aus Clostridium histolyticum Kulturen isoliert,
Enzymaktivität: 180U/mg Protein
(Worthington Biochemicals Corporation, Freehold, New Jersey, USA)

aus menschlichen neutrophilen Granulozyten isoliert,
Enzymaktivität: 20U/mg Protein
(ICN Biomedicals GmbH, Eschwege)

aus menschlichem Blut isoliert,
Enzymaktivität: 200U/mg
(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)

Für das Screening der Basidiomyceten-Extrakte hinsichtlich einer Beeinflussung der Elastase-Aktivität wurden die in der Diplomarbeit [Rennert 1998] hergestellten Extrakte verwendet.

Für die aktivitätsgeleitete Fraktionierung wurde von neuem Drogenmaterial ausgegangen. Die Fruchtkörper von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. wurden von Frau Prof. Dr. U. Lindequist (Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald) zur Verfügung gestellt. Sie wurden am 30.09.1998 von Fichten in Nehringen (bei Grimmen, Mecklenburg-Vorpommern) gesammelt. Die Fruchtkörper von Lactarius deterrimus Grög. wurden selbst am 09.09.2000 in einer Fichtenschonung bei Bad Sülze (Mecklenburg-Vorpommern) gefunden. Die Identifizierung erfolgte durch Herrn Prof. H. Kreisel und Herrn Dr. N. Amelang (beide: Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald). Die Pilze wurden jeweils gesäubert, tiefgefroren und anschließend lyophilisiert.

(DSMZ: ACC 310)

ECV-304 ist eine humane Harnblasen-Karzinom Zelllinie, die als abgeleitete Linie von T-24 betrachtet werden kann. Sie wurde früher als humane Nabelschnur-Endothelzelllinie beschrieben [Takahashi 1990], jedoch beweisen DNA-Analysen die Verwandtschaft der T-24 Linie zu der von der DSMZ ausgegebenen ECV-304 Linie [Dirks 1999].

Kultivierung:
Die Zellen wurden im Medium 199 EARLE (mit 2.2g/l NaHCO₃ und 0.177g/l N-Acetyl-L-alanyl-L-glutamin) unter Zusatz von 10% fetalem Kälberserum bei 37°C und unter 5%CO₂-Atmosphäre als Monolayer kultiviert. Die Subkultivierung erfolgte unter Verwendung von Trypsin / EDTA – Lösung 1x wöchentlich, mit einem Teilungsverhältnis von etwa 1:13.

(ATCC: HTB-22, DSMZ: ACC 115)

Die Zelllinie wurde von Frau Dr. H. Tullberg (Universität Basel) zur Verfügung gestellt.

MCF-7 ist eine humane Brust-Adenokarzinom Zelllinie und gilt als Estrogen-Rezeptor positiv.

Kultivierung:
Die Zellen wurden im MEM-EARLE (mit 2.2g/l NaHCO₃ und 0.516g/l N-Acetyl-L-alanyl-L-glutamin) unter Zusatz von 10% fetalem Kälberserum, 1% nichtessentiellen Aminosäuren und 1% Natriumpyruvat bei 37°C und unter 5%CO₂-Atmosphäre als Monolayer kultiviert. Die Subkultivierung erfolgte unter Verwendung von Trypsin / EDTA – Lösung 1x wöchentlich, mit einem Teilungsverhältnis von etwa 1:6. Zusätzlich wurde 2x wöchentlich das Medium gewechselt.

(ATCC: HTB-26)

Die Zelllinie wurde von Herrn Prof. Dr. H.R. Maurer (Freie Universität Berlin) zur Verfügung gestellt.

MDA-MB-231 ist eine humane Brust-Adenokarzinom Zelllinie und gilt als Estrogen-Rezeptor negativ.

Kultivierung:
Die Zellen wurden im RPMI-Medium 1640 (mit 2.0g/l NaHCO₃ und stabilem Glutamin) unter Zusatz von 10% fetalem Kälberserum bei 37°C und unter 5%CO₂-Atmosphäre als Monolayer kultiviert. Die Subkultivierung erfolgte unter Verwendung von Trypsin / EDTA – Lösung alle 3-4 Tage, mit einem Teilungsverhältnis von etwa 1:10. Zusätzlich wurde nach 2 Tagen das Medium gewechselt.

IUPAC-Bezeichnung

Kurzformel

Trivialname

Reinheitsgrad

n-Dodecansäure

C12:0

Laurinsäure

≥ 99%

n-Tetradecansäure

C14:0

Myristinsäure

≥ 99.5% (GC)

n-Pentadecansäure

C15:0

ca. 99% (GC)

n-Hexadecansäure

C16:0

Palmitinsäure

> 99% (GC)

n-Heptadecansäure

C17:0

ca. 99%

n-Octadecansäure

C18:0

Stearinsäure

> 99% (GC)

n-Nonadecansäure

C19:0

ca. 99%

n-Eicosansäure

C20:0

Arachinsäure

≥ 99% (GC)

n-Docosansäure

C22:0

Behensäure

ca. 99%

cis-6-Hexadecensäure

C16:1 (cis-9)

Palmitoleinsäure

ca. 99% (GC)

cis-9-Octadecensäure

C18:1 (cis-9)

Ölsäure

> 99% (GC)

cis,cis-9,12-Octadecadiensäure

C18:2 (cis-9,12)

Linolsäure

min. 99%

cis, cis, cis-9,12,15-Octadecatriensäure

C18:3 (cis-9,12,15)

α-Linolensäure

min. 99%

cis, cis, cis-6,9,12-Octadecatriensäure

C18:3 (cis-6,9,12)

γ-Linolensäure

min. 99%

cis, cis, cis, cis, cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaensäure

C20:05 (cis-5,8,11,14,17)

97.49%

cis-13-Docosensäure

C22:1 (cis-13)

Erucasäure

≥ 99% (GC)

cis, cis, cis, cis, cis, cis, cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaensäure

C22:06 (cis-4,7,10,13,16,19)

98.31%

Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland:

Myristinsäure, Arachinsäure

Merck KGaA, Darmstadt:

Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure

Redinomedica AG, Bielefeld:

Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure

Carl Roth GmbH, Karlsruhe:

Erucasäure

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen:

Pentadecansäure, Heptadecansäure, Nonadecansäure, Behensäure, Palmitoleinsäure, Linolsäure, α-Linolensäure, γ-Linolensäure

APMA

ICN Biomedicals GmbH, Eschwege

DMSO (Uvasol^®)

Merck KGaA, Darmstadt

EDTA

Merck KGaA, Darmstadt

Fetales Kälberserum

Biochrom KG, Berlin

Medium 199 EARLE (1x)
(mit 2.2g/l NaHCO₃ und 0.177g/l N-Acetyl-L-alanyl-L-glutamin)

Biochrom KG, Berlin

MEM-EARLE (1x)
(mit 2.2g/l NaHCO₃ und 0.516g/l N-Acetyl-L-alanyl-L-glutamin)

Biochrom KG, Berlin

MTT

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

Natriumpyruvat (100mM)

Biochrom KG, Berlin

Nicht-essentielle Aminosäuren (100x)

Biochrom KG, Berlin

N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-Nitroanilid

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

PBS-Puffer (1x) ohne Ca²⁺, Mg²⁺

Biochrom KG, Berlin

1.10-Phenanthrolin

Merck KGaA, Darmstadt

Pz-peptid

Bachem Biochemica GmbH, Heidelberg

Quarz

Merck KGaA, Darmstadt

RPMI 1640 (1x)
(mit 2.0g/l NaHCO₃ und stabilem Glutamin)

Biochrom KG, Berlin

Trichloressigsäure

Merck KGaA, Darmstadt

Tricin

Merck KGaA, Darmstadt

Tris

Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg

Triton^® X-100

Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Trypsin (EC 3.4.21.4)

Spofa, Praha, Czech republic

Trypsin/EDTA-Lösung [0.05%/0.02% (m/V)] in PBS ohne Ca²⁺, Mg²⁺

Biochrom KG, Berlin

Trypsin-Inhibitor (type I-S: from soybean)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

Universelles Proteasensubstrat [casein, labeled with N-(resorufin-4-carbonyl)-piperidine-4-carbonic acid]

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Alle weiteren Chemikalien oder Lösungsmittel wurden von den Firmen Merck KGaA und Sigma-Aldrich Chemie GmbH bezogen.

Zur Herstellung der wässrigen Basidiomyceten-Extrakte, zur Extraktion der DCM-Extrakte und zur Herstellung der wässrigen Lösungen (Puffer etc.) wurde Aqua bidest. (pH 4.5-6.0) verwendet.

Für die Bestimmung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase wurde das Substrat N-Methoxysuccinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Val-p-nitroanilid [Nakajima 1979] genutzt. Nach Hydrolyse des Substrates konnte das freigesetzte p-Nitroanilin spektrophotometrisch (bei λ=405nm) bestimmt werden [Stein 1983].

Die Bestimmung wurde, wie folgt, durchgeführt: das Substrat wurde in DMSO gelöst und anschließend mit Tris-HCl-Puffer (60mM, pH 7.5) verdünnt (10mM Substrat-Stammlösung, 5% DMSO). 125µl Substratlösung (1.4mM) wurden mit 455µl Tris-HCl-Puffer (60mM, pH 7.5) gemischt. Nach Zugabe von 20µl Enzymlösung (2.5mU, Aqua bidest.) wurden die Proben für 60min bei 37°C (Wasserbad) inkubiert. Der Reaktionsstopp erfolgte mit 500µl Trypsin-Inhibitor-Lösung (0.2mg/ml Tris-HCl-Puffer 60mM, pH 7.5). Anschließend wurde die Absorption der Lösung bei λ=405nm (Spaltbreite: 1.5nm) vermessen.

Zur Bestimmung der MMP-9-Aktivität wurde das Resorufin-markierte Casein (Universelles Proteasensubstrat) genutzt. Wie bereits unter Exp. Teil ‎3.1.2 beschrieben, handelte es sich beim Resorufin-markierten Casein um ein unspezifisches Substrat, welches unter Proteaseeinwirkung zu mit Trichloressigsäure nicht fällbaren Resorufin-markierten Peptiden abgebaut werden konnte. Die Konzentration der im Überstand befindlichen Resorufin-markierten Peptide war ein Maß für die Proteaseaktivität und wurde fluorimetrisch bestimmt. Da die MMP-9 als inaktives Proenzym vorlag, musste sie vor der Inkubation mit dem Substrat mit Hilfe der Organoquecksilber-Verbindung p-Aminophenyl-Quecksilberacetat (APMA) in die aktive Form überführt werden.

Die Bestimmung wurde folgendermaßen durchgeführt: zur Herstellung der APMA-Verdünnung wurde 1 Teil APMA-Stammlösung (10mM in 100mM NaOH) mit 3 Teilen TTC-Puffer (Tris-HCl: 50mM, pH 7.5, 0.05% Triton^® X-100, 5mM CaCl₂) gemischt. Diese Lösung wurde mit 1N HCl auf einen pH-Wert von 7.0-7.5 eingestellt. Zur Aktivierung der MMP-9 wurden 7.5µl APMA-Verdünnung, 7.5µl TTC-Puffer (Tris-HCl: 50mM, pH 7.5, 0.05% Triton^® X-100, 5mM CaCl₂) und 2.5µl MMP-9-Lösung (250µU) gemischt und für 30min bei 37°C (Wasserbad) belassen. Anschließend wurden 50µl Tris-HCl-Puffer (0.2M, pH 7.4) und 82.5µl Aqua bidest. zugesetzt. Nach Durchmischung und Zugabe von 50µl Substratlösung (0.04%, m/V, Aqua bidest.) wurden die Proben für 4h bei 37°C (Wasserbad) inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 480µl 5%iger TCA-Lösung (m/V, Aqua bidest.) und anschließender Inkubation (10min bei 37°C) gestoppt. Nach Zentrifugation (5min, 10000g) wurden 400µl Überstand abgenommen. Der Überstand wurde mit 600µl Tris-HCl-Puffer (0.5M, pH 8.8) gemischt und anschließend wurden sofort die Fluoreszenzeinheiten der Proben bestimmt (λ_ex= 574nm, λ_em= 584nm, Spaltbreite: jeweils 3nm).

Für die Versuche unter Verwendung von Trypsin (EC 3.4.21.4) als Aktivator der MMP-9 wurden 2.5µl MMP-9-Lösung (250µU) und 15µl Trypsin-Lösung (400µg/ml Aqua bidest.) gemischt und für 30min bei 37°C (Wasserbad) belassen. Anschließend wurde die Aktivität von Trypsin durch Zugabe von 65µl Trypsin-Inhibitor-Lösung (2mg/ml Aqua bidest.) gehemmt. Es erfolgte der Zusatz von 50µl Tris-HCl-Puffer (0.2M, pH 7.4) und 17.5µl Aqua bidest. Nach Durchmischung und Zusatz von 50µl Substratlösung (0.04%, m/V, Aqua bidest.) wurden die Proben für 4h bei 37°C (Wasserbad) inkubiert. Weiteres Vorgehen s. oben.

Für das Screening wurden die in der Diplomarbeit von Rennert [Rennert 1998] hergestellten Extrakte verwendet: die Extraktion erfolgte nach der Zerkleinerung des Drogengutes mittels Schlagmühle zunächst mit Aqua dest. in einer Schüttelmaschine für 4h bei Raumtemperatur. Dazu wurde 1g Droge mit 10ml Aqua dest. versetzt. Nach Filtration wurden Drogenrückstände und Extrakte lyophilisiert. Zur Gewinnung der Dichlormethan-Extrakte wurden die lyophilisierten Drogenrückstände mit Dichlormethan für 4h bei 25°C im Wasserbad gleichmäßig geschüttelt (1g Droge mit 10ml DCM). Nach Filtration erfolgte das Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck bei max. 35°C Wasserbadtemperatur.

50.6g lyophilisiertes Drogenmaterial wurden in der Schlagmühle zerkleinert und mit Quarzsand verrieben. Die Extraktion erfolgte in der Reihenfolge: Petrolether, Dichlormethan, Aqua bidest. Die zerkleinerte Droge wurde mit Extraktionsmittel versetzt (Verhältnis: 1g Droge inkl. Quarzsand und 10ml Lösungsmittel) und für 4h bei 35°C im Wasserbad gleichmäßig geschüttelt (Schüttelmaschine). Anschließend wurde filtriert. Das Lösungsmittel (Petrolether bzw. Dichlormethan) wurde unter vermindertem Druck bei max. 35°C Wasserbadtemperatur abgedampft und der Rohextrakt erhalten. Das aus der Extraktion mit Aqua bidest. erhaltene Filtrat wurde lyophilisiert. Die Extraktion mit Dichlormethan wurde zweimal durchgeführt, mit Petrolether und Aqua bidest. wurde jeweils einmal extrahiert. Der erhaltene Dichlormethan-Extrakt wurde mit 100ml Dichlormethan aufgenommen und 3x mit 50ml Aqua bidest. ausgeschüttelt. Die Lösungsmittelphasen wurden getrennt: das Dichlormethan wurde unter vermindertem Druck abgedampft, der wässrige Extrakt lyophilisiert.

Ausbeuten Extraktion:

Petrolether-Extrakt:

0.4g

Dichlormethan-Extrakt:

0.6g

Wässriger Extrakt:

3.4g

Ausbeuten Dichlormethan-H₂O-Extraktion:

Dichlormethan-Extrakt:

0.56g

Dichlormethan-H₂O-Extrakt:

0.04g

78.1g lyophilisiertes Pilzmaterial wurde vor der Extraktion in der Schlagmühle zerkleinert und mit Quarzsand verrieben. Es wurde in folgender Reihenfolge extrahiert: Petrolether, Dichlormethan, Methanol, Aqua bidest. Dazu wurde das zerkleinerte Material mit dem Extraktionsmittel versetzt (Verhältnis: 1g Droge inkl. Quarzsand und 10ml Lösungsmittel) und für 4h bei 35°C im Wasserbad in einer Schüttelmaschine belassen. Anschließend wurde filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft (bei max. 35°C Wasserbadtemperatur). Der wässrige Extrakt wurde lyophilisiert. Die Extraktionen mit Petrolether und Dichlormethan wurden jeweils zweimal durchgeführt, mit Methanol und Aqua bidest. wurde jeweils einmal extrahiert. Der Dichlormethan-Extrakt wurde anschließend mit 200ml Dichlormethan aufgenommen und 3x mit jeweils 100ml Aqua bidest. ausgeschüttelt, die Phasen wurden getrennt und anschließend das Lösungsmittel abgedampft bzw. lyophilisiert.

Ausbeuten Extraktion:

Petrolether-Extrakt:

6.2g

Dichlormethan-Extrakt:

1.7g

Methanol-Extrakt:

8.6g

Wässriger Extrakt:

13.9g

Ausbeuten Dichlormethan-H₂O-Extraktion:

Dichlormethan-Extrakt:

1.35g

Dichlormethan-H₂O-Extrakt:

0.24g

Die Bestimmung der Zytotoxizität der Extrakte und Fettsäuren wurde an der ECV-304 Zelllinie (Passage 33-38 und Passage 45-50) vorgenommen.

Die Bestimmung der Zahl der lebenden Zellen erfolgte mit Hilfe des MTT-Testes. Dieser erlaubte über den Nachweis der Aktivität mitochondrialer Dehydrogenasen eine indirekte Bestimmung der Zellzahl. Aktive mitochondriale Dehydrogenasen wandelten das wasserlösliche gelbe Tetrazoliumsalz MTT durch Spaltung des Tetrazoliumringes in unlösliches violettes Formazan um [Mosmann 1983]. Das auskristallisierte Formazan wurde anschließend zur spektrophotometrischen Bestimmung gelöst. Der Test wurde entsprechend der Literatur [Freshney 1990] durchgeführt:

Die Bestimmung erfolgte unter Verwendung von 96 well plates. Pro Kavität wurden ca. 1000 Zellen (Casy^®1 TT) in 100µl Medium [Medium 199 EARLE (1x) (mit 2.2g/l NaHCO₃ und 0.177g/l N-Acetyl-L-alanyl-L-glutamin) unter Zusatz von 10% fetalem Kälberserum] ausgesät. Nach 24h Inkubation (37°C, 5%CO₂, Brutschrank) wurden die zu untersuchenden Substanzen (in 100µl Medium) aufgegeben. Nach 4 Tagen weiterer Inkubation (37°C, 5%CO₂, Brutschrank) wurden pro Kavität 20µl der MTT-Lösung (5mg/ml PBS-Puffer) zugegeben, die Platte wurde 3min geschüttelt und für 2h im Inkubator (37°C, 5%CO₂) belassen. Anschließend wurden das Medium und die MTT-Lösung entfernt und pro Kavität 100µl DMSO zugegeben. Die Platte wurde für 15min geschüttelt und die Absorption bei λ=580nm (Hintergrundwellenlänge: λ=620nm) im Plattenphotometer vermessen.

Die Untersuchungen zum Nachweis von Proteaseaktivität im Überstand der Zellen wurden an Zellen der Linien ECV-304 (Passage 37-48), MCF-7 (Passage 44-48 und Passage 62-64) und MDA-MB 231 (Passage 5-10 und Passage 24-26) vorgenommen.

Für die Bestimmung der Proteaseaktivität im Überstand der Zellen wurden die Zellen ausgesät und kultiviert. Nach Zugabe des Resorufin-markierten Caseins (Universelles Proteasensubstrat) und dessen Inkubation mit den Zellen, konnten die abgebauten mit TCA nicht-fällbaren Peptide fluorimetrisch ermittelt werden (s. auch Exp. Teil ‎3.1.2). Die Bestimmung wurde, wie folgt, durchgeführt:

Unter Verwendung von 24 well plates wurden pro Kavität ca. 100 000 Zellen (Casy^®1 TT) in 100 µl Medium ausgesät. Nach Zugabe von 900µl Medium erfolgte die Inkubation 4 Tage bei 37°C und 5% CO₂ im Brutschrank. Nach Abnahme des Mediums wurden die Zellen zweimal mit je 450µl PBS-Puffer gewaschen. Anschließend wurden 450µl Glucose-PBS-Puffer (1g/l) und 50µl Proteasensubstrat (1mg/ml Aqua bidest.) für 24h auf den Zellen belassen (37°C, 5%CO₂, Brutschrank). Um die Reaktion zu beenden, wurden 200µl Überstand abgenommen und mit 480µl TCA-Lösung (5%, m/V) versetzt. Nach Inkubation (10min bei 37°C, Wasserbad) wurde für 5min bei 10000g zentrifugiert. 400µl Überstand wurden mit 600µl Tris-HCl-Puffer (0.5M, pH 8.8) gemischt und sofort die Fluoreszenzeinheiten der Proben bestimmt (λ_ex= 574nm, λ_em= 584nm, Spaltbreite: jeweils 3nm).

Die Daten sind als Mittelwert von 2 – 5 unabhängigen Experimenten mit je 2 Proben dargestellt. Als Streuungsmaß wurden die Standardabweichung (SD, bei mindestens 3 unabhängigen Experimenten) oder die Spannweite (R, bei 2 unabhängigen Experimenten) verwendet. Die Prüfung auf Signifikanz der Unterschiede der Mittelwerte erfolgte mit dem Mann-Whitney-Test.

Die Daten sind als Mittelwert von 2 – 5 unabhängigen Experimenten mit je 1 – 2 Proben dargestellt. Als Streuungsmaß wurde die Spannweite (R) verwendet.

Die Daten sind als Mittelwert von 3 – 4 unabhängigen Experimenten mit je 8 Proben dargestellt. Als Streuungsmaß wurde die Standardabweichung (SD) verwendet. Die Prüfung auf Signifikanz der Unterschiede der Mittelwerte erfolgte mit dem Mann-Whitney-Test.

Die Daten sind als Mittelwert von 1 – 4 unabhängigen Experimenten mit je 4 Proben dargestellt. Als Streuungsmaß wurde die Spannweite (R, bei 2 unabhängigen Experimenten) oder die Standardabweichung (SD, bei mindestens 3 unabhängigen Experimenten) verwendet.