Richard, Frank: Chromosomale Imbalancen invasiv duktaler und invasiv lobulärer Mammakarzinome detektiert mittels komparativer genomischer Hybridisierung (CGH)

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Das Mammakarzinom

Brustkrebs ist weltweit die häufigste Tumorerkrankung der Frau und das mit steigender Tendenz. Es wird geschätzt, daß in Deutschland jährlich mehr als 40000 Neuerkrankungen auftreten und daß jede 14. Frau im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs erkrankt (Chang-Claude et al., 1995).

Die Mehrheit der Mammakarzinome tritt sporadisch auf. Nur etwa 10% aller auftretenden malignen Brusttumoren sind auf hereditäre Faktoren zurückzuführen. Seit vielen Jahren gilt die familiäre Häufung von Brustkrebs als gesicherter und streng zu beachtender Risikofaktor (Schneider et al., 1986).

Das Mammaparenchym unterliegt zyklusabhängigen hormonellen Schwankungen. Die biologischen Besonderheiten und die spezifische enzymatische Aktivität können schon bei relativ geringen Tumorvolumina zu einem Einbruch in Lymph- und Blutgefäße führen (Bender und Schnürch, 1991). Studien haben gezeigt, daß für die Entstehung von invasivem Brustkrebs proliferative Brusterkrankungen, wie z.B. die atypische Hyperplasie oder die proliferierende Mastopathie, hinreichende Risikofaktoren darstellen (Kelsey und Berkowitz, 1988; Kelsey und Gammon, 1990). Außerdem geht dem invasiven Karzinom häufig ein Carcinoma in situ voraus (Page und Dupont, 1990, James et al., 1997).

Das Mammakarzinom ist ein epithelialer Tumor des Brustdrüsenparenchyms. Die Mehrzahl der Mammakarzinome gehört dem invasiv duktalen Typ an (70-80%), gefolgt von invasiv lobulären (10-15%). Seltene Formen mit überwiegend guter Prognose sind das medulläre, das muzinöse, das tubuläre und das papilläre Karzinom (Böcker und Kunze, 1997). ‚Duktal’ oder ‚lobulär’ beschreibt nicht notwendigerweise den Ursprungsort der Neoplasien. Studien von Wellings et al. (1975) haben gezeigt, daß die Mehrzahl der Mammakarzinome sowohl des duktalen als auch des lobulären Typs von der terminalen duktulo-lobulären Einheit (TDLE) ausgeht. Die Zellen in der TDLE teilen, vermehren und differenzieren sich sehr schnell, um sich an die physiologischen Bedingungen der Brustdrüse anzupassen. Somit sind sie anfälliger für genetische Mutationen, die dann zu abnormer proliferativer Aktivität und Neoplasie führen (Tavassoli, 1992). Hinsichtlich des histologischen Wachstumsmusters unterscheiden sich invasiv duktale von invasiv lobulären Mammakarzinomen (Abbildung 1). Das invasiv


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duktale Karzinom zeichnet sich durch unregelmäßige, unterschiedlich breite, kohäsiv wachsende Tumorkomplexe häufig assoziiert mit drüsig/tubulärer Differenzierung aus. Das histologische Bild des invasiv lobulären Karzinoms wird durch ein dissoziiertes Wachstum mit einzelnen, hintereinander liegenden Tumorzellen geprägt, wofür häufig der Begriff des ‚Gänsemarschmusters’ verwendet wird (Böcker und Kunze, 1997).

Abbildung 1: Histologische Beispiele für ein a) invasiv duktales und b) invasiv lobuläres Mammakarzinom.

Silverstein et al. (1994) und Yeatman et al. (1995) untersuchten die Unterschiede von invasiv lobulären und invasiv duktalen Tumoren hinsichtlich des klinischen Verhaltens, der Histopathologie und Prognose. Dabei zeigten sie, daß Patienten mit invasiv lobulärem Karzinom oftmals älter waren als solche mit duktalem Karzinom und außerdem einen größeren Tumor zum Zeitpunkt der Diagnose aufwiesen. Die Patienten mit invasiv lobulären Karzinomen hatten auch ein höheres Risiko für den Befall der kontralateralen Brust. Der Prozentsatz an Lymphknotenmetastasen war jedoch geringfügig kleiner (32% versus 37%). Einige prognostische Faktoren, wie histologischer Grad, Ploidie/DNA-Index, S-Phasen-Fraktion sowie Hormonrezeptorgehalt waren für Patienten mit invasiv lobulären Karzinomen günstiger als bei Patienten mit invasiv duktalen Karzinomen, was zu einer längeren krankheitsfreien Überlebensdauer für Patienten mit lobulären Brusttumoren führte. Sinn et al. (1997) vertreten die Auffassung, daß die Langzeitprognose zwischen beiden Tumorarten ähnlich ist, invasiv lobuläre Karzinome aber ein langsameres Tumorwachstum aufweisen. Letzteres führt bei invasiv lobulären Karzinomen häufig zu einer multifokalen Tumormanifestation. Das trägt dazu bei, daß sie mammographisch und palpatorisch schlechter zu lokalisieren sind. Abweichend von diesen Studien sahen Casolo und Mitarbeiter (1997) beim Vergleich von jeweils 117 Patienten mit invasiv lobulären und invasiv duktalen Mammakarzinomen keine signifikanten Unterschiede bezüglich Tumorgröße,


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Lymphknotenbeteiligung, histologischem Grad und Hormonrezeptorstatus. Die Autoren betrachteten die Multifokalität als einzigen Unterschied beider Tumorarten.

Gesichert ist, daß Brustkrebs eine sowohl genetisch (Sato et al., 1990) als auch histologisch (Silverstein et al., 1994) äußerst heterogene Erkrankung darstellt, und der Krankheitsverlauf demzufolge sehr variabel ist. Für ein besseres Verständnis der Entstehung und des Verlaufs dieser Erkrankung ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die zu phänotypischer Heterogenität führen, von entscheidender Bedeutung.

1.2 Komparative genomische Hybridisierung

Die komparative genomische Hybridisierung (engl. comparative genomic hybridization, CGH) ist eine Anfang der neunziger Jahre entwickelte molekulargenetische Methode und erlaubt einen Vergleich zwischen Tumor- und Normal-DNA auf chromosomaler und subchromosomaler Ebene (Kallioniemi et al., 1992, du Manoir et al., 1993). Mit einer einzigen Hybridisierung kann das gesamte Genom auf DNA-Aberrationen im Tumor untersucht werden („Screening“), was einen bedeutenden Vorteil der CGH gegenüber Verfahren wie der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, Southern Blot-Hybridisierung und RFLP-Analyse darstellt. Außerdem können sowohl frisch eingefrorene Gewebsproben als auch in Paraffin eingebettetes Material zur Tumor-DNA-Gewinnung genutzt werden. Die Verwendung von archiviertem Gewebe ermöglicht u.a. den Vergleich der genetischen Aberrationen zwischen Primärtumor und später auftretenden Fernmetastasen (Isola et al., 1994). Es werden nur geringe Mengen an Tumor-DNA benötigt (1µg). Das Auflösungsvermögen der CGH liegt für DNA-Deletionen im Bereich einer chromosomalen Bande (ca.10 Megabasen) (Petersen et al., 1996, Bentz et al., 1998a). Bei DNA-Gewinnen steigt das Auflösungsvermögen auf Werte um 100 Kilobasen, was darauf zurückzuführen ist, daß hierbei eine DNA-Sequenz mehrfach amplifiziert sein kann (Kallioniemi et al., 1994b). Die CGH eignet sich nicht zum Nachweis tumorspezifischer, balanzierter Translokationen oder Punktmutationen (Cremer et al., 1995, Petersen et al., 1996).

Zahlreiche Studien an unterschiedlichen Tumoren haben ergeben, daß die Überexpression von Onkogenen einerseits (Devilee et al., 1994, Terada et al., 1998; Staibano et al., 1998) und die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen andererseits (Hampton et al., 1994, Brewster et al., 1994, Dorion-Bonnet et al., 1995, Clifford et al., 1998) häufig zu beobachten sind. Bedeutungsvoll für molekulargenetische Untersuchungen ist, daß die Onkogen-Aktivierung


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mit DNA-Gewinnen (-Überrepräsentierungen, -Amplifikationen) und die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen mit DNA-Verlusten (-Unterrepräsentierungen, -Deletionen) verbunden sind. Aufgrund des „Screening“-Chrarakters der CGH wurde sie bei einer Vielzahl von genetischen Untersuchungen unterschiedlicher Tumorgruppen angewandt, wie z.B. bei Bronchialkarzinomen (Ried et al., 1994, Petersen et al., 1997), Pankreaskarzinomen (Mahlamaki et al., 1997), Karzinomen der Kopf-Hals-Region (Bockmühl et al., 1997), Ovarialkarzinomen (Sonoda et al., 1997), Blasenkarzinomen (Voorter et al., 1995, Sauter, 1997), Meningiomen (Weber et al., 1997, Carlson et al., 1997), Prostatakarzinomen (Cher et al., 1994, Nupponen et al., 1998) und Leukämien (Bentz et al., 1995, Willem und Mendelow, 1997). CGH-Untersuchungen an Mammakarzinomen und Brustkrebszellinien beschrieben ein komplexes Muster an DNA-Gewinnen und -Verlusten des Tumors gegenüber dem Normalgewebe (Kallioniemi et al., 1992; Kallioniemi et al., 1994a, Nishizaki et al., 1995, Ried et al., 1995, Courjal und Theillet, 1997, James et al., 1997, Nishizaki et al., 1997a, Nishizaki et al., 1997b, Schwendel et al., 1998a). Häufig vorkommende Regionen mit DNA-Zugewinnen wurden auf den Chromosomen 1q, 6p, 8q, 11q, 16p, 17q, 19p,q und 20q detektiert. DNA-Verluste kamen gehäuft auf 6q, 13q, 16q, 17p und 22q vor.

1.3 Bekannte genetische Alterationen in invasiv duktalen und invasiv lobulären Mammakarzinomen

Wichtige an der Kanzerogenese der Brust beteiligte Onkogene sind erbB-2 (Clark und McGuire, 1991, Tsuda et al., 1989), c-myc (Bland et al., 1995) und cyclin D1(Courjal et al., 1996) sowie das Tumorsuppressorgen p53 (Deng et al., 1994).

Seit längerem werden genetische Unterschiede zwischen beiden Tumorarten diskutiert und es konnte gezeigt werden, daß die Überexpression des erbB-2 Onkogens (Kreipe et al., 1993) und des EGF-Rezeptors (epidermal growth factor-) (Martinazzi et al., 1993) sowie Mutationen des p53 Suppressorgens (Marchetti et al., 1993) weniger häufig in invasiv lobulären Tumoren als in invasiv duktalen Tumoren auftreten.

Eine Region mit häufig beobachteten DNA-Verlusten liegt auf dem langen Arm von Chromosom 16. Das E-cadherin Gen, ein Tumorsuppressorgen, ist auf 16q22.1 lokalisiert und kodiert für ein calciumabhängiges Zelladhäsions-Molekül (Takeichi, 1991). Die verminderte Expression des E-cadherin Gens steht in der Mehrzahl der Fälle mit dem lobulären Phänotyp in Verbindung (Moll et al., 1993, Bukholm et al., 1997). Weiterhin scheint die verminderte Expression von E-cadherin ein frühes Ereignis in der Kanzerogenese von lobulären


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Karzinomen zu sein. Vos et al. (1997) untersuchten in 6 Fällen von Carcinoma lobulare in situ (CLIS) und 150 Fällen von duktalem Carcinoma in situ (DCIS) die E-cadherin Expression mittels immunhistochemischer Färbung. In allen Fällen von CLIS war eine Expression nicht nachweisbar, im Gegensatz dazu war sie in allen 150 DCIS vorhanden.

Bei der Untersuchung von invasiv duktalen und invasiv lobulären Mammakarzinomen mit anderen molekulargenetischen Methoden wurden z.T. kontroverse Ergebnisse erzielt. Aldaz et al. (1995) untersuchten mit Hilfe der Microsatelliten-Längen-Polymorphismus-Analyse genetische Aberrationen an einem Kollektiv von 23 lobulären und 29 duktalen Fällen. Hierbei wurden Imbalancen in den Regionen 1q, 13q, 16q, 17p und 18q vermehrt in invasiv duktalen Karzinomen beobachtet. DNA-Verluste auf 8p waren häufiger beim lobulären Phänotyp zu finden. Vermehrte Alterationen in invasiv duktalen Tumoren im Vergleich zu invasiv lobulären zeigten sich auf Chromosom 1 auch durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen (Farabegoli et al., 1996). Eine größere Frequenz von 8p-Deletionen in invasiv lobulären Karzinomen wurden durch weitere Untersuchungen auf Verlust der Heterozygotie (LOH, loss of heterozygosity) bestätigt (Seitz et al., 1997). Weiterhin wurden mittels LOH Alterationen auf 11p15 (Garcia-Foncillas et al., 1996) mit größerer Häufigkeit bei invasiv lobulären Mammakarzinomen nachgewiesen.

Ein Vergleich von 46 invasiv duktalen Mammakarzinomen und 19 invasiv lobulären Mammakarzinomen mittels CGH (Nishizaki et al., 1997b) zeigte, daß die Gesamtanzahl chromosomaler Veränderungen in invasiv duktalen Tumoren größer als in invasiv lobulären Tumoren war. Vor allem DNA-Zugewinne auf 8q und 20q zeigten in invasiv duktalen Tumoren eine signifikant größere Frequenz. Nach Ansicht der Autoren lassen die vermehrten Zugewinne auf 8q und 20q einen stärkeren Einfluß auf hier lokalisierte Onkogene bei duktalem Brustkrebs vermuten. DNA-Deletionen auf 16q waren im Gegensatz dazu in invasiv lobulären Karzinomen häufiger zu finden, was mit den Ergebnissen von Moll et al. (1993) und Bukholm et al. (1997) korreliert. Häufige DNA-Deletionen betrafen insgesamt die Chromosomen 6q, 13q, 17p und X, DNA-Gewinne die Chromosomen 1q und 17q. In einer früheren CGH-Studie von Nishizaki et al. (1995) wurden beim Vergleich von 20 invasiv lobulären und 79 invasiv duktalen Mammakarzinomen ähnliche Ergebnisse erzielt. Neben geringeren DNA-Gewinnen auf 8q und häufigeren Gewinnen auf 1q wurde eine höhere Frequenz von DNA-Verlusten auf 16q, 18q und X bei invasiv lobulären Mammakarzinomen festgestellt.


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1.4 Fragestellung

Die vorliegende Arbeit sollte einen Beitrag leisten zur Beantwortung der folgenden Fragen:


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Thu Sep 20 11:14:14 2001