Aus der Abteilung für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

In vitro Untersuchung der Fibroblastenadhäsion
und -proliferation
an oberflächenmodifizierten Titanwerkstoffen

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Matthias Richard
aus München

Dekan: Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. PD Dr.Dr. M.Klein
2. Prof. Dr.Dr. B.Hoffmeister
3. Prof. Dr.Dr. K.-D.Wolff

Datum der Promotion: 11.10.2002

Datum der Einreichung: 31.05.2002

Was immer Du tun kannst oder erträumst tun zu können, beginne es. Kühnheit besitzt Genie, Macht und Magische Kraft. Beginne es jetzt. Johann Wolfgang Goethe

Widmung:

Meiner Tochter Clara gewidmet

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Einführung
  • 1.2  Epithesen
  • 1.3  Hautdurchleitungen - perkutane Implantate
  • 1.4 Haut und Bindegewebe
  • 1.5 Wundheilung und Gewebereaktion
  • 1.6 Werkstoffe
  • 1.7 Biokompatibilität und –funktionalität
  • 1.8  Oberflächentopographie
  • 1.9 Zelladhäsion an azellulärer und zellulärer Materie
  • 1.10  Radio frequency glow discharge
  • 1.11  Vielschrittige Gestaltwandlung und kontaktinduzierte Zellspreitung
  • 1.12 Vermeidungsstrategien von Implantatkomplikationen
• 2  Problemstellung und Zielsetzung
• 3  Material und Methode
  • 3.1  Vorversuche
  • 3.2 Versuchsdurchführung
  • 3.3  Verwendete Zellart und Zellkultivierung
  • 3.4 Statistische Verfahren
• 4  Ergebnisse
  • 4.1 Ergebnisse der Vorversuche
  • 4.2  Ergebnisse der Hauptversuche
  • 4.3 Ergebnisse der Zellzählung via Neubauer-Zählkammer
    • 4.3.1 RFGD-Verfahren versus ohne RFGD-Verfahren
    • 4.3.2  Ergebnisse für die 12-Stunden-Werte
    • 4.3.3  Ergebnisse für die 72-Stunden-Werte
    • 4.3.4  Vergleichende Betrachtungen – deskriptive Auswertungen
  • 4.4  Elektronenmikroskopische Befunde
    • 4.4.1 Fibroblastenwachstum und Kolonienbildung
    • 4.4.2  Qualitative Bewertung des Zellbewuchses
  • 4.5  Werkstoffanalyse
    • 4.5.1 Oberflächen der Titanplättchen
    • 4.5.2 Benetzbarkeit modifizierter Titanplättchenoberflächen
    • 4.5.3  Spurenelementanalyse
• 5  Diskussion
  • 5.1 Diskussion des Materials
  • 5.2 Diskussion der Methode
  • 5.3  Diskussion der Ergebnisse
  • 5.4 Fazit und Ausblick
• 6  Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Anhang
  • Materialien
  • Tabellen
• Danksagung
• Lebenslauf
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Zur Oberflächenmodifikation geeignete Werkstoffe Curtis und Wilkinson (1997):
• Tab. 2: Oberflächenmodifikationen
• Tab. 3: Übersicht über die mittels Aktivitätsbestimmung der LDH ermittelten Zellzahlen
• Tab. 4: Ergebnisse für die 12-h-Werte - “mit” RFGD-Verfahren versus “ohne” RFGD-Verfahren
• Tab. 5: Ergebnisse für die 72-h-Werte - “mit” RFGD-Verfahren versus “ohne” RFGD-Verfahren
• Tab. 6: Ergebnisse des Teilmengen-Auswahlverfahrens für die 12-Stunden-Werte
• Tab. 7: Ergebnisse des Teilmengen-Auswahlverfahrens für die 72-Stunden-Werte
• Tab. 8: Prozentuale Differenzen der gemessenen Zellzahlen innerhalb einer Oberflächenklasse “ohne” versus “mit” RFGD-Behandlung ohne Berücksichtigung der Zuwachsraten:
• Tab. 9: Ergebnisse der qualitativen Beurteilung des Zellbewuchses anhand eines 7-Punkte-Scores
• Tab. 10: Konzentrationen von Spurenelementen bei Titanplättchen und Titanabutments
• Tab. 11: in den Vor- und Hauptversuchen verwendete Materialien
• Tab. 12: Übersicht sämtlicher Ergebnisse der Zellzählung nach 12 Stunden Zellkultivierung
• Tab. 13: Übersicht sämtlicher Ergebnisse der Zellzählung nach 72 Stunden Zellkultivierung
• Tab. 14: Qualitative Auswertung des Fibroblastenwachstums nach 12stündiger Kultivierung
• Tab. 15: Qualitative Auswertung des Fibroblastenwachstums nach 72stündiger Kultivierung

Bilder

• Abb. 1: a) periorbitale implantatfixierte Magnete, b) eingegliederte Orbitaepithese
• Abb. 2: Distanzhülse mit Implantatschraube
• Abb. 3: Dreiphasenlienie
• Abb. 4: Periimplantäre Entzündung an einem transkutanen Implantat mit daran befestigtem Steg
• Abb. 5: epidermale Säule
• Abb. 6: Fibroblast (der Pfeil weist in die Bewegungsrichtung);  aus: H.Lodish et al., Molekulare Zellbiologie, de Gruyter, 1994
• Abb. 7: Abfolge von Oxidation und Hydrolyse auf einer Titanoberfläche
• Abb. 8: Schemazeichnung eines Fibroblasten auf mikrotexturierter Oberfläche:
• Abb. 9: Beziehung zwischen der Oberflächenbenetzung, dem Kontaktwinkel (θ), der Oberflächenspannung (γ) des Substrats (S) u. der Flüssigkeit (L) sowie der kritischen Oberflächenspannung (C)
• Abb. 10: Integrin; aus: Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie, B. Alberts et al. 1999
• Abb. 11: Adhäsionsvorgang, aus Grinell: Cellular Adhesiveness and Extracellular Substrata (1978)
• Abb. 12: LDH-Konzentrationen, die in den Standards mit vorgegebenen Zellzahlen ermittelt wurden.
• Abb. 13: Zwei Wells mit a) halbiertem, konvexem Abutment, b) flachem Titanplättchen
• Abb. 14: EDAX (Energy dispersiv analysis of X-ray) sandgestrahlte Oberfläche (Titanplättchen) mit verfahrensbedingten Silikat-Rückständen
• Abb. 15: RFGDT-Gerät
• Abb. 16: Dargestellt ist das Umsetzen der Titanplättchen in leere Wells derselben Mikrotiterplatte nach abgeschlossener Kultivierung (12 u. 72 h); in den leeren Wells erfolgt die Ablösung der Zellen von den Werkstoffoberflächen zwecks anschließender Zellzählung
• Abb. 17: LDH-Konzentrationen anhand derer die Zellzahlen ermittelt wurden; zu erkennen ist die nahezu lineare Beziehung zwischen LDH-Konzentration und Zellzahl
• Abb. 18: ermittelte Zellzahlen für die 12h-Werte
• Abb. 19: ermittelte Zellzahlen für die 72h-Werte
• Abb. 20: Zellzahlen am Ende der 12-stündigen Kultivierung (Medianwerte plus Standardabweichung)
• Abb. 21: Zellzahlen am Ende der 72-stündigen Kultivierung (Medianwerte plus Standardabweichung)
• Abb. 22: prozentuale Zellzuwächse im Zeitraum zwischen 12 und 72 Stunden (zugrunde gelegt wurden die Medianwerte)
• Abb.23: Fibroblastenrasen nach dreitägiger Kultivierung auf einer polierten Titanoberfläche, ohne RFGDT; die Lücke im Zellrasen bei 12 bis 2 Uhr entspricht einem fixierungsbedingten Artefakt. Der Vergrößerungsfaktor (x 23) ist am unteren Rand der Aufnahme links wiedergegeben.
• Abb. 24: Polygonal geformte Fibroblasten auf:  a) sandgestrahlten Titanplättchen (mit RFGDT) nach 12 h Kultivierung, (Vergr.fakt. x 1000)   b) kugelgestrahlten Titanplättchen (mit RFGDT) nach 12 h Kultivierung, (Vergr.fakt. x 1000)
• Abb. 25: Parallel orientierte Fibroblasten auf kugelgestrahlten Titanplättchen nach 72 h Kultivierung
• Abb. 26: Fibroblasten mit zahlreichen Aktinfilamenten auf polierten Titanplättchen ohne RFGDT,
• Abb. 27: Parallel aneinander orientierte Fibroblasten auf polierten Titanplättchen nach 72 h Kultivierung:
• Abb. 28: Plane Fibroblasten mit z.T. verwaschenen Zellgrenzen auf polierten Titanträgern ohne RFGDT nach 12 h Kultivierung, (Vergr.fakt. x 1000)
• Abb. 29: Plane, polygonale Fibroblasten und kräftiger Polylayer auf kollagenbeschichteten Titanträgern
• Abb. 30: Spärlicher Zellrasen und ausgeprägter Mikrovilli-Besatz bei Fibroblasten auf silikonbeschichteten Trägern  a) ohne RFGDT nach 72 h Kultivierung, (Vergr.fakt. x 1000)   b) mit RFGDT nach 72 h Kultivierung, (Vergr.fakt. x 3000)
• Abb. 31: Typischer und kräftiger Fibroblasten-Polylayer auf kollagenbeschichteten Titanträgern, nach 72 h Kultivierung: a) ohne RFGDT, (Vergr.fakt. x 200);  b) mit RFGDT, (Vergr.fakt. x 200)
• Abb. 32: Quantitativ, anhand der gemessenen Zellzahlen gewichteter Bewuchs nach 12 und 72 Stunden
• Abb. 33: Qualitativ, anhand des o.a. Scores gewichteter Zellbewuchs nach 12 und 72 Stunden
• Abb. 34: Elektronenmikroskopische Darstellung der unterschiedlichen Titanoberflächen
• Abb. 35: Benetzungswinkel eines Wassertropfens auf drei verschiedenen oberflächenmodifizierten Titanplättchen (Photos angefertigt von Herrn Dipl.-Ing. M. Meyer, Institut für nicht-metallische  Werkstoffe, TU-Berlin)
• Abb. 36: Ergebnisvergleich beider Studien (Zellzahlen nach 12 bzw. 24h und nach 72h Kultivierung); die schwarzen Säulen repräsentieren die bei Fibroblasten, die weißen Säulen die bei Keratinozyten (KLEIN und HOHLFELD) ermittelten Zellzahlen (auf 1 x 10 ⁴/ µl korrigierte Werte).