Richard, Frank: Chromosomale Imbalancen invasiv duktaler und invasiv lobulärer Mammakarzinome detektiert mittels komparativer genomischer Hybridisierung (CGH)

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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 Chemikalien und Geräte

DNA-Extraktion

Digestionspuffer (50mM Trispuffer, 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20)

Trispuffer (pH 8,5) [Sigma]

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, pH 8,0) [Sigma]

Tween 20 [Boehringer Mannheim]

Proteinase K [Boehringer-Mannheim]

Xylol

Ethanol [Sigma]

Phenol [Sigma]

Chloroform [Sigma]

Isoamylalkohol [Sigma]

Isopropanol [Sigma]

NaCl [Sigma]

Aqua ad iniectabile [Braun Melsungen]

Präparation der Metaphasenchromosomen

RPMI Medium 1640 [Sigma]

Penicillin/Streptomycin [Sigma]

L-Glutamin [Sigma]

Steril filtriertes fötales Kälberserum [Sigma]

Phytohämagglutinin [Sigma]

Colcemid [Sigma]

KCl (0,075 M) [Sigma]

Fixativ (Methanol/Eisessig, 3/1) [Sigma]

DNA-Markierung (Nick-Translation)

Biotin-dUTP [Boehringer-Mannheim]

Digoxigenin-dUTP [Boehringer-Mannheim]

Reaktionspuffer (10x: 0,5 M Tris pH 8, 50mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA)


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MgCl2 [Sigma]

BSA [Sigma]

Beta-Mercaptoethanol [Sigma]

DNase [Boehringer-Mannheim]

Kornberg DNA Polymerase [Boehringer-Mannheim]

dATP [Boehringer-Mannheim]

dCTP [Boehringer-Mannheim]

dGTP [Boehringer-Mannheim]

dTTP [Boehringer-Mannheim]

Agarose [Boehringer-Mannheim]

20xSSC (Sodium Cloride/Sodium Citrate Puffer)

Ethidiumbromid [Sigma]

EDTA [Sigma]

SDS [Sigma]

Hybridisierung und DNA-Nachweis

Humane Cot1-DNA [Gibco BRL, Life Technologies]

Heringssperma-DNA [Promega]

Natriumacetat [Sigma]

Ethanol [Sigma]

Formamid (FA) [Merck]

Mastermix (4xSSC, 0,1 % Tween + 20% Dextransulfat)

Anti-Dig-Rhodamin [Boehringer-Mannheim]

Fluorescein-Avidin [Vector Laboratories, USA]

DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid) [Sigma]

DABCO (1,4 Diazobicyclooctan)

Fixogum Rubber cement [Marabu]

Geräte für die DNA-Präparation

Gefriermikrotom [Frigocut 2800-E, Reichert-Jung]

Eppendorf-Zentrifuge [5415 C, Eppendorf]

Wärmeblock für Eppendorf-Tubes [Thermomixer 5436, Eppendorf]

Photometer [Gene Quant II, Pharmacia Biotech]


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SpeedVac [Savant, Life Sciences]

Magnetrührer mit Heizplatte [NeoLab]

Wasserbäder [Gesellschaft für Labortechnik mbH]

Agarose-Gel-Elektrophorese-Kammer [BIO-RAD]

UV-Transilluminator mit Gel-Dokumentations-Einheit [Hoefer]

Kühlzentrifuge für Eppendorf-Tubes [5402, Eppendorf]

Phasenkontrastmikroskop Axiolab [Zeiss, Oberkochen]

Wärmeofen [Heraeus]

Wärmeplatte [NeoLab]

Geräte für die Bildaufnahme und Bildverarbeitung

Zeiss-Axiophot-Fluoreszenzmikroskop [Zeiss, Oberkochen]

Plan NEOFLUAR Ölobjektiv 63fach, N.A. 1.25 [Zeiss, Oberkochen]

Filtersätze [Zeiss, Oberkochen]:

DAPI: Zeiss Filtersatz 02, Exzitation G365, Strahlenteiler FT 395, Emission LP 420

FITC: Zeiss Filtersatz 10, Exzitation BP 450-490, Strahlenteiler FT 510, Emission BP 515-565

TRITC: Chroma Filtersatz HQ Cy3 plus Zeiss Exzitation Filtersatz 15, Exzitation BP 546/12,

Strahlenteiler FT 565, Emission BP 570-650

CCD-Kamera (Charge-Coupled-Device) [Photometrics, Arizona, USA]

Apple Macintosh-Computer Quadra 900 [USA]

Pentium Personal-Computer mit Zip-Disketten-Laufwerk

Farb-Tintenstrahldrucker Canon BJC 610

Software

Nu 200 2.0 für Apple Macintosh

Canvas 3.5 für Apple Macintosh

CGH-Software [AMBA-System, Karyotypisierungsmodul KARYOTYP (IBSB GmbH, Berlin]: Programme„CGH“, „CGHeval“, „CGHSuper“

Betriebssystem Microsoft Windows 95


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2.2 Methoden

Eine rasche und umfassende Analyse eines Genoms auf über- und unterrepräsentierte DNA-Abschnitte erlaubt die Methode der komparativen genomischen Hybridisierung. Die methodischen Schritte der CGH-Analyse sind in Abbildung 2 dargestellt und sollen im weiteren näher beschrieben werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das Protokoll von Schwendel et al. (1998a) mit geringen Modifizierungen verwendet.

Abbildung 2: Methodische Schritte der CGH-Analyse.


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2.2.1 Tumormaterial

Das Tumorgewebe wurde von 30 Patientinnen mit invasiv duktalen Mammakarzinomen sowie 20 Patientinnen mit invasiv lobulären Mammakarzinomen gewonnen. In der Mehrzahl der Fälle wurde Tumormaterial im Rahmen der intraoperativen Schnellschnittuntersuchung gewonnen, welches bis zur DNA-Extraktion bei -80°C aufbewahrt wurde. Bei den restlichen Proben handelte es sich um Paraffin-eingebettete Tumorproben. Die Tabellen 1 und 2 zeigen eine Auflistung der untersuchten Mammakarzinome mit zugehörigem Alter der Patientinnen zum Zeitpunkt der Tumorentnahme, histologischem Grad, Tumorgröße, Lymphknotenstatus und Östrogenrezeptor-Status. Das Grading und Staging erfolgte entsprechend den geltenden Kriterien der UICC (Wittekind und Wagner, 1997).

Tabelle 1: Klinisch pathologische Daten der untersuchten invasiv duktalen Mammakarzinome.

Fall-Nr.

Alter

Malignitätsgrad

Stadium

Östrogenrezeptoren

1

42

G1

pT2, N0

ja

2

57

G1

pT1c, N0

ja

3

81

G1

pT1c, N0

ja

4

59

G1

pT1c, N1a

ja

5

72

G1

pT2, NX

ja

6

76

G1

pT1, N1bi

ja

7

67

G1

pT1c, N0

ja

8

61

G1

pT1c, N0

ja

9

59

G1

pT2, N1bi

keine Angaben

10

44

G3

pT1c, N1

ja

11

71

G3

pT2, N1a

nein

12

53

G3

pT1, N0

nein

13

72

G3

pT2, N0

ja

14

61

G3

pT1c, NX

ja

15

53

G3

pT2, N0

nein

16

59

G3

pT1b, N0

ja

17

58

G3

pT1, N0

ja

18

55

G3

pT2, N0

nein

19

74

G3

pT4, NX

ja

20

68

G3

pT1c, N1bi

ja

21

34

G3

pT2, N0

nein

22

58

G3

pT1, N0

ja

23

48

G3

pT1c, N0

nein

24

58

G3

pT2, NX

ja

25

41

G3

pT2, N0

ja

26

50

G3

pT2, N0

nein

27

47

G3

pT1b, N0

ja

28

59

G3

pT4, NX

ja

29

79

G3

pT1c, NX

ja

30

55

G3

pT2, N0

nein


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Tabelle 2: Klinisch pathologische Daten der untersuchten invasiv lobulären Mammakarzinome.

Fall-Nr.

Alter

Malignitätsgrad

Stadium

Östrogenrezeptoren

31

60

G1

pT1c, N1bi

ja

32

56

G1

pT2, N0

ja

33

46

G1

pT1c, N0

ja

34

68

G1

pT1c, N0

ja

35

76

G1

pT4, N1biii

ja

36

68

G1

pT4, NX

ja

37

58

G1

pT1c, N0

ja

38

48

G2

pT1c, N0

ja

39

79

G2

pT2, N1biv

ja

40

55

G2

pT2, N1bii

ja

41

83

G2

pT2, NX

ja

42

88

G2

pT2, N0

nein

43

55

G2

pT3, N1biii

ja

44

74

G2

pT2, Nx

ja

45

62

G2

pT1c, N0

ja

46

54

G2

pT3, NX

ja

47

41

G2

pT1c, N0

ja

48

53

G2

pT2, N1bii

ja

49

63

G3

pT2, N0

ja

50

59

G3

pT2, NX

ja

2.2.2 DNA-Extraktion

Von den tiefgefrorenen Tumorproben wurden am Gefriermikrotom 20-30 Schnitte (Schnittdicke 30µm) angefertigt, mit 900 µl Digestionspuffer versetzt und mit 20-30 µl Proteinase K bei 50°C inkubiert. Im Falle von paraffin-asserviertem Tumorgewebe wurde zu den Mikrotomschnitten 1,5-2ml Xylol zum Entparaffinieren zugegeben. Danach wurden die Proben zweimal für 5 Minuten bei 14000 rpm zentrifugiert und dekantiert. Nach einem Waschvorgang mit 1-2 ml absolutem Alkohol und Trocknung der Proben erfolgte die Proteinase K-Behandlung. Die DNA-Extraktion erfolgte durch Zugabe eines Gemisches von Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 25/24/1). Auf jede Extraktion folgten je 10 Minuten Schütteln und Zentrifugieren. Nach dreimaligem Extrahieren wurden die Proben zur DNA-Fällung mit 1 ml Isopropanol und 90µl einer 3 M NaCl-Lösung versetzt und für eine Stunde bei -80°C belassen. Danach erfolgte die Zentrifugation für 20 Minuten bei 4°C, Dekantieren, Waschen der Pellets mit 70% Ethanol und nochmaliges Zentrifugieren und Dekantieren. Nach dem Trocknen wurden die Proben in Aqua ad iniectabile gelöst. Anschließend wurden Aliquots der Proben im Verhältnis 1:20 (5µl DNA + 95 µl Aqua ad iniectabile) verdünnt und die Konzentration mit dem Photometer anhand der Absorption bei 260 nm bestimmt.


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2.2.3 Präparation der Metaphasenchromosomen

Eine Kurzzeitkultur von Blutlymphozyten mit folgendem Ansatz:

war Vorraussetzung für die Präparation von Metaphasenchromosomen.

Die Kultur erfolgte für 72 Stunden bei 37°C. Unter Zugabe von Colcemid wurden die Lymphozyten in der Metaphase arretiert und mit Fixativ (Methanol/Eisessig; 3/1) gewaschen sowie zentrifugiert. Beim Auftropfen der Lösung mit den Zellkernen auf die Objektträger ist darauf zu achten, daß eine gute Spreitung der Metaphasenchromosomen erfolgt, da dies eine Grundvorraussetzung für eine hohe Qualität der nachfolgenden Hybridisierung ist. Da sowohl weibliches als auch männliches Spenderblut für die Metaphasengewinnung verwendet wurde, sind die Chromosomen X und Y nicht in die spätere Auswertung miteinbezogen worden. Die Aufbewahrung der Objektträger erfolgte bei Raumtemperatur. Die Objektträger mit den Metaphasenchromosomen der Firma Vysis wurden bei -20°C gelagert.

Zur Denaturierung der Metaphasenchromosomen wurden zwei unterschiedliche Verfahrensweisen angewendet:


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2.2.4 DNA-Markierung (Nick-Translation)

Während der Nick-Translation werden durch die DNase Einzelstrangbrüche (‚Nicks’) in der DNA erzeugt. An die so entstandenen Fragmentenden werden unter Vermittlung der DNA-Polymerase die eingesetzten Nukleotide (dNTPs und Hapten-markierte dUTPs) angelagert und eine neue doppelsträngige DNA synthetisiert. Im Falle der Tumor-DNA wurde Biotin-dUTP verwendet und im Falle der Normal-DNA Digoxigenin-dUTP. Die an dUTP gekoppelten Haptene Biotin bzw. Digoxigenin werden nun an Stelle des Nukleotids dTTP in die Tumor- bzw. Normal-DNA eingebaut.

Für die Nick- Translation wurde ein Mix aus folgenden Reagenzien hergestellt :

Mix

Reaktionspuffer (10x: 0,5M Tris pH 8, 50mM MgCl2, 0,5mg/ml BSA)

5µl

Beta-Mercaptoethanol (0,1 M)

5µl

dNTPs : dATP, dCTP, dGTP je 0,5 mM, dTTP 0,1mM

5µl

ein modifiziertes Nukleotid: Biotin-dUTP oder Digoxigenin-dUTP

2µl

DNase (3mg/ml, 1:2000 verdünnt)

1µl

Kornberg DNA-Polymerase

1µl

___________________________________________________________________________

5 µg Tumor-DNA oder 5 µg Normal-DNA, Aqua ad iniectabile

31µl

 

Sigma

50 µl

Nach einer Inkubation von 20 Minuten im Wasserbad (15°C) wurden zur Überprüfung der Fragmentlängen Aliquots der Proben mittels Gel-Elektrophorese getestet (1,5% Agarosegel, 1µl Ethidiumbromid). Die enstandenen Biotin- oder Digoxigenin-markierten DNA-Fragmente sollten eine Fragmentlänge zwischen 200-500 bp aufweisen. Der Abbruch der Nick-Translation erfolgte durch Zugabe von 2µl EDTA und 2µl SDS. Die Proben wurden bis zur Hybridisierung bei -20°C gelagert.

2.2.5 Hybridisierung

Bei der Hybridisierung werden die Nick-translatierte Tumor-DNA sowie die Normalgewebs-DNA zu gleichen Teilen auf die Metaphasenchromosomen hybridisiert, wo sie um homologe Bindungsstellen konkurrieren. Im einzelnen wurden die folgenden Reagenzien vermischt:

Die Cot1-DNA bindet an die repetitiven DNA-Sequenzen am Heterochromatin der Chromosomen. Die Probe wurde dann für 30 Minuten bei -80°C gelagert und anschließend zentrifugiert (4°C, 14000 rpm), dekantiert und luftgetrocknet. Zur Resuspendierung der DNA wurde das Pellet in 5 µl Formamid aufgenommen und bei 37°C in Lösung gebracht. Danach erfolgte die Zugabe von 10 µl Mastermix und die DNA-Denaturierung für 5 Minuten bei 77°C. Zur Vorhybridisierung wurde die DNA bei 37°C 1,5 Stunden inkubiert. Anschließend wurden 12 µl der DNA-Lösung auf einem Objektträger mit denaturierten Metaphasen aufgebracht, mit Deckgläsern abgedeckt und mit ‚rubber cement’ abgedichtet. Die Hybridisierung erfolgte in einer Instrumentenschale aus Metall für 3 Tage in einem Wasserbad bei 37°C.

2.2.6 DNA-Nachweis

Der DNA-Nachweis beinhaltet die Visualisierung der beiden Genome mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen. Nach erfolgter DNA-Hybridisierung wurden die Objektträger zunächst einem mehrfachen Waschvorgang unterzogen:

Formamid/ 2x SSC (50:50)

3x2 Min.

37°C

0,1x SSC

3x2 Min.

60°C

4xSSC/ 0,1% Tween

1x5 Min.

37°C

3% BSA in 4x SSC/ 0,1% Tween 20

15 Min.

37°C

4x SSC/ 0,1% Tween 20

1x5 Min.

37°C

Die Fluorochrommarkierung erfolgte durch Auftropfen von 125 µl Gebrauchslösung (10 µl Anti-Dig-Rhodamin (TRITC), 7 µl Fluoreszein-Avidin (FITC) auf 1ml 3% BSA) auf je einen Objektträger, der für 25 Minuten bei 37°C im feuchten Milieu aufbewahrt wurde. Nach dieser Inkubationszeit wurden die Chromosomen 3x2 Minuten bei 45°C mit 4xSSC/ 0,1% Tween


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gewaschen. Danach erfolgte die Überführung der Objektträger in eine DAPI-Lösung (40ng/ml) für 5 Minuten bei Zimmertemperatur, um anhand der DAPI-Bänderung später die Chromosomen zu karyotypisieren. Zur Verzögerung des Ausbleichens der fluorochrommarkierten Chromosomen wurden 35 µl DABCO aufgetragen und die Objektträger bis zur Bildaufnahme bei 4°C gelagert.

2.2.7 Bildaufnahme

Die Aufnahme der markierten Metaphasen erfolgte mittels eines Zeiss-Axiophot-Fluoreszenzmikroskops. Durch selektive Filter ist es möglich, die Fluoreszenzsignale der einzelnen Fluorochrome getrennt voneinander aufzunehmen und eine Interferenz der Fluoreszenzsignale zu verhindern. Für die Digitalisierung der Fluoreszenzbilder wurde eine CCD-Kamera und ein Apple Macintosh Computer mit dem Softwareprogramm Nu200 2.0 benutzt. Pro Metaphase wurden das FITC-, TRITC- und DAPI-Bild aufgenommen (Abbildung 3). Die Belichtungszeiten hingen von der Intensität der Fluoreszenzsignale ab. Die Standardbelichtungszeiten bei guten Fluoreszenzsignalen lagen bei etwa 1-3 Sekunden für FITC, 1-5 Sekunden für TRITC und 0,1-0,5 Sekunden für DAPI. Die von der CCD-Kamera aufgenommenen Fluoreszenzbilder wurden als Dateien im 8 bit-Tiff-Format (256 Graustufen) gespeichert. Es wurden 15 Metaphasenchromosomen pro Fall aufgenommen, so daß insgesamt 45 Bilder (je 15 für FITC, TRITC, DAPI) vorlagen.

Abbildung 3: Chromosomenmetaphase im FITC- ,TRITC- und DAPI-Bild.


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2.2.8 Bildverarbeitung und Auswertung

Die Bearbeitung der digitalisierten Fluoreszenzbilder erfolgte mit Hilfe einer CGH-Software, die im Institut für Pathologie der Charité hergestellt wurde (Roth et al., 1996). Es basiert wiederrum auf dem Karyotypisierungsprogramm KARYOTYP (IBSB GmbH, Berlin). Zur Erstellung des CGH-Karyogramms sind folgende Arbeitsschritte notwendig:

Während der Bildsegmentation wurde das DAPI-Bild jeder Metaphase eines Falles vom Hintergrundbild getrennt. Das DAPI-Bild diente als Vorlage gegenüber der nachfolgenden Shift-Korrektur der Chromosomen im FITC- und TRITC-Bild, da es während der Aufnahme der drei Fluoreszenz-Bilder durch den manuell durchgeführten Filterwechsel zu einem optischen Versatz kommen kann. Alle Schritte, die zur Herstellung des Karyogramms durchgeführt werden mußten, erfolgten sichtbar am DAPI-Bild. Diese Schritte wurden vom Computer simultan im Hintergrund auch am FITC- und TRITC-Bild durchgeführt. Aus den korrigierten FITC- und TRITC-Bildern wurde das FITC/TRITC- Verhältnisbild (Ratio-Bild) berechnet. Hierbei wurden die Graustufenwerte der Chromosomen beider Bilder skaliert und mittels Falschfarben kodiert. Rote Färbungen der Chromosomen entsprachen einem DNA-Verlust als Ausdruck vermehrter Anlagerung von TRITC-markierter Normal-DNA an die chromosomale DNA. Grüne Färbungen stellten einen DNA-Gewinn dar, d.h. die vermehrte Anlagerung von FITC-markierter Tumor-DNA. Bei einer Gleichverteilung zwischen Tumor- und Normal-DNA erschienen die Chromosomen blau. Die einzelnen Chromosomen wurden schließlich manuell am Computer in ein vorhandenes Karyogramm eingeordnet.

Die nachfolgenden Bildauswertungsschritte sind in Abbildung 4 dargestellt.


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Abbildung 4: CGH-Bildauswertungsschritte.


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Die Ermittlung von genetischen Veränderungen in einem Tumorfall erfolgte anhand des CGH-Summenkaryogramms. Alle gleichen Chromosomen eines Falles wurden nach vorheriger geometrischer Angleichung rechnerisch zusammengefaßt und als gemittelte Chromosomen im Summenkaryogramm dargestellt. Zu jedem der errechneten farbigen Ratio-Chromosomen gehört ein eindimensionales Fluoreszenz-Quotienten-Profil (Ratio-Profil). Die mittlere grüne Linie verdeutlicht das Gleichgewicht zwischen Tumor- und Normal-DNA. Die blauen Linien links und rechts der Mittellinie entsprechen dem theoretischen Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten eines diploiden Tumors, der für ein bestimmtes Chromosom eine Mono- bzw. Trisomie in 50% der Tumorzellen aufweist. Die linke Linie entsprach somit einem Verhältnis FITC/TRITC von 0,75, die rechte Linie einem Verhältnis von 1,25. Bei Überschreitung einer gedachten Linie von 1,5 sprach man von einer hoch amplifizierten Region. Die Linien wurden als Schwellenwerte benutzt für die Bestimmung der DNA-Verluste und DNA-Gewinne in Tabelle 3 und 4 sowie in den Abbildungen 8-10 und 12. Der Verlauf der roten Kurve im Ratio-Profil repräsentierte das jeweilige Verhältnis der Fluoreszenzsignale von Tumor- zu Normal-DNA in der entsprechenden Chromosomen-Region.

Bei der Berechnung des Superkaryogramms wurden die Summenkaryogramme mehrerer untersuchter Tumorfälle zusammengefaßt. So können häufig vorkommende Veränderungen z.B. in einer Tumorentität ermittelt werden. Eine weitere Möglichkeit der Untersuchung von Tumorentitäten wurde durch die Erstellung eines Histogramms ermöglicht. Bei dieser Darstellungsweise wurden die DNA-Verluste und -Gewinne in Form einer Inzidenzkurve zu beiden Seiten der Chromosomenideogramme veranschaulicht. Beim Verlauf der Inzidenzkurve nach links entsprach dies einem DNA-Verlust und nach rechts einem DNA-Gewinn. Die einzelnen DNA-Veränderungen wurden bei der Histogrammdarstellung statistisch mit Hilfe eines Student-t-Tests bestimmt. Blaue Bereiche entsprechen dabei den Veränderungen mit 99% Signifikanz, grüne Bereiche schließen solche Veränderungen mit ein, die eine Signifikanz von 95% zeigten.

Für die Berechnung eines sog. Differenzhistogramm wurden dann aus zwei zu vergleichenden Tumorgruppen die unterschiedlichen Häufigkeiten der chromosomalen Veränderungen berechnet. Diese wurden mit Hilfe des Chi-Quadrat-Test auf ihre Signifikanz geprüft und mittels roter und grüner Inzidenzkurven zu beiden Seiten der Chromosomenideogramme dargestellt. Chromosomale Alterationen, die in einer der beiden Tumorgruppen signifikant


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häufiger vorkamen, wurden mit grauer (99% Signifikanz) bzw. hellgrauer Schraffierung (95% Signifikanz) gekennzeichnet.

In Abbildung 5 ist das Einzel-Histogramm von Chromosom 9 bei (A) invasiv duktalen und (B) invasiv lobulären Mammakarzinomen dargestellt sowie in (C) das errechnete Differenzhistogramm. Die beiden inneren senkrechten Linien zu beiden Seiten der Ideogramme kennzeichnen eine Inzidenz von 50%, die beiden äußeren Linien eine von 100%. Letztere würde vorliegen, wenn sämtliche Tumorproben an der gleichen chromosomalen Region eine identische Alteration aufweisen.

Abbildung 5: Histogramm von Chromosom 9 bei (A) invasiv duktalen (IDC) und (B) invasiv lobulären (ILC) Mammakarzinomen, blau= 99% Signifikanz der genetischen Alterationen, grün= 95% Signifikanz. (C): Darstellung des Differenzhistogramms: rot= Überschuß der chromosomalen Imbalancen in IDC, grün= Überschuß der chromosomalen Imbalancen in ILC, weiße Areale zwischen farbigen Anteilen und der 0% Inzidenzlinie= Anteil der gemeinsamen Veränderungen von IDC und ILC; grau = 99% Signifikanz der genetischen Alterationen, hellgrau = 95% Signifikanz.


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