Aus der Franz-Volhard-Klinik
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Linksventrikuläre Expression verschiedener Housekeeping-Gene bei kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Jeannine Rettschlag

aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. PD Dr. med. Roland Willenbrock
2. Prof. Dr. P. Persson
3. Prof. Dr. med. R. H. G. Schwinger

Datum der Promotion: 12.12.2003

Zusammenfassung

Das Ziel dieser Arbeit war es einen geeigneten internen Standard für die linksventrikuläre mRNA-Quantifizierung bei kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz in der Ratte zu finden. Die mRNA-Expression von GAPDH, 18SrRNA, Cyclophilin and Porphobilinogen-Desaminase (PBGD) wurde vier Wochen nach Induktion von Hypertrophie (kleiner aortokavaler Shunt) und Herzinsuffizienz (großer aortokavaler Shunt bzw. Myokardinfarkt) mit Hilfe des Ribonuklease Protektion Assay (RPA) und der TaqMan® PCR bestimmt. Die linksventrikuläre ANP-mRNA-Expression war in allen untersuchten Modellen unabhängig von der angewendeten Detektionsmethode erhöht.

Die mRNA-Expression der Housekeeping Gene mit Hilfe des RPA bestimmt, war in allen untersuchten Modellen im Vergleich zu den Kontrollen unverändert (GAPDH: kleiner Shunt: 105.1±7.4, großer Shunt: 105.2±6.8, MI: 88.4±3.7; 18SrRNA: kleiner Shunt: 110.7±8.2, großer Shunt: 104.4±8.9, MI: 107.5±12.0; Cyclophilin: kleiner Shunt: 96.4±7.9, großer Shunt: 112.9±4.9, MI: 95.7±13.8; PBGD: kleiner Shunt: 81.9±6.3, großer Shunt: 83.7±4.7, MI: 79.8±9.7; % Kontrolle). In der sehr sensitiven TaqMan® PCR zeigte sich eine veränderte mRNA-Expression von GAPDH, PBGD und Cyclophilin, lediglich 18S wurde unverändert exprimiert (GAPDH: kleiner Shunt: 114.5±18.7, großer Shunt: 133.6±19.1, MI: 64.2±6.2, p<0.01; 18SrRNA: kleiner Shunt : 100.5±18.1, großer Shunt: 109.7±15.8, MI: 122.7±13.0; Cyclophilin: kleiner Shunt: 110.7±8.0, großer Shunt: 166.8±19.2, p<0.01, MI: 80.0±9.4; PBGD: kleiner Shunt: 109.2±14.4, großer Shunt: 116.8±7.1, MI: 62.8±6.3, p<0.01; % Kontrolle).

Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass 18SrRNA aufgrund der unabhängig von der verwendeten Quantifizierungsmethode stabilen Expression, für die kardiale RNA-Quantifizierung in den untersuchten Tiermodellen am besten geeignet ist.

Eigene Schlagwörter: Housekeeping-Gene, GAPDH, 18SrRNA, Cyclophilin, Porphobilinogen Desaminase, Herzinsuffizienz

Abstract

The purpose of this study was to identify an appropriate left ventricular mRNA as internal standard in gene expression analysis in cardiac hypertrophy and heart failure in the rat. Expression levels of GAPDH, 18SrRNA, Cyclophilin and porphobilinogen desaminase (PBGD) were measured four weeks after induction of either cardiac hypertrophy (small aortocaval shunt) or heart failure (large aortocaval shunt or myocardial infarction) using Ribonuclease protection assay (RPA) and TaqMan® PCR.

The left ventricular expression of ANP mRNA was increased in all these experimental models independently of the used method. Using RPA the mRNA expression of all studied housekeeping genes was unchanged in all experimental models compared to controls (GAPDH: small shunt: 105.1±7.4, large shunt: 105.2±6.8, MI: 88.4±3.7; 18SrRNA: small shunt: 110.7±8.2, large shunt: 104.4±8.9, MI: 107.5±12.0; Cyclophilin: small shunt: 96.4±7.9, large shunt: 112.9±4.9, MI: 95.7±13.8; PBGD: small shunt: 81.9±6.3, large shunt: 83.7±4.7, MI: 79.8±9.7; % control). Using the TaqMan® PCR as a much more sensitive method only 18SrRNA levels were unchanged whereas GAPDH, PBGD and Cyclophilin mRNA expression was regulated (GAPDH: small shunt: 114.5±18.7, large shunt: 133.6±19.1, MI: 64.2±6.2, p<0.01; 18SrRNA: small shunt: 100.5±18.1, n.s., large shunt: 109.7±15.8, n.s., MI: 122.7±13.0; Cyclophilin: small shunt: 110.7±8.0, large shunt: 166.8±19.2, p<0.01, MI: 80.0±9.4; PBGD: small shunt: 109.2±14.4, large shunt: 116.8±7.1, MI: 62.8±6.3, p<0.01; % control). This study showed that independently of the used method 18SrRNA is stable expressed and best suitable as internal standard for the quantitative analysis of cardiac mRNA.

Keywords: housekeeping genes, GAPDH, 18SrRNA, Cyclophilin, porphobilinogen desaminase, heart failure

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1. DNA und RNA als Träger der genetischen Information
    • 1.1.1. Einteilung und Aufbau eukaryonter Gene
    • 1.1.2.  Transkription
    • 1.1.3. Translation
    • 1.1.4.  Regulation der Genexpression
  • 1.2. Housekeeping-Gene
    • 1.2.1. Anwendung als interner Standard
    • 1.2.2. Probleme bei der Anwendung
    • 1.2.3. Typische Housekeeping-Gene
      • 1.2.3.1. Glycerinraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)
      • 1.2.3.2. Cyclophilin
      • 1.2.3.3. Porphobilinogen-Desaminase (PBGD)
      • 1.2.3.4. 18S-ribosomale-RNA (18SrRNA)
  • 1.3.  Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz
    • 1.3.1. Ätiologie
    • 1.3.2. Kompensationsmechanismen
    • 1.3.3. Regulation der Genexpression
    • 1.3.4.  Atriales natriuretisches Peptid (ANP)
• 2.  Ziel der Arbeit
• 3.  Material und Methoden
  • 3.1. Tierexperimente
    • 3.1.1. Tierhaltung und Tierzahlen
    • 3.1.2. Induktion der Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz
      • 3.1.2.1. Shunt-Operation
      • 3.1.2.2.  Myokardinfarkt-Induktion
    • 3.1.3. Hämodynamische Messungen
  • 3.2.  Molekularbiologische Untersuchungen
    • 3.2.1. Extraktion und Quantifizierung der RNA
      • 3.2.1.1.  RNA-Extraktion
      • 3.2.1.2. RNA-Quantifizierung
      • 3.2.1.3. Denaturierende Gelelektrophorese der RNA
    • 3.2.2.  Sondenherstellung
      • 3.2.2.1. Primer-Design
      • 3.2.2.2.  RT-PCR
      • 3.2.2.3. Klonierung
      • 3.2.2.4. Plasmidpräparation (Minipräparation)
      • 3.2.2.5. Sequenzierung
      • 3.2.2.6. Plasmidpräparation (Maxipräparation)
      • 3.2.2.7. In vitro-Transkription
    • 3.2.3. Ribonuklease-Protektion-Assay und Quantifizierung der mRNA-Expression
      • 3.2.3.1. Durchführung des RPA
      • 3.2.3.2. PhosphorImager
      • 3.2.3.3. Analyse und Quantifizierung des RPA
    • 3.2.4. TaqManTM -PCR und Quantifizierung der mRNA-Expression
      • 3.2.4.1. Durchführung der TaqManTM -PCR
      • 3.2.4.2. Auswertung TaqManTM -PCR
  • 3.3. Statistische Auswertung der mRNA-Expression
• 4.  Ergebnisse
  • 4.1. Herzgewichte und hämodynamische Messungen
    • 4.1.1. Herzgewichte der Shunt-operierten Tiere
    • 4.1.2.  Hämodynamische Parameter der Shunt-operierten Tiere
    • 4.1.3.  Herzgewichte der Infarkttiere
    • 4.1.4. Hämodynamische Parameter der Infarkttiere
    • 4.1.5. Infarktgröße
  • 4.2.  Linksventrikuläre mRNA-Expression des Hypertrophiemarkers ANP in den verschiedenen Tiermodellen
    • 4.2.1. ANP-mRNA-Expression im kleinen und großen Shunt
    • 4.2.2. ANP-mRNA-Expression beim Infarkt
  • 4.3. Linksventrikuläre mRNA-Expression der Housekeeping-Gene in den verschiedenen Tiermodellen
    • 4.3.1. GAPDH-mRNA-Expression im kleinen und großen Shunt
    • 4.3.2. GAPDH-mRNA-Expression beim Infarkt
    • 4.3.3.  Cyclophilin-mRNA-Expression im kleinen und großen Shunt
    • 4.3.4. Cyclophilin-mRNA-Expression beim Infarkt
    • 4.3.5. PBGD-mRNA-Expression im kleinen und großen Shunt
    • 4.3.6.  PBGD-mRNA-Expression beim Infarkt
    • 4.3.7. 18SrRNA-Expression im kleinen und großen Shunt
    • 4.3.8. 18SrRNA-Expression beim Infarkt
• 5.  Diskussion
  • 5.1. Der aortokavale Shunt und der Myokardinfarkt als Hypertrophie- bzw. Herz- insuffizienzmodell
  • 5.2.  Die linksventrikuläre ANP-mRNA-Expression
  • 5.3.  Die linksventrikuläre mRNA-Expression der Housekeeping-Gene
    • 5.3.1. GAPDH
    • 5.3.2. Cyclophilin
    • 5.3.3. PBGD
    • 5.3.4. 18SrRNA
  • 5.4.  Kritische Betrachtung der verwendeten Methoden und Schlussfolgerungen
• 6.  Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Lebenslauf
• Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1: Primerpaare und Annealingtemperatur für ANP und die untersuchten Housekeeping-Gene
• Tabelle 2: Länge der einzelnen Sonden und des komplementären Fragments
• Tabelle 3: Verwendete Primerpaare und jeweilige Sonde bei der TaqManTM–PCR
• Tabelle 4: Herzgewichte von Kontrolltieren und Tieren mit kleinem und großem Shunt (KG = Körpergewicht, HG = Herzgewicht, RA = rechtsatriales Gewicht, LA = linksatriales Gewicht, RV = rechtsventrikuläres Gewicht, LV = linksventrikuläres Gewicht. ** p<0,01 vs. Kontrolle; ## p< 0,01 vs. kleiner Shunt)
• Tabelle 5: Hämodynamische Parameter bei Kontrolltieren und Tieren mit kleinem und großem Shunt (MAP = mittlerer arterieller Druck, HF = Herzfrequenz, ZVD = zentraler Venendruck, LVEDP = linksventrikulärer enddiastolischer Druck, dP/dtmax = linksventrikuläre Kontraktilität. ∗ p<0,05, ∗∗ p<0,01 vs. Kontrolle; # p< 0,05, ## p< 0,01 vs. kleiner Shunt)
• Tabelle 6: Herzgewichte von Kontrolltieren und Tieren mit Infarkt (KG = Körpergewicht, HG = Herzgewicht, RA = rechtsatriales Gewicht, LA = linksatriales Gewicht, RV = rechtsventrikuläres Gewicht, LV = linksventrikuläres Gewicht.∗∗ <0,01 vs. Kontrolle)
• Tabelle 7: Hämodynamische Parameter bei Kontrolltieren und Tieren mit Infarkt (MAP = mittlerer arterieller Druck, HF = Herzfrequenz, ZVD = zentraler Venendruck, LVEDP = linksventrikulärer enddiastolischer Druck, dP/dtmax = linksventrikuläre Kontraktilität. ∗p<0,05 vs. Kontrolle, ∗∗ p<0,01 vs. Kontrolle)

Bilder

• Abbildung 1: Informationsfluss bei der Proteinbiosynthese und der Replikation in Eukaryonten
• Abbildung 2: Genaufbau bei Eukaryonten
• Abbildung 3: Neuroendokrine Aktivierung bei Herzinsuffizienz
• Abbildung 4: Synthese von ANP
• Abbildung 5: Schematische Darstellung der Anlage eines kleinen und großen Shunts
• Abbildung 6: Ablauf des Ribonuklease-Protektion-Assay (aus Instruction Manual RPA IIITM von Ambion)
• Abbildung 7: Ablauf der TaqManTM-PCR (aus Einführung in Real-Time TaqManTM PCR-Technologie)
• Abbildung 8: Gelelektrophorese der extrahierten RNA
• Abbildung 9: pGEM®-TEasy-Vektor
• Abbildung 10: Gelelektrophorese des Verdaus der verwendeten Plasmide
• Abbildung 11: Beispielgraphen der ANP-mRNA-Expression im Shuntmodell ( ∙Kontrolle, ∙kleiner Shunt, ∙ großer Shunt)
• Abbildung 12: Beispielgraphen der GAPDH-mRNA-Expression im Shuntmodell ( ∙Kontrolle, ∙kleiner Shunt, ∙großer Shunt)
• Abbildung 13: Beispielgraphen der Cyclophilin-mRNA-Expression im Shuntmodell ( ∙Kontrolle, ∙kleiner Shunt, ∙großer Shunt)
• Abbildung 14: Beispielgraphen der PBGD-mRNA-Expression im Shuntmodell ( ∙Kontrolle, ∙kleiner Shunt, ∙großer Shunt)
• Abbildung 15: Beispielgraphen der 18SrRNA-Expression im Shuntmodell ( ∙Kontrolle, ∙kleiner Shunt, ∙großer Shunt)
• Abbildung 16: Linksventrikuläre ANP-mRNA-Expression in Tieren mit kleinem und großem Shunt (** p<0,01 vs. Kontrolle, ##p<0.01 vs. kleiner Shunt)
• Abbildung 17: Linksventrikuläre ANP-mRNA-Expression im Infarktmodell (** p<0,01 vs. Kontrolle)
• Abbildung 18: Linksventrikuläre GAPDH-mRNA-Expression in Tieren mit kleinem und großem Shunt
• Abbildung 19: Linksventrikuläre GAPDH-mRNA-Expression im Infarktmodell (** p<0,01 vs. Kontrolle)
• Abbildung 20: Linksventrikuläre Cyclophilin-mRNA-Expression in Tieren mit kleinem und großem Shunt (** p<0,01 vs. Kontrolle, ##p<0.01 vs. kleiner Shunt)
• Abbildung 21: Linksventrikuläre Cyclophilin-mRNA-Expression im Infarktmodell
• Abbildung 22: Linksventrikuläre PBGD-mRNA-Expression in Tieren mit kleinem und großem Shunt
• Abbildung 23: Linksventrikuläre PBGD-mRNA-Expression im Infarktmodell(** p<0,01 vs. Kontrolle)
• Abbildung 24: Linksventrikuläre 18SrRNA-Expression in Tieren mit kleinem und großem Shunt
• Abbildung 25: Linksventrikuläre 18SrRNA-Expression im Infarktmodell