[Seite 29↓]

3.  Material und Methoden

3.1. Tierexperimente

3.1.1. Tierhaltung und Tierzahlen

Alle Tierversuche (Genehmigungsbescheid G 0262-96 ) wurden an männlichen Wistar-Ratten (Fa. Moellegard, Schönwalde) durchgeführt, die mit handels- und tierüblichem Futter (Ssniff Experimentalfutter für Ratten, Fa. Ssniff, Soest) versorgt wurden und freien Zugang zum Trinkwasser hatten. Das präoperative Gewicht lag zwischen 230 und 250 Gramm. Die Tiere wurden bei einem Hell-Dunkel-Rhythmus von 12 Stunden gehalten. Die Operationen sowie die Blut- und Organentnahme erfolgten zwischen 7 und 12 Uhr. Während der Operation und der hämodynamischen Messungen wurden die Tiere auf einem Wärmekissen bei konstanter Körpertemperatur (37°C) gehalten.

Für die Untersuchungen am Shunt-Modell wurden jeweils 12 Tieren je Gruppe (Kontrolle, kleiner Shunt und großer Shunt) verwendet. Im Infarkt-Modell umfasste die Kontrollgruppe 13 und die Infarktgruppe 9 Tiere.

3.1.2. Induktion der Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz

Als Modell für Herzhypertrophie dienten Ratten mit kleinem aortokavalen Shunt. Als Modell für Herzinsuffizienz wurden zum einen Ratten mit großem aortokavalen Shunt, zum anderen Ratten mit experimentell induziertem Infarkt, hervorgerufen durch Ligation der LAD (left anterior descending artery = Ramus interventricularis anterior), verwendet.

3.1.2.1. Shunt-Operation

Die Anlage des aortokavalen Shunts erfolgte durch eine leicht modifizierte Technik, die erstmals von Garcia und Diebold beschrieben wurde (siehe Abbildung 5) 112.

Nach erfolgter Äther-Narkose wurden die Tiere laparotomiert und die Aorta abdominalis sowie die Vena cava inferior im Bereich zwischen Abgang der Arteriae renales und der Aortenbifurkation dargestellt. Die Aorta abdominalis wurde unterhalb des Abgangs der Arteriae renales abgeklemmt und mit einer Venenpunktionskanüle durchstochen.


[Seite 30↓]

Die Kanüle wurde anschließend bis in das Lumen der Vena cava inferior vorgeschoben, danach zurückgezogen und die Punktionsstelle der Aorta mit Zyanoacrylatkleber (Instant Krazy Glue, Borden Company, Willowdale, Ontario, Kanada) verklebt 90. Die so entstandene Verbindung zwischen der Vena cava und der Aorta induzierte eine Volumenbelastung, die zur Entwicklung von kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz führte. Für den kleinen Shunt wurden Strauß-Kanülen (Braun, Melsungen) mit einem äußeren Durchmesser von 1,2 mm (Herzhypertrophie) und für den großen Shunt Kanülen mit einem Durchmesser von 1,8 mm (Herzinsuffizienz) verwendet. Visuell konnte der Erfolg der Shunt-Operation durch das Anschwellen der Vena cava inferior und die durch Beimischung arteriellen Blutes hellere Farbe beurteilt werden. Anschließend erfolgte der Verschluss des Operationssitus durch Muskel- und Hautnaht (Perma-Hand Seide, 3-0, Ethicon, Norderstedt). Die Kontrolltiere wurden analog den Shunttieren operiert; es wurde nur auf die Anlage des aortokavalen Shunts verzichtet.

Die perioperative Mortalität der Kontrolltiere und der Tiere mit kleinem Shunt betrug weniger als 1 %, die perioperative Mortalität der Tiere mit großem Shunt weniger als 5 %. Die weitere Untersuchung der Tiere (Hämodynamik, RNA-Analysen) erfolgte 30 Tage nach Anlage des Shunts.

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Anlage eines kleinen und großen Shunts


[Seite 31↓]

3.1.2.2.  Myokardinfarkt-Induktion

Die experimentelle Induktion des Myokardinfarkts erfolgte durch Ligation des Ramus interventrikularis anterior (RIVA/LAD). Hierzu wurde eine abgewandelte, ursprünglich von Pfeffer et al. beschriebene Methode verwendet 113.

Die Tiere wurden mit Chloralhydrat anästhesiert und mit einem 1,2 mm breiten PE-Katheter intubiert und beatmet (V5K6 Respirator, Narco Bio-Systems Inc). Nach Thorakotomie und Freilegung der LAD wurde diese zwischen dem pulmonalen Ausflusstrakt und dem linken Atrium mit Ethibond 7/0 (Ethicon) ligiert. Die perioperative Mortalität betrug in den ersten 48 Stunden 56%. Die Kontrolltiere wurden analog operiert; es wurde nur die Ligation der LAD nicht durchgeführt.

3.1.3. Hämodynamische Messungen

Nach Anästhesie durch intraperitoneale Injektion von Chloralhydrat (400mg/kg Körpergewicht, Sigma-Aldrich, Steinheim) wurden die rechte Vena jugularis externa und die rechte Arteria carotis communis präpariert und ein Katheter (PE-50 Mikroschlauch, NeoLab, Heidelberg) eingeführt. Mittels Druckaufnehmer (P23XL, Statham, Viggo-Spectramed, Oxnard, Kalifornien, USA) und Verstärker (Pressure Processor AMP 4600, Gould, Dietzenbach) wurden nach entsprechender Katheterpositionierung der arterielle, der zentralvenöse sowie der linksventrikuläre systolische und enddiastolische Druck gemessen. Die Messung des LVEDP erfolgte R-Zacken getriggert, durch Abgleich von Druckkurve und parallel aufgezeichnetem EKG. Die linksventrikuläre Kontraktilität wurde als Druckanstiegsgeschwindigkeit (dP/dtmax) mittels eines Differentiators (DIF 4600, Gould, Dietzenbach) berechnet.

Anschließend wurde das Herz entnommen, in DEPC-Wasser (0,2 % Diethylpyrocarbonate, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) gespült, die Herzen in Atrien und Ventrikel separiert, gewogen und die Infarktgröße planimetrisch bestimmt. Nach Entfernung des nekrotischen Gewebes wurden die Organe bis zur weiteren Analyse nach Einfrieren in flüssigem Stickstoff bei –80°C aufbewahrt. Für die RNA-Expressions-Bestimmungen wurden nur vitale Bereiche des linken Ventrikels verwendet.


[Seite 32↓]

3.2.  Molekularbiologische Untersuchungen

Für die RNA-Quantifizierung wurden zum einen das Ribonuklease-Protektion-Assay (RPA) und zum anderen die TaqManTM-PCR verwendet. Beide Methoden unterscheiden sich im Ablauf und in ihrer Sensitivität.

Der RPA ist eine Methode zur Detektion und Quantifizierung von RNA (siehe Abbildung 6).

Abbildung 6: Ablauf des Ribonuklease-Protektion-Assay (aus Instruction Manual RPA IIITM von Ambion)

Prinzip des RPA ist: Radioaktiv-markierte RNA-Sonden, die komplementär zu Abschnitten der zu untersuchenden RNA sind, hybridisieren mit diesen Abschnitten der RNA. Unhybridisierte RNA-Einzelstränge werden mit Hilfe von Ribonuklease abgebaut. Die doppelsträngigen, mit den Sonden hybridisierten Abschnitte sind dagegen vor dem Abbau durch Ribonuklease geschützt.


[Seite 33↓]

Durch elektrophoretische Auftrennung im Polyacrylamidgel können die gebundenen radioaktiv-markierten Sonden mit Hilfe der Autoradiographie dargestellt und quantifiziert werden. Folgende Schritte sind für die Untersuchung der Genexpression mittels RPA notwendig:

Vorteil dieser Methode ist, dass eine Degradation der RNA außerhalb der Region, wo die Sonde hybridisiert, keinen Einfluss auf das Ergebnis hat. Außerdem bietet der RPA die Möglichkeit, gleichzeitig verschiedene Sonden anzuwenden. Diese müssen sich lediglich in ihrer Größe so unterscheiden, dass sie durch ein Polyacrylamidgel voneinander abgrenzbar sind.

Die TaqManTM-PCR ist ein neues, sehr sensitives, spezifisches und schnelles Verfahren. Hierbei wird eine aus Oligonukleotiden bestehende, fluorogene Sonde verwendet, deren 5´-Ende mit einem fluoreszenten Reporter-Farbstoff (Fluoreszein-Derivat) markiert ist und deren 3´-Ende einen Quencher-Farbstoff (Rhodamin-Derivat) trägt. Außerdem ist sie mit einem Phosphatrest blockiert. Der Quencher unterdrückt aufgrund der räumlichen Nähe zum Reporter-Farbstoff den Fluoreszenz-Energietransfer in der intakten Sonde. Während der PCR hybridisiert die Sonde zusammen mit den Primern an den Matrizenstrang (siehe Abbildung 7, Bild 1). Während der Extensionphase bewirkt die 5´-3´-Exonuklease-Aktivität der AmpliTaq-DNA Polymerase die Hydrolysierung der Sonde (siehe Abbildung 7, Bild 2). Hierdurch werden Quencher und Reporter getrennt (siehe Abbildung 7, Bild 3) und die Fluoreszenz des Reporters steigt mit zunehmender Akkumulation des PCR-Produktes (siehe Abbildung 7, Bild 4). Das Signal ist strikt sequenzspezifisch. Mit Hilfe eines Sequenzdetektors kann Zyklus für Zyklus („Real-Time“) die Veränderung der Fluoreszenz im geschlossenen Reaktionsgefäß erfasst werden 114.


[Seite 34↓]

Abbildung 7: Ablauf der TaqManTM-PCR (aus Einführung in Real-Time TaqManTM PCR-Technologie)

Während der PCR kommt es zu einer exponentiellen Zunahme des gesuchten Moleküls, wodurch die Quantifizierung innerhalb der logarithmischen Phase der Reaktion ermöglicht wird. Selbst geringe Schwankungen der Startmolekülzahl, die am Ende der Reaktion in der Plateauphase ein einheitliches Niveau erreichen, können bereits während der exponentiellen Zunahme erkannt und mit Hilfe von Standards quantifiziert werden. Weitere Vorzüge der TaqManTM-PCR sind neben dem schnellen Vorliegen quantitativer Ergebnisse das Arbeiten im geschlossenen Gefäß, das Entfallen zeitintensiver Gelelektrophoresen im Anschluss an die PCR sowie die Automatisierung der Methode, die einen hohen Probendurchlauf ermöglicht.

Durch Quantifizierung der mRNA mit unterschiedlichen Detektionsverfahren soll untersucht werden, ob die Wahl der Detektionsmethode einen Einfluss auf das Ergebnis der mRNA-Expression-Messung hat und ob dies bei der Wahl eines geeigneten Housekeeping-Gens zu berücksichtigen ist.

3.2.1. Extraktion und Quantifizierung der RNA

Für die Durchführung der molekularbiologischen Untersuchungen wurden alle verwendeten Reaktionsgefäße und Materialien vor der Benutzung autoklaviert bzw. mit 70% Ethanol (Merck KG, Darmstadt) und DEPC-Wasser (0,2 % Diethylpyrocarbonate, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) gereinigt und gespült. Es wurde nur autoklaviertes DEPC- bzw. RNAse/ DNAse freies Wasser (Promega GmbH Mannheim, Deutschland) benutzt 115.


[Seite 35↓]

3.2.1.1.  RNA-Extraktion

Die Gesamt-RNA des linken Ventrikels wurde aus dem Myokard nach der Single-Step-Extraktionsmethode von Chomczynzski und Sacchy (Guanidiniumisothiocyanite-Phenol-Chloroform) isoliert 116. Prinzip der Methode ist die RNA-Extraktion durch Denaturierung der im Gewebe vorliegenden Endonukleasen, Trennung von RNA und Proteinen sowie die Ausfällung der RNA.

Für die Inaktivierung von Endonukleasen werden Substanzen wie Guanidiniumthiocyanat (Biotechnology Grade, Amresco®, Solon, USA), Phenol (Amresco®, Solon, USA) und Mercaptoethanol (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) verwendet. Guanidiniumthiocyanat ist ein Salz, das Proteine effektiv denaturiert und inaktiviert. Dies führt auch zur Zerstörung der RNAsen. Die denaturierende Wirkung wird durch Mercaptoethanol verstärkt. Mercaptoethanol spaltet intramolekulare Disulfidbrücken in Proteinen 115. Die Trennung von RNA und Proteinen erfolgt durch die unterschiedliche Löslichkeit in Phenol und der verminderten Löslichkeit der RNA in Isopropanol/Ethanol.

Die RNA-Extraktion erfolgte nach folgendem Protokoll: Das noch tiefgefrorene und gewogene Gewebe wurde in 1ml/100mg Gewebe eiskalter Denaturierungslösung (4M Guanidine Thiocyanate; 25mM Natriumcitrat pH 7,0, Amresco®, Solon, USA; 0,5 % N-Lauryl-Sarcosine, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA; 100mM 2-Mercaptoethanol) gebracht und mit dem Ultra-Turrax T25 (Janke & Kunkel IKA-Laborgeräte) homogenisiert, bis keine Partikel mehr sichtbar waren. Je 1ml Denaturierungslösung wurden 0,1ml 2M Natriumacetatlösung (pH 4,0; Merck KG, Darmstadt) und 1ml Phenol /Chloroform:Isoamyl-Alkohol (49:1, Merck KG, Darmstadt) hinzugefügt. Nach Zugabe jedes Reagens wurden die Proben kurzzeitig durchmischt und für 15 Minute auf Eis gestellt.

Natriumacetat senkt den pH-Wert so, dass neben den Proteinen auch kleinere DNA-Fragmente im Phenol gelöst werden. Größere DNA-Fragmente lagern sich durch Zentrifugation in der Interphase. Die Proben wurden 10 Minuten bei 11.500g und 4°C zentrifugiert. Der wässrige, die RNA enthaltene, Überstand wurde vorsichtig in ein neues Eppendorfgefäß überführt, ein äquivalentes Volumen Isopropanol (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) hinzugefügt, die Proben gut durchmischt und eine Stunde bei -80°C gelagert. Hierdurch erfolgte die Fällung der an Natriumacetat gebundenen RNA.


[Seite 36↓]

Nach Zentrifugation für 20 Minuten bei 10.000g und 4°C war die RNA als kleines Pellet am Boden des Reagenzgefäßes sichtbar. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert und die Pellets in 0,3ml Denaturierungslösung vollständig aufgelöst. Ein zweites Mal wurde die RNA wie oben beschrieben mit 0,3ml Isopropanol gefällt, die Pellets vorsichtig zwei Mal mit 0,5 ml 75 % Ethanol gewaschen, für 15 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet, in 50µl RNAse freies Wasser aufgelöst und bei –80°C aufbewahrt.

3.2.1.2. RNA-Quantifizierung

Die RNA-Quantifizierung erfolgte spektralphotometrisch mit dem Gene Quant II. Das Gerät misst die Extinktion bei 260nm (Absorptionsmaximum von RNA) sowie 280nm (Absorptionsmaximum von Proteinen) und berechnet die RNA-Konzentration nach folgender Formel:

Zu beachten ist, dass die Extinktion zwischen 0,1 und 1 liegen sollte, da nur in diesem Bereich Extinktion und Konzentration proportional zueinander sind. Eine Aussage über die Reinheit der RNA kann über das Verhältnis Extinktion bei 260nm zu Extinktion bei 280 nm gemacht werden. Dieser Quotient sollte für eine reine Nukleinsäurelösung zwischen 1,8 und 2,2 liegen. Alle untersuchten Proben erfüllten dieses Kriterium.

Die Quarzküvette wurde vor jeder Messung mit Ethanol und DEPC-Wasser gereinigt. Es erfolgte ein Nullabgleich mit Wasser, anschließend wurden die mit DEPC-Wasser 1:100 verdünnten Proben quantifiziert.

3.2.1.3. Denaturierende Gelelektrophorese der RNA

Die Gelelektrophorese dient der Überprüfung der Intaktheit der RNA und der Kontrolle der Konzentrationsmessung. Für das 1,2%iges Agarose-Gel wurde 0,5g Agarose (Biotechnology Grade, Amresco®, Solon, USA) in 36ml DEPC-Wasser gelöst.


[Seite 37↓]

Nach Abkühlen des Gels auf 60°C wurden 5ml 10xMOPS (50mM Natriumacetat; 200mM MOPS, Analytical Grade, Serva Feinbiochemika GmbH, Heidelberg; 10mM Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA), Analytical Grade, Serva Feinbiochemika GmbH, Heidelberg; pH=7,0) und 9ml Formaldehydlösung (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen) hinzugefügt, anschließend wurde das Gel gegossen und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Elektrophoresekammer wurde mit 1xMOPS als Pufferlösung gefüllt. Die Proben wurden vor Durchführung der Elektrophorese denaturiert: 2µg RNA und DEPC-Wasser in einem Volumen von 5,7µl wurden mit 1µl 10xMOPS, 3,3µl Formaldehyd, 10µl deionisiertem Formamide (Biotechnology Grade, Amresco®, Solon, USA) und 1µl Ethidiumbromid (Biotechnology Grade, Amresco®, Solon, USA) für 15 Minuten bei 65°C inkubiert und anschließend auf Eis abgekühlt. Formaldehyd und Formamide denaturieren RNA und ermöglichen die elektrophoretische Auftrennung der RNA nach der Moleküllänge. Ethidiumbromid ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der sich an RNA bindet und die Darstellung der RNA unter UV-Licht erlaubt. Nach der Inkubationszeit wurden 2µl Gelladepuffer (50 % Glycerol, 1mM EDTA, 0,25 % Bromphenolblau; ACS Grade, Amresco®, Solon, USA; 0,25 % Xylen Cyanol FT, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) hinzugefügt und die Proben in die Geltaschen pipettiert. Die Elektrophorese wurde durch Anlegen eines elektrischen Feldes (4V je cm Gellänge; Agagel Mini/Maxi Gelelektrophoresekammer, BIORAD Laboratories, Hercules, USA) begonnen. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel unter UV-Licht betrachtet und fotografiert. Auf den Gelfotos sind die Banden für die 18- und 28-S ribosomale RNA erkennbar. Dies kennzeichnet die Intaktheit der RNA 117. Alle untersuchten Proben erfüllten dieses Kriterium (siehe Abbildung 8).

Abbildung 8: Gelelektrophorese der extrahierten RNA


[Seite 38↓]

3.2.2.  Sondenherstellung

3.2.2.1. Primer-Design

Bei der Sondenherstellung sind verschiedene Kriterien zu beachten. Die Primer-Sequenz sollte spezifisch für das gewünschte Amplifikationsprodukt sein und nicht mehr als vier gleiche aufeinanderfolgende Basenpaare enthalten, um Fehlhybridisierungen und Leserasterverschiebungen zu vermeiden. Die Länge der Primer umfasst ca. 20 Nukleotide mit einem Anteil von Cytosin zu Guanin von 40-60%. Die Schmelztemperatur sollte für Sense- und Antisense-Primer annähernd gleich sein. Inter/intramolekulare Komplementarität sollte vermieden werden. Das Vorhandensein von ein bis zwei G oder C am 3´- Ende ermöglicht eine bessere Bindung und Elongation.

Diese Punkte wurden bei der Auswahl der Primerpaare berücksichtigt. Die gewählten Sonden unterscheiden sich um mindestens 40 Nukleotide, um eine spätere elektrophoretische Auftrennung zu ermöglichen. Die Gensequenzen wurden über Entrez-NCBI (National Center for Biottechnology, USA) gesucht [Accessionsnummern: ANP (M60731), GAPDH (AF106860), Cyclophilin (M19533), PBGD (Y17155), 18SrRNA (V01270)]. Die Primer wurden von der Firma BioTeZ Berlin-Buch GmbH (Robert-Rössle Str.10, 13125 Berlin, Deutschland) hergestellt (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1: Primerpaare und Annealingtemperatur für ANP und die untersuchten Housekeeping-Gene

Gen

Produkt-länge

Annealing-

Temperatur

Primer forward

Primer reverse

ANP

600 N

61°C

5´-gcgagacaagagagagcagg-3´

5´-caaaagcaagaaataggctatg-3´

GAPDH

303 N

60°C

5´-ccctgcatccactggtgctgcc-3´

5´-cattgagagcaatgccagccc-3´

Cyclo

180 N

55°C

5´-tcacggctgatggcgagccc-3´

5´-ggcgtgtgaagtcaccaccc-3´

PBGD

126 N

55°C

5´-atgtccggtaacggcggcgcgg-3´

5´-cagcatcgctaccacagtgtcg-3´

18 S

76 N

60°C

5´-gccggtacagtgaaactgcg-3´

5´-ccaagtaggagaggagcgag-3´


[Seite 39↓]

3.2.2.2.  RT-PCR

Mit Hilfe der Reversen-Transkriptase-PCR (RT-PCR) lassen sich spezifische RNA-Sequenzen amplifizieren. Durch das Enzym Reverse-Transkriptase erfolgt zunächst die cDNA-Synthese mit der RNA als Matrize. Oligo(dT)-Primer, die im Bereich des Poly-A-Schwanzes (3´-Ende) der RNA hybridisieren, dienen als Startpunkt für die Reverse-Transkriptase. Anschließend wird eine PCR durchgeführt, in der die zuvor gebildete cDNA als Matrize dient.

Für die cDNA-Synthese wurde in einem Ansatz 3µg der extrahierten RNA, 3µl Oligo-dT-Primer (StrataScript™RT-PCR Kit, Stratagene, La Jolla, USA) und DEPC-Wasser in einem Gesamtvolumen von 41µl vorsichtig gemischt. Die Mischung wurde für 10 Minuten bei 65°C im Thermoblock (Trio-Thermoblock™, Biometra, Göttingen, Deutschland) inkubiert und auf 25°C abgekühlt, um die Bindung der Primer an die RNA zu gewährleisten. Anschließend wurden folgende Komponenten (alle StrataScript™ RT-PCR Kit, Stratagene, La Jolla, USA) in der hier angegebenen Reihenfolge hinzugegeben: 10µl First Strand-Puffer, 45µl Wasser, 2µl 25mM dNTPs, 1µl RNAse Block Ribonukleaseinhibitor und 1µl Reverse- Transkriptase. Die Lösung wurde vorsichtig gemischt, kurz zentrifugiert und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde nach dieser Inkubationszeit durch Erwärmen auf 90°C für 5 Minuten abgebrochen.

Die Amplifikation der gewünschten Abschnitte der cDNA erfolgte mittels PCR. Ausgehend von der vorliegenden cDNA wurden durch Verwendung spezifischer Primerpaare, die Anfangs- und Endpunkt der Reaktion bestimmen, DNA-Strang-Duplikate der gewünschten Sequenz synthetisiert. Die Sequenzen für die Primerpaare der entsprechenden Sonden sind in Tabelle 1 aufgeführt. Für die PCR wurden jeweils 10µl cDNA-Lösung mit folgenden Komponenten (alle StrataScript™ RT-PCR Kit, Stratagene, La Jolla, USA)gemischt: 10µl 10x Taq DNA polymerase buffer, 0,5µl 25mM dNTPs, 1µl Primer-Set (jeweils 0,5µl Sense-/Antisense-Primer; 0,1µg/µl), 1,0µl DynazymeII (2u/µl) und 77,5µl DEPC-Wasser. Alle Proben wurden mit 75µl Mineralöl (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland) überschichtet, um ein Verdunsten des Probeninhaltes zu verhindern. Für jedes Primerpaar lief eine Negativkontrolle mit.


[Seite 40↓]

Das Reaktionsgemisch unterlag im Thermoblock folgenden Temperaturen: Denaturierung (Trennung der komplementären Stränge) bei 94°C für 10 Minuten; [Einstellung der spezifischen Annealingtemperatur zur Anlagerung der Primer (siehe Tabelle 1) für 30 Sekunden, Elongation (Strangsynthese) bei 72°C für 60 Sekunden, Denaturierung bei 94°C für 45 Sekunden] für 35 Zyklen; Elongation bei 72°C für 10 Minuten; Beenden der Reaktion durch Abkühlen auf 4°C.

Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte durch Elektrophorese in einem 1,6%igem Agarosegel mit Ethidiumbromid in 1xTE-Puffer (5xTE-Puffer-Stammlösung: 0,45M Tris (Sigma-Aldrich Chemie GmbH Deisenhofen, Deutschland), 0,45M Borsäure (Sigma-Aldrich Chemie GmbH Deisenhofen, Deutschland), 10mM EDTA, pH 8,0). Die spezifischen Banden wurden unter UV-Licht fotografiert und ausgeschnitten.

Die Gelstücke wurden mit dem QIAquick Gel Extraktions Kit (Qiagen GmbH Hilden, Deutschland) nach dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Das Gelstück wurde in 300µl/100mg Puffer QG für 10 Minuten bei 50°C vollständig aufgelöst und 100µl/100mg Isopropanol hinzugefügt. Das gesamte Volumen wurde über die Qiagen-Säule gegeben, 1 Minute bei 15.500g zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Danach wurden 500µl Puffer QG auf die Säule pipettiert, 1 Minute bei 15.500g zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Anschließend wurde 750µl Puffer PE auf die Säule pipettiert, zweimal 1 Minute bei 15.500g zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Danach wurde die Säule in ein steriles Eppendorfgefäß überführt, 30µl Puffer EB in die Mitte der Säule pipettiert, 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert, 1 Minute bei 15.500g zentrifugiert und das gereinigte Produkt bei –20°C aufbewahrt.

3.2.2.3. Klonierung

Die Klonierung von PCR-Produkten dient der Herstellung großer Mengen identischer DNA. Hierbei wird die spezifische DNA (Insert) in einen Vektor eingebaut (Ligation), der in Bakterien eingeschleust wird (Transformation) und auf diese Weise vermehrt werden kann. Zur Ligation wurde der pGEM®-TEasy-Vektor(Promega GmbH, Mannheim, Deutschland) verwendet. Dieser Vektor enthält Basensequenzen häufiger Restriktionsendonukleasen, ein Ampicillin-Resistenz-Gen und das für ß-Galactosidase kodierende lacZ-Gen (siehe Abbildung 9).


[Seite 41↓]

Bakterien, die dieses Plasmid enthalten, exprimieren das Enzym ß-Galactosidase, welches galactosidische Bindungen spaltet und einen blauen Farbstoff bildet. Das lacZ-Gen wird nur exprimiert, wenn kein DNA-Insert dieses Gen unterbricht. Weiße Kolonien enthalten daher das gewünschte Klonierungsprodukt.

Abbildung 9: pGEM®-TEasy-Vektor

Für die Ligation wurden 7µl der gereinigten PCR-Produkte mit 0,1µl T-Vektor, 1µl Ligationspuffer und 1µl T4-DNA-Ligase (alles Promega GmbH, Mannheim, Deutschland) auf Eis gemischt und im Thermoblock für 1 Stunde bei 4°C und anschließend für 24 Stunden bei 16°C inkubiert.

Für die Transformation wurde Luria-Bertani-(LB)-Medium (10g Tryptone, Sigma-Aldrich Chemie GmbH Deisenhofen, Deutschland; 5g Hefe-Extrakt, Merck KG, Darmstadt, 5g NaCl, 20ml 1 M Tris-HCL (pH7,4) auf 1 Liter destilliertes Wasser) hergestellt. Die Lösung wurde autoklaviert, auf 50°C abgekühlt, 50ml als Transformationslösung abgenommen und 50mg/l Ampicillin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH Deisenhofen, Deutschland) steril hinzugefügt. Anschließend wurden 10 µl Ligationsansatz und 50µl kompetente JM109-Zellen (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland) für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Danach wurden die Ansätze für 45 Sekunden auf 37°C erhitzt (Hitzeschock) und sofort für 3 Minuten auf Eis abgekühlt (Kälteschock). Nach Hinzufügen von 800µl Transformationslösung wurden die Ansätze für 1 Stunde bei 37°C geschüttelt.


[Seite 42↓]

Zur Kontrolle wurde die Bakterienlösung auf einer Ampicillin-Agar-Platte ausgestrichen. Für die Platten wurde 8g Agar in 250ml H2O gelöst und autoklaviert. Nach Abkühlen auf 50°C wurde 25mg Ampicillin, 160µl 0,8 M Isopropyl-1-thio-ß-D-galactosid (IPTG) und 10mg 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-ß-D-galactosid (X-Gal) hinzugefügt und luftblasenfrei in Petrischalen gegossen. IPTG induziert die Expression am lac-Promotor, X-Gal ist ein Substrat ß-Galactosidase und Ampicillin verhindert das Wachstum von Bakterien, die kein Ampicillin-Resistenz kodierendes Plasmid enthalten. Die mit der Bakterienlösung ausgestrichenen Platten wurden bei 37°C über Nacht inkubiert. Da die Bakterien ein Ampicillin-Resistenz-Gen enthalten, können sie sich auf den Agar-Platten vermehren. Am nächsten Tag wurden mehrere weiße Kolonien gepickt und in 3ml LB-Medium bei 37°C über Nacht inkubiert.

3.2.2.4. Plasmidpräparation (Minipräparation)

Die Plasmidpräparation erfolgte nach folgendem Protokoll: Zunächst wurde 1ml der Bakteriensuspension mit 1ml Dimethylsulphoxide (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) gemischt und bei –80°C gelagert. Die restlichen 2ml der Bakteriensuspension wurden für 5 Minuten bei 5.000g zentrifugiert, das Pellet in 250µl TE-Puffer+RNase (100:1) aufgenommen, 250µl 1% SDS(Sigma Chemical Co., St. Louis, USA), 1 M NaOH-Lösung (pH 7,2; Roth GmbH Carl CO Karlsruhe, Deutschland) hinzugefügt und für 5 Minuten inkubiert. Die Bakterienlösung wurde vorsichtig geschüttelt, 250µl 3M Natriumacetat und 750µl Chloroform hinzu pipettiert, geschüttelt und für 5 Minuten bei 5.000g zentrifugiert. Die obere Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und der Rest verworfen. Nach Hinzufügen von 1ml Isopropanol, wurde die Lösung geschüttelt und für 20 Minuten bei 4°C und 16.000g zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig entfernt und das Pellet mit 75% Ethanol gewaschen, bei Raumtemperatur getrocknet und in 30µl TE-Puffer (pH 8,0) aufgenommen.

Zur Kontrolle erfolgte ein Probeverdau der Plasmide mit dem Restriktionsenzym Not-I (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland). Not-I schneidet beidseits des Inserts in den multiplen Kloning-Regionen des pGem®-TEasy-Vektors. In einem Ansatz von 10µl wurden 0,5µl Not-I, 1µl Puffer D, 1µl BSA 1:10 (bovines Serumalbumin) sowie 1µl DNA-Plasmid für 2 Stunden bei 37°C inkubiert und am Ende für 15 Minuten bei 65°C erhitzt.


[Seite 43↓]

Anschließend wurden die erhaltenen Fragmente in einem 1,6% Agarose-Gel aufgetrennt und analysiert. Alle Inserts hatten die erwartete Länge.

3.2.2.5. Sequenzierung

Jedes Plasmid wurde nichtradioaktiv nach der Methode von Sanger sequenziert (Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit mit 7-deaza-dGTP)118. Durch die Sequenzierung kann die Richtung der Sequenz festgestellt und kontrolliert werden, dass die richtige Sequenz kloniert wurde.

Für die Einzelreaktionen (A, C, G und T) wurden jeweils 850ng/1kb eingesetzt, ansonsten wurde entsprechend dem Protokoll des Herstellers verfahren. Als Sequenzierungs-Primer wurden IRD-800 markierte Standard-Oligonukleotide (M13 universal, M13 reverse, SP6, T7, und T3; MWG, Ebersberg) verwendet. Für die PCR wurden 4µl-Ansätze auf eine dünnwandige 96-Well-PCR-Mikrotiterplatte aufgetragen und mit PCR-Wachs überschichtet. Jeweils 1µl der denaturierten PCR-Produkte wurde in die Geltasche eines 6%igen denaturierenden Acrylamidgels pipettiert. Die elektrophoretische Auftrennung wurde bei 50°C und 34 V je cm (LI-COR 2000 System; MWG; Ebersberg) durchgeführt.

Die Detektion der Produkte erfolgte durch kontinuierliche Fluoreszenz-Messung. Die Sequenzauswertung wurde mit Hilfe der LI-COR-Software durchgeführt. Alle Plasmide enthielten die richtigen Sequenzen. ANP, GAPDH, Cyclophilin und PBGD wurden in Richtung des T7-Promotors, 18S in Richtung des SP6-Promotors transkribiert. Diese Information benötigt man für die Durchführung der in vitro-Transkription der RNA-Sonden für den RPA.

3.2.2.6. Plasmidpräparation (Maxipräparation)

Zur Herstellung einer größeren Menge von Plasmiden wurden 1ml des Bakterien/DMSO-Gemischs über Nacht in 200ml LB-Medium inkubiert. Die Plasmidpräparation erfolgte mit Hilfe des Qiagen-Kits (Qiagen GmbH Hilden, Deutschland) entsprechend dem Protokoll des Herstellers. Zunächst wurde die Bakteriensuspension für 20 Minuten bei 4°C und 5.000g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in jeweils 4ml Puffer 1 und 4ml Puffer 2 vorsichtig aufgelöst und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.


[Seite 44↓]

Danach wurden 4ml Puffer 3 hinzugefügt und die Suspension für 15 Minuten auf Eis gelagert. Anschließend wurde die Lösung für 30 Minuten bei 4°C und 30.000g zentrifugiert. Der Probenüberstand wurde auf die mit 10ml QBT-Puffer gewaschene Säule gegeben und zweimal mit 30ml QC-Puffer gewaschen. Nachdem 15ml QF-Puffer über die Säule gelaufen sind, wurden jeweils 5ml Eluat mit 3.5ml Isopropanol gemischt und die Lösung für 30 Minuten bei 4°C und 15.500g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet 10 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wurde das Pellet dreimal mit 5ml 75% Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. Das getrocknete Pellet wurde in DEPC-Wasser aufgenommen.

Die Plasmide von ANP, GAPDH, Cyclophilin und PBGD wurden mit den Restriktionsenzymen Nae-I (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland) und Sac-I (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland) in Puffer A (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland) verdaut. Nae-I schneidet den pGEM®-TEasy-Vektor (3.015N) an der Stelle 2.707 und Sac-I an der Stelle 109. Daher ergibt sich die verdaute Plasmidlänge aus der Sondenlänge plus 417N (ANP 1017 N, GAPDH 720N, Cyclophilin 597N, PBGD 543N) Das 18SrRNA-Plasmid wurden mit Vsp-I (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland) und SpH-I (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland) in Puffer D (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland) verdaut. SpH-1 schneidet den Vektor an der Stelle 26 und Vsp-I an den Stellen 288, 347 und 1582. Die Plasmidlänge für 18SrRNA beträgt daher 338N (siehe 3.2.2.4). Die erhaltenen Fragmente wurden in einem 1,6% Agarosegel aufgetrennt und analysiert. Alle Plasmide enthielten die entsprechenden Inserts (siehe Abbildung 10).

Abbildung 10: Gelelektrophorese des Verdaus der verwendeten Plasmide


[Seite 45↓]

Die spezifischen Banden wurden ausgeschnitten und mit Hilfe des QIAquick Gel Extraktions Kits (Qiagen GmbH Hilden, Deutschland)gereinigt (siehe 3.2.2.2).

3.2.2.7. In vitro-Transkription

Die in vitro-Transkription dient der Herstellung radioaktivmarkierter RNA-Sonden. Bei der in vitro-Transkription synthetisiert eine RNA-Polymerase RNA, wobei DNA als Vorlage dient. Die RNA-Polymerase bindet an einen entsprechenden DNA-Promotor, trennt die doppelsträngige DNA und benutzt den 3´-5´ Strang als Vorlage, um einen komplementären 5´-3´ RNA-Strang zu synthetisieren. Dabei wird 32P-radioaktives-UTP eingebaut und die Sonde radioaktiv markiert.

Für die in vitro-Transkription wurden entsprechend des Protokolls des Herstellers 0,5µg DNA mit 2µl 10xTranskriptionspuffer, 5µl 32P- markiertes-UTP, 2µl RNA-Polymerase (T7; SP6) und jeweils 1µl ATP, CTP, GTP (10mM) in einem Ansatz von 20µl gemischt und bei 37 °C inkubiert (MAXIscript-KitTM der Firma AMBION). Nach einer Stunde wurde 1µl DNAse 1 hinzugefügt und nochmals für 15 Minuten inkubiert. Durch Zugabe von 1µl EDTA (0,5 M) wurde die Reaktion gestoppt. Anschließend wurden die Sonden mit einem Polyacrylamidgel gereinigt, ausgeschnitten, über Nacht in 300µl Elutionspuffer gelöst und die Radioaktivität bestimmt.

3.2.3. Ribonuklease-Protektion-Assay und Quantifizierung der mRNA-Expression

3.2.3.1. Durchführung des RPA

Für die Durchführung des RPA wurde das RPA III KitTM (Ambion; Wiesbaden, Deutschland) verwendet. Am ersten Tag wurden jeweils 2,5µg der extrahierten RNA mit 20µl Hybridization III Buffer vermischt und die jeweiligen markierten Sonden hinzugegeben. Es wurde ein Assay mit den markierten Sonden für ANP (50.000cpm) und PBGD (50.000cpm), GAPDH (30.000cpm) und 18SrRNA (50.000cpm) sowie Cyclophilin (80.000cpm) durchgeführt. Alle Sonden wurden vorher getestet und die optimale Konzentration bestimmt. Hefe-RNA diente als Negativkontrolle.

Die Proben wurden 5 Minuten bei 90°C denaturiert. Durch Inkubation über Nacht bei 42°C (18 Stunden) konnte die RNA mit der komplementären Sonde hybridisieren.


[Seite 46↓]

Am nächsten Tag erfolgte die Herstellung eines RNAse-Mix durch Hinzufügen von 2,5µl RNAse A/T1 auf jeweils 200µl RNAse Digestion III Buffer. Um die ungebundene einsträngige RNA zu verdauen, wurde zu den über Nacht inkubierten Proben der RNAse-Mix hinzugefügt und die Proben für 60 Minuten bei 37°C inkubiert.

Diese Zeit diente zur Vorbereitung eines 8,0% denaturierenden Polyacrylamidgels, hergestellt aus 38,75 ml 9M-Urea (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA), 6,25ml 40% Acrylamid (Acryl: bis-Acryl=19:1, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA), 5ml 10xTBE-Puffer und 400µl 10% Amoniumpersulfat (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) in dH2O, 54µl TEMED (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA). Nach der Inkubation der Proben wurde die RNAse mittels 300µl RNAse Inactivation/Precipitation III Lösung inaktiviert und die Proben nochmals für 30 Minuten bei –20°C inkubiert und anschließend die unverdauten RNA-Abschnitte durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 4°C und 15.500g ausgefällt.

In der Zwischenzeit wurde die Elektrophorese gestartet. Alle Geltaschen wurden mehrmals sorgfältig gespült, um Reste des Harnstoffs zu entfernen. Als Laufpuffer für die Elektrophorese wurde 1xTBE-Puffer verwendet. Der radioaktive Überstand der Proben wurde vorsichtig entfernt und entsorgt. Die Pellets wurden in jeweils 8µl Gel Loading Buffer II aufgelöst, 5 Minuten bei 95°C erhitzt und vorsichtig in die Geltaschen pipettiert. Die Elektrophorese lief für 2 Stunden bei 250 V.

3.2.3.2. PhosphorImager

Für die Analyse der radioaktiven Signale wurde der PhosphorImager (Fujix Bio-Imaging Analyzer BAS 2000) verwendet. Hierzu wurde das Polyacrylamid-Gel nach der Elektrophorese auf ein Filterpapier transferiert, mit durchsichtiger Plastikfolie abgedeckt, bei 80°C Vakuum-getrocknet und in Abhängigkeit von der Sonde nach 1-3 Stunden auf einer PhosphorImager-Platte entwickelt. Die Länge der einzelnen Sonden und die Länge des entsprechend komplementär bindenden Fragments sind in Tabelle 2 aufgeführt.


[Seite 47↓]

Tabelle 2: Länge der einzelnen Sonden und des komplementären Fragments

Sonde

Länge der Sonde

Länge des komplemtären

Fragmentes

ANP

709 N

600 N

GAPDH

412 N

303 N

Cyclophilin

289 N

180 N

PBGD

235 N

126 N

18SrRNA

191 N

76 N

3.2.3.3. Analyse und Quantifizierung des RPA

Die Auswertung der autoradiographischen Signale erfolgte anhand der optischen Dichte mit Hilfe der NIH-Image-Software (National Institute of Health, USA).

3.2.4. TaqManTM -PCR und Quantifizierung der mRNA-Expression

3.2.4.1. Durchführung der TaqManTM -PCR

Für die Durchführung der TaqManTM-PCR wurde das TaqManTM-PCR Core Reagent Kit (PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Germany) verwendet und das Protokoll des Herstellers berücksichtigt. Jeweils 2µl der cDNA wurden mit 23µl eines Reaktionsgemisches bestehend aus jeweils 2,5µl 10xTaqMan buffer A, 3,5µl Magnesiumchlorid (25mM), jeweils 0,5µl dATP, dCTP, dGTP und dUTP (10mM), jeweils 0,75µl forward und reverse Primer (10µM), 0,75µl der mit 5´-Fam-/3´-Tamra-markierten Sonden (5µM), 0,125µl AmpliTaq Gold (5 U/µl) und 0,25µl AmpErase UNG (1 U/µl). Die TaqManTM-PCR erfolgte mit Hilfe des ABI PRISM 7700 Sequece Detection System. Folgende Zyklusparameter wurden verwendet: Enzymaktivierung bei 50°C für 2 Minuten, Denaturierung bei 95°C für 10 Minuten, 50 Zyklen Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden und anschließend Annealing (Anlagerung) der Primer und Elongation (Strangsynthese) bei 60°C für eine Minute.

Primerpaare und Sonden wurden von der Firma BioTeZ Berlin-Buch GmbH (Robert-Rössle Str.10, 13125 Berlin, Deutschland) hergestellt (Sequenzen siehe Tabelle 3).


[Seite 48↓]

Tabelle 3: Verwendete Primerpaare und jeweilige Sonde bei der TaqManTM–PCR

Gen

Primer forward/Primer reverse

TaqMan-Sonde

ANP

5´-ctt ctt ctt ctt ggc ctt ttg -3´ /

5´-gtg ttg gac acc gca ctg tat ac-3´

5´-Fam- TCC CAG GCC ATA TTG GAG CAA ATC C -Tamra -3´

GAPDH

5´-aac gac ccc ttc att gac ctc-3´/

5´-CTT CCC ATT CTC AGC CTT GAC T-3´

5´-Fam- ACC CAC GGC AAG TTC AAC GGC A –Tamra-3´

Cyclo

5´-CCA AGA CTG AGT GGC TGG ATG-3´/

5´-TCC ACA ATG CTC ATG CCT TC-3´

5´-Fam- CAA GCA TGT GGT CTT TGG GAA GGT GAA -Tamra-3´

PBGD

5´-TGG CTC AGA TAG CAT GCA AGA G-3´/

5´-TGG ACC ATC TTC TTG CTG AAC A-3´

5´-Fam- ATG CAG GCC ACC ATC CAG GTC C -Tamra-3´

18 S

5´-CAT TCG TAT TGC GCC GCT A-3´/

5´-TGC TTT CGC TCT GGT TCG T-3´

5´-Fam- AGG TGA AAT TCT TGG ACC GGC GCA -Tamra-3´

3.2.4.2. Auswertung TaqManTM -PCR

Die Auswertung der Expressionsdaten erfolgte mit Hilfe des Ct-Wertes (Cycle Threshold). Dieser Wert entspricht der Zyklenzahl, bei der zum ersten Mal ein Anstieg der Reporter-Fluoreszenz über die Grundlinie erfasst wird. Für die Berechnung wurde die in der Benutzeranleitung #2 des ABI PRIMS 7700 Sequence Detection System beschriebene ΔΔ Ct-Methode zur Quantifizierung verwendet.

Die mRNA Expression ergibt sich aus folgender Formel:

Die folgenden Bilder zeigen Beispielgraphen der durchgeführten TaqManTM-PCR für ANP und die untersuchten Housekeeping-Gene (siehe Abbildungen 11-15).


[Seite 49↓]

Abbildung 11: Beispielgraphen der ANP-mRNA-Expression im Shuntmodell ( ∙Kontrolle, ∙kleiner Shunt, ∙ großer Shunt)

Abbildung 12: Beispielgraphen der GAPDH-mRNA-Expression im Shuntmodell ( ∙Kontrolle, ∙kleiner Shunt, ∙großer Shunt)

Abbildung 13: Beispielgraphen der Cyclophilin-mRNA-Expression im Shuntmodell ( ∙Kontrolle, ∙kleiner Shunt, ∙großer Shunt)


[Seite 50↓]

Abbildung 14: Beispielgraphen der PBGD-mRNA-Expression im Shuntmodell ( ∙Kontrolle, ∙kleiner Shunt, ∙großer Shunt)

Abbildung 15: Beispielgraphen der 18SrRNA-Expression im Shuntmodell ( ∙Kontrolle, ∙kleiner Shunt, ∙großer Shunt)

3.3. Statistische Auswertung der mRNA-Expression

Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen wurden mit Hilfe der ANOVA Analyse der Varianz und anschließender Fischer Post-Hoc Analyse bestimmt. Das Signifikanzniveau wurde mit p<0,05 festgelegt.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
10.03.2005