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1.  Einleitung

Die molekularbiologische Grundlagenforschung beschäftigt sich unter anderem mit der Untersuchung von Genen und deren Regulation. Dabei ist die Anpassung der Genexpression an verschiedene Umweltbedingungen oder Erkrankungen und ihre daraus resultierende Veränderung eines der wesentlichen Forschungsschwerpunkte.

Bereits 1961 veröffentlichten Jacob und Monod ein erstes Modell zur Genregulation, das sogenannte „Operonmodell“ 1. Mittlerweile ist durch intensive Forschung das Verständnis von der Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Informationen viel größer geworden. Bis zum jetzigen Zeitpunkt sind jedoch noch viele Fragen ungeklärt.

1.1. DNA und RNA als Träger der genetischen Information

1944 identifizierten Avery et al. die DNA als Träger der genetischen Information 2. Diese befindet sich bei Eukaryonten mit Ausnahme der mitochondrialen DNA im Zellkern. Sie setzt sich aus den Purinbasen Adenin (A), Guanin (G) und den Pymidinbasen Cytosin (C), Thymin (T) zusammen, deren Reihenfolge die DNA-Sequenz bestimmt. Jede Zelle enthält die gesamte genetische Information. Das Genom höherer Organismen kodiert ca. 100.000 bis 140.000 verschiedene Genprodukte 3;4. Die entwicklungsabhängige Regulation der Genexpression ermöglicht die Differenzierung der Zelle und ihre Anpassung an verschiedene Umweltbedingungen 5;6.

Die DNA wird durch Transkription in RNA umgeschrieben, die durch Translation in die entsprechende Aminosäuresequenz des Proteins umgewandelt wird. Genetische Informationen werden in der Regel nur von der DNA über die RNA zum Protein übertragen. Eine Ausnahme bilden Retroviren, die mit Hilfe der reversen Transkriptase RNA in DNA umschreiben können 7. Die Replikation (identische Reduplikation) ermöglicht die unveränderte Weitergabe der in der DNA gespeicherten Information und des spezifischen Musters an- und abgeschalteter Gene bei der Zellteilung (siehe Abbildung 1).


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Abbildung 1: Informationsfluss bei der Proteinbiosynthese und der Replikation in Eukaryonten

1.1.1. Einteilung und Aufbau eukaryonter Gene

Ein Gen ist eine funktionelle Einheit des Genoms, das die Information für ein Genprodukt enthält. Man unterscheidet drei Klassen von Genen:

Ribosomale RNA bildet den Strukturbaustein der Ribosomen, messenger RNA dient als Matrize bei der Proteinsynthese, die kleeblattartig aufgebaute transfer RNA überträgt die Aminosäuren bei der Proteinsynthese und small nuclear RNA ist ein Bestandteil der für die Reifung der mRNA benötigten Spleißosome. Die tRNA enthält eine Bindungsstelle für Aminosäuren und das als Leseeinheit für das entsprechende Kodon der mRNA dienende Antikodon.

Die Klasse-II-Gene unterteilt man in regulierte und nicht-regulierte Gene. Die nicht-regulierten oder konstitutiv exprimierten Gene bezeichnet man auch als Housekeeping-Gene (siehe Abschnitt 1.2).

Die Transkription der unterschiedlichen Genklassen erfolgt mit Hilfe verschiedener RNA-Polymerasen (I, II, III). Polymerasen sind Enzymkomplexe, die aus mehr als zehn Untereinheiten bestehen und zusammen mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren die Transkription katalysieren (siehe Abschnitt 1.1.2).


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Jedes Gen setzt sich in der Regel aus Promotor, Startkodon, Kodierungssequenz, Stopkodon, Enhancer und Silencer zusammen (siehe Abbildung 2) 8.

Abbildung 2: Genaufbau bei Eukaryonten

Die Promotorregion ermöglicht die genaue Bindung der RNA-Polymerase am Transkriptionsstartpunkt und gibt Informationen über die Effizienz, mit der ein Gen transkribiert wird 9;10. Häufig enthält sie das Inr-Element, eine Pyrimidin-reiche Sequenz im Bereich des Startkodons 11. In regulierten Genen findet man ungefähr 30 Nukleotide vom Transkriptionsstartpunkt entfernt eine AT-reiche Sequenz, die sogenannte TATA-Box. Sie bestimmt die Transkriptionsgeschwindigkeit und die Genauigkeit des Transkriptionsstarts. In vielen, aber nicht allen Promotoren, kommen sogenannte CCAAT- und GC-Boxen mit der Konsensussequenz GGGCGG in wechselnder Anzahl, Orientierung und Lage zum Transkriptionsstartpunkt vor 9. Enhancer und Silencer sind Elemente, die die Genexpression regulieren, in dem sie die Transkription eines Gens verstärken bzw. abschwächen. Sie befinden sich häufig einige hundert Basenpaare von der Promotorregion entfernt.

Gene von Eukaryonten bestehen im Gegensatz zu Prokaryonten aus mehreren kodierenden (Exons) und nicht-kodierenden Abschnitten (Introns). Sowohl Exons als auch Introns werden transkribiert, und es entsteht die sogenannte prä-mRNA. Durch verschiedene Reifungsschritte und das Entfernen der Introns (Spleißing) wird die prä-mRNA in die reife mRNA umgewandelt.


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1.1.2.  Transkription

Die Transkription ist der erste Schritt der Genexpression. Hierbei wird die Nukleotidsequenz des kodierenden DNA-Abschnittes mit Hilfe von RNA-Polymerasen in die komplementäre Basensequenz der RNA umgeschrieben. Die Transkription proteinkodierender Gene (Klasse-II-Gene) wird durch die RNA-Polymerase II katalysiert. Bei der RNA-Synthese wird anstelle des DNA-spezifischen Zuckers Desoxyribose Ribose eingebaut und Thymin durch Uracil ersetzt. Für die Transkription werden drei Schritte benötigt:

Das größte Problem der Initiation ist das Auffinden der korrekten Startstelle. Die Promotorregion ermöglicht die korrekte Bindung der RNA-Polymerase. Sie bildet zusammen mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren den Initiationskomplex. Transkriptionsfaktoren (TF) werden entsprechend ihrer Spezifität für die RNA-Polymerasen I, II, III als TFIX, TFIIX bzw. TFIIIX bezeichnet.

Der Transkriktionsfaktor TFIID setzt sich zusammen aus dem TATA-Bindeprotein (TBP) und TBP assoziierten Faktoren (TAF). TFIID erkennt die TATA-Box und bindet die Transkriptionsfaktoren TFIIB und TFIIF. Hierdurch wird die exakte Anheftung der RNA-Polymerase II an die DNA ermöglicht. Weitere Faktoren tragen zur Stabilisierung des Initiationskomplexes bei. Durch Phosphorylierung der RNA-Polymerase zerfällt der Initiationskomplex und die korrekt platzierte RNA-Polymerase wird gelöst. Dieser Vorgang bewirkt den Übertritt in die Elongationsphase 12.

Während der Elongation wandert die RNA-Polymerase entlang der DNA-Matrize in 5´- 3´- Richtung. Unter Pyrophosphatabspaltung bindet sie komplementäre Nukleosidtriphosphate an den kodogenen Strang und verknüpft diese zum primären Transkriptionsprodukt, die prä-mRNA. Die RNA-Synthese erfolgt bis zum Erreichen einer Stopsequenz. Dieses Terminationssignal bewirkt die Ablösung der RNA-Polymerase. Anschließend steht die abgelöste RNA erneut zur Transkription bereit 8.

Aus der nicht funktionsfähigen prä-mRNA entsteht durch verschiedene Modifikationsschritte die fertige mRNA 13. Zu diesem sogenannten RNA-Processing zählt neben dem Spleißen das Anhängen einer Cap-Struktur (7-Methylguanosin-Rest) an das 5´- Ende der mRNA und das Hinzufügen einer Poly-AMP-Sequenz (100-200 Basen) an das 3´- Ende der mRNA 14.


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Spleißen bezeichnet das enzymatische Herausschneiden der nicht-kodierenden Introns durch Endonukleasen und das Zusammenfügen der kodierenden Exons mit Hilfe von Ligasen. Dieser Vorgang erfolgt an den aus snRNA aufgebauten Spleißosomen 15.

1.1.3. Translation

Unter Translation versteht man die Übersetzung der transkribierten DNA in die Aminosäuresequenz der Proteine. Sie findet außerhalb des Zellkerns an den Ribosomen statt. Die mRNA muss für die Translation aus dem Zellkern in das Zytosol transportiert werden. Die Translation erfolgt in drei Schritten:

Eukaryonte Ribosomen setzen sich aus einer großen und einer kleinen Untereinheit zusammen. Die große Untereinheit besteht aus ribosomaler RNA mit den Sedimentationskonstanten 28S, 5,8S und 5S, die kleine Untereinheit besteht aus ribosomaler RNA mit der Sedimentationskonstante 18S.

Die Initiation beginnt mit der Bildung eines 80S-Initiationskomplexes. Dies erfolgt durch Bindung der kleinen ribosomalen Untereinheit an das Startkodon der mRNA (Triplett AUG), Anlagerung eines tRNA-Startmoleküls und Bindung der großen ribosomalen Untereinheit. Für diesen Vorgang werden verschiedene Initiationsfaktoren sowie Mg2+ und GTP benötigt.

Während der Elongationsphase wird die mit der passenden Aminosäure (entsprechend dem Kodon der mRNA) beladene tRNA angelagert. Die Aminosäure(n) der vorherigen tRNAs werden mit Hilfe von Peptidyltransferasen und Ribozymen übertragen und verknüpft. Anschließend wird die nun leere tRNA abgelöst und das Ribosom entlang der mRNA um die Länge eines Tripletts bewegt. Der Elongationszyklus wiederholt sich bis zum Erreichen eines Stopkodons. Für die Elongation werden neben Peptidyltransferase und Ribozymen verschiedene Elongationsfaktoren sowie Mg2+ und GTP benötigt.

Drei verschiedene Stopkodons (UAG, UAA, UGA) signalisieren das Ende der Translation. Da es keine entsprechende tRNA gibt, wird die Peptidkette in Gegenwart verschiedener Terminationsfaktoren hydrolytisch von der tRNA gespalten. Das Ribosom dissoziiert in die beiden Untereinheiten. Durch verschiedene Modifikationsschritte wird die Peptidkette in ihre biologisch aktive Form umgewandelt 16.


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1.1.4.  Regulation der Genexpression

Die Regulation der Genexpression findet auf verschiedenen Ebenen statt. Sie ist Voraussetzung für eine zell- bzw. gewebsspezifische Differenzierung und erlaubt die Anpassung der Zelle an geänderte Umweltbedingungen. Gleichzeitig können auch pathobiochemische Reaktionen wie maligne Transformationen durch Genregulation verursacht werden. Mechanismen der Genregulation sind:

Die Transkription stellt den wichtigsten Kontrollpunkt der Genregulation dar 24. Es hat sich gezeigt, dass fast jedes Gen einen eigenen spezifischen Regulationsmechanismus aufweist. Man unterscheidet cis- und trans-aktivierende Faktoren 25. Cis-aktivierende Faktoren beeinflussen Gene auf dem gleichen Chromosom. Zu ihnen zählt man Enhancer und andere in der Nähe des Gens lokalisierte Kontrollelemente. Enhancer beschleunigen die Transkription. Oft befinden sie sich einige hundert Basenpaare ober- oder unterhalb der Promotorregion. Die Orientierung des Enhancers zum Promotor ist unwesentlich. Häufig findet man palindromische (identische Basensequenz der Einzelstränge in 5´-Richtung) oder gleichartig bzw. sehr ähnliche, wiederholte Sequenzen 26. Silencer reduzieren im Gegensatz zu den Enhancern die Transkriptionsrate, können diese aber vermutlich nicht vollständig hemmen 27.

Trans-aktivierende Faktoren wirken eher auf weit entfernt liegende Gene oder andere Chromosomen. Hierzu gehören z.B. Transkriptionsfaktoren. In der Regel kommt es zu Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren, induzierbaren regulierenden Proteinen und bestimmten DNA-Sequenzen im Bereich des Promotors oder anderen Regulationselementen. Die gebundenen Proteine können den Aufbau und die Funktion des Initiationskomplexes beeinflussen und zu einer Änderung der Transkriptionsgeschwindigkeit führen. Die Transkriptionsfaktoren unterteilt man in allgemeine und spezifische bzw. regulatorische Faktoren 25.


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Allgemeine Faktoren sind eine Voraussetzung für die exakte Initiation der Transkription (siehe Abschnitt 1.1.2), spezifische Faktoren regulieren dagegen nur wenige Gene eines Organismus. Die spezifischen Faktoren enthalten in der Regel mindestens drei Domänen, die folgende Funktionen erfüllen:

Die Ligandenbindungsdomäne ist aufgrund der Vielfalt möglicher Liganden sehr spezifisch. Die DNA-Bindungsdomäne bildet dagegen häufig wiederkehrende Motive, wie das Zinkfinger-Motiv, das Leucin-Zipper-Motiv und das Helix-Loop-Helix-Motiv 28.

Bei der Genregulierung spielt nicht nur die Aktivierung, sondern auch die Hemmung der Transkription eine Rolle. Die Mechanismen der Transkriptionsinhibition sind vielfältig. Neben den oben erwähnten Silencern gibt es auch inhibitorisch wirkende Transkriptionsfaktoren 29;30. Transkriptionsfaktoren können auf ihrem Weg vom Zytosol (Syntheseort) in den Nukleolus (Wirkungsort) behindert werden. Dieser Mechanismus ist für den Transkriptionsfaktor Nuclear-Faktor-kappaB (NF-χB) gut untersucht 31. Weiterhin können DNA-Bindungsstellen blockiert, Proteine von der Bindungsstelle verdrängt oder die Transaktivierung beeinflusst werden. Die vielfältige Anzahl von Regulationsmechanismen ermöglicht eine sehr diffizile Regulierung der Transkription 24.

Die Methylierung der DNA stellt eine weitere wichtige Möglichkeit der Genregulierung dar. Hierbei kommt es zur kovalenten Bindung von Methylresten, in der Regel an der C5-Position des Cytosins. Bevorzugt werden Cytosinreste innerhalb der Basensequenz 5´-CpG-3´ methyliert 32. Durch die Methylierung können verschiedene DNA-bindende Proteine nicht anheften, außerdem werden Bindungsstellen durch Proteine mit höherer Affinität zu methylierter DNA blockiert. Es kommt zu einer unspezifischen Unterdrückung der Transkription 33. Vermutlich führt die Methylierung zu einer Erhöhung der Bindungsaffinität der Histone. Dies führt zu einer dichteren Packung des Chromatins und zur Inaktivierung der Genstruktur 34. Unmethylierte DNA-Abschnitte werden dagegen verstärkt exprimiert 35-37. Die auf diese Art und Weise entstehenden Methylierungsmuster des Genoms können bei der Replikation der DNA durch das Enzym DNA-Methyl-Transferase weitergegeben werden. Unterschiede im Methylierungsmuster sind für das sogenannte „genomic imprinting“ verantwortlich.


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Hierunter versteht man das Phänomen, dass gleiche Allele paternaler und maternaler Gene unterschiedlich exprimiert werden. Es gibt allerdings auch stark methylierte Gene, die exprimiert und nicht-methylierte Gene, die überhaupt nicht exprimiert werden 37-39. So konnte z.B. an verschiedenen Tumorzellen gezeigt werden, dass die Methylierung der DNA eine Induktion der Expression bewirkt 39.

1.2. Housekeeping-Gene

Als Housekeeping-Gene bezeichnet man diejenigen Gene, die nicht reguliert sind, dass heißt unabhängig von Umwelteinflüssen in allen Zellen konstant exprimiert werden. In der Regel kodieren sie für Enzyme, die der Aufrechterhaltung des Stoffwechsels dienen, für Proteine des Zytoskeletts, für rRNA und für Histone 27. Beispiele für Housekeeping-Gene sind Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), Cyclophilin, Porphobilinogen-Desaminase (PBGD) und rRNA.

Der Aufbau von Housekeeping-Genen unterscheidet sich in wesentlichen Punkten von regulierten eukaryonten Genen. Der Promotor nicht-regulierter Gene weist folgende Merkmale auf:

Die TATA-Box ermöglicht einen genauen Start der Transkription und erhöht die Aktivität des Promotors (siehe Abschnitt 1.1.1 und 1.1.2). Häufig findet man daher in Housekeeping-Genen mehrere eng beieinander liegende Startpunkte. Hier übernimmt das INR-Element die Funktion der TATA-Box. Der Transkriptionsfaktor TFII-I erkennt den Initiator, ermöglicht die Bindung von TFII-D an den TATA-losen Promotor und fördert den Aufbau des Initiationskomplexes. Sp1 ist ein Protein, das an GC-Boxen bindet. Es besitzt ein Zinkfinger-Motiv und fördert den Aufbau des Initiationskomplexes 40. In Housekeeping-Genen hilft es den Faktor TFII-D richtig zu plazieren 38;41.

Als CpG-Inseln bezeichnet man einige hundert Basenpaare umfassende Abschnitte der DNA, die eine signifikante Häufung unmethylierter CpG-Folgen aufweisen.


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CpG-Folgen sind charakteristisch für Promotoren von Housekeeping-Genen 42. Die Dinukleotid-Sequenz CpG kommt mit etwa einem Fünftel der Häufigkeit vor, die man aufgrund der Basenzusammensetzung erwarten würde. Ursache hierfür ist vermutlich ein Selektionsprozess. Cytosin ist in CpG-Folgen meist methyliert (siehe Abschnitt 1.1.4). Methylcytosin kann durch hydrolytische Deaminierung in Thymin überführt werden. Dieser Austausch von Cytosin gegen Thymin ist nicht reparabel und führt zu einer Häufung von Mutationen. CpG-Folgen sind daher Orte erhöhter Mutationsraten, sogenannte Hot Spots 41.

Ungeklärt ist die Frage, warum CpG-Inseln trotz ihres Methylierungspotentials durch den hohen Anteil von Cytosin in der Regel unmethyliert sind. Eine Hypothese ist, dass CpG-Inseln ein unpassendes Substrat für die DNA-Methyltransferase darstellen. Gegen diese Hypothese spricht, dass methylierte CpG-Inseln auf dem inaktiven X-Chromosom und beim genomic imprinting vorkommen. Außerdem scheint die Methylierung von CpG-Inseln eine Rolle beim Altern und der Tumorgenese zu spielen. Weiterhin könnten komplexe Proteine die Methylierung verhindern, indem sie im Bereich der CpG-Inseln binden, oder Demethylasen aktiv die Methylierung unterbinden 43.

Ein neuer Erklärungsversuch beruht auf Untersuchungen, die nicht nur die Rolle von CpG-Inseln bei der Transkription, sondern auch ihre starke Aktivität in Zellen der Keimbahn und ihre Kolokalisierung zu Ursprüngen der Replikation belegen. CpG-Inseln könnten innerhalb von aktiven Promotoren, die als Replikationsursprung in frühen Stadien der Entwicklung dienen, entstanden sein. Das Fehlen bestimmter Komponenten im Initiationsstadium der Replikation könnte Ursache für die Anreicherung von Cytosin und Guanin sein und erklären, warum Cytosin im Bereich der CpG-Inseln unmethyliert vorliegt. Housekeeping-Gene als Gene, die in allen Zellen exprimiert werden, weisen daher unmethylierte CpG-Inseln auf. Andere regulierte Gene, die in frühen Entwicklungsstadien nicht exprimiert werden und daher nicht als Replikationsursprung dienen, wären vor Methylierung nicht geschützt 43.

Ein weiteres Merkmal von einigen Housekeeping-Genen ist ihre Anordnung in Clustern. Für das Genom von Prokaryonten ist gezeigt worden, dass funktionell zusammengehörige Gene oft zusammengefasst sind. Für Eukaryonten wurde angenommen, dass ihre Gene eher zufällig verteilt sind. Allerdings liegen die Gene für 18S-, 5,8S- und 28S-rRNA auch bei Eukaryonten in Clustern und wiederholen sich hintereinander. Dies gilt ebenso für die Anordnung von Histongenen 44.


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Ein neueres Modell geht davon aus, dass die Anordnung in Clustern nur für Housekeeping-Gene gilt. Das scheinbare Auftreten von Clustern hochexprimierter Gene wird als Folge der Clusterbildung bei Housekeeping-Genen betrachtet 45.

1.2.1. Anwendung als interner Standard

Wie schon berichtet, beschäftigen sich viele Forschungsarbeiten mit der Expression von Genen in unterschiedlichen Zellen unter verschiedenen Bedingungen. Wichtige Methoden, die die Quantifizierung spezifischer mRNA ermöglichen, sind Northern Blot, Ribonuklease-Protektion-Assay und quantitative „Real-Time“-PCR. Alle Verfahren erfordern eine Standardisierung des gemessenen Signals, um Messfehler bei der spektrophotometrischen Quantifizierung, Ungenauigkeiten beim Pipettieren oder RNA-Verlust beim Übertragen auf Membranen auszugleichen. Hierzu wird der Quotient aus der Expression des untersuchten und der Expression eines Standardgens gebildet. Ein abnehmender Quotient entspricht einer Abnahme, ein zunehmender Quotient entspricht einer Zunahme der Expression des untersuchten Gens.

Unter der Annahme, dass Housekeeping-Gene unabhängig von Umwelteinflüssen in allen Zellen stabil exprimiert werden, verwendet man sie als internen Standard für die Quantifizierung von mRNA.

1.2.2. Probleme bei der Anwendung

Entgegen der Annahme, dass Housekeeping-Gene unabhängig von äußeren Einflüssen in allen Zellen stabil exprimiert werden, zeigen eine Vielzahl von Untersuchungen die Regulierung verschiedener Housekeeping-Gene 46. Hypoxie und Zellproliferation, führen zu einer veränderten Expression von einigen klassischen Housekeeping-Genen 47-51. Andere Untersuchungen geben Hinweise auf intra- und interindividuelle Unterschiede in der Expression verschiedener Housekeeping-Gene 52;53. Gemessene Unterschiede in der mRNA-Expression könnten daher Folge einer veränderten Expression des untersuchten Gens und/oder einer veränderten Expression des verwendeten Housekeeping-Gens sein. Dies erfordert die Überprüfung, welches Housekeeping-Gen unter den spezifischen experimentellen Bedingungen als Kontrollgen geeignet ist.


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Obwohl es eine Vielzahl von Veröffentlichungen zur Genexpression bei Hypertrophie und Herzinsuffizienz gibt, liegen bis zum jetzigen Zeitpunkt keine Untersuchungen zur Expression von Housekeeping-Genen bei kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz vor.

1.2.3. Typische Housekeeping-Gene

1.2.3.1. Glycerinraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)

GAPDH ist ein Schlüsselenzym der Glykolyse, das in allen Zellen exprimiert wird. Es katalysiert die Oxidierung bzw. Dehydrierung und gleichzeitige Phosphorylierung von Glycerinaldehyd-3-phosphat zu 1,3-Diphosphoglycerat. NAD+ dient dabei als Oxidations-mittel und nimmt den bei der Reaktion freigesetzten Wasserstoff auf 54.

GAPDH setzt sich aus vier identischen Untereinheiten mit einer Größe von 37 kDa zusammen, die ein Tetramer bilden. Es besitzt eine N-terminale Domäne, die für die Bindung des Co-Faktors NAD+ verantwortlich ist, und eine mittlere Domäne, die das katalytische Zentrum bildet. Hier erfolgt die kovalente Bindung des Substrats und des anorganischen Phosphats an der Sulfhydrilgruppe eines Cysteinrestes 54.

Die Gensequenz von GAPDH ist in den verschiedenen Spezies sehr ähnlich, was auf eine hohe Konservierung des Enzyms während der Evolution hinweist. Trotzdem gibt es eine Vielzahl von Genvarianten, die mit einer unterschiedlichen Enzymaktivität einhergehen. In der Regel handelt es sich um Punktmutationen 54. GAPDH wird von Genen auf unterschiedlichen Chromosomen kodiert (1, 2, 4, 6, 12, X). Es besitzt im Bereich des 5´-Endes eine CpG-Insel, die im aktiven und inaktiven X-Chromosom unterschiedlich methyliert ist. Genomanalysen zeigten drei Klassen von GAPDH-Sequenzen. Klasse 1 (Huhn) enthält eine Kopie des GAPDH-Gens, Klasse 2 (Mensch, Hase, Meerschwein, Hamster) besitzt eine geringe Anzahl von Wiederholungen des Gens und Klasse 3 (Maus, Ratte) besitzt über 200 Kopien 54.

Unabhängige Studien weisen eine Vielzahl von weiteren Funktionen des GAPDH-Proteins nach 54;55. Beispiele hierfür sind die Mitwirkung beim Transport und der Fusion von Membranen sowie der Endozytose. GAPDH scheint eine Rolle bei der Regulation von mRNA, dem Export von tRNA und der Replikation bzw. Reparatur von DNA zu spielen.


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Vermutlich steht GAPDH im Zusammenhang mit der Initiierung der Apoptose, dem programmierten Zelltod, sowie der Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen wie z.B. Morbus Alzheimer 56. Weitere neu entdeckte Eigenschaften des GAPDH-Proteins sind die Phosphotransferase- und -kinase-Aktivität und die Interaktion mit Stickstoff 57.

GAPDH galt lange Zeit als klassisches Housekeeping-Gen und wird häufig als interner Standard für die Quantifizierung von mRNA verwendet.

Mittlerweile gibt es eine Vielzahl von Untersuchungen, die eine Änderung der Genexpression von GAPDH zeigen. Zellproliferation führt zu einer erhöhten GAPDH-Expression 51. Lungenkarzinom- und hepatische Karzinomzellen exprimieren vermehrt GAPDH 49;58. Die Stimulation von Endothelzellen durch Stickstoff verursacht eine Erhöhung der GAPDH-Synthese 59. Der Hypoxia-Inducible Faktor 1 (HIF-1) bewirkt bei Sauerstoffentzug eine Steigerung der Expression von GAPDH 47. Reduzierte Nahrungszufuhr vermindert die Expression von GAPDH in Zellen des Pankreas und des oberen Gastrointestinaltraktes 60.

Diese Untersuchungen zeigen, wie wenig man über die Funktion und Regulation von GAPDH weiß und wie wichtig daher die Überprüfung der Expression von GAPDH und anderen Housekeeping-Genen unter den spezifischen experimentellen Bedingungen ist, bevor sie als Kontrollgen verwendet werden.

1.2.3.2. Cyclophilin

Cyclophilin bindet das immunsuppressiv wirkende Cyclosporin A und hemmt dessen Aktivität. Es gehört zu der Gruppe der Prolyl-cis-trans-Isomerasen, die mit für die Faltung und Isomerisation von Proteinen verantwortlich sind. Es wird in allen Zellen reichlich exprimiert und kommt sowohl frei als auch membrangebunden vor. Cyclophilin ist ein hochkonserviertes Gen, welches verschiedene Isoformen aufweist. Das Säugetiergenom enthält ca. 20 Kopien von Sequenzen unterschiedlicher Cyclophiline 61.

Cyclophilin gehört zu den Housekeeping-Genen und wurde in den letzten Jahren immer häufiger als Standardgen zur RNA-Normalisierung verwendet 62;63. Untersuchungen an verschiedenen Zelllinien und Gewebetypen zeigten, dass die mRNA-Level von Cyclophilin im Vergleich zu GAPDH stabiler sind 64.

Hitzeschock und Hypoxie führen jedoch zu einer signifikanten Induktion von Cyclophilin 48;65. Man vermutet eine funktionelle Assoziation zwischen Cyclophilin und spezifischen Hitzeschockproteinen.


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Außerdem scheint Cyclophilin eine Rolle bei der Entstehung von Ischämie-Reperfusionsschäden des Myokards zu spielen. Mitochondriales Cyclophilin ist ein Bestandteil mitochondrialer, kalziumabhängiger Kanäle, die den Proteintransport durch die Mitochondrienmembran ermöglichen. Die irreversible Öffnung dieser Kanäle z.B. bei erhöhten Ca2+-Konzentrationen und oxidativem Stress verursacht vermutlich Reperfusionsschäden und programmierten Zelltod. Die genauen Mechanismen sind noch nicht bekannt, aber eine regulative Wirkung von Cyclophilin als Bestandteil dieser Kanäle konnte nachgewiesen werden 48;65.

1.2.3.3. Porphobilinogen-Desaminase (PBGD)

PBGD ist ein Schlüsselenzym der Porphyrinsynthese. Es katalysiert die Desaminierung und Polymerisation von vier Porphobilinogen-Molekülen zu linearem Tetrapyrol, das sofort mittels Uroporphyrinogen-III–Synthetase in das ringförmige Uroporphyrinogen III umgewandelt wird. Vergleiche verschiedener Organismen zeigen eine Konservierung der Proteinstruktur zwischen den verschiedenen Spezies. Beim Menschen befindet sich das Gen für PBGD auf dem Chromosom 11. Das PBGD-Gen besitzt zwei Promotoren und kodiert für das erythrozyten-spezifische Isoenzym (42kDa) und das ubiquitäre Isoenzym (44kDa). Der Promotor der erythrozytenspezifischen Isoform weist strukturelle Ähnlichkeiten mit dem ß-Globin-Gen auf. Der Promotor für das ubiquitäre Enzym enthält eine Bindungsstelle für Sp1, die charakteristisch für Housekeeping-Gene ist 66;67.

PBGD ist ein pseudogenfreies Housekeeping-Gen. Pseudogenfrei bedeutet, es gibt keine homologen, angrenzenden Gene, die für nicht funktionsfähige Proteine kodieren. Pseudogene können durch reverse Transkription von mRNA oder durch Duplikation von Genen, die durch Mutation ihre Funktionsfähigkeit verloren haben, entstehen 44. In 23 verschiedenen Zellhomogenisaten der Ratte (z.B. Hepatozyten, Kardiomyocyten, Endothelzellen), sowie in spezifisch durch Laser ausgewählten Zellen wurde mit Hilfe von RT-PCR gezeigt, dass die mRNA-Expression des pseudogenfreien Housekeeping-Gens konstant ist 67. PBGD wird daher von einigen Autoren als Standardgen für die mRNA-Quantifizierung empfohlen. Andere Untersuchungen an verschiedenen Nephronabschnitten der Ratte haben dagegen wesentlich höhere PBGD-mRNA-Level in Tubulus-Homogenisate als in Glomeruli-Homogenisaten nachgewiesen 68.


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Da nur sehr wenige Veröffentlichungen zur Regulation von PBGD vorliegen, sollte die Expression von PBGD vor der Anwendung als Kontrollgen genau überprüft werden.

1.2.3.4. 18S-ribosomale-RNA (18SrRNA)

Die ribosomale RNA (rRNA) macht ungefähr 80% der Gesamt-RNA aus. 18SrRNA ist am Aufbau der kleinen 40S-Untereinheit der eukaryontischen Ribosomen beteiligt. Gene, die für rRNA kodieren, kommen im Säugetier in mehr als 100 Kopien vor. Dies ermöglicht die gleichzeitige Transkription mehrerer Gene. Die Gene für 18S, 5,8S und 28SrRNA liegen in Clustern und wiederholen sich. Cluster werden durch Spacer unterschiedlicher Länge getrennt, die nicht transkribiert werden. Sie befinden sich im Bereich der Nukleoli und sind häufig auf verschiedenen Chromosomen verteilt. Ihre Transkription erfolgt mit Hilfe der RNA-Polymerase I. Der Promotor von rRNA-Genen ist sehr einfach aufgebaut. Er besteht aus dem proximalen Promotor-Element und dem UCE (upstream control element). An beiden Elementen bindet der UBF (upstream binding factor). Er bildet zusammen mit dem Transkriptionsfaktor IB (TFIB) und der RNA-Polymerase I den Initiationskomplex 41;44;69.

Aufgrund des hohen Anteils von rRNA an der Gesamt-RNA geht man davon aus, dass die Menge der ribosomalen RNA nur sehr geringe Schwankungen aufweist 46. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass die rRNA-Expression im Vergleich zu anderen Housekeeping-Genen relativ konstant ist. Im hepatozellulären Karzinom, in kultivierten Hautfibroblasten und bei Hypoxie ist die Expression von 28SrRNA im Gegensatz zu anderen Housekeeping-Genen unverändert 47;49;70. Das Gleiche gilt für die Expression von 18SrRNA in kultivierten Hautfibroblasten und in Zellen des Pankreas bzw. oberen Gastrointestinaltraktes bei Nahrungsentzug 60;70. Häufig wird daher die Anwendung von rRNA als interner Standard zur Quantifizierung von mRNA empfohlen 46;62.

Andere Untersuchungen weisen dagegen Änderungen der Expression von rRNA nach. Es ist gezeigt worden, dass es in leukämischen Zellen zu Störungen im RNA-Metabolismus kommt 71;72. Leukämische CD38+-Zellen besitzen im Vergleich zu normalen Knochenmarkzellen ein signifikant niedrigeres Level von 18SrRNA 73.Ein weiteres Beispiel ist die Erniedrigung der rRNA-Expression aufgrund von Degradation einiger rRNA-Spezies als Folge von Hitzeschock74.


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1.3.  Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz

Hypertrophie ist definiert als das Wachstum von Geweben oder Organen durch Zunahme des Zellvolumens bei gleichbleibender Zellzahl. Sie wird durch Anpassung an eine physiologische Mehrbelastung oder eine pathologische Überlastung verursacht 75.

Als Herzinsuffizienz bezeichnet man die Unfähigkeit des Herzens, trotz ausreichenden venösen Rückstroms und normalen enddiastolischen Ventrikeldrucks ein für den Bedarf des Organismus ausreichendes Herzzeitvolumen zu fördern und den venösen Rückstrom aufzunehmen 76.

Eine akute Herzinsuffizienz, z.B. ausgelöst durch akuten Verlust kontraktiler Fasern infolge eines Myokardinfarkts, kann eine kompensatorische Hypertrophie der noch vitalen Kardiomyozyten verursachen. Aber auch eine bestehende Herzhypertrophie kann bei anhaltendem Stimulus wie Druck- oder Volumenbelastung zur Herzinsuffizienz führen.

1.3.1. Ätiologie

Herzinsuffizienz ist ein klinisches Syndrom, das durch eine Vielzahl kardialer und extrakardialer Störungen verursacht oder begünstigt wird. Ursachen können eine Verminderung der myokardialen Kontraktilität, eine unphysiologische Erhöhung der Vorlast (Volumenbelastung), eine unphysiologische Erhöhung der Nachlast (Druckbelastung) oder Erkrankungen, die zu einer Behinderung der diastolischen Füllung des Herzens führen, sein. Häufige Erkrankungen, die zu Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz führen können, sind Koronare Herzerkrankung, Hypertonie und Myokardinfarkt 77.

1.3.2. Kompensationsmechanismen

Die herabgesetzte Förderleistung des Herzens aktiviert im gesamten Organismus eine Vielzahl struktureller und neurohormonaler Kompensationsmechanismen, die den Blutdruck und das zirkulierende Blutvolumen trotz verminderter Pumpleistung aufrechterhalten sollen, aber letztendlich durch einen Circulus vitiosus zu einer Progredienz der Herzinsuffizienz führen 78.


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Zu diesen Kompensationsmechanismen gehören die kardiale Hypertrophie, der Frank-Starling-Mechanismus sowie die Aktivierung von Katecholaminen, Endothelin, Vasopressin und des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS) einerseits bzw. von natriuretischen Peptiden, Adrenomedullin, Prostaglandinen und Bradykinin andererseits.

Die kardiale Hypertrophie führt zur Zunahme der kontraktilen Masse. Die Zunahme des Herzgewichts wird durch Verlängerung der einzelnen Kardiomyozyten und Zunahme der Myofibrillen verursacht. Man unterscheidet die durch Volumenbelastung bedingte exzentrische und die durch Druckbelastung bedingte konzentrische Hypertrophie. Ziel der Hypertrophie ist die Normalisierung der bei insuffizienten Herzen nach dem Laplace´schen-Gesetz erhöhten systolischen Wandspannung 79. Ab einem sogenannten kritischen Herzgewicht ist die Versorgung der Koronararterien mit Sauerstoff eingeschränkt. Außerdem kommt es durch Gefügedilatation zur weiteren Abnahme der Leistungsfähigkeit.

Der Frank-Starling-Mechanismus bewirkt die Anpassung der kardialen Auswurfleistung an veränderte hämodynamische Bedingungen in Abhängigkeit vom enddiastolischen Ventrikelvolumen. Die Kontraktilität nimmt proportional zur Sarkomerlänge zu. Als Ursache hierfür wird die längenabhängige Zunahme der Kalzium-Sensitivität des Troponin-C gesehen 79-82. Auch der Frank-Starling-Mechanismus wirkt nur bis zu einem gewissen Grad der Dehnung der Sarkomere. Beim Überschreiten einer kritischen Länge wie bei massiv dilatierten Ventrikeln nimmt die Kontraktilität wieder ab.

Katecholamine, das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS), Endothelin und Vasopressin dienen der Aufrechterhaltung einer adäquaten Perfusion lebenswichtiger Organe. Durch Vasokonstriktion und Wasserretention tragen sie vor allem im akuten Stadium der Herzinsuffizienz zur hämodynamischen Kompensation bei. Erhöhte Katecholamin-, Angiotensin-II und Endothelinkonzentrationen verursachen jedoch auch eine kardiale Hypertrophie und führen langfristig zur Progredienz der Herzinsuffizienz. Es entwickelt sich ein Circulus vitiosus aus neuroendokriner Aktivierung, Vasokonstriktion, Wasserretention und progredienter Abnahme der linksventrikulären Pumpfunktion 79.

Natriuretische Peptide, Adrenomedullin, Prostaglandine und Bradykinin können durch ihre vasodilatorische und diuretische Wirkung der Vasokonstriktion und Wasserretention entgegenwirken. Darüber hinaus ist für die natriuretischen Peptide eine antihypertrophe Wirkung beschrieben worden 83. Im Verlauf der Herzinsuffizienz kommt es zum zunehmenden Wirkverlust der natriuretischen Peptide, dessen Ursache bisher unklar ist.


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Diskutiert werden eine Downregulation der natriuretischen Peptidrezeptoren und die Inhibition ihrer Signaltransduktion.

Infolge des deutlichen Übergewichts der vasokonstringierenden, wasserretinierenden und wachstumsauslösenden Systeme kommt es letztendlich zur Progredienz der Erkrankung (siehe Abbildung 3).

Abbildung 3: Neuroendokrine Aktivierung bei Herzinsuffizienz

1.3.3. Regulation der Genexpression

Hypertrophie und Herzinsuffizienz führen zu qualitativen und quantitativen Änderungen der Genexpression. Hierbei kommt es zur Aktivierung des „fetalen Genexpressionprogrammes“. Es wurde gezeigt, dass die Umstellung des Genexpressionsmusters eher durch eine verminderte Expression adulter Gene als eine vermehrte Expression fetaler Gene erfolgt 84. Die Reaktivierung des fetalen Genexpressionsprogramms stellt einen Anpassungsmechanismus an die verminderten Energieressourcen dar. Es kommt zur veränderten Expression verschiedener Schlüsselenzyme des Energiestoffwechsels. Enzyme der ß-Oxidation werden vermindert, Enzyme des Glukosestoffwechsels vermehrt exprimiert. Wie beim fetalen Herz stellen Kohlenhydrate die Hauptenergiesubstrate zur ATP-Synthese dar 84.

Weitere Beispiele für die Umstellung auf das fetale Expressionsmuster sind Aktin, Myosin, Teile des regulatorischen Troponinkomplexes sowie die Na-K-ATPase.


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Bei der kardialen Hypertrophie der Ratte kommt es zum Myosin-Isoform-Shift der drei Formen des Myosins (V1, V2, V3). V1 stellt die erwachsene Isoform da und besitzt eine hohe ATPase-Aktivität, V3 ist die fetale Isoform und besitzt eine niedrige ATPase-Aktivität. Im Myokard von Kontrolltieren wurde vor allem V1, im mittelgradig hypertrophierten Myokard alle drei Isoformen und im stark hypertrophierten Myokard vor allem V2 und V3 exprimiert.

Die kardiale Hypertrophie ist außerdem gekennzeichnet durch eine regulative Induktion verschiedener Protoonkogene und Stressproteine, wie insulin like growth factor (IGF), platelet derived growth factor (PDGF), endothelial growth factor (EGF) und Tumornekrosefaktor (TNF) 85-87. Sie binden an den Tyrosinkinaserezeptor, der durch Autophosphorylierung eine Signaltransduktionskaskade in Gang setzt, die letztendlich durch Phosphorylierung der sogenannten Mitogen-aktivierten-Proteinkinase (MAPK) an der Regulation von Wachstum und Differenzierung beteiligt ist. Es kommt zu Veränderungen der kontraktilen Proteine und zu einer zunehmenden Fibrosierung.

Insgesamt kommt es bei Hypertrophie zu einer generellen Zunahme von RNA und Proteinen in der Zelle. Eine konstante mRNA-Konzentration pro Gesamt-RNA bedeutet also letztendlich eine absolute Zunahme der mRNA.

Die Expression der natriuretischen Peptide ist abhängig vom Schweregrad der Herzinsuffizienz. Zu den natriuretischen Peptiden (NP) werden das atriale natriuretische Peptid (ANP), das Brain natriuretic peptide (BNP), das C-Typ-natriuretische Peptid (CNP) und das Dendroaspis-natriuretische Peptid (DNP) gezählt. Diese Peptidhormone besitzen untereinander Strukturhomologien und weisen ein ähnliches Wirkungsspektrum auf 88;89. ANP und BNP sind kardiale Hormone mit natriuretischen, vasodilatatorischen und Aldosteron-inhibierenden Eigenschaften.ANP zeigt bereits bei der kompensierten Herzinsuffizienz einen maximalen Anstieg der mRNA-Expression, während die BNP-mRNA-Expression unverändert ist. Erst bei der manifesten Herzinsuffizienz wird auch die BNP-mRNA-Expression induziert, die ANP-mRNA-Synthese bleibt im Vergleich zur kompensierten Herzinsuffizienz unverändert hoch. Als Ursache für die vom Schweregrade der Herzinsuffizienz unabhängige ANP-mRNA-Expression wird ein negativer Autofeedbackmechanismus diskutiert 90.

Die Plasmakonzentrationen von ANP und BNP sind proportional zum Schweregrad der Herzinsuffizienz. Beide dienen als Marker einer eingeschränkten linksventrikulären Funktion, dabei ist jedoch BNP gegenüber ANP hinsichtlich der Spezifität überlegen 91.


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1.3.4.  Atriales natriuretisches Peptid (ANP)

ANP ist ein Peptidhormon aus der Familie der natriuretischen Peptide, das 1981 von de Bold et al. im Vorhof von Ratten entdeckt wurde 92.

Abbildung 4: Synthese von ANP

ANP wird auf dem kurzen Arm von Chromosom 1 kodiert. Das Gen für ANP besteht aus 3 Exons. Abhängig von der Spezies liegt nach der Translation ein unterschiedlich langes präpro-ANPvor, das die Vorstufe von pro-ANP und ANP ist 93-97. Das humane präpro-ANP besteht aus 151 Aminosäuren (AS), das der Ratte aus 153 AS. Charakteristisch für präpro-ANP ist ein 24 AS langes Signal-Peptid am N-terminalen Molekülende, das für den Transport von präpro-ANP über die Membran des endoplasmatischen Retikulums abgespalten werden muss. Das präpro-ANP der Ratte enthält darüber hinaus zwei zusätzliche Carboxylgruppen am C-terminalen Molekülende 98;99. Durch Abspaltung des Signalpeptides und der zwei Carboxylgruppen wird das präpro-ANP(1-126) in das pro-ANP umgewandelt. Pro-ANP stellt die Hauptspeicherform des ANP in den atrialen Granulae dar 98;100;101. Erst durch Spaltung des Moleküls (1-126) entsteht das biologisch aktive ANP(99-126) und das inaktive N-terminale ANP(1-98) (siehe Abbildung 4). An der Position 105 und 121 befindet sich jeweils die Aminosäure Cystein. Sie bilden eine intramolekulare Disulfidbrücke, die charakteristisch und notwendig für die biologische Aktivität der natriuretischen Peptide ist 98;102.


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Hauptsyntheseort von ANP sind die Atrien 100;103;104. Dort wird das pro-Hormon in Form von 250-500nm großen Granulae gespeichert 100;103. Die Konversion zum biologisch aktiven ANP(99-126) erfolgt wahrscheinlich während der Ausschüttung in den Kreislauf.

Als erstes pro-ANP konvertierendes Enzym konnte die kardial exprimierte Typ-II Serin-Protease Corin identifiziert werden 105. Adäquater Reiz für die akute Ausschüttung von ANP ist die Dehnung der Vorhöfe durch Volumenbelastung. Für die ANP-Freisetzung spielen darüber hinaus ein lokaler Konzentrationsanstieg von Endothelin-1 und Angiotensin-II sowie ein Konzentrationsabfall von NO eine Rolle 106-109.

ANP-mRNA wird in den Atrien gesunder adulter Tiere in höherer Menge als in den Ventrikeln synthetisiert. Während der Embryogenese ist das Verhältnis genau umgekehrt: in dieser Entwicklungsphase sind die Ventrikel Hauptsyntheseort für ANP 110. Wie bei der fetalen ANP-Expression kommt es bei Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz zur gesteigerten ventrikulären ANP-Expression. ANP-mRNA eignet sich aufgrund seiner bekannten Regulation als Marker kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz 111.


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10.03.2005