dann eine höhere Flexibilität aufweist. In den helikalen Abschnitten besitzen die Peptidketten aller Kollagene eine spezifische Zusammensetzung an Aminosäuren: Gly-X-Y. Glycin stellt jede dritte Aminosäure dar, in der X- und Y-Position findet man häufig die Aminosäuren Prolin, an der Y-Stelle können aber auch 4-Hydroxprolin (oft), 3-Hydroxprolin und 5-Hydroxylysin (seltener) vorkommen [Löffler 1998].

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Elastin ist ein elastisches Skleroprotein. Man findet es z.B. in Geweben des Herzkreislaufsystems (z. B. Aorta, Pulmonalarterie), des Respirationstraktes (Lunge, Bronchien) und der Haut. Elastin besitzt ein Molekulargewicht von 68 kDa und polymerisiert nach oxidativer Desaminierung von Lysylresten (zu Aldehyden) zu Desmosinverbindungen (Kondensationsprodukt aus Lysin) zu langen verknäulten Polypeptidketten. Die Peptidketten zeichnen sich durch einen hohen Gehalt an hydrophoben Aminosäuren (vor allem Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin) und wiederum Glycin und Prolin aus [Löffler 1998].

Proteoglykane sind die quantitativ bedeutendsten, strukturell vielfältigsten und funktionell vielseitigsten Bestandteile der extrazellulären Matrix. Sie sind sehr große Molekülkomplexe (bis über 2000 kDa), bestehend aus Kohlenhydraten (85-95%) und Proteinen (5-15%) und liegen im Gegensatz zu den geformten Fasern von Kollagen und Elastin als amorphe Substanz vor. Der Aufbau ist Bürsten-ähnlich: an ein Kernprotein (sog. Core-Protein) werden viele lange, unverzweigte Kohlenhydratketten kovalent gebunden. Die Kohlenhydratketten bestehen aus meist sich wiederholenden Disaccharid-Einheiten, die aus einem Aminozucker (meist Glucosamin oder Galactosamin) und einem Monosaccharid-Derivat (meist einer Uronsäure: Glucuronsäure oder Iduronsäure) bestehen. Sie werden deshalb auch als Glykosaminoglykane bezeichnet. Zusätzlich können die Disaccharide noch sulfatiert und acetyliert sein. Bedingt durch die Anwesenheit von Uronsäuren und Sulfaten haben die Proteoglykane der extrazellulären Matrix saure Eigenschaften. Bei physiologischem pH-Wert liegen als Gegenionen vor allem Natrium-, Kalium- und Calcium-Ionen vor. Aufgrund dessen und aufgrund ihrer molekularen Struktur sind die vorkommenden Proteoglykane in der Lage, viel Wasser (und Kationen) zu binden. Viele Proteoglykane bilden mit Hyaluronsäure große, nicht-kovalente Aggregate. Hier bildet Hyaluronsäure eine Grundachse, an die sich dann die Core-Proteine anlagern, die ihrerseits wieder die vielen Polysaccharid-Ketten tragen, so dass der Aufbau dann einer Flaschenbürste ähnelt [Löffler 1998, Hänsel 1999].

Die Strukturglykoproteine bestehen zum Großteil aus Protein, an welches Monosaccharidketten gebunden sind, mit Molekulargewichten zwischen 150 – 400 kDa. Zu den Strukturglykoproteinen gehören die adhäsiven Glykoproteine (oder Nektine) und die Laminine. Nektine (z.B. Fibronektin) vermitteln den Kontakt zu den im Bindegewebe eingelagerten Zellen. Über die Adhäsionsrezeptoren auf den Zellen stellen sie die Verbindung zwischen der extrazellulären Matrix und dem Zellinneren her. Laminine sind wesentlich am Aufbau der Basalmembran beteiligt [Löffler 1998].

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Neben den im lockeren Bindegewebe vorkommenden fixen Zellen können andere Zellen in das Gewebe „einwandern“. Zu diesen mobilen Zellen gehören neutrophile Granulozyten, Makrophagen, Lymphozyten aber auch eosinophile Granulozyten und Mastzellen. Sie übernehmen im Fall von infektiösen und allergischen Erkrankungen (bzw. Reaktionen) die Deaktivierung der Mikroorganismen bzw. pathogenen Faktoren. Der Abbau der extrazellulären Matrix und des Bindegewebes kann entsprechend der Einzelbestandteile durch Hydrolasen, vor allem Peptidasen und Glycosidasen erfolgen. Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit standen die Peptidasen: Clostridium histolyticum Kollagenase, humane neutrophile Elastase und (humane) Matrix-Metalloproteinase 9.

Clostridium histolyticum Kollagenase (EC 3.4.24.3)

Kollagenasen sind proteolytische Enzyme, die Kollagen in niedermolekulare Peptide spalten. Die Clostridium histolyticum Kollagenase (EC 3.4.24.3) gehört zur Klasse der Metalloendopeptidasen (Hydrolasen, Peptidasen: EC 3.4.24.x). Sie ist ein Gemisch von Kollagenasen, die aus dem Überstand von C. histolyticum Kulturen gewonnen werden. Derzeit sind 6 (Sekundärliteratur spricht von 7 [van Wart 1998]) Kollagenasen aufgereinigt und charakterisiert worden [Bond 1984a]. Sie werden aufgrund ihrer Reaktivität gegenüber Kollagen und synthetischen Peptidsubstraten in Klasse I – Kollagenasen (α, β, γ) und Klasse II – Kollagenasen (δ, ε, ζ) eingeteilt [Bond 1984b, van Wart 1985]. Alle Clostridium histolyticum Kollagenasen bestehen aus einer einzelnen Polypeptid-Kette mit Molekulargewichten zwischen 68 kDa und 125 kDa (die Benennung der Kollagenasen nach ihrem Molekulargewicht scheint zu weniger Missverständnissen zu führen). Sie enthalten zwischen 2 und 5 Cystein-Resten pro Kette, allerdings ist nicht bekannt, ob sie Disulfidbrücken ausbilden. Die isoelektrischen Punkte liegen zwischen 5.35 und 6.20. Alle Kollagenasen enthalten etwa 1 Zink-Ion pro Kette. Dieses Zink-Ion ist essentiell für die Reaktivität der Enzyme und befindet sich vermutlich im aktiven Zentrum, welches als HEYTH (L-Histidin-L-Glutaminsäure-L-Tyrosin-L-Threonin-L-Histidin) beschrieben wird. Zur Stabilisierung der Struktur des Enzyms enthalten die Kollagenasen neben Zink Calcium-Ionen: 1.9 (α-Kollagenase) bis 6.8 (β-Kollagenase) Ionen pro Molekül [van Wart 1998]. Eine Kristallisation einzelner Kollagenasen ist bisher nicht publiziert worden, so dass kaum Aussagen zur Tertiärstruktur gemacht werden können.

Die Clostridium histolyticum Kollagenase kann sowohl natives wasserunlösliches als auch denaturiertes wasserlösliches Kollagen abbauen. Fast alle Kollagen-Typen werden angegriffen, wobei der Abbau von den helikalen Kollagenen Typ I, II und III sehr gut charakterisiert ist [Mookhtiar 1992, van Wart 1998].

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Clostridium histolyticum ist ein grampositives, sporenbildendes Bakterium, das sich nur anaerob kultivieren läßt. Es gehört neben Clostridium perfringens, C. novyi und C. septicum zu den Erregern des Gasbrands / Gasödems. Das Bakterium nutzt die Kollagenasen, zum einen um in den Wirtsorganismus zu gelangen, zum anderen sind die aus dem Abbau des Kollagens entstandenen Peptide Nahrungsgrundlage. Ein alternativer Angriffspunkt hinsichtlich der Abwehr gegenüber infektiven Organismen, könnte die Verhinderung des Einwanderns der Mikroorganismen in den Wirt sein. Näher behandelt wird diese Angriffsmöglichkeit in der Übersicht von Travis et al. [Travis 2000].

Aufgrund struktureller Ähnlichkeiten der Clostridium histolyticum Kollagenase und der Matrix Metalloproteinasen (MMPs) wird in der Literatur auch immer wieder der Modellcharakters der Clostridium histolyticum Kollagenase betont [Scozzafava 2000]. Die Clostridium histolyticum Kollagenase und die Matrix Metalloproteinasen (MMPs) sind multidomäne Zink-enthaltende Proteine, die zur Klasse der Metalloendopeptidasen (EC 3.4.24.x) gehören. Ihr Mechanismus zur Hydrolyse von Proteinen und synthetischen Substraten ist ähnlich und es existieren Inhibitoren (z.B. Hydroxamsäure-Derivate), die sowohl gegenüber der Clostridium histolyticum Kollagenase als auch gegenüber den MMPs aktiv sind [Scozzafava 2000, Kumar 2003]. Es zeigt sich jedoch immer mehr, dass die Unterschiede gegenüber den Gemeinsamkeiten überwiegen [Jung 1999], was allein bei der Vielfalt der MMPs nicht überrascht. Immerhin werden min. 25 Enzyme zur Gruppe der Matrix Metalloproteinasen gerechnet [Lauer-Fields 2002].

Humane neutrophile Elastase (EC 3.4.21.37)

Die humane neutrophile Elastase gehört zur Klasse der Serin-Proteasen (Hydrolasen, Peptidasen: EC 3.4.21.x), hier zur Chymotrypsin Familie (S1). Ältere Bezeichnungen sind humane Leukozyten-Elastase, Granulozyten-Elastase oder Serin-Elastase. Die neutrophile Elastase ist ein 30 kDa Glycoprotein [Baugh 1976], bestehend aus einer einzelnen Peptidkette mit 218 Aminosäuren und 4 Disulfid-Brücken. Das aktive Zentrum setzt sich aus den His-, Asp- und Ser-Resten zusammen [Bode 1989].

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Die humane neutrophile Elastase kommt hauptsächlich in den Azurgranula der segmentkernigen neutrophilen Granulozyten vor. Sie wurde aber auch in der Membran des Zellkerns, im Golgi-Apparat, im endoplasmatischen Retikulum und in den Mitochondrien der neutrophilen Granulozyten nachgewiesen [Bieth 1998].

Neben Elastin baut die humane neutrophile Elastase weitere Skleroproteine ab, z.B. Kollagen Typ I, II, III, IV, VIII, IX, X und XI, Strukturglykoproteine wie Fibronektin und Laminin, sowie Proteoglykane. Weiterhin stimuliert die neutrophile Elastase den Abbau von Proteinen der extrazellulären Matrix auch indirekt. So wurde nachgewiesen, dass sie die MMP-9 und MMP-3 in ihre aktive Form überführen kann [Okada 1989, Delclaux 1996, Ferry 1997]. Für die MMP-2 liegen diesbezüglich widersprüchliche Ergebnisse vor [Okada 1989, Rice 1995]. Weitere physiologische Angriffspunkte für die neutrophile Elastase sind das Immunsystem und das Blutgerinnungssystem [Bieth 1998].

Obwohl sehr umfangreiche Ergebnisse über das Enzym Elastase in der Literatur vorliegen, scheint seine biologische Funktion noch nicht vollständig klar zu sein. Die meisten Erkenntnisse weisen auf Zerstörungen von Gewebe hin. Eine Konzentration von etwa 5mM (!) Enzym in den Azurgranula der neutrophilen Granulozyten wurde geschätzt. Unter normalen Bedingungen werden davon weniger als 2% in den Extrazellularraum sekretiert. Neutrophile Granulozyten sind jedoch in der Lage 12% der Enzymmenge in den Zellmembranen zu lokalisieren, hier soll das Enzym dann auch aktiv aber relativ widerstandsfähig gegenüber Inhibitoren sein. Um eine Zerstörung des körpereigenen Bindegewebes zu verhindern, sind im Körper physiologische Gegenspieler der neutrophilen Elastase, wie das α1-Antitrypsin und das α2-Makroglobulin vorhanden. Das α1-Antitrypsin beispielsweise kommt in sehr großen Mengen im Extrazellularraum vor. Aufgrund der geringen Konzentration an Elastase im Extrazellularraum und der dagegen hohen Konzentration von α1-Antitrypsin könnte man vermuten, dass die bedeutende biologische Funktion der Elastase vor allem im Intrazellularraum ausgeübt wird. Das könnte auf eine antimikrobielle Aktivität hinweisen. Andererseits können große Mengen an Elastase von den Zellen während „frustrated phagocytosis“ und dem sich anschließenden Zelltod freigesetzt werden (falls die Zellen nicht von Makrophagen aufgenommen werden). Sollte die Menge an α1-Antitrypsin dann nicht ausreichen, könnte die Elastase zerstörerisch wirksam werden [Shapiro 2002]. Dies scheint beim Lungenemphysem der Fall zu sein: durch einen Infekt kann es zu einer erhöhten Elastase-Freisetzung kommen. Bei gleichzeitiger Vorschädigung des α1-Antitrypsins (z.B. durch Oxidation mittels Zigarettenrauch) führt dies zu einem Übergewicht an Elastase, die dann die Alveolarwände der Lunge durch Abbau der elastischen Fasern und anderer Matrix-Proteine ungehindert angreifen kann [Bieth 1998].

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Weitere Erkrankungen, bei denen die neutrophile Elastase eine bedeutende Rolle zu spielen scheint, sind die Mukoviszidose (cystische Fibrose), die Schocklunge (ARDS: adult respiratory distress syndrome), die rheumatoide Arthritis und infektiöse Erkrankungen [Bieth 1998].

Nicht zu verwechseln ist die hier besprochene und in der vorliegenden Arbeit verwendete humane neutrophile Elastase (EC 3.4.21.37) mit der Pankreas-Elastase (EC 3.4.21.36) und der Metallo-Elastase (Makrophagen-Elastase, EC 3.4.24.65). Die Enzyme unterscheiden sich hinsichtlich Aufbau und Substratspezifität. Da der verkürzte Name „Elastase“ bei allen drei Enzymen identisch ist, kommt es hier häufig zu Missverständnissen in der Literatur, die vor diesem Hintergrund kritisch auszuwerten ist.

Matrix Metalloproteinase 9 (EC 3.4.24.35)

Die Matrix Metalloproteinase 9 (MMP-9) gehört zur Gruppe der Matrix Metalloproteinasen. Die Matrix Metalloproteinasen werden der Klasse der Metalloendopeptidasen (Hydrolasen, Peptidasen: EC 3.4.24.x) zugeordnet, das Zentralion ist Zink (Zn2+). Ältere Bezeichnungen für die MMP-9 sind Gelatinase B, Gelatinase 92kDa oder 92kDa Typ IV Kollagenase.

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Die MMP-9 kann von Alveolarphagozyten (Makrophagen), neutrophilen und eosinophilen Granulozyten, Keratinozyten und Trophoblasten sezerniert werden [Lee 2001, Westermarck 1999]. Durch Abspaltung eines amino-terminalen Propeptides wird die inaktive 92kDa Proform in die aktive Form überführt. Diese Aktivierung kann durch Serin-Proteasen (z.B. Cathepsin G, Trypsin, humane neutrophile Elastase), durch andere MMPs (z.B. MMP-3) oder in vitro unter Ausschluss von Enzym durch Organo-Quecksilberverbindungen (z.B. APMA) erfolgen. Die entstandene aktive Form der MMP-9 scheint hinsichtlich der Molekülgröße nicht einheitlich zu sein. Die Angaben in der Literatur reichen von 71 bis 88kDa, auch in Abhängigkeit von der Art der Aktivierung [Delclaux 1996, Ferry 1997, Matrisian 1992, Westermarck 1999].

Aktivierte MMP-9 kann in vitro Elastin, Typ IV und Typ V Kollagen in helikalen Domänen und Gelatine (denaturiertes Typ I Kollagen) abbauen aber kein intaktes Typ I Kollagen [Hibbs 1987, Liotta 1979, Senior 1991]. Ein Nachweis für den Abbau in vivo steht jedoch noch aus [Westermarck 1999]. Physiologische Inhibitoren der MMP-9 sind TIMP-1 und TIMP-2 (TIMP: tissue inhibitor of metalloproteinases). Beide können an die aktivierte MMP-9 binden und das Enzym inhibieren. Zusätzlich ist TIMP-1 in der Lage an die 92kDa Proenzym-Form zu binden, wobei die Aktivierung unterbunden wird. Dies hat zur Folge, dass trotz einer großen Anzahl von MMP-9 sekretierenden Zellkulturen, sich die Gewinnung von TIMP-1-freiem Proenzym schwierig gestaltet [Collier 1998].

Die Matrix Metalloproteinase 9 besteht aus mehreren strukturellen Domänen: an das N-terminale Propeptid schließt sich die katalytische Domäne an, in die eine Fibronektin-artige Sequenz inseriert ist. Der zweite Teil der katalytischen Domäne enthält die Zink-Bindungsstelle des aktiven Zentrums. An die katalytische Domäne schließt sich eine Kollagen-artige Domäne an und daran die C-terminale Hämopexin-artige Domäne. Die Fibronektin-artige Domäne ist für die Bindung zu Kollagen nötig, wohingegen die Hämopexin-artige Domäne für die Bildung des Komplexes des Proenzymes mit TIMP-1 erforderlich ist [Collier 1998, Matrisian 1992, Westermarck 1999].

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Die physiologische und pathologische Bedeutung der MMP-9 wird intensiv untersucht, so kann das Enzym bei einer Vielzahl von Entzündungsreaktionen und Tumoren nachgewiesen werden [Collier 1998]. Wegen der Fähigkeit Typ IV Kollagen (der Hauptkomponente der Basalmembran) abzubauen, ist anzunehmen, dass die MMP-9 eine Rolle im Um- und Abbau der Basalmembran spielt. Durch die Basalmembran (ca. 1µm dick) ist das Epithelgewebe mit dem Bindegewebe verbunden und gleichzeitig voneinander abgegrenzt. Das ist insofern von Bedeutung, dass erst nach dem Durchbruch der Basalmembran für die Zellen (Leukozyten, Tumorzellen etc.) Anschluss an die Blut- und Lymphgefäße besteht. Ein kontrollierter Abbau der Basalmembran ist ein Schlüsselschritt bei vielen physiologischen Prozessen, wie z.B. bei der Entwicklung fötaler Gewebe, der Angiogenese, der Wundheilung, dem Knochenumbau oder der Wanderung von Makrophagen und Leukozyten. Einen „pathologischen Abbau“ hingegen findet man bei der Einwanderung von Tumorzellen und der Metastasierung. Das macht die MMP-9 zu einem interessanten Zielobjekt für die Suche nach therapeutischen Wirkstoffen.

Basidiomyceten: Einfluss auf Serin- und Metalloendopeptidasen

Höhere Pilze als potentielle Naturstoffproduzenten sind in den letzten zwei Jahrzehnten verstärkt in das Blickfeld der Forschung aufgenommen worden. Die Auswahl der Arten zur näheren Charakterisierung und pharmakologischen Prüfung erfolgte meist aufgrund der Anwendung entsprechender Pilze in der Volksmedizin, der Verbreitung und ökologischen Bedeutung der Pilze, z. T. aufgrund der Ergebnisse von Screening-Tests und der Übertragung dieser Resultate auf ähnliche physiologische und molekularbiologische Mechanismen. In der Volksmedizin werden und wurden Basidiomyceten bzw. deren Inhaltsstoffe vor allem im osteuropäischen und asiatischen Raum genutzt. Die bei Pilzen häufig gefundene antibakterielle, zytostatische und antivirale Wirksamkeit ist aufgrund der notwendigen Abwehrstrategien zur Sicherung der Existenz der Basidiomyceten nicht überraschend. Aber auch weitere pharmakologische Effekte, wie immunstimulierende, antiallergische und auch hypoglykämische, lipidsenkende und hypotensive Wirkungen zeigten, dass Extrakte bzw. isolierte Substanzen von Basidiomyceten eine potentielle Quelle für neue Arzneistoffe bzw. Leitstrukturen sein können [Lindequist 1990, Wasser 1999]. Häufig bezogen sich die Untersuchungen, meist in Anlehnung an die Volksmedizin, auf ausgewählte Basidiomyceten. Screening-Tests einer größeren Anzahl von Pilzen hinsichtlich einer Wirkung bzw. eines Wirkungsmodells lagen weniger vor bzw. waren nicht veröffentlicht. Dies stellte dann jedoch auch die Spezifität einer Wirkung einzelner Pilze in Frage.

Untersuchungen hinsichtlich einer Beeinflussung der humanen neutrophilen Elastase durch Basidiomyceten-Extrakte bzw. deren Inhaltsstoffe gab es in der Literatur bisher nicht. Hinweise zur Beeinflussung anderer Serin-Proteasen konnten jedoch gefunden werden.

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Pilgrim et al. [Pilgrim 1992] beschrieben eine Hemmung der Aktivität von Trypsin durch wässrige Basidiomyceten-Extrakte. Von den untersuchten Extrakten von 46 Arten wurde bei 8 Extrakten eine hohe Inhibitoraktivität (≥50%) bestimmt. Beim Vergleich der Dosis-Effekt-Kurve des wirksamsten Extraktes [Laccaria proxima (Boud.) Pat.] mit der eines unter gleichen Bedingungen hergestellten Phaseolus vulgaris L. Extraktes konnte festgestellt werden, dass die IC50-Werte eine gleiche Größenordnung besitzen (Laccaria proxima: IC50=2.4mg/ml, Phaseolus vulgaris IC50=1.4mg/ml). Interessant ist die weitergehende Untersuchung der Pilz-Extraktlösungen hinsichtlich des Gerbstoff-Gehaltes. Mit Ausnahme von zwei Extrakten trat keine positive Gerbstoffreaktion auf, es wurde das Vorhandensein von „echten“ Trypsin-Inhibitoren postuliert [Pilgrim 1992].

Doljak et al. [Doljak 2001] untersuchten den Einfluss polarer Extrakte (50% Methanol/Wasser) von Basidiomyceten auf die Aktivität von Thrombin und Trypsin. 3 von 95 getesteten Extrakten hemmten Thrombin unter den angegebenen Bedingungen stark (≥50%) und 3 hatten eine hohe Inhibitoraktivität (≥50%) gegenüber Trypsin. Bei beiden Enzymen war der aktivste Extrakt, der Extrakt von Gleophyllum odoratum (Wulf.:Fr.) Imazeki.

Zum Einfluss von Basidiomyceten-Extrakten auf Metalloendopeptidase-Aktivität lagen Ergebnisse aus der eigenen Arbeitsgruppe vor. Melzig et al. [Melzig 1996] konnten einen hemmenden Effekt von wässrigen Extrakten von Basidiomyceten auf die Aktivität der Neutralen Endopeptidase (NEP) und des angiotensin-converting-enzyme (ACE) nachweisen. 23 von 27 Extrakten hemmten die Aktivität der Metalloendopeptidase NEP, für 5 wurden IC50-Werte von 40-55µg/ml bestimmt. Die Aktivität der Dipeptidylpeptidase ACE wurde von 6 (von 27) Extrakten gehemmt, die IC50-Werte lagen hier zwischen 200-1500µg/ml.

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In der Diplomarbeit von Rennert [Rennert 1998] wurden wässrige und Dichlormethan-Extrakte von 21 Basidiomyceten auf eine Beeinflussung der Kollagenase-Aktivität getestet. In Konzentrationen von 2mg Extrakt pro ml Ansatz zeigten nur 3 der wässrigen Extrakte hemmende Effekte (unbedeutend mit max. 8 bis 14%). Die Dichlormethan-Extrakte hemmten die Aktivität der Kollagenase in Konzentrationen von 200µg Extrakt pro ml Ansatz (mit Ausnahme eines Extraktes). Für 11 der lipophilen Extrakte konnte ein IC50-Wert von unter 200µg/ml bestimmt werden. Als wirksamste Extrakte erwiesen sich die von Heterobasidion annosum (Fr.)Bref., Lactarius deterrimus Grög. und Lentinula edodes (Berk.) Pegler mit IC50-Werten von 80-100µg/ml. Eine Übersicht der Ergebnisse gibt Tab. 1. Die Auswertung der Ergebnisse der Diplomarbeit ließ auf ein Vorkommen von Kollagenase-Inhibitoren in den Dichlormethan-Extrakten schließen. Der Vergleich der erzielten Hemmaktivitäten mit Angaben aus der Literatur zu Kollagenase-hemmenden Verbindungen zeigte, dass die lipophilen Basidiomyceten-Extrakte eine potente Quelle für Kollagenase-Inhibitoren darstellen können [Rennert 1998].

Tab. 1: Einfluss der Dichlormethan-Extrakte von Basidiomyceten auf die Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase

Name des Basidiomyceten

Hemmung der Kollagenase-Aktivität [%] durch DCM-Extrakte

200µg/ml

Agaricaceae Cohn

Macrolepiota rhadoces (Vitt.) Sing.

74.1 R=7.2

Coriolaceae Sing.

Daedaleopsis confragosa (Bolt.:Fr.) Schroet.

43.6 R=15.8

Fomes fomentarius (L.:Fr.) Fr.

20.3 R=1.8

Fomitopsis pinicola (Sow.:Fr.) Karst.

27.5 R=1.1

Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.

55.4 R=12.5

Trametes versicolor (L.:Fr.) Pil.

k.H.

Ganodermataceae Donk

Ganoderma applanatum (Pers.:S.F.Gray) Pat.

37.2 R=1.4

Geastraceae E.Fischer

Geastrum melanocephalum Czern.

47.1 R=2.6

Hymenochaetaceae Donk

Inonotus hispidus (Bull.:Fr.) Karst.

72.5 R=10.0

Inonotus obliquus (Pers.:Fr.) Pil.

k.H.

Pluteaceae Kotl. & Pouz.

Volvariella speciosa (Fr.:Fr.) Sing.

68.4 R=3.6

Polyporaceae CDA.

Lentinula edodes (Berk.) Pegler

80.2 R=6.9

Piptoporus betulinus (Bull.:Fr.) Karst.

33.1 R=0.5

Russulaceae Roze

Lactarius deterrimus Grög.

72.8 R=5.3

Scutigeraceae Bond.&Sing.

Meripilus giganteus (Pers.:Fr.) Karst.

62.4 R=8.8

Phaeolus schweinitzii (Fr.) Pat.

63.8 R=13.3

StrophariaceaeOvereem: Sing & Smith

Pholiota squarrosa (Pers.:Fr.) Kumm.

57.4 R=10.1

Tricholomataceae Roze: Overeem

Collybia dryophila (Bull.:Fr.) Kumm.

28.9 R=15.8

Flammulina velutipes (Curt.:Fr.) Karst.

24.9 R=4.8

Tricholoma populinum LGE.

60.4 R=0.6

Tricholomopsis rutilans (Schiff.:Fr.) Sing.

68.0 R=1.3

aus Rennert 1998: k.H. – keine Hemmung, R – Spannweite, n≥ 3

Problemstellung

In der vorliegenden Arbeit sollte zunächst der Einfluss der wässrigen und Dichlormethan-Extrakte von Basidiomyceten auf die Aktivität der humanen neutrophilen Elastase untersucht werden.

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Nach Auswertung dieses Screenings und der Daten aus den bereits durchgeführten Untersuchungen hinsichtlich einer Beeinflussung der Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase sollte durch aktivitätsgeleitete Fraktionierung von in ihrer Aktivität auffälligen Extrakten der Versuch unternommen werden, die für diese Wirkung verantwortlichen Komponenten zu isolieren und zu identifizieren.

Sollten die für die Wirkung verantwortlichen Naturstoffgruppen identifiziert werden, könnten im Rahmen eines Screenings innerhalb dieser Naturstoffgruppen bestimmte für die Wirkung erforderliche Strukturen näher charakterisiert werden.

Um Aussagen über die Spezifität der Wirkung gegenüber den Enzymen treffen zu können, sollte eine weitere Bindegewebe-abbauende Protease (MMP-9) hinsichtlich einer Beeinflussung durch die identifizierte Naturstoffgruppe untersucht werden.

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Studien zur Zytotoxizität der Basidiomyceten-Extrakte und der gefundenen Naturstoffe sollten erste Hinweise bezüglich einer möglichen therapeutischen Anwendung geben.

Um eine Übertragung der in den biochemischen Experimenten gewonnenen Erkenntnisse auf Zellkultursysteme zu ermöglichen, sollten verschiedene Zelllinien hinsichtlich einer Sekretion von Proteasen und deren Aktivität getestet werden. Erste Versuche zur Hemmung sezernierter Proteasen sollten durchgeführt werden.


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10.11.2006