Aus der Franz-Volhard-Klinik
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Linksventrikuläre Expression verschiedener Housekeeping-Gene bei kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Jeannine Rettschlag

aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. PD Dr. med. Roland Willenbrock
2. Prof. Dr. P. Persson
3. Prof. Dr. med. R. H. G. Schwinger

Datum der Promotion: 12.12.2003

Zusammenfassung

Das Ziel dieser Arbeit war es einen geeigneten internen Standard für die linksventrikuläre mRNA-Quantifizierung bei kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz in der Ratte zu finden. Die mRNA-Expression von GAPDH, 18SrRNA, Cyclophilin and Porphobilinogen-Desaminase (PBGD) wurde vier Wochen nach Induktion von Hypertrophie (kleiner aortokavaler Shunt) und Herzinsuffizienz (großer aortokavaler Shunt bzw. Myokardinfarkt) mit Hilfe des Ribonuklease Protektion Assay (RPA) und der TaqMan® PCR bestimmt. Die linksventrikuläre ANP-mRNA-Expression war in allen untersuchten Modellen unabhängig von der angewendeten Detektionsmethode erhöht.

Die mRNA-Expression der Housekeeping Gene mit Hilfe des RPA bestimmt, war in allen untersuchten Modellen im Vergleich zu den Kontrollen unverändert (GAPDH: kleiner Shunt: 105.1±7.4, großer Shunt: 105.2±6.8, MI: 88.4±3.7; 18SrRNA: kleiner Shunt: 110.7±8.2, großer Shunt: 104.4±8.9, MI: 107.5±12.0; Cyclophilin: kleiner Shunt: 96.4±7.9, großer Shunt: 112.9±4.9, MI: 95.7±13.8; PBGD: kleiner Shunt: 81.9±6.3, großer Shunt: 83.7±4.7, MI: 79.8±9.7; % Kontrolle). In der sehr sensitiven TaqMan® PCR zeigte sich eine veränderte mRNA-Expression von GAPDH, PBGD und Cyclophilin, lediglich 18S wurde unverändert exprimiert (GAPDH: kleiner Shunt: 114.5±18.7, großer Shunt: 133.6±19.1, MI: 64.2±6.2, p<0.01; 18SrRNA: kleiner Shunt : 100.5±18.1, großer Shunt: 109.7±15.8, MI: 122.7±13.0; Cyclophilin: kleiner Shunt: 110.7±8.0, großer Shunt: 166.8±19.2, p<0.01, MI: 80.0±9.4; PBGD: kleiner Shunt: 109.2±14.4, großer Shunt: 116.8±7.1, MI: 62.8±6.3, p<0.01; % Kontrolle).

Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass 18SrRNA aufgrund der unabhängig von der verwendeten Quantifizierungsmethode stabilen Expression, für die kardiale RNA-Quantifizierung in den untersuchten Tiermodellen am besten geeignet ist.

Eigene Schlagwörter: Housekeeping-Gene, GAPDH, 18SrRNA, Cyclophilin, Porphobilinogen Desaminase, Herzinsuffizienz

Abstract

The purpose of this study was to identify an appropriate left ventricular mRNA as internal standard in gene expression analysis in cardiac hypertrophy and heart failure in the rat. Expression levels of GAPDH, 18SrRNA, Cyclophilin and porphobilinogen desaminase (PBGD) were measured four weeks after induction of either cardiac hypertrophy (small aortocaval shunt) or heart failure (large aortocaval shunt or myocardial infarction) using Ribonuclease protection assay (RPA) and TaqMan® PCR.

The left ventricular expression of ANP mRNA was increased in all these experimental models independently of the used method. Using RPA the mRNA expression of all studied housekeeping genes was unchanged in all experimental models compared to controls (GAPDH: small shunt: 105.1±7.4, large shunt: 105.2±6.8, MI: 88.4±3.7; 18SrRNA: small shunt: 110.7±8.2, large shunt: 104.4±8.9, MI: 107.5±12.0; Cyclophilin: small shunt: 96.4±7.9, large shunt: 112.9±4.9, MI: 95.7±13.8; PBGD: small shunt: 81.9±6.3, large shunt: 83.7±4.7, MI: 79.8±9.7; % control). Using the TaqMan® PCR as a much more sensitive method only 18SrRNA levels were unchanged whereas GAPDH, PBGD and Cyclophilin mRNA expression was regulated (GAPDH: small shunt: 114.5±18.7, large shunt: 133.6±19.1, MI: 64.2±6.2, p<0.01; 18SrRNA: small shunt: 100.5±18.1, n.s., large shunt: 109.7±15.8, n.s., MI: 122.7±13.0; Cyclophilin: small shunt: 110.7±8.0, large shunt: 166.8±19.2, p<0.01, MI: 80.0±9.4; PBGD: small shunt: 109.2±14.4, large shunt: 116.8±7.1, MI: 62.8±6.3, p<0.01; % control). This study showed that independently of the used method 18SrRNA is stable expressed and best suitable as internal standard for the quantitative analysis of cardiac mRNA.

Keywords: housekeeping genes, GAPDH, 18SrRNA, Cyclophilin, porphobilinogen desaminase, heart failure

Inhaltsverzeichnis

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10.03.2005