Studien zur Beeinflussung Bindegewebe-abbauender Proteasen
durch Basidiomyceten-Extrakte und deren Inhaltsstoffe,
unter besonderer Berücksichtigung der Fraktion freier Fettsäuren

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Pharmazie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt Universität zu Berlin

von
Diplom-Pharmazeutin Beate Rennert
geboren am 21.06.1973 in Berlin

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. J. Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Th. J. Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. M.F. Melzig
2. Prof. Dr. H.-H. Borchert
3. Prof. Dr. G. Reznicek

Tag der mündlichen Prüfung: 26.08.2005

Inhaltsverzeichnis

• Einleitung
  • 1  Bindegewebe-abbauende Proteasen
  • 2  Basidiomyceten: Einfluss auf Serin- und Metalloendopeptidasen
  • 3  Problemstellung
• Untersuchungen und Ergebnisse
  • 1  Vorversuche und Methodenoptimierung
    • 1.1  Bestimmung der Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase
    • 1.2 Bestimmung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase
    • 1.3 Bestimmung der Aktivität der Matrix-Metalloproteinase 9
    • 1.4 Bestimmung der Zytotoxizität
  • 2  Screening von Basidiomyceten-Extrakten: Beeinflussung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase
  • 3  Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög.: Botanik, Inhaltsstoffe und Bedeutung
    • 3.1  Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.
    • 3.2  Lactarius deterrimus Grög.
  • 4  Isolation und Charakterisierung von Verbindungen mit Wirkung auf die Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase und der humanen neutrophilen Elastase
    • 4.1  Einfluss der Extrakte auf die Enzymaktivität
    • 4.2 Aktivitätsgeleitete Fraktionierung der Dichlormethan-Extrakte
    • 4.3 Bestimmung des Fettsäureanteils mittels GC-MS
  • 5  Freie langkettige Fettsäuren: Einfluss auf die Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase und der humanen neutrophilen Elastase
  • 6  Beeinflussung der Aktivität der Matrix-Metalloproteinase 9 durch ausgewählte freie langkettige Fettsäuren
  • 7  Bestimmung der Zytotoxizität
    • 7.1  Extrakte
    • 7.2 Fettsäuren
  • 8  Proteaseaktivität verschiedener Zelllinien und ihre Beeinflussung
    • 8.1  Proteaseaktivität verschiedener Zelllinien
    • 8.2  Einfluss von APMA
    • 8.3  Einfluss von 1.10-Phenanthrolin, EDTA und γ-Linolensäure
• Diskussion
  • 1  Einfluss der Basidiomyceten-Extrakte auf die Aktivität der humanen neutrophilen Elastase
  • 2  Aktivitätsgeleitete Fraktionierung
  • 3  Freie langkettige Fettsäuren
    • 3.1  Einfluss auf die Aktivität der Enzyme
    • 3.2  Physiologische und therapeutische Bedeutung
    • 3.3 Erucasäure
  • 4  Einfluss von Naturstoffen und Synthetika auf die Aktivität der humanen neutrophilen Elastase
  • 5  Proteaseaktivität verschiedener Zelllinien
  • 6  Ausblick
• Experimenteller Teil
  • 1  Geräte
  • 2  Material
    • 2.1  Enzyme
    • 2.2  Drogenmaterial
    • 2.3 Zelllinien
    • 2.4  Fettsäuren
    • 2.5 Chemikalien, Reagenzien und Zellmedien
  • 3  Methoden
    • 3.1  Bestimmung der Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase
      • 3.1.1  Methode unter Verwendung des Pz-peptids
      • 3.1.2 Methode unter Verwendung von Resorufin-markiertem Casein
    • 3.2 Bestimmung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase
    • 3.3 Bestimmung der Aktivität der Matrix-Metalloproteinase 9
    • 3.4 Herstellung der Pilzextrakte
    • 3.5  Isolation und Identifizierung der Fettsäuren
      • 3.5.1  Dünnschichtchromatographie
      • 3.5.2  Säulenchromatographie
      • 3.5.3 Isolation der Fettsäuren – Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.
      • 3.5.4 Isolation der Fettsäuren – Lactarius deterrimus Grög.
      • 3.5.5 Gaschromatographie-Massenspektrometrie
    • 3.6  Bestimmung der Zytotoxizität
    • 3.7 Nachweis von Proteaseaktivität im Überstand der Zellen
    • 3.8 Mathematische Berechnungen und statistische Methoden
• Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Eigene Veröffentlichungen
• Danksagung
• Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Einfluss der Dichlormethan-Extrakte von Basidiomyceten auf die Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase
• Tab. 2: Einfluss von DMSO auf die Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase
• Tab. 3: Vergleich der Methoden zur Bestimmung der Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase
• Tab. 4: Einfluss von DMSO auf die Aktivität der humanen neutrophilen Elastase
• Tab. 5: Einfluss unterschiedlicher Enzymaktivitäten auf die Bestimmungsmethode der MMP-9
• Tab. 6: Einfluss der Aktivierungsdauer (APMA) auf die MMP-9-Aktivität
• Tab. 7: Vergleich der Aktivierung der MMP-9 durch APMA und Trypsin
• Tab. 8: Einfluss von DMSO auf die Aktivität der Matrix-Metalloproteinase 9
• Tab. 9: Vergleich der Inkubationsdauer von MTT im Zytotoxizitätstest
• Tab. 10: Vergleich des Einflusses unterschiedlicher Mengen MTT im Zytotoxizitätstest
• Tab. 11: Einfluss von DMSO auf die Zellzahl (MTT-Test)
• Tab. 12: Einfluss der Basidiomyceten-Extrakte auf die Aktivität der humanen neutrophilen Elastase
• Tab. 13: Einfluss der Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög. auf die Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase und der humanen neutrophilen Elastase
• Tab. 14: Quantitative Bestimmung des Fettsäuregehaltes der Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. durch GC-MS (Angabe in µg/100µg Extrakt)
• Tab. 15: Quantitative Bestimmung des Fettsäuregehaltes der Extrakte von Lactarius deterrimus Grög. durch GC-MS (Angabe in µg/100µg Extrakt)
• Tab. 16: Quantitative Bestimmung des Fettsäuregehaltes der Fraktionen von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. durch GC-MS (Angabe in µg/100µg Extrakt)
• Tab. 17: Quantitative Bestimmung des Fettsäuregehaltes der Fraktionen von Lactarius deterrimus Grög. durch GC-MS (Angabe in µg/100µg Extrakt)
• Tab. 18: Hemmung der Aktivität der Clostridium histolyticum Kollagenase und der humanen neutrophilen Elastase durch freie langkettige Fettsäuren
• Tab. 19: Einfluss freier langkettiger Fettsäuren auf die Aktivität der Matrix-Metalloproteinase 9
• Tab. 20: Einfluss der Extrakte auf Zellen der Linie ECV-304
• Tab. 21: Einfluss der Fettsäuren auf Zellen der Linie ECV-304
• Tab. 22: Einfluss der Inkubationsdauer auf die Proteasesekretion
• Tab. 23: Einfluss der Zellzahl auf die Proteasesekretion
• Tab. 24: Vergleich der Proteaseaktivität verschiedener Zelllinien
• Tab. 25: Einfluss von APMA auf die Proteaseaktivität
• Tab. 26: Einfluss von 1.10-Phenanthrolin auf die Proteaseaktivität
• Tab. 27: Einfluss von EDTA und γ-Linolensäure auf die Proteaseaktivität
• Tab. 28: Naturstoffe, die die Aktivität der humanen neutrophilen Elastase hemmen
• Tab. 29: Hemmung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase durch ausgewählte Fettsäuren (aus: Tab. 18)

Bilder

• Abb. 1: Abhängigkeit der Zahl der Fluoreszenzeinheiten von der enzymatischen Aktivität im Kollagenase-Assay
• Abb. 2: Abhängigkeit der Zahl der Fluoreszenzeinheiten von der Inkubationsdauer im Kollagenase-Assay
• Abb. 3: Abhängigkeit der Absorption von der Substratkonzentration im Elastase-Assay
• Abb. 4: Abhängigkeit der Absorption von der enzymatischen Aktivität im Elastase-Assay
• Abb. 5: Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. [Mykonet 2003]
• Abb. 6: Lactarius deterrimus Grög. [Mykonet 2003]
• Abb. 7: Clostridium histolyticum Kollagenase: Einfluss der Fraktionen A-M (Säule 1) aus dem DCM-Extrakt von H. annosum (Konzentration: 200µg/ml)
• Abb. 8: Humane neutrophile Elastase: Einfluss der Fraktionen A-M (Säule 1) aus dem DCM-Extrakt von H. annosum (Konzentration: 2µg/ml)
• Abb. 9: Clostridium histolyticum Kollagenase: Einfluss der Fraktionen E3.2-E3.8 (Säule 3) aus dem DCM-Extrakt von H. annosum (Konzentrationen: 200/100/50µg/ml)
• Abb. 10: Clostridium histolyticum Kollagenase: Einfluss der Fraktionen B-N (Säule 1) aus dem DCM-Extrakt von L. deterrimus (Konzentrationen: 200/20µg/ml)
• Abb. 11: Humane neutrophile Elastase: Einfluss der Fraktionen B-N (Säule 1) aus dem DCM-Extrakt von L. deterrimus (Konzentrationen: 20/2/0.2µg/ml)
• Abb. 12: Massenspektren der Methylester von C18:1-Fettsäuren: x-C18:1, Elaidinsäure, Ölsäure
• Abb. 13: Gaschromatogramme Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.: PE-Extrakt, DCM-Extrakt und DCM-H₂O-Extrakt
• Abb. 14: Gaschromatogramme Lactarius deterrimus Grög.: PE-Extrakt, DCM-Extrakt und DCM-H₂O-Extrakt
• Abb. 15: Clostridium histolyticum Kollagenase: Dosis-Effekt-Kurven ausgewählter Fettsäuren
• Abb. 16: Humane neutrophile Elastase: Dosis-Effekt-Kurven ausgewählter Fettsäuren
• Abb. 17: Clostridium histolyticum Kollagenase: Einfluss freier langkettiger Fettsäuren [50µM]
• Abb. 18: Humane neutrophile Elastase: Einfluss freier langkettiger Fettsäuren [5µM]