Untersuchungen und Ergebnisse

Vorversuche und Methodenoptimierung

1.1  Bestimmung der Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase

↓12

Die Bestimmungen wurden entsprechend der Beschreibung unter Exp. Teil ‎3.1.2 durchgeführt. Es wurde jeweils der Parameter geändert, der aus den folgenden Absatzüberschriften hervorgeht.

Einfluss der Substratkonzentration

↓13

Es wurden Versuche mit Substratkonzentrationen von 1.06µM, 2.12µM, 3.18µM, 4.24µM, 6.36µM und 8.47µM im Reaktionsansatz (720mU Kollagenase, 60min Inkubation) durchgeführt. Bei Verwendung der 6.36µM bzw. 8.47µM Substratlösung erwies sich die Konzentration der entstandenen Fragmente als zu hoch für eine Fluoreszenzbestimmung. Mit 1.06µM, 2.12µM, 3.18µM und 4.24µM Lösungen konnten bei einer Enzymmenge, die 720mU entsprach, steigende Fluoreszenzeinheiten bestimmt werden, was auf einen Substratmangel hindeutete. In den folgenden Versuchen musste also die einzusetzende Enzymkonzentration noch gesenkt werden.

Einfluss der Enzymmenge

In Abb. 1 ist beispielhaft die Abhängigkeit der Konzentration der Reaktionsprodukte (dargestellt als Fluoreszenzeinheiten) von der Enzymaktivität im Versuchsansatz dargestellt. Bei Einsatz von 4.24µM Substratlösung und 60min Inkubationsdauer wurden Kollagenasemengen, die folgenden Enzymaktivitäten entsprachen, eingesetzt: 180mU, 360mU, 540mU, 720mU und 900mU. Dem Diagramm war zu entnehmen, dass mit steigender Enzymaktivität auch die Anzahl der Fluoreszenzeinheiten und damit die Konzentration der Reaktionsprodukte stieg. Der Verlauf war jedoch nicht linear, sondern entsprach einer Kurve. Bei höheren Enzymaktivitäten sank die Reaktionsgeschwindigkeit, vermutlich aufgrund eines eintretenden Substratmangels. Um einerseits ausreichend Fluoreszenz zu messen, andererseits aber nicht im Substratmangel zu arbeiten, wurde die anzustrebende Enzymaktivität in der vorliegenden Versuchsreihe auf 360mU festgelegt. Aufgrund der unterschiedlichen Enzymaktivitäten der einzelnen Chargen mussten die einzusetzenden Kollagenasemengen jedoch regelmäßig neu bestimmt werden.

Abb. 1: Abhängigkeit der Zahl der Fluoreszenzeinheiten von der enzymatischen Aktivität im Kollagenase-Assay

n≥ 3, Mittelwert ±SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.1.2: 4.24µM Substrat, 60min Inkubation

Einfluss der Inkubationsdauer

↓14

Für die Ermittlung einer optimalen Versuchsdauer wurden die Proben 15, 30, 45, 60, 90, 120 und 180min inkubiert. Mit zunehmender Inkubationsdauer (bis 120min) stieg die Fluoreszenz und somit auch die Konzentration der entstandenen Reaktionsprodukte (s. Abb. 2). Da die Darstellung der Werte im Diagramm einer Kurve entsprach, musste man annehmen, dass die Reaktionsgeschwindigkeit mit zunehmender Inkubationszeit sank (wahrscheinlich aufgrund von Substratmangel). Um einerseits ausreichend messbare Konzentrationen des Reaktionsproduktes zu erhalten, andererseits jedoch nicht mit Substratmangel zu arbeiten, wurde die Inkubationsdauer auf 60min festgelegt.

Abb. 2: Abhängigkeit der Zahl der Fluoreszenzeinheiten von der Inkubationsdauer im Kollagenase-Assay

n≥ 2, Streuung - R, Methode s. Exp. Teil ‎3.1.2: 4.24µM Substrat, 360mU Kollagenase

Einfluss von EDTA und 1.10-Phenanthrolin

Als Positivkontrolle für die Kollagenase wurden die für Metalloendopeptidasen unspezifisch inhibitorisch wirksamen Verbindungen EDTA und 1.10-Phenanthrolin verwendet. Für EDTA wurde bei einer Konzentration von 10µM eine 99.5%ige Hemmung bestimmt (SD=1.53, n=4), die IC50 lag bei 3.6µM. Für 1.10-Phenanthrolin konnte bei einer Konzentration von 1mM eine 95.1%ige Hemmung (SD=1.63, n=3) errechnet werden, die IC50 lag bei 49.4µM.

Einfluss von DMSO

↓15

Um den Großteil der getesteten Extrakte, Fraktionen und Substanzen in Lösung zu bringen, musste mit DMSO als Lösungsvermittler gearbeitet werden. Den Einfluss von DMSO auf die Enzymaktivität zeigt Tab. 2:

Tab. 2: Einfluss von DMSO auf die Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase

Konzentration DMSO [% (V/V)]

Relative Enzymaktivität [%]

0.0

100.0 SD=3.31

0.5

94.0 SD=1.79

1.0

90.7 SD=3.97

2.0

83.7 SD=8.14

5.0

62.2 SD=18.13

n = 3, Streuung - SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.1.2: 4.24µM Substrat, 360mU Kollagenase

DMSO beeinflusste die Aktivität der Kollagenase konzentrationsabhängig. Aufgrund der geringen Löslichkeit der untersuchten Substanzen musste jedoch mit (max.) 1%igen DMSO-Konzentrationen in den Versuchen gearbeitet werden. Eine Kontrolle für die jeweilige DMSO-Konzentration wurde in jeder Versuchsreihe mitgeführt.

Vergleich der Substrate

↓16

In der Diplomarbeit [Rennert 1998] wurde zur Bestimmung der Kollagenase-Aktivität mit einem synthetischen Peptid als Substrat gearbeitet. Da die Durchführung der Methode unter Verwendung des synthetischen Peptids erheblich aufwendiger war, als die Methode unter Verwendung des Resorufin-markierten Caseins, wurde die Bestimmung mit Hilfe des Caseins in der vorliegenden Arbeit durchgeführt. Ein weiteres Argument für die Verwendung des Caseins war die Tatsache, dass Casein als Substrat näher an die physiologischen Verhältnisse anknüpfte als ein synthetisches Peptid. Um Rückschlüsse auf eine Vergleichbarkeit beider Methoden ziehen zu können, wurden die in der Diplomarbeit hergestellten DCM-Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref., Lactarius deterrimus Grög. und Lentinula edodes (Berk.) Pegler, sowie die Positivkontrolle EDTA auf eine Beeinflussung der Aktivität der Kollagenase mit Hilfe beider Bestimmungsmethoden (s. Exp. Teil ‎3.1.1 und Exp. Teil ‎3.1.2) getestet (Tab. 3):

Tab. 3: Vergleich der Methoden zur Bestimmung der Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase

Konzentration Testsubstanz

Rel. Enzymaktivität
(Pz-peptid)

Rel. Enzymaktivität
(Casein)

1µM EDTA

95.6 R=6.1, n=3

90.4 R=5.5, n=4

10µM EDTA

90.5 R=7.3, n=3

-1.0 R=4.4, n=4

100µM EDTA

8.2 R=0.9, n=3

0.0 R=0.4, n=2

200µg/ml DCM-Extrakt H. annosum

55.4 R=12.5, n=3

21.6 R=2.7, n=2

200µg/ml DCM-Extrakt L. deterrimus

72.8 R=5.3, n=3

21.3 R=0.1, n=2

200µg/ml DCM-Extrakt L. edodes

80.2 R=6.9, n=3

71.7 R=6.1, n=2

Streuung - R, Methode s. Exp. Teil ‎3.1.1 und ‎3.1.2

Es zeigte sich, dass qualitativ gleiche Ergebnisse mit beiden Bestimmungsmethoden erhalten wurden. Da es innerhalb der Bestimmungsmethoden zum Einsatz unterschiedlicher Mengen Kollagenase (Pz-peptid: 1.44U bzw. Casein: 0.36U) kam, waren die quantitativen Unterschiede in den Hemmaktivitäten jedoch zu erwarten.

1.2 Bestimmung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase

↓17

Die Bestimmungen wurden entsprechend der Beschreibung unter Exp. Teil ‎3.2 durchgeführt. Es wurde jeweils der Parameter geändert, der aus den folgenden Absatzüberschriften hervorgeht.

Einfluss der Substratkonzentration

Folgende Substratkonzentrationen wurden getestet: 58.3µM, 116.7µM, 233.3µM, 291.7µM und 583.3µM. Bei der Darstellung der Werte der Substratkonzentration gegen die Werte der Absorption erhielt man eine Kurve (Abb. 3). In niedrigen Substratkonzentrationen (58.3µM, 116.7µM und u.U. auch 233.3µM Substratlösung) war die Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratmenge abhängig, der Umsatz zu p-Nitroanilin war proportional zur Substratmenge. Erst ab Substratkonzentrationen von über 233.3µM Substratlösung war eine weitere Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit nicht mehr festzustellen, das Enzym schien mit Substrat gesättigt, die Kurve flachte ab. Es wurde in allen weiteren Versuchen mit einer Substratkonzentration von 291.7µM gearbeitet.

Abb. 3: Abhängigkeit der Absorption von der Substratkonzentration im Elastase-Assay

n≥ 3, Mittelwert ±SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.2: 2.5mU Elastase, 60min Inkubation

Einfluss der Enzymmenge

↓18

Die einzusetzende Enzymmenge musste für jede Charge des Enzyms neu bestimmt werden. In Abb. 4 ist die Abhängigkeit der Elastasemenge (dargestellt als enzymatische Aktivität) von der umgesetzten Substratmenge (dargestellt als Absorption) beispielhaft gezeigt:

Abb. 4: Abhängigkeit der Absorption von der enzymatischen Aktivität im Elastase-Assay

n≥ 2, Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.2: 291.7µM Substrat, 60min Inkubation

Der Abbildung war zu entnehmen, dass mit steigender Enzymmenge die Menge freigesetztes p-Nitroanilin stieg. Es schien kein Substratmangel bei den eingesetzten Enzymmengen vorzuliegen. Für die nachfolgenden Untersuchungen wurde bei dieser Enzym-Charge die Enzymmenge gewählt, die 2.5mU Aktivität entsprach.

Einfluss von Elastatinal

↓19

Elastatinal als spezifischer (wenn auch wenig potenter) Inhibitor der humanen neutrophilen Elastase wurde in dieser Arbeit als Positivkontrolle verwendet. In Konzentrationen von 970µM wurde eine Hemmung von 63.1% bestimmt (SD=2.04, n=3).

Einfluss von DMSO

Es wurden folgende Konzentrationen von DMSO im Reaktionsansatz getestet (Tab. 4):

Tab. 4: Einfluss von DMSO auf die Aktivität der humanen neutrophilen Elastase

Konzentration DMSO [% (V/V)]

Relative Enzymaktivität [%]

0.0

100.0 SD=3.22

0.5

93.0 SD=1.99

1.0

100.0 SD=1.27

2.0

96.3 SD=5.19

5.0

84.0 SD=13.48

n = 3, Streuung - SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.2: 291.7µM Substrat, 2.5mU Elastase

↓20

Um den Großteil der getesteten Extrakte und Substanzen in Lösung zu bringen, wurde DMSO verwendet. In Konzentrationen von max. 1% war der Einfluss des DMSO auf die Elastase-Aktivität vernachlässigbar (s. rel. Enzymaktivität und SD), so dass diese Menge als Lösungsvermittler eingesetzt werden konnte. Auch hier wurden jedoch bei allen Versuchsreihen DMSO-Kontrollen mitgeführt.

1.3 Bestimmung der Aktivität der Matrix-Metalloproteinase 9

Die Bestimmungen wurden entsprechend der Beschreibung unter Exp. Teil ‎3.3 durchgeführt. Es wurde jeweils der Parameter geändert, der aus den folgenden Absatzüberschriften hervorgeht.

Überprüfung des Enzyms auf weitere Proteasenaktivität

Da das Enzym ohne weitere Aufreinigung eingesetzt wurde, es sich beim verwendeten Substrat aber um ein unspezifisches Proteasensubstrat handelte, musste ein Abbau des Substrates durch andere Proteasen ausgeschlossen werden. Ohne Zusatz von APMA bzw. von Trypsin war keine Protease-Aktivität nachzuweisen, d.h. in der Enzymlösung waren keine das Ergebnis beeinflussenden Proteasen vorhanden, die ohne Aktivierung durch APMA bzw. Trypsin das Substrat abbauen konnten.

Bestimmung der einzusetzenden Enzymmenge

↓21

Es wurden 2.5µl (250µU) und 5µl (500µU) Enzymlösung mit APMA für jeweils 30min versetzt. Nach der Aktivierung wurde die Enzymlösung für 4h mit dem Substrat inkubiert. Bei der anschließenden Messung der Fluoreszenzeinheiten konnte festgestellt werden, dass unter Einsatz von 500µU MMP-9 mehr Substrat umgesetzt wurde als unter Einsatz von 250µU. Da der Substratabbau unter 250µU Enzym jedoch ausreichend stark war (d.h. ausreichend Fluoreszenzeinheiten - 200 - bestimmbar waren), wurde mit Blick auf die Kosten in den folgenden Versuchen immer mit 250µU MMP-9 gearbeitet. Die Bestimmung ist in Tab. 5 zusammengefasst:

Tab. 5: Einfluss unterschiedlicher Enzymaktivitäten auf die Bestimmungsmethode der MMP-9

Enzymaktivität [µU]

Relative Fluoreszenz [%]

250

100.0 R=2.4

500

154.0 R=3.2

n = 2, Streuung - R, Methode s. Exp. Teil ‎3.3: 4.24µM Substrat, 4h Inkubation

Aktivierung von MMP-9 durch APMA

Um zu gewährleisten, dass die Dauer der MMP-9-Aktivierung durch APMA ausreichend war, wurde für 30 und 60min mit APMA inkubiert. Es war kein Unterschied in der Enzymaktivität bezüglich der Inkubationsdauer festzustellen, so dass die Aktivierungsdauer auf 30min festgelegt wurde (Tab. 6):

↓22

Tab. 6: Einfluss der Aktivierungsdauer (APMA) auf die MMP-9-Aktivität

Aktivierungsdauer [min]

Relative Enzymaktivität [%]

30

100.0 R=2.4

60

98.9 R=4.4

n = 2, Streuung - R, Methode s. Exp. Teil ‎3.3: 4.24µM Substrat, 250µU MMP-9, 4h Inkubation

Aktivierung von MMP-9 durch Trypsin

Aufgrund der von der Firma vorgeschlagenen Bestimmungsmethode für die Aktivität der MMP-9 [Roche 1999], wurde als möglicher enzymatischer Aktivator auch die Serinprotease Trypsin (EC 3.4.21.4) untersucht. Da in der vorliegenden Arbeit mit einem universell einsetzbaren (und damit abbaubaren) Proteasensubstrat gearbeitet wurde, musste die Trypsinaktivität nach der Aktivierung des Enzyms gehemmt werden. Dazu wurde der Trypsin-Inhibitor verwendet (s. auch Exp. Teil ‎3.2). Nach Aktivierung der MMP-9 mit APMA konnte eine größere Enzymaktivität bestimmt werden als unter Verwendung des Trypsins (Tab. 7).

Tab. 7: Vergleich der Aktivierung der MMP-9 durch APMA und Trypsin

Aktivator

Relative Enzymaktivität

APMA

100.0 R=7.4

Trypsin

65.8 R=5.8

n = 2, Streuung - R, Methode s. Exp. Teil ‎3.3: 4.24µM Substrat, 250µU MMP-9, 4h Inkubation

↓23

Da die Verwendung eines zweiten Enzyms innerhalb der Bestimmungsmethode nicht als günstig angesehen wurde und die MMP-9-Aktivität unter APMA-Behandlung größer war, wurde die Aktivierung mit APMA der Aktivierung mit Trypsin vorgezogen.

Einfluss von DMSO

Folgende Konzentrationen DMSO im Reaktionsansatz wurden getestet (Tab. 8):

Tab. 8: Einfluss von DMSO auf die Aktivität der Matrix-Metalloproteinase 9

Konzentration DMSO [% (V/V)]

Relative Enzymaktivität [%]

0.0

100.0 R=11.4

0.1

99.5 R=0.9

0.5

85.2 R=3.7

1.0

77.2 R=4.7

n = 2, Streuung - R, Methode s. Exp. Teil ‎3.3: 4.24µM Substrat, 250µU MMP-9, 4h Inkubation

↓24

DMSO als Lösungsmittel hemmte die Enzymaktivität konzentrationsabhängig. Bei Konzentrationen von 1% DMSO wurde eine Beeinflussung der MMP-9-Aktivität von 20-25% bestimmt. Erst in Konzentrationen von unter 0.5% konnte von einer geringen Beeinflussung der Enzymaktivität ausgegangen werden. Dies war für die weitergehenden Versuche problematisch, da die zu testenden Substanzen sich begrenzt in DMSO lösten und durch eine Verdünnung auf 0.5% die einsetzbaren Konzentrationen limitiert wurden. Auch hier wurden entsprechende DMSO-Kontrollen bei allen Versuchsreihen mitgeführt.

1.4 Bestimmung der Zytotoxizität

Für die Bestimmung der Anzahl lebender Zellen wurde der MTT-Test verwendet. Die Versuchsdurchführung erfolgte entsprechend der Beschreibung unter Exp. Teil ‎3.6 unter Einsatz der für die Zytotoxizitätsuntersuchungen genutzten ECV-304 – Zellen. Es wurde jeweils der Parameter geändert, der aus den folgenden Absatzüberschriften hervorgeht.

Einfluss der Inkubationsdauer von MTT

Um zu gewährleisten, dass einerseits die Zeit für eine Umsetzung des MTT ausreichend, andererseits das eingesetzte MTT selbst aber noch nicht toxisch bzw. proliferationshemmend auf die Zellen wirkte, wurden Versuche hinsichtlich des Einflusses der Inkubationsdauer des MTT mit den Zellen durchgeführt. Dazu wurden 100µg MTT [entsprechend 20µl einer MTT-Lösung (5mg/ml PBS-Puffer, m/V)] pro Kavität eingesetzt und es wurde für 1, 2, 3 und 4 Stunden mit MTT inkubiert. Die Absorption nach 2 Stunden wurde 100% gesetzt und daraus die relativen Absorptionen nach 1, 3 bzw. 4 Stunden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tab. 9 dargestellt:

↓25

Tab. 9: Vergleich der Inkubationsdauer von MTT im Zytotoxizitätstest

Inkubationsdauer MTT [h]

Relative Absorptionen [%]

1

72.4 SD=4.58

2

100.0 SD=6.27

3

109.2 SD=9.49

4

107.7 SD=4.13

n = 4, Streuung - SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.6: 100µg MTT / 220µl Medium

Es zeigte sich, dass die Absorption nach 3 und 4 Stunden Inkubationsdauer gegenüber 2 Stunden nicht signifikant zunahm. Das konnte einerseits bedeuten, dass nach 2 Stunden sich das Gleichgewicht zwischen MTT und Formazan eingestellt hatte, andererseits konnte es aber auch auf einen Substratmangel an MTT hinweisen. Aufgrund dieser Überlegung wurde anschließend mit unterschiedlichen Mengen MTT inkubiert.

Einfluss der MTT-Konzentration

Die Durchführung erfolgte in Anlehnung an die Bestimmung des Einflusses der Inkubationsdauer von MTT. Es wurden hier 50, 100 bzw. 150µg MTT [entsprechend 10, 20 bzw. 30µl einer MTT-Lösung (5mg/ml PBS-Puffer, m/V)] pro Kavität zugegeben und wieder die Absorption nach 1, 2, 3 und 4 Stunden bestimmt. In Tab. 10 wurden die relativen Absorptionen von 50 und 150µg MTT gegenüber der Absorption bei Inkubation mit 100µg MTT (diese Absorption wurde 100% gesetzt) betrachtet:

↓26

Tab. 10: Vergleich des Einflusses unterschiedlicher Mengen MTT im Zytotoxizitätstest

Inkubationsdauer MTT [h]

Relative Absorption [%] gegenüber 100µg MTT bei

50 µg MTT

150 µg MTT

1

67.0 R=5.6, n=3

103.3 R=5.4, n=2

2

82.4 R=5.0, n=3

102.2 R=4.1, n=2

3

84.4 R=3.2, n=4

101.3 R=2.5, n=2

4

87.2 R=15.2, n=4

103.5 R=3.1, n=2

Streuung - R, Methode s. Exp. Teil ‎3.6

Beim Einsatz von 50µg MTT wurde eine signifikant geringere Absorption gemessen als beim Einsatz von 100µg. Beim Vergleich der Inkubationszeiten (50µg MTT) fiel auf, dass es nach 2 Stunden zu keiner signifikanten Zunahme der Absorptionen kam (wenn es auch einen leichten Trend gab). Das entsprach dem Ergebnis der unterschiedlichen Inkubationszeiten bei 100µg MTT. Beim Einsatz von 150µg MTT wurde keine Zunahme der Absorption gegenüber 100µg MTT bestimmt.

Man konnte davon ausgehen, dass der Einsatz von 150µg MTT keinen Vorteil gegenüber dem Einsatz von 100µg hat. Als Nachteil muss jedoch der größere MTT-Verbrauch genannt werden. Für den Einsatz von 50µg MTT spräche der geringe Materialverbrauch, allerdings konnte mit diesen Versuche nicht gezeigt werden, ob die Nicht-Zunahme der Absorption nach 3 bzw. 4 Stunden gegenüber 2 Stunden auf einem Substratmangel beruhte oder nicht. Die absoluten Absorptionswerte nach 1 Stunde Inkubation mit 50µg erschienen gering, so dass für alle folgenden Zytotoxizitätsuntersuchungen mit einer Menge von 100µg MTT [entsprechend 20µl MTT-Lösung (5mg/ml PBS-Puffer, m/V)] und einer Inkubationszeit mit MTT von 2 Stunden gearbeitet wurde.

↓27

Auf weitere Vorversuche wurde verzichtet, da es sich hier um eine etablierte Bestimmungsmethode handelte.

Einfluss von DMSO

Da der Großteil der zu untersuchenden Substanzen sehr unpolar und somit nicht im wässrigen Medium in ausreichender Menge löslich war, wurde als Lösungsvermittler DMSO eingesetzt. Um zytotoxische bzw. proliferationshemmende Effekte des Lösungsmittels von denen der Substanzen abgrenzen zu können, wurde der alleinige Einfluss von DMSO auf die Zellen getestet. Es wurde auch hier unter Verwendung von ECV-304 – Zellen gearbeitet, die Bestimmung wurde entsprechend Exp. Teil: ‎3.6 durchgeführt.

Tab. 11: Einfluss von DMSO auf die Zellzahl (MTT-Test)

Konzentration DMSO [% (V/V)]

Relative Zellzahl [%]

0.00

100.0 SD=10.03

0.10

95.5 SD=2.50

0.50

77.9 SD=3.33

0.75

66.4 SD=3.48

1.00

52.8 SD=4.89

n = 3, Streuung - SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.6: 100µg MTT / 220µl Medium, 2h Inkubation

↓28

Bei Endkonzentrationen von 0.5% DMSO traten bereits nachweisbare zytotoxische bzw. proliferationshemmende Effekte auf. Die Zellzahl verringerte sich um 20-25% gegenüber der Kontrolle, die kein DMSO enthielt. Erst bei Konzentrationen von 0.1% DMSO konnte man von geringen Schädigungen ausgehen. Dies stellte im Vergleich zu den Enzymassays (Kollagenase, Elastase: hier waren DMSO-Konzentrationen von 1% tolerierbar) ein Problem dar, da durch den begrenzten Einsatz des DMSO auch die Löslichkeit der Substanzen und damit deren einsetzbare Konzentrationen eingeschränkt wurden.

Screening von Basidiomyceten-Extrakten: Beeinflussung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase

Die wässrigen und Dichlormethan-Extrakte von 15 Basidiomyceten aus 7 Familien wurden hinsichtlich einer Beeinflussung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase getestet. Die Bestimmung erfolgte unter Verwendung des isolierten Enzyms und eines synthetischen Peptids als Substrat (s. Exp. Teil: ‎3.2.).

Alle wässrigen Extrakte hemmten die Elastase-Aktivität in Konzentrationen von 200µg/ml um 40-90%. Fünf der Extrakte wiesen einen IC50-Wert zwischen 2-20µg/ml auf.

↓29

11 der Dichlormethan-Extrakte hemmten in Konzentrationen von 2µg/ml die Enzymaktivität um 40-97%. Bei sechs dieser Extrakte konnten auch bei Konzentrationen von 200ng/ml Elastase-Hemmungen im Bereich von 20-55% nachgewiesen werden. Auffällig war, dass die Dosis-Effekt-Kurve beim Großteil der Dichlormethan-Extrakte sehr steil zu verlaufen schien: so fand man bei Konzentrationen von 2µg/ml 90%ige Hemmung, bei 200ng/ml jedoch keine Aktivitätsbeeinflussung mehr.

Es war festzustellen, dass die Dichlormethan-Extrakte in geringeren Konzentrationen als die wässrigen Extrakte die Aktivität der Elastase hemmten. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse des Screenings vom Basidiomyceten-Extrakten hinsichtlich einer Beeinflussung der Elastase-Aktivität gibt Tab. 12.

Für die Isolierung des wirksamen Prinzips sowohl der Kollagenase- als auch der Elastase-Hemmung wurden die Dichlormethan-Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög. ausgewählt. Beide Extrakte zeigten sowohl eine starke Kollagenase- (s. Tab. 1) als auch eine starke Elastase-Beeinflussung (s. Tab. 12).

↓30

Tab. 12: Einfluss der Basidiomyceten-Extrakte auf die Aktivität der humanen neutrophilen Elastase

Hemmung der Elastase-Aktivität [%] durch

DCM-Extrakte

Wässrige Extrakte

2µg/ml

200ng/ml

200µg/ml

20µg/ml

2µg/ml

Coriolaceae Sing.

Fomes fomentarius (L.:Fr.) Fr.

56.4 R=21.7

24.9 R=5.4

83.6 R=0.9

62.9 R=0.3

k.H.

Fomitopsis pinicola (Sow.:Fr.) Karst.

96.9 R=0.1

k.H.

63.9 R=7.9

33.7 R=20.2

Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.

95.2 R=2.9

55.9 R=30.0

80.4 R=3.8

37.3 R=22.9

Trametes versicolor (L.:Fr.) Pil.

89.1 R=3.9

k.H.

46.0 R=17.5

55.5 R=6.1

39.0 R=8.7

Ganodermataceae Donk

Ganoderma applanatum (Pers.:S.F.Gray) Pat.

86.0 R=6.7

k.H.

42.2 R=21.0

21.4 R=9.7

Hymenochaetaceae Donk

Inonotus hispidus (Bull.:Fr.) Karst.

92.0 R=5.9

32.2 R=23.2

53.6 R=11.2

19.8 R=1.0

Inonotus obliquus (Pers.:Fr.) Pil.

84.3 R=9.3

22.5 R=1.9

52.9 R=7.8

49.0 R=21.3

29.4 R=12.5

Polyporaceae CDA.

Lentinula edodes (Berk.) Pegler

k.H.

k.H.

41.5 R=3.1

k.H.

Piptoporus betulinus (Bull.:Fr.) Karst.

96.3 R=2.5

39.2 R=17.9

61.5 R=3.4

k.H.

Russulaceae Roze

Lactarius deterrimus Grög.

93.8 R=4.0

35.2 R=0.1

84.2 R=2.6

46.5 R=17.0

Scutigeraceae Bond.&Sing.

Phaeolus schweinitzii (Fr.) Pat.

42.5 R=2.7

k.H.

44.6 R=8.6

k.H.

Tricholomataceae Roze: Overeem

Collybia dryophila (Bull.:Fr.) Kumm.

k.H.

k.H.

85.5 R=3.1

59.7 R=13.1

Flammulina velutipes (Curt.:Fr.) Karst.

k.H.

k.H.

65.3 R=3.3

30.7 R=0.7

Tricholoma populinum Lge.

91.1 R=1.4

k.H.

86.7 R=4.6

58.2 R=23.8

k.H.

Tricholomopsis rutilans (Schiff.:Fr.) Sing.

k.H.

k.H.

90.1 R=2.6

64.7 R=4.7

27.9 R=1.0

k.H. – keine Hemmung, R – Spannweite, n≥ 3, Methode s. Exp.Teil ‎3.2

Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög.: Botanik, Inhaltsstoffe und Bedeutung

3.1  Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.

Abb. 5: Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. [Mykonet 2003]

↓31

Wissenschaftlicher Name:

Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.

Früherer wissenschaftlicher Name:

Fomes annosus (Fr.) Cooke,
Fomitopsis annosa (Fr.) Karst.

Deutsche Bezeichnung:

Wurzelschwamm,
Rotfäule der Fichte

Familie:

Coriolaceae Sing.

Ordnung:

Poriales Loqu.

Unterklasse:

Hymenomycetidae (Fr.) Kreisel

Klasse:

Basidiomycetes Sachs: Winter

[Rothmaler 1984]

Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. ist ein Fäulnis verursachender Pilz. Er kommt hauptsächlich in Fichtenbeständen [Picea abies (L.) Karst.] aber auch an anderen Nadelbäumen, sehr selten auch an Laubbäumen vor. Man findet ihn ganzjährig und er ist in Mitteleuropa weit verbreitet. H. annosum lebt parasitisch in den Wurzeln (deutsche Bezeichnung: „Wurzelschwamm“) und im unteren Stammbereich lebender Bäume, man findet ihn aber auch an toten Stämmen und Stubben. Er ist ein holzzerstörender Pilz, der das Holz durch Weißfäule abbaut. Die Weißfäule ist gekennzeichnet durch den Abbau von Lignin und Cellulose. Meist erscheint das Holz dann hell, durch den Abbau und die Abgabe von Sekundärstoffen kann es jedoch auch eine rotbraune Färbung annehmen. Durch die Fäule wird die Festigkeit des Holzes stark beeinträchtigt, es kann bis zur vollständigen Verwertung des Holzes kommen. Aufgrund seiner intensiven Weißfäuleaktivität und des damit verbundenen beträchtlichen wirtschaftlichen Schadens ist der Pilz im Forst gefürchtet [Rothmaler 1984, Maifeld 1998].

Untersuchungen von Heterobasidion annosum standen meist unter dem forstpathologischen Blickpunkt: Isolierung von für den Abbau verantwortlichen Enzymen, biologische Behandlung von Stümpfe und Wurzeln zur Verhinderung des Eindringens von H. annosum usw. Als Inhaltsstoffe wurden aus Monokulturen (z.T. auch aus Dualkulturen) das Sesquiterpen Fomannosin [Kepler 1967], Dihydrobenzofurane [Hirotani 1977, Donnelly 1988], z.B. Fomannoxin, und Benzofurane [Donnelly 1988] sowie Cyclopentabenzopyrane [Donnelly 1982, Sonnenbichler 1983], z.B. Fomajorin D und Fomajorin S isoliert. Fomannoxin konnte auch in von H. annosum natürlich befallenem Fichten-Kernholz nachgewiesen werden [Heslin 1983]. Weiterhin lagen Untersuchungen zum Fettsäure- und Sterolprofil vor [Müller 1994]. Ein Hinweis auf eine medizinische Verwendung des H. annosum konnte nicht gefunden werden.

3.2  Lactarius deterrimus Grög.

↓32

Abb. 6: Lactarius deterrimus Grög. [Mykonet 2003]

Wissenschaftlicher Name:

Lactarius deterrimus Grög.

Frühere wissenschaftliche Namen:

Lactarius deliciosus var. piceiVassilk.

Deutsche Bezeichnung:

Fichten-Milchling

Familie:

Russulaceae Roze

Ordnung:

Russulales Kreisel

Unterklasse:

Hymenomycetidae (Fr.) Kreisel

Klasse:

Basidiomycetes Sachs: Winter

[Rothmaler 1984]

Lactarius deterrimus Grög. ist ein in Fichtenwäldern [Picea abies (L.) Karst.], besonders auf kalkhaltigen Böden vorkommender Milchling. Er ist nicht selten und die Fruchtkörper können vor allem von August bis Oktober gefunden werden. Da er als kaum genießbar gilt, wird er auch dementsprechend wenig verwendet. Die Unterscheidung von anderen Milchlingen [L. sanguifluus (Paulet ex Fr.) Fr., L. semisanguifluus Heim & Lecl. sens. Grög., L. deliciosus (L. ex Fr.) S.F. Gray, L. salmonicolor Heim & Lecl.] ist nicht einfach, neben der makroskopischen und mikroskopischen Untersuchung wird hier der Standort (obligat: unter Fichten) sowie das Aussehen und der Geschmack des Milchsaftes (Aussehen: nach Anschneiden karottenrot, nach 2-3 Stunden weinrot, Geschmack: bitter bis schwach brennend) herangezogen [Rothmaler 1984].

↓33

Zu L. deterrimus lagen wenige phytochemische Untersuchungen vor. So wurden Sesquiterpene vom Guajan-Typ [Anke 1989, Bergendorff 1988], ein Azulen-Derivat (11,12-Dihydrolactaroviolin) [Koul 1985] und ein Lektin [Giollant 1993] isoliert. In Kultur konnten Indolderivate nachgewiesen werden [Kohlmunzer 2000]. Weitergehende Untersuchungen zum Vorkommen von Sesquiterpenen, freien Fettsäuren und Estern von Sesquiterpenen und Fettsäuren zeigten, dass bei nicht bzw. wenig zerstörten Fruchtkörpern Ester isoliert werden konnten. Bei Zerkleinerung der Fruchtkörper hingegen wurden diese Ester abgebaut und es waren strukturell veränderte Sesquiterpene und freie Fettsäuren nachweisbar [Bergendorff 1988].

Hinweise auf medizinische oder volksmedizinische Anwendungen für L. deterrimus und allgemein Lactarius-Arten konnten nicht gefunden werden. In vitro Untersuchungen von in Lactarius-Arten häufig gefundenen Sesquiterpen-Derivaten hinsichtlich mutagener, antimikrobieller und zytotoxischer Effekte lagen jedoch vor [Anke 1989, Anke 1991].

Isolation und Charakterisierung von Verbindungen mit Wirkung auf die Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase und der humanen neutrophilen Elastase

4.1  Einfluss der Extrakte auf die Enzymaktivität

Die hergestellten Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög. wurden vor Beginn einer weiteren Aufarbeitung hinsichtlich einer Beeinflussung der Kollagenase- und Elastase-Aktivität getestet (Tab. 13).

↓34

Tab. 13: Einfluss der Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög. auf die Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase und der humanen neutrophilen Elastase

Kollagenase-Hemmung [%]

Elastase-Hemmung [%]

200µg/ml

20µg/ml

20µg/ml

2µg/ml

Heterobasidion annosum

PE-Extrakt

91.8 R=0.1

70.5 R=1.9

91.2 R=1.7

70.2 R=2.8

DCM-Extrakt

79.1 R=8.1

k.H.

97.3 R=0.6

87.5 R=1.9

DCM-H2O-Extrakt

k.H.

24.9 R=16.0

H2O-Extrakt

k.H.

24.0 R=12.5

Lactarius deterrimus

PE-Extrakt

91.5 R=1.0

48.2 R=7.2

92.0 R=7.2

19.9 R=13.4

DCM-Extrakt

70.7 R=4.9

k.H.

96.8 R=1.4

46.7 R=5.5

DCM-H2O-Extrakt

k.H.

56.5 R=8.1

k.H.

MetOH-Extrakt

k.H.

55.0 R=2.3

k.H.

H2O-Extrakt

k.H.

k.H.

k.H. – keine Hemmung, n≥ 2, Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.1.2, Exp. Teil ‎3.2

Als aktivster Extrakt für die Kollagenase erwies sich bei beiden Pilzen der Petrolether-Extrakt. Die Aktivität der Elastase wurde durch die Dichlormethan-Extrakte (beider Pilze) am stärksten gehemmt. Da der Dichlormethan-Extrakt beider Pilze sowohl eine inhibitorisch starke Wirkung gegenüber der Kollagenase als auch gegenüber der Elastase hatte, wurde dieser Extrakt bei beiden Pilzen weiter aufgearbeitet.

4.2 Aktivitätsgeleitete Fraktionierung der Dichlormethan-Extrakte

Da das Ziel der vorliegenden Arbeit eine aktivitätsgeleitete Fraktionierung der zu untersuchenden Extrakte war, wich die Auftrennung der Extrakte von der klassischen Separation ab. Die Eignung eines Trennsystems zeigte sich darin, dass bei dessen Verwendung eine möglichst große Zahl an Banden bei DC-Untersuchungen und Probesäulen sichtbar wurde (UV 254nm bzw. UV 366nm) bzw. detektierbar (Schwefelsäure 10%) war. Nach der Trennung wurden Fraktionen mit gleichen phytochemischen Eigenschaften wieder vereinigt und die so erhaltenen Fraktionen hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber Kollagenase und Elastase getestet.

Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.

↓35

Der Dichlormethan-Extrakt von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. wurde an silanisiertem Kieselgel mit dem FM A chromatographiert. Die Chromatographie ergab 13 Fraktionen (Fraktionen A-M). Kollagenase-hemmende Effekte konnten in den Fraktionen E-H nachgewiesen werden, wobei der stärkste Effekt (Hemmung von 93 bzw. 89% bei Konzentrationen von 200µg / ml Ansatz) in den Fraktionen E und F auftrat (s. Abb. 7). Bei der Testung auf die Aktivität der Elastase musste festgestellt werden, dass ein Hemmeffekt in den Fraktionen B-M auftrat, wobei die stärksten Effekte (Hemmung von 84 bis 93% in Konzentrationen von 2µg / ml Ansatz) in den Fraktionen G-L auftraten (s. Abb. 8).

Abb. 7: Clostridium histolyticum Kollagenase: Einfluss der Fraktionen A-M (Säule 1) aus dem DCM-Extrakt von H. annosum (Konzentration: 200µg/ml)

n≥ 2 , Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.1.2

Abb. 8: Humane neutrophile Elastase: Einfluss der Fraktionen A-M (Säule 1) aus dem DCM-Extrakt von H. annosum (Konzentration: 2µg/ml)

n≥ 2 , Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.2

↓36

Die Separation von Elastase-hemmenden Verbindungen war mit dieser Chromatographie nicht gelungen, der Großteil der erhaltenen Fraktionen hemmte die Aktivität des Enzyms in gleichen Konzentrationen. Eine Weiterbearbeitung bezüglich des biologischen Testsystems „Elastase“ fand nicht statt, da an dieser Stelle nicht klar war, ob die Hemmung der Elastase eine unspezifische Hemmung durch allgemein apolare Verbindungen war, ob es keine Trennung der Elastase-hemmenden Verbindungen gab (da das Trennsystem ungeeignet war), oder ob in den einzelnen Fraktionen jeweils unterschiedliche Verbindungen vorlagen, die in ihrer Gesamtheit (entweder Wirkstärke, vorliegende Konzentration bzw. die Kombination aus beiden) gleiche Elastase-beeinflussende Eigenschaften hatten. Eine Einzelbetrachtung und Auftrennung jeder Fraktion wäre auch aufgrund der vorhandenen Substanzmengen nur sehr eingeschränkt möglich gewesen. Für die weitere aktivitätsgeleitete Fraktionierung wurde als biologisches Testsystem nur noch die Kollagenase-Beeinflussung gewählt.

Die Fraktionen E und F der Säule 1 wurden (nach Vereinigung) an einer weiteren mit silanisiertem Kieselgel gefüllten Säule mit dem FM B chromatographiert. Es wurden 8 Fraktionen (E1-E8) erhalten, wobei Kollagenase-hemmende Effekte in den Fraktionen E2-E4 nachweisbar waren: E2, E3: Hemmungen von 96 bzw. 95% (jeweils R = 1), E4: Hemmung von 39% (R = 15) in Konzentrationen von 200µg / ml Ansatz.

Die aktivste Fraktion E3 wurde weiters an Sephadex LH-20 mit dem FM C chromatographiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden zu 9 Fraktionen (E3.1.-E3.9) zusammengefasst. Die anschließende Kollagenase-Testung zeigte, dass eine Kollagenase-hemmende Wirkung in den Fraktionen E3.4-E3.7 nachgewiesen werden konnte, die aktiven Substanzen lagen vor allem in den Fraktionen E3.5 und E3.6 vor (Hemmungen von 79 bzw. 81% in Konzentrationen von 50µg / ml, s. Abb. 9).

↓37

Abb. 9: Clostridium histolyticum Kollagenase: Einfluss der Fraktionen E3.2-E3.8 (Säule 3) aus dem DCM-Extrakt von H. annosum (Konzentrationen: 200/100/50µg/ml)

n≥ 2 , Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.1.2

Die anschließende dünnschichtchromatographische Untersuchung der Fraktionen wies aufgrund der Detektierbarkeit von Substanzen in den aktiven Fraktionen mittels UV 254nm, UV 366nm, Schwefelsäure 10%, Wasser und Rhodamin B auf ein Vorkommen von freien Fettsäuren hin. Dies konnte durch eine erste GC-MS-Untersuchung bestätigt werden. Da die Fettsäuren (aufgrund von Substanzmangel) nicht in der für die Strukturaufklärung erforderlichen Reinheit gewonnen werden konnten, schloss sich eine genauere GC-MS-Untersuchung an (s. Untersuchungen und Ergebnisse ‎4.3).

Lactarius deterrimus Grög.

Der Dichlormethan-Extrakt von Lactarius deterrimus Grög. wurde an einer Kieselgel-Säule mit dem FM D chromatographiert. Die Chromatographie ergab 14 Fraktionen (Fraktionen A-N). Die stärksten Kollagenase-hemmenden Effekte konnten in den Fraktionen I-J nachgewiesen werden (Hemmung von 94 bzw. 89% in Konzentrationen von 200µg/ml, s. Abb. 10). Bei der Testung auf die Aktivität der Elastase musste erneut festgestellt werden, dass ein Hemmeffekt in fast allen Fraktionen auftrat (s. Abb. 11). Die Fraktionen A, D und E wurden aufgrund zu geringer Mengen nicht in den Test einbezogen.

↓38

Abb. 10: Clostridium histolyticum Kollagenase: Einfluss der Fraktionen B-N (Säule 1) aus dem DCM-Extrakt von L. deterrimus (Konzentrationen: 200/20µg/ml)

n≥ 2, Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.1.2

Abb. 11: Humane neutrophile Elastase: Einfluss der Fraktionen B-N (Säule 1) aus dem DCM-Extrakt von L. deterrimus (Konzentrationen: 20/2/0.2µg/ml)

n≥ 2 , Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.2

Auch hier wies die Dünnschichtchromatographie der Fraktionen unter Verwendung von Detektionsmitteln (Schwefelsäure 10%, Wasser und Rhodamin B) und Referenzsubstanzen (Palmitinsäure, Stearinsäure) auf das Vorkommen von freien Fettsäuren hin. Es wurde hier deshalb gleich im Anschluss (ohne weitere Auftrennung der aktivsten Fraktionen) eine GC-MS-Untersuchung vorgenommen.

4.3 Bestimmung des Fettsäureanteils mittels GC-MS

Optimierung der Methode zur chromatographischen Trennung

↓39

Die Methodenoptimierung orientierte sich an einer vollständigen Grundlinien-Trennung der Peaks der vorhandenen Fettsäuremethylester und einer vertretbaren Dauer der einzelnen Analysen (16min pro Analyse).

Bestimmung der Retentionszeiten von vorhandenen Fettsäuremethylestern

Die relativen Retentionszeiten der Methylester der gesättigten (C12:0, C14:0, C16:0, C17:0, C18:0, C19:0, C20:0, C22:0) und der ungesättigten Fettsäuren (C18:1, C22:1) als Einzelverbindungen und im Gemisch wurden bestimmt. Die Peaks der Fettsäuremethylester trennten sich vollständig voneinander. Laurinsäuremethylester wurde unter der gewählten Methode zu früh eluiert (mit dem Lösungsmittel / Derivatisierungsreagenz), da Laurinsäure aber keine Beeinflussung der Enzymaktivitäten zeigte, wurde auf die gaschromatographische Bestimmung der Säure in den Extrakten und Fraktionen verzichtet.

Interner Standard

Da an dem Gerät die Probenaufgabe manuell erfolgte, musste die Bestimmung der Retentionszeiten und die Quantifizierung der Fettsäuremethylester (und damit der Fettsäuren) mittels internen Standard erfolgen. Als Substanz wurde hier Erucasäure (C22:1) gewählt. Dazu wurde im TIC überprüft, ob Erucasäure(methylester) in den zu untersuchenden Extrakten vorkam. Dies war nicht der Fall und deckte sich mit den Angaben der Veröffentlichung [Müller 1994] für das Fettsäureprofil von Heterobasidion annosum - Extrakten. Die Verwendung einer freien Fettsäure erwies sich auch hinsichtlich des Derivatisierungsreagenzes als günstig: es wurden jeweils der Extrakt und der interne Standard gemischt und anschließend das Derivatisierungsreagenz zugegeben. Sollte es bei sehr fettsäurereichen Fraktionen, doch zu einem Mangel an Derivatisierungsreagenz kommen, so dass nicht alles umgesetzt wird, wäre auch die Konzentration des Methylesters des internen Standards geringer. Pro Probenaufgabe wurde eine Menge, die 250ng (entspricht ca. 740pmol) Erucasäure entspricht, eingesetzt.

Methodenfaktor

↓40

Für die Quantifizierung mittels GC-MS war die Bestimmung der Methodenfaktoren der zu quantifizierenden Substanzen notwendig. Dazu musste das Peakflächenverhältnis Fettsäure / Standard ermittelt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Methodenfaktoren für eine gesättigte und eine ungesättigte Fettsäure (Stearinsäure: C18:0 bzw. Ölsäure: C18:1) bestimmt. Die Peakflächen bei aufgegebenen Mengen von 12.5 / 25.0 / 31.3 / 62.5 / 125.0 / 312.5 und 625ng Stearin- bzw. Ölsäure wurden gegen die Peakfläche bei 250ng Erucasäure bestimmt. Für Stearinsäure wurde als Methodenfaktor 0.64 und für Ölsäure 0.63 errechnet.

Qualitative Bestimmung von Fettsäuren und weiteren Verbindungen

Qualitative Aussagen über das Vorkommen von Substanzen in den zu untersuchenden Proben waren mittels GC-MS mit differierender Sicherheit möglich. In der vorliegenden Arbeit war eine sehr sichere Aussage möglich, wenn die Retentionszeit und das Massenspektrum mit denen eines Referenzfettsäuremethylester übereinstimmten. Sichere Aussagen waren möglich, wenn es sich bei den gefundenen Substanzen um Homologa der Referenzfettsäuren handelte, und entsprechend die Retentionszeit und das Massenspektrum zueinander „passten“ (z.B. für C15:0, C24:0). Unsichere Aussagen musste man bei Isomeren (der Fettsäuren), wie z.B. cis/trans bzw. auch Doppelbindung an C9, C10 oder C11, treffen: die Massenspektren der Isomere unterschieden sich nicht (s. Abb. 12: Darstellung der Massenspektren des gefundenen x-C18:1-Fettsäuremethylesters und der Methylester von Elaidin- bzw. Ölsäure), und mit Hilfe der Chromatographie (unter den hier gewählten Bedingungen) erfolgte keine Trennung der Isomere (bestätigt auch durch die Literatur: Müller 1994). Es war in diesem Fall nur eine allgemeine Aussage über das Vorliegen, z.B. eines x-C18:1-methylesters oder x,x-C18:2-methylesters möglich. Da die Identifizierung der Verbindungen durch vorhandene Massenspektrenbibliotheken unterstützt wurde, war es außerdem möglich, Vermutungen über weiter vorliegende Verbindungsklassen, wie z.B. Ergosterol-Derivate zu tätigen. Die Aussagekraft dieser Vermutung wurde allerdings durch das Fehlen von Referenzsubstanzen stark eingeschränkt.

Abb. 12: Massenspektren der Methylester von C18:1-Fettsäuren: x-C18:1, Elaidinsäure, Ölsäure

Methode s. Exp. Teil ‎3.5.5:
EI: 70eV, Temperatur der Ionenquelle: 250°C, Massenscan: 40-500/1s

Quantitative Bestimmung ausgewählter Fettsäuren in den Extrakten

↓41

Für die Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög. wurden der Gehalt an Palmitinsäure (C16:0), Stearinsäure (C18:0), einer einfach ungesättigten C18-Säure und einer zweifach ungesättigten C18-Säure bestimmt. Für die Berechnung der Gehalte für Palmitin- und Stearinsäure wurde der Methodenfaktor 0.64 (Stearinsäure), für x-C18:1 und x,x-C18:2 der Methodenfaktor 0.63 (Ölsäure) zugrunde gelegt. Die Ergebnisse zeigen Tab. 14 und Tab. 15, Beispielchromatogramme zeigen die Abb. 13 und Abb. 14.

Tab. 14: Quantitative Bestimmung des Fettsäuregehaltes der Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. durch GC-MS (Angabe in µg/100µg Extrakt)

C16:0

C18:0

C18:1

C18:2

PE-Extrakt

0.4 R=0.3

15.6 R=11.6

0.4 R=0.2

0.3 R=0.2

DCM-Extrakt

0.8 R=1.3

2.7 R=0.4

1.1 R=1.6

DCM-H2O-Extrakt

-

-

-

-

n = 3, Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.5.5

Tab. 15: Quantitative Bestimmung des Fettsäuregehaltes der Extrakte von Lactarius deterrimus Grög. durch GC-MS (Angabe in µg/100µg Extrakt)

C16:0

C18:0

C18:1

C18:2

PE-Extrakt (n=5)

0.6 R=0.5

19.6 R=8.4

6.3 R=6.0

DCM-Extrakt (n=7)

0.5 R=0.6

11.5 R=9.6

4.2 R=3.3

MetOH-Extrakt (n=2)

0.2 R=0.0

-

-

0.8 R=0.2

DCM-H2O-Extrakt (n=6)

0.1 R=0.2

0.1 R=0.2

0.1 R=0.2

0.4 R=0.4

Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.5.5

↓42

Abb. 13: Gaschromatogramme Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.: PE-Extrakt, DCM-Extrakt und DCM-H2O-Extrakt

TIC: 1 – C16:0, 2 – x,x-C18:2, 3 – x-C18:1, 4 – C18:0, 5 – Verunreinigung, 6 – C22:1(cis-13) (jeweils der Methylester); Methode s. Exp. Teil ‎3.5.5: DB-5MS: 30mx0.32mm (0.1µm), Injektor: 250°C (split-splitless), Säule: 150°C (1min) – Heizrate 10°C/min auf 300°C, Helium

Abb. 14: Gaschromatogramme Lactarius deterrimus Grög.: PE-Extrakt, DCM-Extrakt und DCM-H2O-Extrakt

TIC: 1 – C16:0, 2 – x,x-C18:2, 3 – x-C18:1, 4 – C18:0, 5 – Verunreinigung, 6 – C22:1(cis-13) (jeweils der Methylester); Methode s. Exp. Teil ‎3.5.5: DB-5MS: 30mx0.32mm (0.1µm), Injektor: 250°C (split-splitless), Säule: 150°C (1min) – Heizrate 10°C/min auf 300°C, Helium

Die Ergebnisse zeigten, dass im Petrolether-Extrakt von H. annosum und dem Petrolether- und Dichlormethan-Extrakt von L. deterrimus Stearinsäure einen erheblichen Masseanteil einnnahm. Sie kam in Konzentrationen von 15.6, 19.6 bzw. 11.5% vor. Im Petrolether- und Dichlormethan-Extrakt von L. deterrimus konnte daneben noch ein erheblicher Anteil (jeweils ca. 5%) an ungesättigten Fettsäuren bestimmt werden. Der Gesamtfettsäuregehalt des Dichlormethan-Extraktes von H. annosum war dagegen im Vergleich zu den anderen apolaren Extrakten auffallend gering. In den polaren Extrakten (Methanol- und Dichlormethan-Wasser-Extrakte) war der Masseanteil an den quantitativ bestimmten Fettsäuren bei beiden Pilzen max. 1%.

Quantitative Bestimmung ausgewählter Fettsäuren in den Fraktionen

↓43

Für die Fraktionen der dritten Säulenchromatographie des Extraktes von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und die Fraktionen der ersten Säulenchromatographie des Extraktes von Lactarius deterrimus Grög. wurde der Gehalt an Palmitinsäure (C16:0), Stearinsäure (C18:0), einer einfach ungesättigten C18-Säure und einer zweifach ungesättigten C18-Säure bestimmt. Für Palmitin- und Stearinsäure wurde der Methodenfaktor 0.64 (Stearinsäure), für x-C18:1 und x,x-C18:2 der Methodenfaktor 0.63 (Ölsäure) berücksichtigt. Die Ergebnisse zeigen Tab. 16 und Tab. 17.

Tab. 16: Quantitative Bestimmung des Fettsäuregehaltes der Fraktionen von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. durch GC-MS (Angabe in µg/100µg Extrakt)

Fraktion

C16:0

C18:0

C18:1

C18:2

E3.3

0.3 R=0.3

0.2 R=0.2

0.1 R=0.2

-

E3.4

0.4 R=0.5

18.7 R=5.9

0.2 R=0.2

E3.5

0.6 R=0.2

23.3 R=8.4

0.1 R=0.1

-

E3.6

4.5 R=5.0

50.3 R=8.5

1.2 R=1.0

-

E3.7

-

0.5 R=0.6

-

-

n = 3, Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.5.5

Tab. 16 ist zu entnehmen, dass der Masseanteil von Stearinsäure in den Fraktionen E3.4, E3.5 und vor allem E3.6 sehr hoch war, der Anteil an ungesättigten Fettsäuren war eher gering. In den Fraktionen E3.3 und E3.7 konnten dagegen kaum Fettsäuren nachgewiesen werden.

↓44

Tab. 17: Quantitative Bestimmung des Fettsäuregehaltes der Fraktionen von Lactarius deterrimus Grög. durch GC-MS (Angabe in µg/100µg Extrakt)

Fraktion

C16:0

C18:0

C18:1

C18:2

B

0.2 R=0.1

-

0.4 R=0.1

0.1 R=0.0

C

0.5 R=0.5

0.1 R=0.2

1.1 R=0.1

G

0.3 R=0.2

2.5 R=0.1

1.6 R=0.0

H

0.6 R=0.2

0.6 R=0.1

1.2 R=0.2

I

0.3 R=0.4

14.9 R=8.8

7.7 R=3.2

J

0.4 R=0.4

13.8 R=2.7

4.0 R=2.0

K

2.0 R=1.7

1.1 R=1.4

1.9 R=1.0

L

1.6 R=1.5

-

-

3.6 R=1.8

M

0.8 R=0.9

1.1 R=0.1

-

2.6 R=1.6

N

0.3 R=0.2

0.2 R=0.2

0.2 R=0.0

n = 2, Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.5.5

Aus Tab. 17 ist ersichtlich, dass der höchste Masseanteil an Stearinsäure in den Fraktionen I und J bestimmt wurde. In allen anderen Fraktionen war der Anteil gesättigter Fettsäuren eher gering. Auffallend ist jedoch der Gehalt an ungesättigten Fettsäuren, der in den Fraktionen I und J sehr hoch aber auch in den Fraktionen C-M noch verhältnismäßig hoch war. Dies korrelierte mit dem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren im DCM-Extrakt des L. deterrimus (s.Tab. 15).

Freie langkettige Fettsäuren: Einfluss auf die Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase und der humanen neutrophilen Elastase

Nachdem freie langkettige Fettsäuren als ein wirksames Prinzip für die Hemmung der Clostridium histolyticum Kollagenase bzw. der humanen neutrophilen Elastase erkannt wurden, sollten Untersuchungen hinsichtlich der Abhängigkeit der Struktur der Fettsäuren von ihrer inhibitorischen Wirksamkeit durchgeführt werden. Für dieses Screening wurden 17 Fettsäuren mit Kettenlängen von 12 bis 22 Kohlenstoffatomen, sowohl gerad- als auch ungeradzahlig und mit unterschiedlichen Sättigungsgraden (hier allerdings nur cis verknüpfte) ausgewählt. Die Bestimmung der Enzymaktivitäten wurde auch hier mit den im Exp. Teil: ‎3.1.2 bzw. Exp. Teil: ‎3.2 beschriebenen in vitro Assays durchgeführt.

↓45

Der Großteil der getesteten Fettsäuren (mit Ausnahme der Laurin-, Behen-, Eicosapentaen- und Docosahexaensäure) hemmte die Kollagenase-Aktivität in Konzentrationen von 50-500µM. Die Elastase-Aktivität wurde in Konzentrationen von 5-50µM gehemmt (mit Ausnahme der Laurin-, Eicosapentaen- und Docosahexaensäure). Festzuhalten war, dass sich die inhibitorisch wirksamsten Fettsäuren der beiden Enzyme unterschieden. So hemmten die gesättigten Fettsäuren mit Kohlenstoffatomen von C16-C19 die Kollagenase-Aktivität am stärksten (Abb. 17). Hinsichtlich der Elastase-Aktivität waren die einfach ungesättigten Fettsäuren stärker wirksam als ihre gesättigten bzw. mehrfach ungesättigten Homologa (Abb. 18). Erucasäure war die potenteste der Fettsäuren gegenüber der Elastase mit einer IC50 von 450nM. Tab. 18 zeigt die IC50-Werte aller getesteten Fettsäuren.

Abb. 15: Clostridium histolyticum Kollagenase: Dosis-Effekt-Kurven ausgewählter Fettsäuren

n≥ 4, Mittelwert ±SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.1.2

Abb. 16: Humane neutrophile Elastase: Dosis-Effekt-Kurven ausgewählter Fettsäuren

n≥ 4, Mittelwert ±SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.2

↓46

Abb. 17: Clostridium histolyticum Kollagenase: Einfluss freier langkettiger
Fettsäuren [50µM]

n≥ 4, Säule – Mittelwert, Fehlerbalken – SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.1.2

Abb. 18: Humane neutrophile Elastase: Einfluss freier langkettiger Fettsäuren [5µM]

n≥ 4, Säule – Mittelwert, Fehlerbalken – SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.2

Tab. 18: Hemmung der Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase und der humanen neutrophilen Elastase durch freie langkettige Fettsäuren

Trivialname

Kurz-Formel

Kollagenase

IC 50 [µM]

Elastase

IC 50 [µM]

Laurinsäure

12:00

k.H.

k.H.

Myristinsäure

14:00

270

35

Pentadecansäure

15:00

125

25

Palmitinsäure

16:00

35

15

Heptadecansäure

17:00

30

H.

Stearinsäure

18:00

20

10

Nonadecansäure

19:00

45

H.

Arachinsäure

20:00

H.

15

Behensäure

22:00

k.H.

30

Palmitoleinsäure

16:01 (cis-9)

405

20

Ölsäure

18:01 (cis-9)

460

5

Linolsäure

18:02 (cis-9,12)

375

10

α-Linolensäure

18:03 (cis-9,12,15)

460

15

γ-Linolensäure

18:03 (cis-6,9,12)

H.

15

Eicosapentaensäure

20:05 (cis-5,8,11,14,17)

k.H.

k.H.

Erucasäure

22:01 (cis-13)

415

0.45

Docosahexaensäure

22:06 (cis-4,7,10,13,16,19)

k.H.

k.H.

k.H. – keine Hemmung, H. - Hemmung < 50% bei Konzentrationen von 500µM (Kollagenase) bzw. 50µM (Elastase), Methode s. Exp. Teil ‎3.1.2 und Exp. Teil ‎3.2

Beeinflussung der Aktivität der Matrix-Metalloproteinase 9 durch ausgewählte freie langkettige Fettsäuren

↓47

Gesättigte und ungesättigte Fettsäuren mit der Anzahl der Kohlenstoffatome 16, 18 und 22 wurden hinsichtlich einer Beeinflussung der Matrix-Metalloproteinase 9-Aktivität getestet (Methode: s. Exp.Teil ‎3.3). Es war festzustellen, dass die gesättigten Verbindungen in Konzentrationen von 250µM keine bzw. eine vernachlässigbare Beeinflussung der Enzymaktivität zeigten. Bei den ungesättigten Verbindungen waren Hemmungen der Aktivität in Konzentrationen von 250 und 50µM zu beobachten. Für die Fettsäuren mit der Kohlenstoffanzahl 18 war festzuhalten, dass die Hemmaktivität mit der Anzahl der Doppelbindungen zunahm: die inhibitorisch aktivsten Fettsäuren waren die α- und die γ-Linolensäure. Eine Übersicht der Ergebnisse zeigt Tab. 19:

Tab. 19: Einfluss freier langkettiger Fettsäuren auf die Aktivität der Matrix-Metalloproteinase 9

Trivialname

Kurz-Formel

Hemmung der MMP-9-Aktivität [%]

250µM

50µM

Palmitinsäure

C16:0

10.5 R=2.1

k.H.

Palmitoleinsäure

C16:1 (cis-9)

43.2 R=1.2

27.1 R=15.1

Stearinsäure

C18:0

9.2 R=15.5

k.H.

Ölsäure

C18:1 (cis-9)

6.3 R=0.3

7.3 R=8.1

Linolsäure

C18:2 (cis-9,12)

39.2 R=4.8

13.4 R=18.4

α-Linolensäure

C18:3 (cis-9,12,15)

69.8 R=2.7

26.8 R=22.6

γ-Linolensäure

C18:3 (cis-6,9,12)

75.2 R=9.2

24.2 R=21.1

Behensäure

C22:0

k.H.

k.H.

Erucasäure

C22:1 (cis-13)

11.1 R=10.3

5.1 R=6.8

k.H. – keine Hemmung, n≥ 2, Streuung - R, Methode s. Exp.Teil ‎3.3

Bestimmung der Zytotoxizität

7.1  Extrakte

Die Bestimmung der Zytotoxizität der Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög. wurde an ECV-304 Zellen entsprechend Exp. Teil: ‎3.6 durchgeführt. Um eine Reduktion des MTT bzw. eine Hemmung der Reduktion allein durch Inhaltsstoffe der Extrakte auszuschließen, wurde in Blindversuchen der Einfluss der Extrakte auf die Bestimmungsmethode untersucht. Es ergaben sich keine Hinweise auf eine entsprechende Störung der Methode. Die Ergebnisse der Testung der Extrakte hinsichtlich der Beeinflussung der Zellzahl zeigt Tab. 20:

↓48

Tab. 20: Einfluss der Extrakte auf Zellen der Linie ECV-304

Relative Zellzahl [%]

100µg/ml

20µg/ml

2µg/ml

Heterobasidion annosum

PE-Extrakt

2.4 SD=0.10

80.3 SD=5.80

92.3 SD=0.10

DCM-Extrakt

2.4 SD=0.15

45.3 SD=9.74

75.4 SD=0.15

DCM-H2O-Extrakt

71.9 SD=5.20

83.3 SD=6.73

k.H.

H2O-Extrakt

k.H.

-

-

Lactarius deterrimus

PE-Extrakt

50.2 SD=10.85

k.H.

k.H.

DCM-Extrakt

22.9 SD=5.55

64.2 SD=2.93

93.9 SD=2.30

DCM-H2O-Extrakt

80.9 SD=7.41

88.0 SD=1.57

k.H.

MetOH-Extrakt

78.3 SD=9.72

82.4 SD=10.83

k.H.

H2O-Extrakt

k.H.

-

-

k.H. – keine Hemmung, n≥ 3,Streuung - SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.6: MTT-Test

Die wässrigen Extrakte beider Pilze wurden auch in höheren Konzentrationen untersucht: für den wässrigen Extrakt von H. annosum wurde in Konzentrationen von 1mg/ml bzw. 500µg/ml eine relative Zellzahl von 54.8% (SD=1.66, n=3) bzw. 73.0% (SD=2.43, n=3) bestimmt; der wässrige Extrakt von L. deterrimus beeinflusste auch in einer Konzentration von 1mg/ml die Zellzahl kaum (relative Zellzahl: 90.5%, SD=7.22, n=4).

7.2 Fettsäuren

Es wurden Untersuchungen zur Zytotoxizität von 14 Fettsäuren durchgeführt. Ziel dieser Bestimmung war die Beantwortung der Frage, ob die in den Enzymassays inhibitorisch aktiven Fettsäure-Konzentrationen bereits zytotoxisch bzw. proliferationshemmend sind oder nicht. Hiermit sollten erste Hinweise auf mögliche therapeutische Anwendungen gewonnen werden. Die Bestimmung wurde entsprechend Exp. Teil: ‎3.6 an der ECV-304 Zelllinie vorgenommen. Aufgrund nicht-ausreichender Löslichkeit bzw. unzureichender Stabilität und der geringen Bedeutung in den Enzymbestimmungen wurde auf die Bestimmung der Behensäure (C22:0), der Eicosapentaensäure [C20:05 (cis-5,8,11,14,17)] und der Docosahexaensäure [C22:06 (cis-4,7,10,13,16,19)] verzichtet.

↓49

Es wurden Fettsäure-Konzentrationen von 50, 100 und 250µM getestet. Alle Substanzen zeigten eine konzentrationsabhängige Toxizität bzw. Proliferationshemmung. Eine Übersicht zu diesen Untersuchungen gibt Tab. 21:

Tab. 21: Einfluss der Fettsäuren auf Zellen der Linie ECV-304

Trivialname

Kurz-Formel

Relative Zellzahl [%]

250µM

100µM

50µM

Laurinsäure

12:00

41.6 SD=1.25

k.H.

k.H.

Myristinsäure

14:00

58.2 SD=5.25

+

+

Pentadecansäure

15:00

57.9 SD=5.25

+

k.H.

Palmitinsäure

16:00

40.4 SD=5.40

83.8 SD=10.37

90.2 SD=4.21

Heptadecansäure

17:00

12.0 SD=2.40

48.5 SD=6.70

92.2 SD=4.30

Stearinsäure

18:00

48.3 SD=9.65

72.3 SD=14.50

k.H. SD=3.11

Nonadecansäure

19:00

71.8 SD=4.45

72.4 SD=3.60

85.7 SD=4.17

Arachinsäure

20:00

70.3 SD=6.40

74.9 SD=2.10

77.8 SD=3.64

Palmitoleinsäure

16:01 (cis-9)

2.4 SD=0.87

k.H.

k.H.

Ölsäure

18:01 (cis-9)

1.8 SD=0.25

k.H.

k.H.

Linolsäure

18:02 (cis-9,12)

1.9 SD=0.15

k.H.

k.H.

α-Linolensäure

18:03 (cis-9,12,15)

1.8 SD=0.05

94.1 SD=4.50

92.3 SD=2.16

γ-Linolensäure

18:03 (cis-6,9,12)

2.0 SD=0.15

33.0 SD=2.60

k.H.

Erucasäure

22:01 (cis-13)

26.5 SD=0.90

k.H.

k.H.

k.H. – keine Hemmung, + - Aktivierung, n≥ 3, Streuung – SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.6:
MTT-Test

In Konzentrationen von 250µM bewirkten alle getesteten Fettsäuren eine Abnahme der Zellzahl. Die Zahl der Zellen nahm mit sinkender Fettsäure-Konzentration zu: bei Konzentrationen von 50µM war nur noch bei 5 Fettsäuren eine Abnahme der Anzahl lebender Zellen feststellbar. Sie lag aber mit Ausnahme der Nonadecan- und der Arachinsäure unter 10%. Interessant ist der steile Verlauf der Dosis-Effekt-Kurve für die Palmitolein-, Öl- und Linolsäure: bei 250µM Konzentration ist die Zellzahl fast auf null gesunken, dagegen ist bei 100µM Konzentration keine Beeinflussung der Zellzahl nachweisbar.

Proteaseaktivität verschiedener Zelllinien und ihre Beeinflussung

8.1  Proteaseaktivität verschiedener Zelllinien

↓50

Die Proteaseaktivität wurde im Überstand der Zellen mit Hilfe eines universellen Proteasesubstrates (Resorufin-markiertes Casein) bestimmt. Die Versuche wurden entsprechend der unter Exp. Teil ‎3.7 beschriebenen Methode durchgeführt.

Einfluss der Inkubationsdauer auf die Proteasesekretion

Die Proteaseaktivität im Überstand der Zellen der Linien ECV-304 und MCF-7 wurde nach Inkubation mit Resorufin-markiertem Casein für 4, 8 und 24 Stunden bestimmt. Die Ergebnisse (Angabe der Fluoreszenzeinheiten) zeigt Tab. 22:

Tab. 22: Einfluss der Inkubationsdauer auf die Proteasesekretion

Zelllinie

Fluoreszenzeinheiten nach

4h

8h

24h

ECV-304

31 n=1

55 n=1

138 R=123, n=4

MCF-7

29 R=3, n=2

78 R=6, n=2

235 R=72, n=3

Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.7

↓51

Mit zunehmender Inkubationsdauer nahm die Anzahl der Fluoreszenzeinheiten und damit der Abbau des Proteasesubstrates zu, die Proteasesekretion stieg. Nach 24 Stunden Inkubation war eine ausreichende Anzahl Fluoreszenzeinheiten messbar, bei gleichzeitig geringer Streuung der Werte. Die Zeit für die Inkubation mit dem Resorufin-markiertem Casein wurde auf 24 Stunden festgelegt.

Einfluss der Zellzahl auf die Proteasesekretion

Es wurde untersucht, ob eine Steigerung der Anzahl auszusäender Zellen zu einer Steigerung der Proteaseaktivität im Überstand der Zellen führte. Dazu wurden 100 000 bzw. 200 000 Zellen pro Kavität ausgesät und für 4 Tage kultiviert. Die Ergebnisse (Angabe der Fluoreszenzeinheiten) zeigt Tab. 23:

Tab. 23: Einfluss der Zellzahl auf die Proteasesekretion

Zelllinie

Fluoreszenzeinheiten

100 000 Zellen

200 000 Zellen

MCF-7

235 R=72, n=3

293 R=293, n=2

MDA-MB-231

409 R=57, n=4

719 R=264, n=2

n≥ 2, Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.7

↓52

Bei Aussaat von 200 000 Zellen pro Kavität löste sich beim Waschen der Zellen bereits ein großer Teil der Zellen ab. Die Zellzahl in den Kavitäten war deshalb nicht reproduzierbar. Dies wurde auch aus der Streuung der Werte für die Bestimmung der Proteaseaktivität deutlich. Die auszusäende Zellzahl wurde deshalb auf 100 000 Zellen pro Kavität festgelegt.

Vergleich der Proteaseaktivität

Es wurde die Proteaseaktivität der Zelllinien ECV-304, MCF-7 und MDA-MB-231 bestimmt. Nach Aussaat von 100 000 Zellen pro Kavität und Kultivierung über 4 Tage wurden folgende Aktivitäten (wobei die Proteaseaktivität der ECV-304-Zellen 100% gesetzt wurde) bestimmt:

Tab. 24: Vergleich der Proteaseaktivität verschiedener Zelllinien

Zelllinie

Proteaseaktivität [%]

ECV-304

100 SD=32.2

MCF-7

171 SD=21.2

MDA-MB-231

297 SD=14.8

n≥ 3, Streuung – SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.7

↓53

Die Proteaseaktivität der Überstände der Zelllinien nahm in der Reihenfolge ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB-231 zu.

8.2  Einfluss von APMA

Um einen Hinweis auf die Eigenschaften der sezernierten Proteasen zu bekommen, wurde der Einfluss einer Organoquecksilber-Verbindung (APMA) auf die Proteaseaktivität im Überstand der Zellen untersucht. Dazu wurde nach Abnahme des Zellüberstandes und seiner Inkubation für 24 Stunden mit PBS-Glucose-Puffer diese Lösung mit APMA (Endkonzentration: 140µM) für 1 bzw. 2 Stunden versetzt. Die Ergebnisse (Angabe der Fluoreszenzeinheiten) zeigt Tab. 25:

Tab. 25: Einfluss von APMA auf die Proteaseaktivität

Zelllinie

Zeit [h]

Fluoreszenzeinheiten

APMA-Zugabe

ohne APMA-Zugabe

ECV-304

1

149 SD=4.1

154 SD=2.0

2

157 SD=7.2

162 SD=8.2

MCF-7

1

320 SD=24.5

336 SD=23.7

2

321 SD=14.0

337 SD=16.2

MDA-MB-231

1

555 SD=12.9

567 SD=3.4

2

582 SD=25.8

591 SD=27.1

n≥ 3, Streuung – SD, Methode s. Exp. Teil ‎3.7

↓54

Es zeigte sich, dass APMA keinen Einfluss auf die Proteaseaktivität hatte. Bei allen 3 Zelllinien wurden in den Lösungen mit APMA die gleiche Anzahl Fluoreszenzeinheiten gemessen wie in den Lösungen ohne. Als Ergebnis war festzuhalten, dass sich zum Zeitpunkt der Zugabe von APMA keine durch Organoquecksilber-Verbindungen-aktivierbaren Proteasen in den Zellüberständen befanden. Es war jedoch nicht auszuschließen, dass von den Zellen derartige Proteasen sezerniert wurden. Eine Zugabe von APMA direkt auf die Zellen war indes nicht sinnvoll, da die Verbindung zytotoxisch wirkte. Um einen Nachweis für die Sekretion der mit Organoquecksilber-Verbindungen- aktivierbaren Proteasen MMP-2 und MMP-9 zu erbringen, wären die Methoden des Enzym-Immunoassays (z.B. ELISA) oder der Zymographie geeignet.

8.3  Einfluss von 1.10-Phenanthrolin, EDTA und γ-Linolensäure

1.10-Phenanthrolin

Der Einfluss von 1.10-Phenanthrolin auf die Proteaseaktivität wurde untersucht. Handelte es sich bei den Proteasen um Metallopeptidasen so müßte nach Zusatz von 1.10-Phenanthrolin eine Hemmung der Proteaseaktivität nachweisbar sein. Es wurden Bestimmungen durchgeführt bei denen 1.10-Phenanthrolin dem von den Zellen abgetrennten Überstand zugegeben wurde und Untersuchungen bei denen 1.10-Phenanthrolin direkt auf die Zellen gegeben wurde. Die Aktivität der Lösungen ohne 1.10-Phenanthrolin-Zusatz wurde 100% gesetzt, die Aktivitäten der 1.10-Phenanthrolin-Lösungen entsprechend darauf bezogen. Die Ergebnisse zeigt Tab. 26:

Tab. 26: Einfluss von 1.10-Phenanthrolin auf die Proteaseaktivität

Proteaseaktivität [%]

2mM 1.10-Phenanthrolin
2h im Überstand

1mM 1.10-Phenanthrolin
24h auf Zellen

ECV-304

84.1 n=1

75.6 R=2.4, n=2

MCF-7

94.5 n=1

25.8 R=31.3, n=2

MDA-MB-231

113.9 n=1

19.8 n=1

R – Streuung, Methode s. Exp. Teil ‎3.7

↓55

Da es sich bei den Untersuchungen größtenteils um Einzelversuche handelte, war eine Auswertung nur bedingt möglich. In den Bestimmungen bei denen 1.10-Phenanthrolin nur dem Überstand zugesetzt worden war, war die Beeinflussung der Proteaseaktivität bei allen Zelllinien gering. Wurde 1.10-Phenanthrolin jedoch direkt auf die Zellen gegeben, so konnte bei allen Zelllinien eine deutliche Verringerung der Proteaseaktivität nachgewiesen werden. Es konnte jedoch keine Aussage gemacht werden, ob die Proteasen durch 1.10-Phenanthrolin gehemmt wurden oder die Zellschädigung durch 1.10-Phenanthrolin eine geringere Proteasesekretion zur Folge hatte. An dieser Stelle fehlten die entsprechenden Zytotoxizitätsuntersuchungen für 1.10-Phenanthrolin.

EDTA und γ-Linolensäure

Um einen ersten Hinweis auf eine Hemmung der Proteaseaktivität durch freie Fettsäuren zu bekommen, wurde der Einfluss von γ-Linolensäure auf die Proteaseaktivität der Zellen getestet. Als Vergleichssubstanz wurde weiterhin EDTA, als unspezifischer Inhibitor von Metallopeptidasen, in die Testung einbezogen.

Die Versuche wurden mit Zellen der Linie MDA-MB-231 durchgeführt. Nach Aussaat von 100 000 Zellen pro Kavität und Inkubation für 3 Tage, wurden die Überstände abgenommen und verworfen. Die Zellen wurden einmal mit 500µl PBS-Puffer gewaschen. Anschließend erfolgte die Aufgabe von 400µl PBS-Glucose-Puffer, 50µl 0.1% Resorufin-markiertem Casein und 50µl Testsubstanz pro Kavität. Nach Inkubation für 24 Stunden wurden die Überstände abgenommen und der Abbau des Proteasesubstrats fluorimetrisch bestimmt. In allen Kavitäten betrug die Konzentration an DMSO 0.1%. Die Ergebnisse zeigt Tab. 27:

↓56

Tab. 27: Einfluss von EDTA und γ-Linolensäure auf die Proteaseaktivität

Relative Proteaseaktivität [%]

0.1% (V/V) DMSO

100.0 R=13.8

50µM EDTA

76.1 R=10.8

50µM γ-Linolensäure

96.0 R=36.1

n = 3, Streuung – R, Methode s. Exp. Teil ‎3.7

EDTA hemmte die Proteaseaktivität in der Konzentration 50µM in allen 3 Versuchen um ca. 20-30%. Die 50µM γ-Linolensäure-Lösung zeigte in 2 Versuchen eine Hemmung und in einem Versuch eine Steigerung der Proteaseaktivität. Alle Versuche waren jedoch nur bedingt auswertbar, da keine Zytotoxizitätsbestimmungen der untersuchten Substanzen für die Zelllinie MDA-MB-231 durchgeführt worden waren. Diese wären jedoch notwendig, da die Substanzen für 24 Stunden auf den Zellen verblieben und eine Zellschädigung nicht auszuschließen war.


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HTML-Version erstellt am:
10.11.2006