Diskussion

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Einfluss der Basidiomyceten-Extrakte auf die Aktivität der humanen neutrophilen Elastase

Beim Screening der wässrigen und Dichlormethan-Extrakte von 15 Basidiomyceten hinsichtlich einer Beeinflussung der Elastase-Aktivität konnte festgestellt werden, dass alle wässrigen Extrakte in Konzentrationen von 200µg/ml und 11 der Dichlormethan-Extrakte in Konzentrationen von 2µg/ml die Aktivität des Enzyms hemmten. Bei der Betrachtung der Werte der Dichlormethan-Extrakte fiel auf, dass die Konzentrationen, die eine 50%ige Hemmung bewirkten, sehr ähnlich waren: sie lagen zwischen 200ng/ml und 2µg/ml. Auch schien der Verlauf der Dosis-Effekt-Kurve sehr steil zu sein: 9 der Extrakte hemmten in Konzentrationen von 2µg/ml die Aktivität um 80-90%, bei Konzentrationen von 200ng/ml konnte bei 4 Extrakten keine Hemmung und bei weiteren 4 Extrakten nur eine Hemmung von 20-30% festgestellt werden. Dies könnte auf einen ähnlichen Wirkmechanismus bei allen Extrakten und damit auf Substanzen hinweisen, die in Basidiomyceten häufig vorkommen. Die wässrigen Extrakte erwiesen sich als weniger wirksam gegenüber der Elastase als die Dichlormethan-Extrakte. Sie zeigten allerdings, zumindest zum Teil, deutlich flachere Verläufe der Dosis-Effekt-Kurven.

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Die Konzentration der eingesetzten Dichlormethan-Extrakte, die eine Hemmung der Elastase-Aktivität bewirkten, war mit 2µg/ml gering. Da die Untersuchungen unter Verwendung von Rohextrakten, die also keine weitere Aufreinigung erfuhren, durchgeführt wurden, schienen in den Extrakten entweder sehr inhibitorisch aktive Verbindungen oder etwas weniger aktive Substanzen, die dann aber in großer Konzentration vorlagen, vorhanden zu sein. Eine aktivitätsgeleitete Isolierung der Substanzen schien Erfolg versprechend.

Der Vergleich der Konzentrationen der Pilzextrakte hinsichtlich der Aktivitätsbeeinflussung von Kollagenase und Elastase zeigte, dass die eingesetzten Konzentrationen sowohl der wässrigen als auch der Dichlormethan-Extrakte für eine 50%ige Elastase-Hemmung zahlenmäßig kleiner waren als die für eine 50%ige Kollagenase-Hemmung (s. Tab. 1, Tab. 12). Eine allgemeine Aussage, dass die Elastase durch Basidiomyceten-Extrakte stärker gehemmt würde, ließ sich daraus jedoch nicht ableiten. Es wurden unterschiedliche Enzymmengen (unterschiedlicher Aktivität) eingesetzt und auch die Affinität zu den (unterschiedlichen) Substraten war nicht vergleichbar. Es handelte sich hier also nur um einen zahlenmäßigen aber keinen wertenden Vergleich.

Wie in der Einleitung erwähnt, lagen Ergebnisse hinsichtlich einer Beeinflussung von Serin-Proteasen durch Basidiomyceten-Extrakte vor. So untersuchten Pilgrim et al. [Pilgrim 1992] wässrige Extrakte von Basidiomyceten hinsichtlich einer Trypsin-Beeinflussung (s. Einleitung ‎2). Immerhin 9 der in dieser Publikation getesteten Basidiomyceten wurden auch in den Untersuchungen der vorliegenden Arbeit verwendet. Ein Vergleich der eingesetzten Extrakt-Konzentrationen war indes schwierig: in der vorliegenden Arbeit wurde eine definierte Menge lyophilisierter Extrakt mit einer definierten Menge Aqua bidest. in Lösung gebracht, in der Arbeitsgruppe Pilgrim et al. wurden jeweils 100µl einer frisch hergestellten Extraktlösung (50mg Pilzmaterial plus 5ml Aqua dest.) bzw. deren Verdünnung verwendet. Es konnte jedoch qualitativ festgestellt werden, dass die jeweils aktivsten Extrakte differierten. Doljak et al. [Doljak 2001] untersuchten den Einfluss von polaren Extrakten (50% Methanol/Wasser) von 95 Basidiomyceten auf die Aktivität von Thrombin und Trypsin (s. Einleitung ‎2). 5 der dort untersuchten Basidiomyceten fanden auch in der vorliegenden Arbeit Verwendung. Auch hier war der Vergleich der eingesetzten Extrakt-Konzentrationen schwierig: Doljak et al. testeten die definierte Masse von 0.5ml lyophilisierter Extraktlösung. Zusammenfassend konnte aus den Ergebissen der eigenen Untersuchungen und denen der Publikationen jedoch festgehalten werden, dass auch ein rein qualitativer Vergleich von aktiven und weniger bzw. nicht aktiven polaren Basidiomyceten-Extrakten keinen Hinweis auf eine Hemmung der Aktivität aller Serin-Proteasen durch polare Extrakte einzelner Basidiomyceten gab.

Aktivitätsgeleitete Fraktionierung

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Das Ziel aktivitätsgeleiteter Fraktionierungen ist die Abtrennung biologisch aktiver Fraktionen bzw. Einzelverbindungen von nicht-aktiven. Dabei wird der Nachweis der Anreicherung wirksamer Verbindungen durch ein Ansteigen der biologischen Aktivität erbracht. Diese biologische Testung muss nach jedem Trennungsschritt bzw. jeder Aufreinigung erfolgen. Für eine aktivitätsgeleitete Fraktionierung ist also neben einer einfach und schnell durchführbaren Bestimmungsmethode, auch ausreichend Substanz nötig.

Eine gelungene Isolation von Einzelverbindungen, die für die biologische Aktivität eines Extraktes verantwortlich sind, allein durch die aktivitätsgeleitete Fraktionierung ist der Idealfall. Häufig ist zu beobachten, dass die biologische Aktivität durch weitere Aufreinigungsschritte nicht steigt bzw. kann es sein, dass die Aktivität bei der Auftrennung eines Extraktes bzw. einer Fraktion „verschwindet“. Das kann bedeuten, dass nur das Gemisch der Verbindungen bzw. auch der Rohextrakt wirksam ist. Je komplexer ein Wirkungsmechanismus und die Bestimmungsmethode ist, desto häufiger wird ein „Verschwinden“ der biologischen Aktivität auftreten, da hier das Zusammenspiel mehrerer Verbindungen, sei es z.B. durch Lösungsvermittlung, eine größere Rolle spielt als bei sehr einfachen Assays.

Weiterhin muss man bei aktivitätsgeleiteten Fraktionierungen davon ausgehen, dass man bereits bekannte und ganz unspektakuläre Verbindungen (wie z.B. Fettsäuren) isoliert. Das muss dann allerdings auch akzeptiert werden.

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In der vorliegenden Arbeit sollte eine aktivitätsgeleitete Fraktionierung mit Hilfe von in vitro Enzymbestimmungsmethoden für die Clostridium histolyticum Kollagenase und die humane neutrophile Elastase als biologischen Testsystemen durchgeführt werden. Dazu wurden die Dichlormethan-Extrakte von zwei Basidiomyceten ausgewählt, die sich in den vorangegangenen Screenings als besonders aktiv gegenüber beiden Enzymen herausstellten. Bei einer Fraktionierung an zwei Systemen musste damit gerechnet werden, dass die jeweils aktivsten Fraktionen für jedes Testsystem differierten. Die Testergebnisse der jeweils ersten Separation in dieser Arbeit zeigten für die Kollagenase eine Anreicherung der aktiven Verbindungen in bestimmten (wenigen) Fraktionen, die Abtrennung unwirksamer Extraktanteile war gelungen. Für die Elastase konnte dies so nicht festgestellt werden, die inhibitorische Aktivität konnte in fast allen Fraktionen in gleicher Größenordnung festgestellt werden. Die aktivitätsgeleitete Fraktionierung hinsichtlich der Aktivität der Elastase war nicht gelungen.

Von den aktivsten Fraktionen des Dichlormethan-Extraktes des Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. wurden mit Hilfe von zwei weiteren Säulenchromatographien weitere Kollagenase-inaktive Substanzen abgetrennt. Die Dünnschichtchromatographie ergab Hinweise auf das Vorkommen von freien Fettsäuren in den aktiven Fraktionen. Dies konnte durch GC-MS-Bestimmungen bestätigt werden. Bei der Auftrennung des Dichlormethan-Extraktes des Lactarius deterrimus Grög. wurde nach der ersten Säulenchromatographie sofort eine GC-MS-Bestimmung angeschlossen. Auch hier konnten als eine wirksame Verbindungsklasse die freien Fettsäuren bestimmt werden.

Das reichhaltige Vorkommen von freien Fettsäuren in Pilzen ist bereits beschrieben worden [Müller 1994]. Es ist jedoch zu vermuten, dass nicht alle bestimmten Fettsäuren von Beginn der Extraktion an oder sogar originär frei vorkamen. So stellten Bergendorff et al. fest, dass nach Zerkleinerung der Fruchtkörper von Lactarius deterrimus Grög. freie Fettsäuren und strukturell veränderte Sesquiterpene vorlagen statt der in nicht zerstörten Fruchtkörpern vorkommenden ursprünglichen Ester [Bergendorff 1988].

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Freie Fettsäuren waren sicher nicht die einzig wirksamen Substanzen der Extrakte. Dies galt vor allem für die Elastase. Bei beiden Dichlormethan-Extrakten konnte nach der ersten Säulenchromatographie in fast allen Fraktionen eine Elastase-hemmende Wirkung nachgewiesen werden. In der Literatur wurde die vielfältige Beeinflussung der Elastase durch Naturstoffe beschrieben (s. auch Diskussion ‎4). Es konnte also sein, dass in den einzelnen Fraktionen tatsächlich Substanzen unterschiedlicher Struktur vorlagen. Aber auch bei Betrachtung der Ergebnisse der Kollagenase musste man feststellen, dass weitere aktive Substanzen vorhanden waren. So zeigte die Fraktion E3.7 des Extraktes von H. annosum zwar eine Kollagenase-hemmende Aktivität (s. Abb. 9), es konnten aber nur geringe Mengen Fettsäure (s. Tab. 16) nachgewiesen werden.

Ein weiterer Diskussionspunkt betrifft die Auswahl der Pilze. Die DCM-Extrakte beider Pilze wiesen sowohl gegenüber der Kollagenase als auch gegenüber der Elastase eine starke inhibitorische Aktivität auf, es war also eher wahrscheinlich, dass man für beide Extrakte das gleiche Prinzip isoliert. Hinsichtlich einer Isolierung unterschiedlicher Naturstoffgruppen ist es unter Umständen vorteilhafter einen Extrakt mit starker Kollagenase- aber schwacher bzw. keiner Elastase-Aktivität und vice versa auszuwählen. Zusätzlich muss auch beachtet werden, dass die Auftrennung der Gemische nicht in zu viele Fraktionen erfolgt, da man immer ausreichend Substanz sowohl für die Testungen als auch zur weiteren Bearbeitung aktiver Fraktionen zur Verfügung haben muss. Möglicherweise kann es auch günstiger sein, die Separation anhand von Naturstoffgruppen vorzunehmen, als das Trennsystem an einer möglichst großen Anzahl detektierbarer Banden in der DC bzw. an Probensäulen zu optimieren, wie es in dieser Arbeit gehandhabt wurde.

Die Feststellung, dass freie Fettsäuren die Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase und der humanen neutrophilen Elastase hemmten, verlagerte den weiteren Forschungsschwerpunkt: von der Isolation und Charakterisierung weiterer inhibitorisch-wirksamer Verbindungen wurde zu Gunsten einer intensiven Betrachtung der Gruppe der Fettsäuren hinsichtlich der Beeinflussung von Bindegewebe-abbauenden Proteasen abgesehen.

Freie langkettige Fettsäuren

3.1  Einfluss auf die Aktivität der Enzyme

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In der vorliegenden Arbeit konnte ein hemmender Einfluss freier langkettiger Fettsäuren auf die Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase nachgewiesen werden. In der Literatur wurden keine Hinweise auf eine Beeinflussung der Kollagenase-Aktivität durch Fettsäuren gefunden. Die 17 getesteten Fettsäuren hemmten in Abhängigkeit von ihrer Kettenlänge und dem Grad ihrer Sättigung die Kollagenase-Aktivität unterschiedlich stark. Die gesättigten Fettsäuren mit Kettenlängen von C16-C19 (Palmitin-, Heptadecan-, Stearin-, Nonadecansäure) erwiesen sich als besonders potent (IC50: 20-45µM). Sowohl die getesteten ungesättigten Homologa als auch Fettsäuren mit kürzeren oder längeren Ketten waren weniger aktiv. Als ein möglicher Reaktionsmechanismus könnte hier die Bildung unlöslicher Salze mit Calcium-Ionen postuliert werden. Da die Clostridium histolyticum Kollagenase zur Stabilisierung ihrer Struktur (nicht jedoch im aktiven Zentrum) Calcium-Ionen benötigte [van Wart 1998], war bei vermindertem Calcium-Gehalt auch mit einer verringerten Enzymaktivität zu rechnen. Dass langkettige gesättigte Fettsäuren mit Calcium-Ionen schwerlösliche Salze bildeten, war bekannt.

Bei der Untersuchung der Wirkung von 17 freien Fettsäuren auf die Aktivität der humanen neutrophilen Elastase konnte eine Beeinflussung der Enzym-Aktivität durch Fettsäuren in Abhängigkeit von ihrer Kettenlänge und dem Grad der Sättigung nachgewiesen werden. Hierbei erwiesen sich die einfach ungesättigten Fettsäuren als potenter als ihre gesättigten bzw. mehrfach ungesättigten Homologa. Die stärkste inhibitorische Aktivität konnte für die Erucasäure (IC50: 450nM) nachgewiesen werden. Bereits Ashe et al. [Ashe 1977] stellte fest, dass die Aktivität der Elastase durch cis-ungesättigte Fettsäuren gehemmt werden konnte. In der Arbeit wurden vor allem cis- und trans-ungesättigte Fettsäuren mit den Kettenlängen C14-C22 (nur geradzahlig) getestet, ferner deren Alkohole. Dort wurde festgestellt, dass die cis-ungesättigten Fettsäuren einen hemmenden Effekt zeigten, während die trans-Fettsäuren die Enzymaktivität nicht beeinflussten. Auch hier waren einfach ungesättigte Fettsäuren aktiver als ihre zweifach oder dreifach ungesättigten Homologa (C18:x). Die gesättigten Fettsäuren (C16:0 und C18:0) zeigten keinen Effekt, die Alkohole stimulierten die Elastase-Aktivität. Beim Vergleich der Werte der vorliegenden Arbeit mit den Ergebnissen von Ashe et al. [Ashe 1977] ist jedoch zu berücksichtigen, dass unterschiedliche Substrate eingesetzt wurden. Arbeiten, die sich mit dem Einfluss freier Fettsäuren auf die Aktivität der Elastase beschäftigten und in welchen das gleiche Substrat wie in der vorliegenden Arbeit verwendet wurde, erschienen von Sklan et al. [Sklan 1990] und Tyagi et al. [Tyagi 1991]. Bei Sklan et al. [Sklan 1990] wurden die Stearin-, Öl- und Linolsäure untersucht mit dem Ergebnis, dass Ölsäure die stärkste inhibitorische Aktivität zeigte. Tyagi et al. [Tyagi 1991] stellten fest, dass die Elastase-Aktivität durch die cis- und trans- Parinarsäure [C18:4(x-9,11,13,15)] gehemmt werden konnte. Abschließend ist festzuhalten, dass alle Arbeiten, die die Fettsäuren C18:x mit in die Untersuchungen einbezogen, für diese Verbindungen qualitativ die selben Ergebnisse ermittelten. Die Unterschiede in den Werten der Hemmkonzentrationen waren aufgrund der Verschiedenartigkeit der eingesetzten Substrate und der unterschiedlichen Enzymmengen zu erwarten. Bode et al. [Bode 1989] untersuchten Struktur, Strukturspezifität und bekannte Inhibitoren der Elastase intensiv. Sie stellten fest, dass der Raum um die Substratbindungsstelle viele hydrophobe Seitenketten enthielt, so dass eine Hemmung durch kleinere Verbindungen mit hydrophoben Eigenschaften erklärbar schien. Ein Hinweis auf eine Beeinflussung der Enzymaktivität durch eine verminderte Calciumkonzentration (ähnlich der Kollagenase) wurde nicht gefunden. Die Stabilität der neutrophilen Elastase war im Gegensatz zur Stabilität der Pankreas-Elastase nicht von Calcium-Ionen abhängig [Bode 1989].

Als weiteres Enzym wurde die Matrix-Metalloproteinase 9 hinsichtlich ihrer Beeinflussung durch freie langkettige Fettsäuren untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass bei den getesteten Säuren die Hemmaktivität mit zunehmender Anzahl der Doppelbindungen stieg. Für die C18:x – Säuren waren die α-Linolensäure und γ-Linolensäure inhibitorisch am stärksten aktiv. Insgesamt war jedoch festzuhalten, dass die inhibitorisch-wirksamen Konzentrationen mit 250µM (in Konzentrationen von 50µM konnte nur für Palmitoleinsäure, α-Linolensäure und γ-Linolensäure eine Aktivitätshemmung festgestellt werden) sehr hoch lagen. Eine Untersuchung zur Beeinflussung der MMP-9 durch Fettsäuren lag bereits vor. Berton et al. [Berton 2001] testeten ausgewählte Fettsäuren. Als wirksamste Verbindung wurde cis-Parinarsäure [C18:4 (cis-9, trans-11, trans-13, cis-15)] gefunden, während Ölsäure weniger und Stearinsäure deutlich weniger potent waren. In dieser Untersuchung wurde jedoch ein anderes Substrat als in der vorliegenden Arbeit verwendet, dennoch wiesen die Ergebnisse beider Arbeiten qualitativ in die gleiche Richtung. Die Hemmung der Aktivität der MMP-9 durch Fettsäuren wurde wahrscheinlich durch das Vorhandensein der Fibronektin-artigen Domäne möglich gemacht. Berton et al. [Berton 2001] untersuchten den Einfluss der Fettsäuren auf die Aktivität der MMP-1, der MMP-2 und einer rekombinaten MMP-2 (ohne Fibronektin-artige Domäne). Es wurde festgestellt, dass auch die Aktivität der MMP-2 durch Fettsäuren hemmbar war, im Gegensatz dazu wurden die Aktivität der MMP-1 und die Aktivität der rekombinanten MMP-2 nicht beeinflusst. Da MMP-2 wie MMP-9 eine Fibronektin-artige Domäne enthält, diese jedoch bei MMP-1 wie bei allen anderen MMPs fehlt und auch die Aktivität der rekombinanten MMP-2 nicht durch Fettsäuren beeinflussbar war, schien für die Hemmung der Enzymaktivität durch Fettsäuren die Fibronektin-artige Domäne essentiell zu sein.

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Beim Zusammenfassen der Ergebnisse für alle drei Enzyme stellte man fest, dass für jedes Enzym eine andere Gruppe von Fettsäuren die potenteste darstellte. Ein wertender Vergleich der eingesetzten inhibitorisch wirksamen Fettsäuren-Konzentrationen zwischen den unterschiedlichen Enzymen verbietet sich auch hier (s. Diskussion ‎1).

Weitergehende Untersuchungen zum Einfluss freier Fettsäuren auf andere Metalloendopeptidasen bzw. Serin-Proteasen bieten sich an. Hier könnte überprüft werden, ob die inhibitorische Wirkung der Fettsäuren für einzelne Enzyme spezifisch ist oder sich Gemeinsamkeiten in den Struktur-Wirkungs-Beziehungen finden lassen. Für die Serin-Protease Thrombin (EC 3.4.21.5) lagen Untersuchungen vor, bei denen 10 Fettsäuren, die auch in dieser Arbeit untersucht wurden, hinsichtlich einer Beeinflussung der Enzymaktivität getestet worden waren [Henke 2004]. Erucasäure und Ölsäure erwiesen sich als die inhibitorisch aktivsten Säuren mit IC50-Werten von 5µM bzw. 7µM. Ähnlich dem Ergebnis für die humane neutrophile Elastase waren ihre gesättigten und mehrfach ungesättigten Analoga weniger potent [Henke 2004].

Um erste Hinweise auf mögliche therapeutische Anwendungen zu erhalten und auch die Ergebnisse der biochemischen Experimente auf Zellkultursysteme übertragbar zu machen, wurden die Fettsäuren hinsichtlich einer möglichen toxischen bzw. proliferationshemmenden Wirkung auf Zellen untersucht. Dazu wurden Zellen der Linie ECV-304 verwendet. Für die inhibitorisch aktivsten Fettsäuren der Clostridium histolyticum Kollagenase, die gesättigten Fettsäuren der Kettenänge C16-C19, wurden IC50-Werte von 20-45µM bestimmt. In Konzentrationen von 50µM waren diese Fettsäuren nicht bzw. nur gering zytotoxisch bzw. proliferationshemmend. Die Aktivität der humanen neutrophilen Elastase wurde unter den gegebenen Versuchsbedingungen schon durch geringe Fettsäure-Konzentrationen gehemmt. Die größte eingesetzte Konzentration wurde deshalb auf 50µM festgelegt. Für alle hinsichtlich der Zytotoxizität untersuchten Fettsäuren wurden für die Elastase IC50-Werte unter 50µM bestimmt (Ausnahme: Heptadecan-, Nonadecansäure). In der Konzentration von 50µM waren alle Fettsäuren nur noch gering oder gar nicht zytotoxisch bzw. proliferationshemmnd wirksam. Die gegenüber der MMP-9 inhibitorisch aktivsten Fettsäuren (Palmitolein-, α- Linolen-, γ-Linolensäure) waren zwar in der Konzentration von 50µM nicht zytotoxisch bzw. proliferationshemmend, aber auch nicht mehr sehr potent gegenüber der MMP-9. Die für die MMP-9 ebenfalls untersuchte Konzentration von 250µM erwies sich gerade für die ungesättigten Fettsäuren als sehr zytotoxisch bzw. proliferationshemmend. Der Vergleich der Konzentration für die Zytotoxizität mit der inhibitorisch wirksamen Konzentration gibt nur einen ersten Hinweis, ob eine Übertragung des Enzymassays auf einen Zellkulturassay möglich ist. Sollte eine solche Übertragung stattfinden, muss für jedes Enzym eine Zellkultur gesucht werden, die das entsprechende Enzym in großen Mengen sekretiert. Dann sind erneut für jede Zellkultur Zytotoxizitätsuntersuchungen nötig, um anschließend eine Beeinflussung des sekretierten Enzyms durch Fettsäuren zu bestimmen.

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Abschließend soll angemerkt werden, dass die Aussage zur Zytotoxizität bzw. Proliferationshemmung aufgrund der verwendeten Methode begrenzt ist. Im MTT-Test wird die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenasen bestimmt. Eine verringerte Aktivität kann auch durch eine partielle Hemmung der Aktivität der Dehydrogenasen bewirkt worden sein, es ist keinesfalls belegt, dass die Verringerung des MTT-Umsatzes allein durch eine geringere Anzahl an Zellen bewirkt wurde. Sollen die Aussagen zur Zytotoxizität präzisiert werden, wären Bestimmungsmethoden erforderlich, die u.a. die Zellmembranpermeabilität (z.B. Farbstoffaufnahme-, Farbstoffausschlusstests oder der Laktat-Dehydrogenase-Assay), die DNA-Synthese (z.B. 3H-Thymidin-Markierung) oder die Proteinsynthese (z.B. 35S-Methionin-Markierung) charakterisieren.

3.2  Physiologische und therapeutische Bedeutung

Physiologische Bedeutung

Langkettige Fettsäuren gehören als Bestandteile der Lipide zu den Biomolekülen im menschlichen Körper. Sie kommen zum überwiegenden Teil im Körper gebunden, meist verestert, vor. Freie langkettige Fettsäuren findet man nur in geringen Mengen. Im Blut erfolgt der Transport der langkettigen, in Wasser unlöslichen Säuren durch Bindung an Albumin. Bei physiologischem pH-Wert liegen die Fettsäuren ionisiert vor.

Fettsäuren erfüllen im Körper bedeutende physiologische Funktionen. Zum einen sind sie als Bausteine von Phospholipiden und Glykolipiden Bestandteile von biologischen Membranen. Zum anderen sind Fettsäuren wichtige Energieträger, wobei sie hierfür als Triacylglycerole gespeichert werden. Eine dritte Aufgabe ist die thermische, mechanische und elektrische Isolierung. Außerdem agieren Fettsäurederivate als Hormone und intrazelluläre Signalmoleküle, sowie als sogenannte Membrananker, wobei sie in dieser Funktion durch kovalente Bindung Proteine an bestimmte Membranorte fixieren [Koolman 1998].

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Fettsäuren werden mit der Nahrung aufgenommen, sie können jedoch auch vom Körper synthetisiert werden. Die Bereitstellung der Fettsäuren erfolgt meist durch Hydrolyse von Nahrungslipiden und körpereigenen Lipiden. Kettenverlängerungen von Fettsäuren (immer C2-Einheiten) kann der Organismus selbst vornehmen, sie werden in den Mitochondrien vollzogen. Eine totale Neusynthese von Fettsäuren erfolgt im Zytoplasma. Es gibt jedoch Fettsäuren, die der Mensch mit der Nahrung zuführen muss. Bei diesen essentiellen Fettsäuren handelt es sich im engeren Sinne um Linol- (C18:2 cis-9,12) und α-Linolensäure (C18:3 cis-9,12,15), im weiteren Sinne zusätzlich um Arachidonsäure (C20:4 cis-5,8,11,14). Arachidonsäure wird im Körper für die Biosynthese von Eicosanoiden benötigt. Die Neusynthese der Arachidonsäure ist im Körper jedoch nicht möglich, weil der Organismus zwar Fettsäuren um C2-Einheiten verlängern, nicht jedoch Doppelbindungen in den hinteren Teil der Fettsäuren einführen kann. Die kürzere Linol- und α-Linolensäure können durch Verlängerung in Arachidonsäure umgewandelt werden und sind deshalb in der Lage, die Arachidonsäure in der Nahrung zu ersetzen. Um den Bedarf an Arachidonsäure zu decken, muss also entweder gleich Arachidonsäure oder zumindest aber die kürzere Linolsäure mit der Nahrung aufgenommen werden [Koolman 1998]. Bei Mangel an essentiellen Fettsäuren, vor allem bedingt durch eine fettfreie Diät oder fettfreie parenterale Ernährung, kann es zu Hautveränderungen (Hyperkeratose, Alopezie), Thrombopenie und Wachstumsstörungen kommen.

Der Abbau der Fettsäuren erfolgt nach vorheriger Aktivierung in den Mitochondrien enzymatisch durch β-Oxidation zu Acetyl-CoA. Dieses wird anschließend im Citratcyclus unter Energiefreigabe zu CO2 und H2O abgebaut. Der Energiegewinn beträgt, z.B. für Palmitinsäure 106 Mol ATP pro Mol Fettsäure (28 Mol ATP aus β-Oxidation, 80 Mol ATP aus Citratcyclus abzüglich 2 Mol ATP von Aktivierung der Säure). Im Vergleich dazu werden pro 1 Mol Glucose unter den Bedingungen der aeroben Oxidation 32 Mol ATP freigesetzt (7 Mol ATP aus Glycolyse, 5 Mol ATP aus Pyruvat-Dehydrogenase-Reaktion, 20 Mol ATP aus Citratcyclus). Neben diesem Hauptweg des Fettsäureabbaus, der für die geradzahligen, gesättigten Fettsäuren typisch ist, gibt es für ungesättigte, ungeradzahlige, methylverzweigte oder sehr langkettige Fettsäuren noch andere Möglichkeiten des Abbaus [Koolman 1998].

Wie bereits beschrieben kommen freie Fettsäuren im Körper nur in sehr geringem Maße vor. Eine vermehrte Freisetzung von freien Fettsäuren kann durch die verstärkte Ausschüttung von Adrenalin (bei Stress) oder durch eine gesteigerte Lipolyse, z.B. bedingt durch eine verringerte Glucoseverwertung bei Diabetes mellitus oder bei Hyperthyreose, beim Phäochromozytom und beim Hunger hervorgerufen werden. Die freien Fettsäuren werden dann in die Prozesse der β-Oxidation und des Citratcycluses eingespeist. Ist die Aufnahmekapazität des Citratcyclus jedoch erschöpft, kommt es bei einem Überangebot an Acetyl-CoA zur Bildung und Ausscheidung von Ketonkörpern.

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Die Menge Fettsäuren, die im Körper frei vorliegt, wird also durch Regulationsmechanismen eingegrenzt. Entweder werden die Fettsäuren verestert und der Fettspeicherung zugeführt, oder es erfolgt der Abbau durch β-Oxidation und Citratcyclus. Eine interne therapeutische Anwendung größerer Mengen freier Fettsäuren wird wahrscheinlich immer an diese Grenzen stoßen.

Säureschutzmantel der Haut

Die Funktionen der Haut sind neben der rein mechanischen Barriere gegenüber der Umwelt auch die Wärmeregulierung, die Energiespeicherung (Fettpolster), der Schutz vor Strahlen (Pigmentierung) und Mikroorganismen. Weiterhin gilt die Haut auch als ein Sinnesorgan. Die oberste Hautschicht (Epidermis) wird von einem dünnen Oberflächenfilm bedeckt, der aus einer wässrigen Lösung von Salzen, Harnstoff, Harnsäure, Aminosäuren, Ammoniak, Zucker, Lipiden, Milchsäure und Ascorbinsäure besteht. Die Lösung wird überwiegend aus den Absonderungen der Talg- und Schweißdrüsen aufgebaut und besitzt einen sauren pH-Wert (pH 4.2 bis 5.6). Dieser sogenannte Säureschutzmantel der Haut übt vor allem eine Schutzwirkung gegenüber Mikroorganismen aus [Bauer 1993]. Er wird durch häufiges Waschen bzw. Waschen mit Seifen abgetragen bzw. zerstört. Bis zum Wiederaufbau des Säureschutzmantels ist die Haut einer verstärkten Wasserverdunstung ausgesetzt, wodurch es zu Austrocknungserscheinungen kommen kann. Eine frühzeitige Rückfettung der Haut kann dem entgegenwirken. Um den physiologischen pH-Wert wiederherzustellen, sind Hautpflegemittel mit einem leicht sauren pH-Wert einzusetzen. Aus dieser Überlegung und aus dem Ergebnis der vorliegenden Arbeit, dass freie Fettsäuren Bindegewebe-abbauende Enzyme in ihrer Aktivität hemmen können, könnte sich als weitergehender Forschungsschwerpunkt, die Untersuchung des Einflusses von freien Fettsäuren in Pflegemitteln, die direkt auf die Haut gebracht werden, ergeben. Als Fragen könnten geklärt werden, inwieweit eine Erhöhung des Fettsäureanteils in Salben die Neubildung des Säureschutzmantels beeinflusst oder ob der Einsatz freier Fettsäuren in Salben das Eindringen von Mirkroorganismen in den Körper behindert.

3.3 Erucasäure

Erucasäure zeigte sich in der vorliegenden Arbeit als potenteste Fettsäure hinsichtlich der Hemmung der Elastase-Aktivität mit einem IC50-Wert von 450nM. Ihre therapeutischen Eigenschaften sollen deshalb näher betrachtet werden.

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Erucasäure gilt, obwohl eine tatsächliche Gefährdung des Menschen experimentell nicht nachgewiesen ist, als eine für die menschliche Ernährung gesundheitsschädliche Fettsäure. Bei Zufuhr hoher Mengen erucasäurereicher Fette (vor allem aus Samen von Brassicaceen: Brassica napus L.) kommt es zu Fettablagerungen im Herzmuskel (Lipidose) bei Ratten. Daraufhin hat man erucasäurearme Rapssorten (bezeichnet als 0-Sorten) gezüchtet, die Öle mit Erucasäuremengen unter 5% liefern. Im Codex Alimentarius wird der Erucasäuregehalt für Speise-Rapsöl auf unter 2% festgelegt [Codex Alimentarius 2004], diese Menge wird auch bei den in Deutschland angebauten Sorten erreicht. Allerdings gibt es keinen Zusammenhang zwischen dem Verzehr von Rapsöl und Herzschäden beim Menschen, so dass die Obergrenze für die empfohlene Tagesdosis anhand der Tierversuche abgeschätzt wird. Inwieweit diese Tierexperimente jedoch auf den Menschen übertragbar sind, ist umstritten. Weiterhin muss festgestellt werden, dass sich bei Wiederholung der Tierversuche mit erucasäurearmen Ölen die Myokarditiden ebenfalls erzeugen ließen. Es scheint also fraglich zu sein, ob die Schädigungen Ausdruck einer spezifischen Toxizität der Erucasäure sind oder nicht vielmehr Folge einer unsachgemäßen Fütterung der Versuchstiere [Lindner 1990, Macholz 1989, Freepedia 2004].

Therapeutisches Interesse hat die Erucasäure als Bestandteil des sogenannten Lorenzo`s Öl (4:1 Mischung von Glycerintrioleat und Glycerintrierucat) zur Behandlung der Adrenoleukodystrophie gefunden. Bei dieser Erkrankung handelt es um eine X-chromosomal vererbte Störung des Metabolismus der Peroxisomen. Sie ist biochemisch gekennzeichnet durch eine unzureichende β-Oxidation von sehr langkettigen gesättigten Fettsäuren vor allem der Cerotinsäure (Hexacosansäure C26:0) aber auch der Lignocerinsäure (Tetracosansäure C24:0). Die daraus folgende abnorme Anhäufung der sehr langkettigen Fettsäuren im ZNS führt zu Demyelinisation (Entmarkung) im ZNS und in deren Folge zu neurologischen Ausfällen. Bei Ablagerung in der Nebenniere kann es zur Atrophie und weiter zu Nebenniereninsuffizienz (Morbus Addison) kommen [van Geel 1999, Krenn 2001]. Es handelt sich bei der Adrenoleukodystrophie um eine seltene Erkrankung mit einer Inzidenz von 1 : 20 000 – 50 000 [Suzuki 2001]. Da die Krankheit X-chromosomal-rezessiv vererbt wird, sind nur Männer betroffen, Frauen sind Konduktoren. Für die klinischen Phänotypen gibt es eine große Variabilität: sie reicht von einer rasch progressiven infantilen Form bis zu einer mild verlaufenden langsam progredienten Adrenomyeloneuropathie [s.a.: Krenn 2001]. Als ein Ziel der Therapie galt die Reduktion der Plasmaspiegel der sehr langkettigen Fettsäuren. Rizzo et al. [Rizzo 1989] konnten unter Behandlung mit Lorenzo`s Öl eine Normalisierung der Plasmaspiegel zeigen. Allerdings konnte im Anschluß daran keine Gruppe eine klinisch relevante Verbesserung der Erkrankung nachweisen. Neuere Studien zeigen, dass eine alleinige Normalisierung der Plasmaspiegel nicht ausreicht, um die Krankheit aufzuhalten oder deren Verlauf abzumildern. Der Effekt des Lorenzo` Öl wird dadurch in Zweifel gezogen und nach Abwägung der Nebenwirkungen eher für den Nichteinsatz plädiert [van Geel 1999, Moser 1999]. Das Problem aller Studien ist, dass aufgrund der geringen Patientenzahlen und der gleichzeitigen großen Variabilität der Phenotypen randomisierte Studien im Prinzip nicht möglich sind. Interessant wäre trotzdem die Untersuchung, ob die Normalisierung der Plasmaspiegel der sehr langkettigen Fettsäuren allein durch eine Konkurrenz der Fettsäuren bei der β-Oxidation bewirkt wird, oder hier nicht auch eine Proteasehemmung eine Rolle spielen könnte.

Einfluss von Naturstoffen und Synthetika auf die Aktivität der humanen neutrophilen Elastase

Vor allem in den letzten Jahren wurden viele Ergebnisse bezüglich der Beeinflussung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase durch Naturstoffe publiziert. Es fällt auf, dass man in einem Großteil der Naturstoffgruppen Vertreter findet, die die Aktivität der Elastase hemmen (Tab. 28):

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Tab. 28: Naturstoffe, die die Aktivität der humanen neutrophilen Elastase hemmen

Naturstoffgruppe

aktivste Verbindung

IC50

Literatur

Isoprenoide

Sesquiterpenlactone

Podachaenin

7µM

Siedle 2002

Triterpene

Lupeol

1.9µM

Mitaine-Offer 2002

Ursolsäure

4µM (Ki)

Ying 1991

Phytosterole

3-O--D-Glucopyranosyl--Sitosterol

Mitaine-Offer 2002

Phenolische Verbindungen

Phenolcarbonsäuren

Fukinolsäure

0.23µM (0.1µg/ml)

Löser 2000

Kaffeesäurebornylester

1.6µM (0.5µg/ml)

Melzig 1999

trans-Drimenylkaffeesäureester

0.2µM

Melzig 2001

3,5-O-Dicaffeoylchinasäure

0.2µM

Cumarin-Derivate

Pochet 2000

Flavonoide

Myricetin

4µM

Sartor 2002a

Hyperosid

0.3µM

Melzig 2001

Catechine

(-)-Epigallocatechin-3-gallat

0.34µM (Ki)

Sartor 2002b

Antibiotika

Makrolide

Erythromycin

3.0µM (Ki)

Gorrini 2001

bei den in der Tab. zitierten Untersuchungen wurde immer als Substrat das N-Methoxysuccinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Val-p-nitroanilid, welches auch in der vorliegenden Arbeit verwendet wurde, eingesetzt

Bei den Elastase-hemmenden Naturstoffgruppen handelt es sich zum einen um hydrophobe Moleküle (z.B. Triterpene, Phytosterole) oder aber phenolische Verbindungen (z.T. mit Gerbstoffeigenschaften), wobei auch hier die Aglyka meist inhibitorisch aktiver als ihre glykosidischen Verbindungen sind. Keine Angaben konnten zu Naturstoffgruppen, wie Anthranoide, Saponine, Alkaloide, Kohlenhydraten oder Ätherisch Öl – Komponenten gefunden werden. Die Frage, ob es sich hierbei um zu polare Verbindungen (Saponine, Anthranoid-Glykoside, Kohlenhydrate, Alkaloide) oder zu kleine Moleküle (Ätherisch Öl – Komponenten) handelt, die die Aktivität des Enzyms nicht beeinflussen oder aber diese Gruppen nur nicht auf eine Aktivitätsbeeinflussung hin getestet wurden, lässt sich an dieser Stelle nicht beantworten. Es wäre bei diesem Enzym wichtig, Testungen mit Naturstoffen, die die Aktivität der Elastase nicht beeinflussen zu veröffentlichen, da sich sonst der Eindruck ergibt, dass die Elastase ein beliebig hemmbares Enzym ist. Dies würde dann auch therapeutische Anwendungen in Frage stellen. In diesem Sinne sind auch Testungen von Extrakten von Drogen, die als antirheumatisch oder antiinflammatorisch wirksam gelten zu bewerten. Die Feststellung, dass eine Droge Elastase-inhibierend wirkt, lässt weder den Rückschluss zu, dass diese Hemmung für diese Droge spezifisch ist (meist werden Drogen, die nicht als antiinflammatorisch oder antirheumatisch gelten, nicht getestet), noch dass im Fall einer antiinflammatorisch / antirheumatisch wirksamen Droge die Elastase-Hemmung das wirksamkeitsbestimmende Prinzip ist. Nicht unerheblich ist auch die Frage, in welcher Form die in vitro getesteten Verbindungen am Wirkort vorliegen. Dazu müssten Resorptions-, Metabolisierungs- und Stabilitätsstudien durchgeführt werden.

Beim Vergleich der in dieser Arbeit bestimmten IC50-Werte der freien Fettsäuren (Tab. 29:) mit den Werten in Tab. 28 musste man feststellen, dass die Aktivität der Fettsäuren (insbesondere der Erucasäure) sich in gleichen Größenordnungen, wie die der jeweils als inhibitorisch-aktivsten Vertreter gefundenen, befindet. Auch das sollte bei der Interpretation von Untersuchungen zur Elastase-Aktivität beachtet werden.

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Tab. 29: Hemmung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase durch ausgewählte Fettsäuren (aus: Tab. 18)

Fettsäure

IC 50 Elastase

[µM]

[µg/ml]

Palmitinsäure

15

3.9

Stearinsäure

10

2.8

Ölsäure

5

1.4

Linolsäure

10

2.8

Erucasäure

0.45

0.2

Ein sehr wichtiger Diskussionspunkt betrifft die physiologische, pathologische und „therapeutische“ Bedeutung der Elastase. Dadurch dass das Enzym in eine Vielzahl von Reaktionsprozessen involviert ist und es ein breites Spektrum an Substraten zu haben scheint (es baut, z.B., fast alle Bestandteile der extrazellulären Matrix ab, s. Einleitung ‎2) ist eine Hemmung der Aktivität der Elastase nur bedingt sinnvoll. Zum einen gibt es für die Reaktionsprozesse andere Enzyme, die die Funktion der Elastase wahrnehmen können, zum anderen soll mitunter nur ein bestimmter Prozess unterdrückt werden. Dies ist bei der Omnipotenz der Elastase schwierig. Bei der Vielzahl der Publikationen und des damit verbundenen großen Interesses der Forschung an der Elastase ist es überraschend, dass bis jetzt kaum Elastase-Hemmer Eingang in die Therapie gefunden haben. Eine Ausnahme ist der ONO-6818 (CP-955), ein oral verfügbarer Elastase-Hemmmer, der derzeit für die Indikationen: rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankungen und chronisch-obstruktive Lungenerkrankungen (chronic obstructive pulmonary disease, COPD) untersucht wird [Ohmoto 2001, Trifilieff 2002].

Proteaseaktivität verschiedener Zelllinien

Eine Voraussetzung für die Invasion von Zellen ist der Abbau der extrazellulären Matrix. Dies geschieht hauptsächlich durch Proteasen. Die Hemmung der Aktivität dieser Proteasen könnte entsprechend eine verminderte Invasion von Zellen bewirken. Bevor also die Invasivität von Zellen mit erheblichen experimentellem Aufwand untersucht wird, sollten Zelllinien zuerst hinsichtlich ihrer Proteaseaktivität untersucht werden. Ziel der Versuche der vorliegenden Arbeit war es, Zellen zu finden, die eine hohe proteolytische Aktivität zeigten und diese Aktivität zu charakterisieren. Es wurden Zellen der Linien ECV-304, MCF-7 und MDA-MB 231 untersucht. Die Bestimmung wurde ähnlich einem Enzymassay durchgeführt, als Enzym(-quelle) fungierte der Überstand der Zellen. Als Substrat diente das Resorufin-markierte Casein (s. Kollagenase-Assay: Exp. Teil ‎3.1.2, MMP-9-Assay: Exp. Teil‎3.3), ein unspezifisches und deshalb als universell bezeichnetes Proteasesubstrat. Mit diesem Substrat war ein großer Teil der Proteaseaktivität erfassbar, allerdings war keine Charakterisierung der Enzyme möglich.

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In der Arbeit wurde festgestellt, dass die Proteaseaktivität der Überstände der Zellen unter den Versuchsbedingungen in der Reihenfolge ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB 231 zunahm.

Um die sezernierten Proteasen zu charakterisieren, wurden Versuche unter Verwendung einer Organoquecksilber-Verbindung (APMA) zur Aktivierung der Proteasen (z.B MMP-2, MMP-9) und unter Verwendung von Chelatbildnern (1.10-Phenanthrolin, EDTA) zur Hemmung von Metalloendopeptidasen durchgeführt. Die Zugabe von 140µM APMA hatte unter den Versuchsbedingungen keinen Effekt auf die Proteaseaktivität. Daraus konnte man jedoch nicht schließen, dass keine mit APMA-aktivierbaren Proteasen sezerniert wurden, da die APMA-Zugabe (aufgrund der Toxizität der Substanz) erst spät durchgeführt wurde. Mögliche sezernierte Proenzyme (z.B. MMP-2, MMP-9) konnten schon durch andere Proteasen aktiviert worden sein. Unter Zusatz von 1mM 1.10-Phenanthrolin und 50µM EDTA verringerte sich die Proteaseaktivität. Allerdings läßt sich nicht ausschließen, dass dieser Effekt auf eine Zellschädigung zurückzuführen war, da die Substanzen auf den Zellen für 24h verblieben. Zytotoxizitätsprüfungen lagen nicht vor.

Abschließend wurde der Einfluss von 50µM γ-Linolensäure auf die Proteaseaktivität getestet. Hier wurden widersprüchliche Ergebnisse erhalten: in zwei Versuchen hemmte die Fettsäure die Proteaseaktivität, in einem Versuch wurde eine erhöhte Proteaseaktivität bestimmt.

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Die Zellen, der als hoch invasiv beschriebenen Zelllinie MDA-MB 231 [Price 1990, Gohla 1996], zeigten in dieser Arbeit die höchste Proteaseaktivität. Mit den Zellen dieser Linie könnten Versuche zur Invasivität durchgeführt werden, auch wenn eine hohe Proteaseaktivität wahrscheinlich noch kein Nachweis für eine hohe Invasivität der Zellen ist. Für die Charakterisierung der Proteasen sollte man auf die Bestimmung mittels ELISA zurückgreifen, da diese Methode spezifisch und meist einfach durchführbar ist (bei Verwendung der industriell hergestellten Kits). Neben den MMPs und der humanen neutrophilen Elastase sollte der Fokus auch auf die Plasminogen-Aktivatoren (tPA: tissue plasminogen activator EC 3.4.21.68; uPA: urokinase plasminogen activator EC 3.4.21.73) gelegt werden, da das durch die Plasminogen-Aktivatoren freigesetzte Plasmin in hohem Maße sowohl zum Abbau von Bestandteilen der extrazellulären Matrix als auch zur Aktivierung von Bindegewebe-abbauenden Enzymen (wie MMPs) befähigt zu sein scheint [Mignatti 1993]. Zytotoxizitätsuntersuchungen müssen für alle zu testenden Substanzen und die entsprechenden Zelllinien vorliegen.

Als Invasionsassay bietet sich der Matrigel-Assay an [Albini 1987]. Bei dieser Methode wird die Migrationsfähigkeit der Zellen durch die Barriere des Matrigels, ein solubilisierter Extrakt der Basalmembran des Englebreth-Holm-Swarm-Tumors mit den Hauptkomponenten Laminin und Kollagen Typ IV, untersucht. Die Quantifizierung der invasiven Zellen kann z.B. durch Auszählen [Albini 1987] oder eine DNA-Bestimmung [Gohla 1996] vorgenommen werden. Der Literatur war zu entnehmen, dass sich die Invasivität von Zellen während der Subkultivierung verändern konnte [Kolkhorst 1998], aber auch der Zusatz unterschiedlicher Substrate [Seftor 1990] oder von Wachstumsfaktoren (TGF ) [Mooradian 1992] konnte zur Veränderung des invasiven Potentials von Zellen führen. Dies wäre zu beachten bei der Durchführung entsprechender Versuche. Auch die parallele Beobachtung von Invasivität und Proteaseaktivität bei unterschiedlichen Versuchsbedingungen erscheint interessant. Wenn ein entsprechender Invasionsassay etabliert würde, wäre eine Untersuchung der Fettsäuren hinsichtlich der Beeinflussung des Migrationsverhaltens der Zellen lohnenswert.

Ausblick

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Screening von Extrakten von Basidiomyceten hinsichtlich einer Beeinflussung von Bindegewebe-abbauenden Enzymen durchgeführt. Aus den beiden näher untersuchten Extrakten von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög. wurde als ein wirksamkeitsbestimmendes Prinzip die Fraktion freier Fettsäuren isoliert. In der anschließenden breitangelegten Untersuchung der freien Fettsäuren wurde eine Hemmung der Aktivität der Bindegewebe-abbauenden Enzyme Clostridium histolyticum Kollagenase, humane neutrophile Elastase und Matrix Metalloproteinase 9 durch Fettsäuren in Abhängigkeit ihrer Kettenlänge und des Sättigungsgrades festgestellt.

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Fortführende Untersuchungen könnten klären, ob die Hemmung der Kollagenase- und MMP-9-Aktivität bzw. der Elastase-Aktivität durch die Fettsäuren spezifisch ist. Dazu sollte der Einfluss der freien Fettsäuren auf andere Metalloendopeptidasen bzw. Serin-Proteasen geprüft werden.

Auch die Untersuchung der Beeinflussung von Hauterkrankungen bzw. Hautveränderungen, die aufgrund einer Schädigung des Säureschutzmantels der Haut entstanden sind, durch freie Fettsäuren erscheint lohnenswert. Ein weiterer Forschungsansatz wäre der lokale Einsatz freier Fettsäuren bei der Behandlung von Entzündungsreaktionen, die mit einer hohen Elastase-Aktivität bzw. einer hohen bakteriellen Kollagenase-Aktivität einhergehen, wie die Paradontitits oder Gingivitis.

Weitere Arbeiten mit Protease-aktiven bzw. invasiven Zellen könnten prüfen, ob sich die Proteaseaktivität hemmen und die Invasivität der Zellen durch freie Fettsäuren vermindern läßt. Sollte dies in vitro nachweisbar sein, würde sich ebenfalls eine Untersuchung in vivo anbieten.


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10.11.2006