[Seite 62↓]

5.  Diskussion

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen geeigneten internen Standard zur RNA-Quantifizierung bei kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz in der Ratte zu finden. Hierzu wurde die linksventrikuläre mRNA-Expression von Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), Cyclophilin, Porphobilinogen-Desaminase (PBGD) sowie 18SrRNA in Tieren mit kleinem und großem Shunt sowie Myokardinfarkt, als verschiedene Modelle der experimentellen Hypertrophie bzw. Herzinsuffizienz, bestimmt. Die Tiere wurden hämodynamisch charakterisiert und die linksventrikuläre mRNA-Expression der Housekeeping-Gene mit Hilfe von Ribonuklease-Protektion-Assay und TaqManTM-PCR untersucht. Beide Methoden sind häufig verwendete Verfahren zur Quantifizierung von mRNA, wobei sich die TaqManTM-PCR durch ihre höhere Sensitivität und Spezifität auszeichnet 119;120. Die Anwendung von zwei unterschiedlichen Methoden ermöglichte einerseits die Kontrolle der Ergebnisse, andererseits konnte der Einfluss der Detektionsmethode auf die Expressionswerte gezeigt werden. Die linksventrikuläre ANP-mRNA-Expression als bekannter Hypertrophie- und Insuffizienzmarker diente in allen Untersuchungen als Positivkontrolle.

5.1. Der aortokavale Shunt und der Myokardinfarkt als Hypertrophie- bzw. Herz- insuffizienzmodell

Hypertrophie und Herzinsuffizienz können durch eine Vielzahl kardialer und extrakardialer Störungen verursacht oder begünstigt werden. Mögliche Ursachen sind eine verminderte O2-Versorgung durch Koronare Herzerkrankung oder Myokardinfarkt, eine Druckbelastung bei erhöhtem Blutdruck oder eine Volumenbelastung. Aufgrund der Heterogenität der Ursachen von Hypertrophie und Herzinsuffizienz wurden die Daten an unterschiedlichen Tiermodellen erhoben.


[Seite 63↓]

Als Herzinsuffizienzmodell, verursacht durch eine chronische Volumenbelastung, wurde der infrarenale aortokavale Shunt der Ratte gewählt. Die Auswahl unterschiedlicher Shuntgrößen (kleiner und großer Shunt) ermöglichte die Erzeugung von Hypertrophie und Herzinsuffizienz im gleichen Tiermodell.

Durch hämodynamische Messungen und die Bestimmung der Organgewichte wurden die Tiermodelle charakterisiert. Als Parameter einer bestehenden Herzinsuffizienz wurden der linksventrikuläre enddiastolische Druck (LVEDP) und die linksventrikuläre Kontraktilität (dP/dtmax) bestimmt.

Tiere mit kleinem Shunt zeigten einen mäßigen Anstieg des zentralen Venendruckes (ZVD) und des LVEDP. Die Kontraktilität war nicht eingeschränkt. Die Zunahme sowohl des Gesamtherzgewichts als auch des Gewichtes der einzelnen Herzkammern kennzeichnete die kardiale Hypertrophie.

Tiere mit großem Shunt hatten im Vergleich zu Tieren mit kleinem Shunt höhere Herzgewichte. Die kardiale Hypertrophie beim großen Shunt war deutlich ausgeprägter als im kleinen Shunt. Auch hämodynamisch unterschieden sich beide Herzinsuffizienzmodelle voneinander. Sowohl der LVEDP als auch der ZVD waren im großen Shunt signifikant erhöht. Die Kontraktilität, als typisches Merkmal der Herzinsuffizienz, war dagegen beim großen Shunt signifikant um etwa 25 % vermindert.

Als weiteres Tiermodell der Herzinsuffizienz diente der durch Ligation der LAD erzeugte Myokardinfarkt. Auch in diesem Modell kam es zu einer kardialen Hypertrophie, gekennzeichnet durch eine Zunahme des Gesamtgewichts und des Gewichts der einzelnen Herzkammern. Eine Ausnahme bildete dabei der linke Ventrikel, dessen Gewicht konstant blieb. Vermutlich reagierten auch die noch vitalen linksventrikulären Myokardzellen mit Hypertrophie. Aufgrund des ausgeprägten Infarkts blieb jedoch eine Zunahme des Gesamtgewichts aus. Die linksventrikuläre Kontraktilität war zwar im Vergleich zur Kontrolle um 15% erniedrigt, jedoch nicht signifikant. Der LVEDP als Merkmal einer Herzinsuffizienz war deutlich erhöht.

Die Gewichtsbestimmung und die hämodynamischen Messungen zeigten, dass die verwendeten Tiere als Modelle für kardiale Hypertrophie bzw. Herzinsuffizienz geeignet waren. Ob die Daten uneingeschränkt auf andere Tiermodelle oder die entsprechende Erkrankung beim Menschen übertragbar sind, bleibt jedoch unklar.


[Seite 64↓]

5.2.  Die linksventrikuläre ANP-mRNA-Expression

ANP wird kardial synthetisiert und in den Kreislauf freigesetzt. Hauptwirkungen von ANP sind Natriurese, Diurese, sowie Vasodilatation. ANP wird bei der Herzinsuffizienz vermehrt exprimiert 121-125. Es ist ein Hypertrophiemarker 111;126 und korreliert relativ gut mit dem Schweregrad der Herzinsuffizienz 127-129. Daher ist ANP-mRNA eine geeignete Positivkontrolle in den verwendeten Tiermodellen.

Die linksventrikuläre ANP-mRNA-Expression war in allen Hypertrophie- und Herzinsuffizienzmodellen im Vergleich zur Kontrolle deutlich erhöht. Dabei unterschied sich das Ausmaß des Anstiegs in den einzelnen Gruppen erheblich in Abhängigkeit von der verwendeten Detektionsmethode. Während mit dem Ribonuklease Protektion Assay (RPA) lediglich ein ca. 50%iger Anstieg der ANP-mRNA-Expression bei Tieren mit kleinem und großem Shunt sowie Infarkttieren im Vergleich zu Kontrolltieren nachgewiesen werden konnte, zeigte sich in der TaqManTM-PCR ein ca. 3,5facher Anstieg in Tieren mit kleinem Shunt, ein ca. 6,5facher Anstieg in Infarkttieren und ein 43facher Anstieg der ANP-mRNA-Expression in Tieren mit großem Shunt im Vergleich zu Kontrolltieren.

Auch früher erhobene Daten zeigten eine erhöhte ANP-mRNA-Expression bei Tieren mit kleinem und großem Shunt im Vergleich zu Kontrolltieren. Mit Hilfe von Northern Blot bzw. Slot Blot wurde ein bis zu 5facher Anstieg der ANP-Expression gemessen 90.

Ursache für diese unterschiedlich erzielten Expressionswerte könnte der geringe dynamische Messbereich des RPAs sein, bei dem die Genexpression anhand der optischen Dichte bestimmt wird. Befinden sich die Expressionswerte an der oberen messbaren Dichte, können Unterschiede nicht mehr detektiert werden. Dagegen ist die TaqManTM-PCR wesentlich sensitiver und erlaubt die genaue Expressionsbestimmung über einen großen Messbereich (siehe auch 5.4). Eine weitere Erklärung wäre, dass die Konzentration der ANP-Sonden für das RPA nicht ausreichend war. Da alle Sonden jedoch vor der Anwendung getestet und die optimale Konzentration bestimmt wurde, kann dies als Ursache ausgeschlossen werden.


[Seite 65↓]

5.3.  Die linksventrikuläre mRNA-Expression der Housekeeping-Gene

5.3.1. GAPDH

GAPDH ist ein wichtiges Enzym der Glykolyse und ein klassisches Housekeeping-Gen. Erst in den letzten Jahren zeigte sich, dass GAPDH nicht nur ein Enzym des Glucosestoffwechsels ist, sondern eine Vielzahl unterschiedlicher Funktionen erfüllt 54;55. GAPDH wird sehr häufig als interner Standard verwendet, da bisher eine von externen Faktoren unabhängige Expression angenommen wurde. Mittlerweile gibt es jedoch eine Reihe von Veröffentlichungen, die eine Regulation von GAPDH, z.B. unter Hypoxie, bei Zellproliferation und bei Zelldifferenzierung zeigen. Deshalb ist es erforderlich, die Eignung von GAPDH als interner Standard für die jeweils verwendete Methode zu testen.

Kardiale Hypertrophie und Herzinsuffizienz führen zu charakteristischen Änderungen in der Genexpression. Es werden eine Reihe von Wachstums- und Transkriptionsfaktoren, wie insulin-like growth factor (IGF),transforming growth factor (TGF) und platelet-derived growth factor (PDGF) freigesetzt 87. Myokardinfarkt und Hypertrophie bedeuten für die Myokardzellen hypoxischen Stress. Bis zum jetzigen Zeitpunkt liegen keine Daten über die Regulation von GAPDH bei kardialer Hypertrophie bzw. Herzinsuffizienz vor. Die vorliegende Studie untersucht daher die linksventrikuläre GAPDH-mRNA-Expression an verschiedenen Tiermodellen der Herzhypertrophie bzw. Herzinsuffizienz.

Der RPA ergab keine signifikanten Veränderungen der GAPDH-mRNA-Expression im Shunt- bzw. Infarktmodell im Vergleich zu Kontrolltieren. In der TaqManTM-PCR war die mRNA-Expression von GAPDH im kleinen und großen Shunt, verglichen mit der Kontrollgruppe, eher erhöht, es ergaben sich jedoch keine signifikanten Unterschiede. Dagegen war in der Gruppe der Infarkttiere die mit der TaqManTM-PCR gemessene GAPDH-mRNA-Expression gegenüber Kontrolltieren signifikant erniedrigt. Daraus ergibt sich, dass GAPDH kein geeigneter interner Standard bei der kardialen mRNA-Analyse ist, insbesondere bei der Verwendung äußerst sensitiver Methoden wie TaqManTM-PCR.

Unterschiedliche Veröffentlichungen zeigen eine Regulation von GAPDH z.B. unter dem Einfluss von Hypoxie. Untersuchungen an verschiedenen Prostatakarzinom- bzw. Endothelzelllinien unter O2-Mangel ergab eine höhere Expression von GAPDH. Es konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor hypoxia-inducible-factor 1 (HIF-1) die Transkription von GAPDH und anderen Enzymen der Glykolyse induziert.


[Seite 66↓]

HIF-1 wird auch durch sauerstoffunabhängige Faktoren aktiviert. Hierzu gehören verschiedene Onkoproteine, Insulin, insulin-like growth factor 1 und 2 (IGF 1, IGF 2) und Interferon. Sie wirken mittels liganden-spezifischer Tyrosinkinaserezeptoren 47. Bei Entzündungsreaktionen kommt es zur Freisetzung von Zytokinen. Diese bewirken durch Induktion der NO-Synthetase eine vermehrte Freisetzung des zytotoxisch wirkenden NO. Dieses hemmt die mitochondriale Elektronentransportkette und die Aktivität von GAPDH. NO verstärkt die Auto-ADP-Ribosylation von GAPDH. Die ADP-Ribosylation findet vermutlich an einem hochkonservierten Cystein im Bereich der NAD-Bindungsstelle statt und verursacht die Inaktivierung des Enzyms 57. Gleichzeitig bewirkt NO aber auch eine erhöhte Expression von GAPDH. Ursache hierfür könnten verschiedene Anpassungsmechanismen der Zelle an eine verminderte Energieproduktion und hypoxischen Stress sein 59. Hypoxieintolerante Zellen wie z.B. renale Endothelzellen, glatte Muskelzellen oder Lungenfibroblasten reagieren nicht mit einer Erhöhung der GAPDH-mRNA-Expression. Man vermutet, dass die Induktion von GAPDH kein allgemein gültiger Adaptionsmechanismus, sondern vielmehr kennzeichnend für hypoxietolerante Zellen ist 50.

Für die Messung der GAPDH-Expression beim Infarktmodell wurde lediglich das vitale Gewebe des linken Ventrikels verwendet. Möglicherweise wäre eine erhöhte Expression von GAPDH im ischämischen Bereich um die Infarktnarbe nachweisbar. Veränderungen in der Genexpression in dieser Region lassen sich jedoch aufgrund des kleinen Anteils bei Untersuchungen am linken Ventrikel kaum nachweisen.

Eine Reihe von Veröffentlichungen beschäftigen sich mit der GAPDH-mRNA-Expression in malignen Zellen und in Tumoren. Es wurde gezeigt, dass es durch die Induktion der hepatozellulärer Proliferation mittels Tetrachloriden nahezu zur Verdopplung der Expression von GAPDH-mRNA kommt 51. In humanen hepatozellulären Karzinomzellen ist im Vergleich zu gesunden Leberzellen die GAPDH-Expression sogar bis auf das 16fache erhöht. Auch in verschiedenen anderen Tumorzellen (Mammakarzinom, Lungentumor, Pankreaskarzinom, Nierenkarzinom) konnte eine vermehrte Expression von GAPDH nachgewiesen werden 58;130-132. Vermutlich steht die erhöhte Expression von GAPDH in Tumorzellen im Zusammenhang mit dem erhöhten Stoffwechselumsatz der Zelle und der Freisetzung von HIF-1-aktivierenden Onkoproteinen.

Eine gesteigerte GAPDH-mRNA-Expression findet man nicht nur in malignen Zellen, sondern auch bei akuter Pankreatitis 133.


[Seite 67↓]

Im Gegensatz dazu führt Nahrungsentzug in Zellen des oberen Intestinaltrakts und des Pankreas zu einer verminderten Expression von GAPDH 60. In kultivierten Fibroblasten ist die GAPDH-mRNA-Expression gegenüber normalen Hautzellen auf das 2-6fache erhöht 70. Die GAPDH-Expression erhöht sich während der Epithelzelldifferenzierung von Keratinozyten, die mit HPV (Humanes Papillomavirus) infiziert sind, auf das 4,9fache 135.

GAPDH gehört zu den am häufigsten verwendeten internen Standardgenen bei der Quantifizierung von mRNA. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass GAPDH nicht nur ein Enzym der Glukolyse ist, sondern vielfältige Funktionen in der Zelle erfüllt. Dies erklärt die in vielen Untersuchungen nachgewiesene Variabilität der Expression des klassischen Housekeeping-Gens. Möglicherweise erklären sich durch die Multifunktionalität des Enzyms scheinbar widersprüchliche Beobachtungen. Dabei könnten unterschiedliche Regulationsmechanismen in vivo und in vitro sowie verschiedene Kontrollmechanismen der Promotoraktivität unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen eine Rolle spielen. Wie diese Arbeit und andere Untersuchungen zeigen, sollte eine Regulation der GAPDH-Expression unter den spezifischen experimentellen Bedingungen vor der Anwendung als interner Standard ausgeschlossen werden.

5.3.2. Cyclophilin

Das zu der Gruppe der Prolyl-cis-trans-Isomerasen gehörende Cyclophilin bindet das immunsuppressiv wirkende Cyclosporin A und hemmt dessen Aktivität. Es gehört zur Gruppe der Housekeeping-Gene und wurde in den letzten Jahren immer häufiger als Standardgen zur RNA-Normalisierung verwendet 62-64.

Die Untersuchung der Cyclophilin-mRNA-Expression mit dem RPA ergab keine signifikanten Unterschiede in den einzelnen Tiermodellen verglichen mit Kontrolltieren. In der Gruppe der Infarkttiere war die mit mit TaqManTM-PCR gemessene Cyclophilin-mRNA-Expression eher erniedrigt, jdoch nicht signifikant. Dagegen zeigte die TaqManTM-PCR in Tieren mit großem Shunt eine deutliche Erhöhung der Cyclophilin-mRNA im Vergleich zu Kontrolltieren. Cyclophilin ist daher, ebenso wie GAPDH, als interner Standard bei der kardialen mRNA-Analyse, insbesondere bei der Verwendung äußerst sensitiver Methoden, ungeeignet.

Eine ähnliche Studie untersuchte das Verhältnis der linksventrikulären Expression von GAPDH und Cyclophilin an hypertensiven Ratten.


[Seite 68↓]

Mit Hilfe von Northern-Blots wurde die mRNA-Expression der Housekeeping-Gene in 6 Monate alten hypertensiven, mit Enalapril (ACE-Hemmer) behandelten und normotonen Ratten bestimmt. Trotz unterschiedlicher hämodynamischer Eigenschaften der untersuchten Gruppen war das Verhältnis von Cyclophilin- und GAPDH-mRNA-Expression gleich. Hieraus wurde auf eine unveränderte Expression von GAPDH und Cyclophilin bei hypertensiven bzw. mit ACE-Hemmern behandelten Ratten geschlossen 136. Eine gleichzeitige Induktion bzw. Suppression von GAPDH und Cyclophilin würde jedoch Unterschiede in der Expression beider Gene verbergen. Das Verhältnis von GAPDH und Cyclophilin, bezogen auf in dieser Arbeit erhobenen Daten, würde ebenfalls nur geringe Veränderungen in der Expression zeigen.

Einige Untersuchungen konnten eine geringere Variabilität der Expression von Cyclophilin im Vergleich zu GAPDH nachweisen. In normalen Keratinozyten und in HPV-infizierten Keratinozyten ist die Cyclophilin-Expression im Vergleich zu GAPDH stabil 135. Ähnliche Ergebnisse erzielten Untersuchungen an 78 verschiedenen Zelllinien und Gewebetypen, wie z.B. Cerebrum, Mamma, Kolon, Leber, Ovar, Pankreas, Prostata und Cutis. Die Cyclophilin-mRNA-Expression war im Vergleich zu GAPDH stabiler. Daher wurde hier Cyclophilin, anstelle des häufig verwendeten GAPDH, als interner Standard bei der mRNA-Quantifizierung empfohlen 64.

Andere Untersuchungen zeigen dagegen eine Regulation von Cyclophilin bei Hypoxie und Hitzeschock. Cyclophilin wirkt bei der Faltung von Proteinen mit. Man vermutet eine funktionelle Assoziation mit spezifischen Hitzeschockproteinen. Hitzeschock und Hypoxie bewirken eine signifikante Induktion der Expression von Cyclophilin in myokardialen Zellen 48. Die aufgrund der Hypertrophie verminderte Perfusion des Myokards könnte die mit der TaqManTM-PCR nachgewiesene signifikant erhöhte Expression von Cyclophilin in Tieren mit großem Shunt erklären. Da lediglich das linksventrikuläre vitale Gewebe der Infarkttiere untersucht wurde, können mögliche Änderungen der Genexpression im ischämischen Bereich um die Infarktnarbe nicht nachgewiesen werden.

Cyclophilin scheint auch eine Rolle bei der Entstehung von Ischämie-Reperfusion-Schäden des Myokards zu spielen. Hierbei könnte die nachgewiesene Wirkung von Cyclophilin auf kalziumabhängige Kanäle eine Rolle spielen. Die mitochondriale Isoform des Cyclophilins ist ein Bestandteil eines Kanals (PT-Pore) der inneren und äußeren mitochondrialen Membran. Man nimmt an, dass dieser Kanal bei Apoptose und Nekrose mitwirkt 48;65.


[Seite 69↓]

Wenn verschiedene Zelllinien hypoxischen Bedingungen (1% O2, 24 Stunden) ausgesetzt werden, bewirkt Hypoxie nicht in allen Zellen die Induktion von Cyclophilin. In Endothelzellen der Vena Umbilikalis ist die Expression um bis zu 22,8% erniedrigt, in Prostatakarzinomzellen dagegen um bis 7,5% erhöht 47.

5.3.3. PBGD

PBGD ist ein Schlüsselenzym der Porphyrinsynthese. Es besitzt zwei Promotoren und kodiert für das erythrozyten-spezifische Isoenzym (42kDa) und das ubiquitär vorkommende Isoenzym (44kDa). Der Promotor des erythrozytenspezifischen PBGD weist strukturelle Ähnlichkeiten mit dem ß-Globin-Gen auf. Der Promotor des ubiquitären Enzyms enthält eine Sp1-Bindungsstelle, die charakteristisch für viele Housekeeping-Gene ist. PBGD wird als pseudogenfreies Housekeeping-Gen von einigen Autoren als Standardgen für die mRNA-Quantifizierung empfohlen 67. Es liegen jedoch nur wenige Veröffentlichungen vor, die die Expression des pseudogenfreien Housekeeping-Gens unter verschiedenen experimentellen Bedingungen untersucht haben.

Die vorliegende Untersuchung konnte eine unveränderte PBGD-mRNA-Expression in Tieren mit Shunt verglichen mit Kontrolltieren zeigen. Infarkttiere zeigten im RPA tendenziell (nicht signifikant) erniedrigte PBGD-mRNA-Expressionwerte im Vergleich zu Kontrolltieren. Bei der Untersuchung der Infarkttiere mit Hilfe der TaqManTM-PCR wurde eine deutlich verminderte PBGD-mRNA-Expression gegenüber Kontrolltieren nachgewiesen. Aus den vorliegenden Daten ergibt sich, dass PBGD kein zuverlässiges Kontrollgen für die kardiale mRNA-Expressionsanalyse ist.

Untersuchungen an verschiedenen Nephronabschnitten zeigten, dass das ubiquitär vorkommende PBGD nicht in allen Zellen gleich exprimiert wird. Tubulus-Homogenisate weisen wesentlich höhere PBGD-mRNA-Level auf als Glomeruli-Homogenisate 68. Aus anderen Veröffentlichungen geht hervor, dass die PBGD-mRNA-Expression des Housekeeping-Gens in verschiedenen Zellhomogenisaten und in durch Laser spezifisch ausgewählten Zellen konstant ist 67.

In Erythrozyten wird PBGD unter hypoxischen Bedingungen aktiviert 137. Buttersäure induziert in humanen leukämischen multipotenten Zellen der K562-Linie die Hämoglobinisierung dosis- und zeitabhängig. Gleichzeitig kommt es zur vermehrten Expression von PBGD-mRNA 138.


[Seite 70↓]

Ebenso bewirken subtoxische Konzentrationen verschiedener Antrazykline eine Differenzierung in Richtung Hämatopoese und die Stimulierung der PBGD-Expression in diesen Zellen. Neuere Untersuchungen an Gliomazellen zeigen eine starke Assoziation von PBGD und Nukleolus. In PBGD transfizierten Gliomazellen kommt es zur Differenzierung in Richtung Astrozyten. Mit Hilfe der Immunofluoreszenz konnte gezeigt werden, dass die Induktion der Gliomazellen zur Differenzierung, eine verminderte Konzentration von PBGD sowohl im Zytoplasma als auch im Kern bewirkt. Diese Untersuchungen lassen neben der Enzymfunktion von PBGD in der Porphyrinsynthese auf eine mögliche regulative Funktion von PBGD bei Proliferation und Differenzierung in Gliomazellen schließen 139.

5.3.4. 18SrRNA

Die Gesamt-RNA besteht zu 80% aus ribosomaler RNA. Daher nimmt man an, dass die Menge der ribosomalen RNA geringeren Schwankungen ausgesetzt ist. Verschiedene Autoren empfehlen die Anwendung ribosomaler RNA bei der Normalisierung von mRNA, da in verschiedenen Untersuchungen gezeigt wurde, dass die rRNA-Expression im Gegensatz zu anderen Housekeeping-Genen relativ stabil ist 46;47;62.

Auch in den vorliegenden untersuchten Modellen konnte gezeigt werden, dass 18SrRNA ein geeignetes Standardgen für Genexpressionsanalysen bei Hypertrophie und Herzinsuffizienz ist. Im Gegensatz zu GAPDH, Cyclophilin und PBGD war es das einzige Housekeeping-Gen, bei dem auch mit der sehr sensitiven TaqManTM-PCR eine stabile Expression sowohl in Tieren mit Shunt als auch in Tieren mit Infarkt nachgewiesen werden konnte. Daher kann 18SrRNA als Kontrollgen zur kardialen mRNA-Expressionsanalyse unter den Bedingungen von kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz verwendet werden.

Auch in kultivierten Hautfibroblasten und in Zellen des Pankreas bzw. oberen Gastrointestinaltraktes bei Nahrungsentzug ist die 18SrRNA-Expression im Vergleich zu anderen Housekeeping-Genen stabil 60;70. Das Gleiche gilt für die 28SrRNA-Expression im hepatozellulären Karzinom und bei Hypoxie 47;49. Trotzdem kann ribosomale RNA nicht uneingeschränkt für die Normalisierung von mRNA empfohlen werden. Es ist bekannt, dass es in leukämischen Zellen zu Störungen im RNA-Metabolismus kommt 71;72. Perfetti et al. untersuchten die Expression von Housekeeping-Genen beim Morbus Hodgkin. Die Expression von GAPDH ist in chronisch entzündlichen Tonsillen bzw. im Lymphknoten eines Patienten mit B-Zell-Lymphom relativ homogen.


[Seite 71↓]

Dagegen variiert in den befallenen Lymphknoten die GAPDH-Expression sehr stark 140. Finnegan et al. testeten die Expression häufig genutzter Housekeeping-Gene in verschiedenen Non-Hodgkin Lymphomen. Mit Hilfe des Northern Blots wurden die Expressionslevel von ß-Aktin, α-Tubulin, ß2-Mikroglobulin und GAPDH im Vergleich zu ribosomaler RNA bestimmt. In reaktiv hyperplastischen Lymphknoten korreliert die Expression von 18SrRNA mit den Housekeeping-Genen. Niedrig- und hochmaligne Lymphome zeigen große Unterschiede im Verhältnis 18SrRNA und Housekeeping-Gen, wobei GAPDH als einziges Housekeeping-Gen noch relativ konstant exprimiert wurde. Sie empfehlen die Anwendung von 18S or 28S rRNA zur RNA-Quantifizierung 141.

Raaijmakers et al. untersuchten die Genexpressionen von 18SrRNA und GAPDH in einer kleinen Anzahl von aufgereinigten normalen und leukämischen CD34+CD38-- und CD34+CD38+-Zellen mit Hilfe der „Real-Time“-PCR. CD34+CD38- sind Zellen der normalen Hämatopoese mit Stammzelleigenschaften, die eine Rolle bei der Entstehung von Leukämien spielen. Die leukämischen Zellen zeigen im Vergleich zu normalen Knochenmarkzellen keine signifikanten Unterschiede in der Expression von GAPDH-mRNA.Die Expression von 18SrRNA variiert dagegen stark. Insbesondere leukämische CD38+ Zellen weisen signifikant niedrigere 18SrRNA-Level als normale Knochenmarkzellen auf. Diese Aussage korreliert mit anderen Veröffentlichungen, die eine Einschränkung der rRNA-Synthese bei der Akuten-Lymphatischen-Leukämie belegen 73. Damit ergibt sich die Frage, ob die Variation des Verhältnisses von GAPDH zu 18SrRNA im Non-Hodgkin-Lymphom nicht durch eine unterschiedliche Expression der rRNA hervorgerufen wird. Dies unterstreicht die Bedeutung der Auswahl eines geeigneten Standards zur RNA-Quantifizierung.

Nicht nur in leukämischen Zellen kommt es zu Änderungen des rRNA-Gehalts der Zelle. Unterschiedliche äußere Bedingungen wie Hitzeschock, Nahrungsentzug und Änderungen der Wachstumsrate führen in Bakterien zu einer erheblichen Veränderung des rRNA-Gehalts. Untersuchungen mit grampositiven Lactococcus-lactis-Bakterien ergaben während Hitzeschock eine Erniedrigung des rRNA-Gehalts pro Zelle um Werte von 30% 74.

Untersuchungen an Adipozyten unter dem Einfluss von 6 Hormonen bzw. an kultivierten Preadipozyten mit Hilfe von TaqManTM-RT-PCR zeigen eine annähernd 2fach erhöhte Expression von 18SrRNA. Von 11 untersuchten Housekeeping-Genen zeigte lediglich GAPDH eine stabile Expression 134.


[Seite 72↓]

5.4.  Kritische Betrachtung der verwendeten Methoden und Schlussfolgerungen

Die Quantifizierung von mRNA ist problematisch. Viele Untersuchungen haben gezeigt, dass es keinen idealen und allgemein gültigen internen Standard gibt und man vorsichtig mit der Verallgemeinerung von Daten sein sollte. Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass in den untersuchten Hypertrophie- und Herzinsuffizienzmodellen lediglich die linksventrikuläre 18SrRNA-Expression in allen untersuchten Gruppen stabil war. Die mRNA-Expression von GAPDH, Cyclophilin und PBGD unterschieden sich in den einzelnen Tiergruppen zum Teil erheblich.

Bei der Interpretation der vorliegenden Ergebnisse sollten einige Punkte berücksichtigt werden. Eine Ursache für die zum Teil konträren Ergebnisse in anderen Studien könnten unterschiedliche Genregulationsmechanismen in vivo und in vitro sein. Häufig werden Untersuchungen zur Genregulation an einzelnen Zelltypen durchgeführt. Die Übertragung der Ergebnisse auf einen Organismus sind nur bedingt möglich. Da für die vorliegende Studie die linksventrikuläre Genexpression an verschiedenen Hypertrophie- und Herzinsuffizienz-modellen in vivo untersucht wurde, kann nicht auf die Expression in einzelnen Zelltypen zurückgeschlossen werden.

Beim Infarktmodell ist zu beachten, dass für die Untersuchungen lediglich vitales Gewebe des linken Ventrikels verwendet wurde. Im Gegensatz zum gesunden Myokard sind Myofibroblasten Hauptbestandteil des Infarktgewebes. Daher könnte sich die Genexpression zwischen Narbengewebe und gesundem Myokard unterscheiden. Die Ergebnisse beziehen sich jedoch nur auf das gesunde Myokard. Mögliche Unterschiede der Genexpression im schmalen ischämischen Bereich um die Infarktnarbe haben, aufgrund des geringen Anteils, kaum einen Einfluss auf die Genexpression im vitalen Rest des linken Ventrikels.

In allen untersuchten Tiermodellen kommt es zur kardialen Hypertrophie, das heißt zu einer Zunahme der Masse des einzelnen Myozyten. Die Hypertrophie geht einher mit einer generellen Vermehrung von RNA und Proteinen. Eine gleichbleibende Expression bedeutet in diesem Fall, dass die mRNA-Konzentration im Verhältnis zur Gesamt-RNA gleich bleibt. Es kommt jedoch zu einer absoluten Zunahme der Expression der Zelle. Interessanterweise zeigen die Infarkttiere eine deutlich verminderte Expression von GAPDH und PBGD. Die Expression von Cyclophilin ist von der Tendenz ebenfalls eher erniedrigt. Dagegen ist die 18SrRNA-Expression in den Infarkttieren gegenüber Kontrolltieren eher erhöht.


[Seite 73↓]

Da die ribosomale RNA den größten Anteil an der Gesamt-RNA ausmacht, könnten bereits geringe Schwankungen in der ribosomalen Expression zu einer verminderten mRNA-Konzentration der anderen Gene führen. Umgekehrt hat eine veränderte Expression bestimmter Gene kaum Einfluss auf die ribosomale RNA-Konzentration.

Die mRNA-Messung der einzelnen Housekeeping-Gene sowie von ANP erfolgte 30 Tage nach Durchführung der Intervention. Diese Studie untersuchte daher nicht den zeitlichen Verlauf, sondern das Genexpressionsmuster des linken Ventrikels zu einem definierten Zeitpunkt. Es ist bekannt, dass es z.B. beim Myokardinfarkt zu einem spezifischen zeitabhängigen Genexpressionsmuster kommt. Möglicherweise sind einige der untersuchten Gene ebenfalls zeitabhängig reguliert und haben zum Messzeitpunkt bereits wieder Normalwerte erreicht, andere Gene könnten erst sehr spät reguliert sein, so dass nachgewiesene Veränderungen in der Genexpression sich vielleicht zu einem früheren Zeitpunkt noch nicht nachweisen ließen.

Auffällig sind die in Abhängigkeit von der verwendeten Detektionsmethode sehr unterschiedlichen Ergebnisse der mRNA-Expression. Während das RPA keine Unterschiede in der Expression der einzelnen Housekeeping-Gene nachweisen konnte, zeigte die TaqManTM-PCR zum Teil deutliche Unterschiede in der Expression von GAPDH, Cyclophilin und PBGD in den untersuchten Hypertrophie- und Herzinsuffizienzmodellen. Lediglich 18SrRNA zeigte nur geringe Unterschiede der Genexpression in den einzelnen Gruppen. Die Expressionsergebnisse korrelieren jedoch zwischen RPA und TaqManTM-PCR. Insbesondere beim Vergleich der ANP-mRNA-Expression werden diese Unterschiede zwischen beiden Methoden deutlich. Beim RPA war die ANP-mRNA- Expression in den Tieren mit kleinem und großem Shunt jeweils um das 1,5fache und in den Infarkttieren um das 1,4fache erhöht. Mit der TaqManTM-PCR ließen sich deutlich höhere Expressionswerte für ANP nachweisen. Im Vergleich zu Kontrolltieren zeigten Tiere mit kleinem Shunt 3,5fach erhöhte, Infarkttiere 6,7fach erhöhte und Tiere mit großem Shunt sogar 43fach erhöhte ANP-mRNA-Expressionswerte. Die TaqManTM-PCR ist eine sehr sensitive Methode, die bereits 10 mRNA Kopien in einer Probe und geringe Änderungen in der Genexpression nachweisen kann. Weiterhin zeichnet sie sich gegenüber dem RPA durch einen größeren dynamischen Messbereich aus. Beim RPA wird die Genexpression anhand der optischen Dichte bestimmt. Befindet man sich mit den Expressionswerten an der oberen messbaren Dichte können Unterschiede nicht mehr detektiert werden. Dies ist eine Erklärung für die geringen Unterschiede in der mit dem RPA gemessenen ANP Expression im kleinen und großen Shunt.


[Seite 74↓]

Aufgrund der eingeschränkten Auflösung lassen sich im Gegensatz zur TaqManTM-PCR geringe Veränderungen in der Genexpression nicht nachweisen.

Die Ergebnisse dieser Studie und andere Veröffentlichungen über die Expression von Housekeeping-Genen zeigen, dass deren Regulation auf komplexen pathophysiologischen Mechanismen beruht. Hieraus wird die Notwendigkeit deutlich, nur für die spezifischen experimentellen Bedingungen geeignete Kontrollgene als interne Standards zu verwenden. Gleichzeitig sollten Veröffentlichungen, die die mRNA-Expression verschiedener Gene untersuchen, kritisch in Bezug auf das gewählte Standardgen analysiert werden. Der allgemeine Vorschlag, ribosomale RNA als internen Standard zu verwenden, ist nicht zu empfehlen, da es Untersuchungen gibt, die eine veränderte Expression nachgewiesen haben. Für die kardiale mRNA-Expression-Analyse in den hier untersuchten Hypertrophie- und Herzinsuffizienzmodellen stellt 18SrRNA, wie auch in vielen anderen Untersuchungen gezeigt, das zuverlässigste Kontrollgen dar.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
10.03.2005