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3  Material und Methode

3.1  Vorversuche

Während der Vorversuche wurde nach einem Modell gesucht, mit dem die Fibroblastenadhäsion und –proliferation an verschiedenartig modifizierten Titanoberflächen untersucht werden kann. Mittels Zählung der von den Implantaten abgelösten Fibroblasten kann auf das Adhäsions- und Proliferationsverhalten an den unterschiedlichen Werkstoffoberflächen rückgeschlossen werden. Daneben dienten die Vorversuche dem Erlernen der Zellkultivierung und dem Zweck, eine geeignete Zellzahl und Kultivierungsdauer zu ermitteln, unter der es zu optimalen Wachstums- und Adhäsionsbedingungen für die Fibroblasten in den Wells der 96er Mikrotiterplatten kommt. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass Zellen metabolisch aktiv sind und fortwährend Stoffe und Mikroexudate in das Zellmedium und auf die Substratoberfläche sezernieren. Daher kann die Dauer eines Zellkulturversuchs infolge der Akkumulation synthetisierter Substanzen die intrinsische Zelladhäsion beeinflussen Grinnel (1978).

Es wurden Mengen von 0.5, 0.7, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 und 5.0 x 104 Zellen/ ml verwendet. Die Kontrollen erfolgten jeweils nach 1, 2, 3 und 4 Tagen Kultivierungsdauer per Lichtmikroskopie und anschließender Zellzählung in der Neubauer-Zählkammer. Das Nährmedium wurde einmal täglich gewechselt. Lichtmikroskopisch wurden insbesondere die Zellrasen neben den Titanplättchen bzw. auf den werkstofffreien Bodenflächen der Kontrollwells hinsichtlich Vitalität respektive Avitalität sowie Zelldichte und –verteilung beurteilt. Der Zellbewuchs ist allerdings auf den Titanplättchen mit Hilfe der Lichtmikroskopie nicht beurteilbar.

Kam es nach einer dreitägigen Kultivierung mit 2 x 104 Zellen/ ml zum Phänomen der Überkonfluenz, d.h. zu einem Überwachsen der Zellen mit konsekutivem Nährstoffverbrauch, erkennbar an der Abnahme der ermittelten Zellmenge, war dahingegen nach einer nur zweitägigen Kultivierung mit gleicher Zellmenge ein lichtmikroskopisch gesunder, monolayerartiger Zellrasen erkennbar. Andererseits fanden sich bei Zellmengen von 0.5 x 104 Zellen/ ml nur spärlich ausgebildete Zellrasen. Es war erforderlich, eine Zellkonzentration zu ermitteln, bei der das Ausmaß von Adhäsion und Proliferation an den unterschiedlich modifizierten Werkstoffoberflächen nach einem bzw. drei Tagen zweifelsfrei differenzier- und messbar ist und bei der das Phänomen der Überkonfluenz vermieden werden kann.


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Um signifkante Ergebnisse zu erhalten, ist eine ausreichend hohe Zellzahl sowohl für die manuelle (Neubauer-Zählkammer) als auch für die apparative Zellzählung (Photoextinktionsmessung, Cellcounter und Analyser System) von Bedeutung. Insbesondere die apparativen Messvorgänge erfordern eine Mindestzellzahl, ab der eine exakte und störungsfreie Messung mit eindeutigen Ergebnissen erst möglich ist.

Die Ergebnisse waren teilweise widersprüchlich und die Ursache hierfür nicht immer ersichtlich. Da mit zunehmender Dauer der Vorversuche einheitlichere Ergebnisse erzielt wurden, muss auch mangelnde Routine und Erfahrung im Umgang mit der Zellkultivierung als Grund hierfür angenommen werden. Mit einer Zellmenge von 1 x 104/ ml für einen und drei Kultivierungstage konnten schließlich stabile und reproduzierbare Ergebnisse für sämtliche Oberflächenmodifikationen erzielt werden. Aufgrund der starken Proliferation der Fibroblasten ist eine Kultivierung mit einer Zelldichte von 4 x 104 Zellen/ ml (∅ 6,5mm) bei einer Kultivierungsdauer von drei Tagen entsprechend den in der Vorläuferstudie untersuchten Keratinozyten nicht sinnvoll Klein et al. (2000).

Überdies dienten die Vorversuche dem Ziel, eine geeignete Methode zur Auszählung bzw. Mengenbestimmung adhärierender Fibroblasten zu finden. Bei der lichtmikroskopischen Zellzählung in der Neubauer-Zählkammer konnten anfangs nur äußerst niedrige Zellzahlen ermittelt werden. Zudem waren die Zählergebnisse sehr uneinheitlich und widersprüchlich. Eine Erklärung hierfür lag in einer zu kurzen Trypsinierungsdauer der Abutments und daraus resultierend mangelhafter Zellablösung. Des Weiteren ließen sich zu Beginn keine signifikanten Unterschiede bezüglich der ermittelten Zellzahlen an den unterschiedlich oberflächenmodifizierten Abutments feststellen. Dies veranlasste, zunächst nach einer alternativen Methode zu suchen, die reproduzierbare Ergebnisse liefert und weitgehend frei von Einflüssen seitens des Untersuchers bzw. fehlerhafter Technik ist.

Um eine Zellzahlbestimmung via Neubauer-Zählkammer zu umgehen, wurde eine Methode zur indirekten Bestimmung der von den Werkstoffen abgelösten Zellmengen gewählt. Zunächst erfolgte nach vorangegangener Lysierung der Fibroblasten die Proteinbestimmung. Die hierbei ermittelten Ergebnisse waren schon deutlich verwertbarer, jedoch war übersehen worden, dass ein Viertel aller Zellträger mit Kollagen beschichtet war.

Da Kollagen ein Eiweiß (aus der Gruppe der fibrillären Proteine) ist, verfälscht es die Ergebnisse zu höheren Werten. Daher wurde nach Ablösen und Lysieren der [Seite 28↓]Fibroblasten mittels dem Detergenz Nonidet P40 ein in vitro Assay (Messung der optischen Dichte als Maß für die LDH-Aktivität) zur quantitativen Bestimmung der Laktatdehydrogenase nach den Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie 1972 gewählt. Von der optischen Dichte lässt sich auf die LDH-Konzentration umrechnen und hierüber die Zellzahl bestimmen. Die Korrelation Optische Dichte/ Konzentration wird mit Hilfe der linearen Regression ermittelt.

Wacker et al. beschrieben 1956 diese hier angewandte Methode zur LDH-Bestimmung mittels Laktat als Substrat und NAD als Koenzym Wacker (1956). Die Laktatdehydrogenase ist eine NAD+ Oxidoreduktase und katalysiert die Oxidation von Laktat zu Pyruvat unter Verwendung von NAD+ als H+ Akzeptor1. Diese Reaktion ist bei physiologischem pH -Wert reversibel. Die LDH ist ein zytoplasmatisch gelöstes Enzym und kommt in allen Geweben vor.

Um fehlerhafte Ergebnisse auszuschließen, ist es erforderlich, die Enzymaktivität im linearen Bereich, also bei konstanter Enzymaktivität, zu messen. Die Linearität der Enzymaktivität ist ablesbar an der gleichbleibenden Differenz der über eine Dauer von fünf Minuten fünfmalig gemessenen Optischen Dichte, d.h. die gemessene Optische Dichte als Maß für die LDH-Aktivität nimmt pro Minute um einen konstanten Betrag ab. Mit zunehmendem Nachlassen der Enzymaktivität flacht die Aktivitätskurve ab.

Im Falle eines zu großen zeitlichen Abstands der LDH-Bestimmung zur Zugabe des Koenzyms NAD+ in die Suspension kommt es zu einem vorzeitigen LDH-Verbrauch mit folglich ausbleibenden Messwerten. Daher musste die Zugabe des Koenzyms unmittelbar vor Beginn der Messung erfolgen.

Während der Vorversuche wurden anfangs die Konzentrationen adhärenter Fibroblasten von je vier Abutmenthälften bzw. Plättchen in einem Eppendorf-Röhrchen bestimmt.

Hierbei ergab sich ein lineares Verhältnis von Zellzahl zu LDH-Konzentration. Im Koordinatensystem lies sich daher die entsprechende Anzahl adhärenter Zellen unmittelbar ablesen (Abb. 12).


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Abb. 12: LDH-Konzentrationen, die in den Standards mit vorgegebenen Zellzahlen ermittelt wurden.

Die Grafik lässt einen streng linearen Bezug von Zellzahl und LDH-Konzentration erkennen.

Da die wegen der Vielzahl an Proben extrem aufwendige Messung die Kapazität des Routine-Labors gesprengt hätte, musste auf ein Mikrotiter-System der Firma Dynatech (DYNATECH MR5000, Dynatech Laboratory Products, Microtiter® MIC-2000® MICROELISA®) zurückgegriffen werden. Hierbei wurden die Zellen einer Versuchsreihe von den einzelnen Trägern abgelöst und die gewonnenen Zellsuspensionen in eine frische 96er-Mikrotiterplatte, in der anschließend die Photoextinktionsmessung erfolgte, umgesetzt. Um direkt auf die Zellzahlen rückschließen zu können, wurde die Optische Dichte zusätzlich in 2 mal 7 Standards mit definierten Zellkonzentrationen (n = 1250, 2500, 5000, 10000, 20000, 40000 und 60000 Zellen/ ml) gemessen.

Es ergab sich jedoch ein neuerliches Problem: lichtmikroskopisch war regelmäßig Zelldetritus in den Wells nachweisbar. Dieser führte bei der Extinktionsmessung infolge uneinheitlicher Lichtabsorption (Wellenlände 340 nm) zu fehlerhaften Werten. Ein vollständiges Abzentrifugieren des Zelldetritus in den hier verwandten Mikrotiterplatten war im Gegensatz zu den Eppendorf-Röhrchen wegen Ermangelung einer ausreichend hochtourigen Zentrifuge (für 96er Mikrotiterplatten) nicht möglich. Da sich der Zelldetritus in den Mikrotiterplatten nicht komplett abzentrifugieren ließ und die LDH–


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Bestimmung in den Eppendorf-Röhrchen durch das Routinelabor aus den o.a. Gründen nicht möglich war, musste diese effiziente Methode verlassen und zur konventionellen Zellzählung via Neubauer-Zählkammer zurückgekehrt werden.

Zur Kontrolle der vollständigen Ablösung aller an den Werkstoffen haftenden Fibroblasten wurden die Träger nach erfolgter Zellablösung nochmals dem gleichen o.a. Ablösungsverfahren unterzogen und anschließend die LDH-Messung wiederholt. Bei ausbleibender Aktivität der Laktatdehydrogenase galt die komplette Zellablösung als bewiesen. Überdies konnten hierdurch das Ablöseverfahren getestet und die erforderliche Menge an Detergenz, die Ultraschalldauer sowie die benötigte Trypsinmenge und Trypsinierungsdauer ermittelt werden.

Um eine sichere Fixierung der Abutments (Hülsenimplantate) auf der Bodenfläche der Wells zu gewährleisten, wurden diese zunächst in einer eigens hierfür angefertigten Apparatur mittels diamantierter Trennscheibe halbiert. Aufgrund der beim Durchtrennungsvorgang entstehenden Hitzeentwicklung kam es hierbei jedoch zu lokalen Schmelzvorgängen an den Kanten der Implantathälften, weshalb eine vollkommen gleichmäßige Halbierung nicht zu erzielen war.

Zudem können die von der Nährstoffoberfläche herabsinternden Fibroblasten, noch ehe der Adhäsionsprozess stattfindet, von den konvexen Abutmentoberflächen abgleiten (Abb. 13). Dies ist umso wahrscheinlicher, als die Zellaktivität durch die vorangegangene Trypsinierung deutlich herabgesetzt ist Grinnel (1978). Darüber hinaus unterliegen Zellen zeitabhängigen Reparationsprozessen z.B. nach Trypsinbehandlung, was wiederum die Zellhaftung beeinträchtigt.

Abb. 13: Zwei Wells mit a) halbiertem, konvexem Abutment, b) flachem Titanplättchen

Von der Flüssigkeitsoberfläche auf den Werkstoff herabsinternde Zellen; im linken Well ist das seitliche Abgleiten der Zellen von der konvexen Werkstoffoberfläche dargestellt.


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Der Vorgang der Zelladhäsion verläuft über mehrere Stunden; erst im Anschluss kommt es dann zur Zellvermehrung. Um ein seitliches Abgleiten der Zellen zu verhindern, wurden die konvexen Abutmenthälften durch flache, kreisförmige und 5mm durchmessende Titanplättchen (hergestellt an der Technischen Universität Berlin) ersetzt. Diese Titanplättchen wurden allerdings erst während der letzten Phase der Vorversuche verwendet und schließlich bei den Hauptversuchen durchgängig eingesetzt.

3.2 Versuchsdurchführung

Es werden insgesamt 200 Titanplättchen eingesetzt. Die vorgenommenen Modifikationen der Oberflächen sind in Tab. 2 aufgelistet.

Tab. 2: Oberflächenmodifikationen

Gruppe

Oberflächenmodifikation

Anzahl
Titanplättchen

1

kugelgestrahlt
(Korngröße 100 bis 200µm)

20

2

kugelgestrahlt plus RFGDT

20

3

sandgestrahlt

20

4

sandgestrahlt plus RFGDT

20

5

poliert

20

6

poliert plus RFGDT

20

7

silikonbeschichtet

20

8

silikonbeschichtet plus RFGDT

20

9

kollagenbeschichtet

20

10

kollagenbeschichtet plus RFGDT

20

Die sand- und kugelgestrahlten Werkstoffoberflächen werden nach Herstellung, um verfahrensbedingte Rückstände an den Oberflächen nachzuweisen, dem sog. EDAX-Verfahren unterzogen (Abb. 14). Da sich hierbei regelmäßig Silikate nachweisen lassen (auf den sandgestrahlten Plättchen höhere Konzentrationen als auf den glaskugelgestrahlten), müssen diese Rückstände ausgewaschen werden.


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Abb. 14: EDAX (Energy dispersiv analysis of X-ray) sandgestrahlte Oberfläche (Titanplättchen) mit verfahrensbedingten Silikat-Rückständen

Vor Verwendung und Beschichtung werden die Werkstoffe zunächst mit einer feinen, weichen Dentalbürste und in einem 15 minütigem Ultraschallbad Cheung und Luk (2000) gereinigt. Im Anschluss folgt die Sterilisierung.

Die Silikonbeschichtung (lufttrocknendes Silikon, Rehau 1511/THF (Tetrahydrophan) 1:4) erfolgt nach vorherigem Auftragen eines Primers (Wacker Grundierung G790). Die Beschichtung mit Kollagen A geschieht, indem die Plättchen über 2 Stunden bei 37°C in 100µl einer Lösung mit 50µg Kollagen A inkubiert werden. Diese Vorgehensweise orientiert sich an früheren Untersuchungen von 0`Keefe und Woodley O`Keefe et al. (1985),Woodley et al. (1988). Die mit Silikon zu beschichtenden Titanplättchen werden erst nach Beschichtung sterilisiert.

Die polierten, nicht oberflächenmodifizierten Plättchen, deren Oberflächen denen der konventionellen polierten Abutments entsprechen, dienen als Kontrollgruppen. Um herauszufinden, für welche Oberflächenart das RFGD-Verfahren von Vorteil ist, wird die Hälfte aller oberflächenmodifizierten Titanplättchen zusätzlich dem Radio- frequency-glow- discharge- Treatment (RFGDT) unterzogen (Abb. 15). Hierdurch entsteht für jede Oberflächenart eine weitere Modifikation.

Abb. 15: RFGDT-Gerät


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Pro Versuchsdurchgang werden 20 Plättchen je Oberflächenart untersucht. Jeder Versuchsdurchgang erfolgt unter sterilen Kautelen. Die vorbereiteten Titanplättchen werden, ohne hierbei die Implantatoberflächen zu berühren, mit Hilfe einer sterilisierten Spezialpinzette in die Wells der 96er Mikrotiterplatten eingebracht. Im Anschluss werden die belegten Wells mit 150µl Nährlösung (Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium) aufgefüllt und abschließend mit der in der Neubauer-Zählkammer ermittelten Zellmenge beschickt. Auf diese Weise können die Zellen von der Mediumoberfläche gleichmäßig verteilt auf die Implantatoberflächen herabsintern.

Die Ermittlung der Zellzahl entsprechend einer Konzentration von 1 x 104 Zellen und die Berechnung der hierzu erforderlichen Menge an Zellmedium erfolgt nach Passagieren der Fibroblastenkulturen (primäre Zellkultur von humanen Hautfibroblasten).

Die Mikrotiterplatten werden nun entsprechend der Inkubationsplanung für die Dauer von 12 und 72 Stunden bei 37°C und 5,0% CO2-Atmosphäre bebrütet (Inkubationsschrank Fa. Heraeus, Hanau, BRD). Während der Versuchsphase werden die Zellrasen in den Wells seitlich der Plättchen auf den werkstofffreien Bodenflächen und in den leeren Kontrollwells einmal täglich lichtmikroskopisch auf Vitalität und Dichte überprüft.

Nach 12 bzw. 72 Stunden werden die Titanplättchen aus den Wells entnommen und in freie Wells der 96er Mikrotiterplatte umgesetzt (Abb. 16). Dort erfolgt nun die Trypsinierung, indem die Wells mit je 50µl Trypsin ((1:250) 2,5% (w/v)) aufgefüllt werden. Die Neutralisierung des Trypsins geschieht durch weiteres Auffüllen der Wells mit 100 µl Nährstofflösung.

Abb. 16: Dargestellt ist das Umsetzen der Titanplättchen in leere Wells derselben Mikrotiterplatte nach abgeschlossener Kultivierung (12 u. 72 h); in den leeren Wells erfolgt die Ablösung der Zellen von den Werkstoffoberflächen zwecks anschließender Zellzählung


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50µl der gut durchmischten Zellsuspension werden nun entnommen und durch Zugabe von weiteren 50µl Trypanblau-Lösung angefärbt. Nach Verwerfen eines Tropfens wird die Zählkammer durch Heranbringen eines Tropfens an den oberen Rand des Deckglases gefüllt, sodass die Zellsuspension die eingeritzten Zählnetze bedeckt. Die Zahl anhaftender Fibroblasten/ ml wird wie folgt errechnet:

Jedes der vier auszuzählenden Quadrate hat eine Fläche von 1mm2 und eine Tiefe von 0,1mm entsprechend einem Volumen von 0,1µl. Um die Zellkonzentration pro Milliliter zu erhalten, wird der Mittelwert aus den 4 Quadraten mit 104 multipliziert. Jede der Zählungen erfolgt wenigstens zweimal. Avitale Zellen werden mitgezählt.

Die Zelldichte pro Flächeneinheit errechnet sich, indem die Zellzahl des über der Fläche abgemessenen Volumens durch die Größe der Fläche geteilt wird:

Innendurchmesser eines Wells

0,65 cm

Fläche (π x r2):

3,1415 x 0,1056 cm2 = 0,3318 cm2

Zellzahl/ ml:

1 x 104 Zellen/ cm3

Volumen der Zellsuspension:

0,15 cm3

Zelldichte/cm2:

0,15 x 104/ 0,3318 = 4521 Zellen/cm2

Einmalig zu Beginn der Versuchsreihen werden die Titanplättchen nach einem Kultivierungsdurchgang von einem bzw. drei Tagen einer Kontrolle auf komplette Zellablösung (siehe Kap. 3.1, S. 30) unterzogen, um so die komplette Zellablösung zu gewährleisten.

Zwecks elektronenmikroskopischer Untersuchung werden parallel zu jedem Versuchsdurchgang je zwei Titanplättchen pro Oberflächenart in gleicher Weise mit Fibroblasten beschickt und bebrütet. Nach 12 bzw. 72 Stunden werden die auf den Titanplättchen gezüchteten Zellkulturen dreimal mit PBS gewaschen und für mindestens 6 Stunden mit Glutaraldehyd 2% in Sörensens Phosphatpuffer (0,06 M, pH 7,2) fixiert. Anschließend erfolgt die Entwässerung der Proben in aufsteigender Alkoholreihe (stufenweise Steigerung der Alkoholkonzentration um 10%). Danach werden die Proben für 2 mal 10 Min. mit Hexamethyldisilazan (HMDS Sigma®) infiltriert, 24 Stunden luftgetrocknet und abschließend mit Gold (BAL-TEC MED 020) beschichtet Brat et al. (1997),Bray et al. (1993). Die elektronenmikroskopische Untersuchung wird mit einem Rasterelektronenmikroskop DSM 982 Gemini der Fa. Zeiss durchgeführt.


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3.3  Verwendete Zellart und Zellkultivierung

Die hier verwendeten Fibroblasten der Fa. Cell-Lining, Berlin, (HIFB Cryopreserved or Proliferating) entstammen einer in antibiotikafreiem Zellmedium gezüchteten Zelllinie menschlicher Hautzellen (23jährige Kaukasierin, Blutgruppe 0 positiv). Es handelt sich um eine Primärzellkultur (Primaria). Proben der Zelllinie werden entsprechend der Richtlinien der Europäischen und Amerikanischen Gesellschaft für Pharmakologie in bakterienhaltiges Medium überimpft und bei 30-35° parallel inkubiert. Um temperaturempfindliche Keime besser erkennen zu können, werden Proben jeder Passage bei drei unterschiedlichen Temperaturbereichen (20-25, 30-35 und 35-39°) bebrütet. Während der Zellzüchtung erfolgt fortlaufend eine lichtmikroskopische Kontrolle der Kulturen. Vor Auslieferung werden die Chargen als kontaminationsfrei verifiziert und für weitere zwei Wochen nach Auslieferung auf mögliche Keimbesiedlung untersucht.

Unmittelbar nach Erhalt einer Zell-Charge erfolgt die sofortige Passage der Zellen. Die Zellen werden hierbei auf vier Kulturflaschen und zusätzlich auf eine Einfrierkapsel verteilt. Nur während der ersten fünf Zellpassagen wird ein Teil der Fibroblasten mittels Tiefkühlung in flüssigem Stickstoff für eventuelle spätere Tests konserviert. Auf diese Weise ist die Durchführung aller Testreihen mit derselben Charge einer Zelllinie gewährleistet.

Zwecks Passage werden die Fibroblasten nach zweimaliger Spülung mit PBS (Dulbeccos Phosphate Buffered Saline ohne Ca++, Mg++) mittels Trypsin (Trypsin (1:250) 2,5% (w/v) in PBS w/o Ca++, Mg++) abgelöst. Der Trypsinierungsprozess wird unter dem Phasenkontrastmikroskop beobachtet. Die Zellen nehmen hierbei eine typisch kugelförmige Gestalt an, schwimmen auf der Oberfläche und lassen sich bereits durch Abklopfen („Shake-off“-Verfahren) vom Substrat lösen. Nach Resuspension von 20ml Nährlösung werden die abgelösten Zellen direkt in vier Kulturflaschen überführt. Um eine schonende Zellpassage durchzuführen, wird nach Ablösen der Zellen auf ein Zentrifugieren verzichtet. Zur Kontrolle auf vollständige Ablösung der Fibroblasten erfolgt eine abschließende lichtmikroskopische Kontrolle der Kulturflaschenböden.

Der Nährmediumwechsel in den Kulturflaschen geschieht dreitägig, mit Ausnahme des ersten Mediumwechsels am ersten Tag nach Passage. Dahingegen erfolgt bei den Versuchsreihen am zweiten Kultivierungstag ein einmaliger Nährmediumwechsel in den Mikrotiterplatten.


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Auf dem Boden der 75 cm2-Kulturflasche lässt sich lichtmikroskopisch schon nach drei Tagen eine deutliche Konfluenz der Zellkolonien bei noch stellenweise lückenhaftem Zellrasen und nach weiteren zwei Tagen ein dichter, monolayerartiger Zellrasen erkennen. Nach insgesamt acht Tagen ist der Boden von einem z.T. mehrschichtigen, dichten und gesunden Zellrasen bedeckt. Zu diesem Zeitpunkt wird die erneute Zellpassage durchgeführt und ein neuer Versuchsdurchgang begonnen.

Die in den Vor- und Hauptversuchen verwendeten Materialien sind der Tabelle 11 im Anhang 8.1, S.130 zu entnehmen.

3.4 Statistische Verfahren

Die mathematisch-statistische Auswertung erfolgt mit Hilfe des Softwareprogramms SPSS, die Aufarbeitung der statistischen Graphik zusätzlich mit Microsoft® Excel 98.

Zur Beurteilung des RFGD-Verfahrens wird der U-Test von Mann und Whitney verwendet.

Zur statistischen Beantwortung der Frage nach der besten Oberflächenmodifikation bezüglich des Gesamteffektes von Adhäsion und Proliferation sowie zur Beurteilung der höchsten Adhäsivität einer Oberfläche wird das Teilmengen-Auswahlverfahren von Hsu eingesetzt.

Die abschließende Signifikanztestung erfolgt für die 12-h-Werte mit dem Kruskal-Wallis-Test und für die 72-h-Werte mit dem U-Test von Mann und Whitney.

Die elektronenmikroskopischen Befunde in Abhängigkeit der Kulturdauer werden anhand eines Scores ausgewertet und deskriptiv-statistisch analysiert.


Fußnoten und Endnoten

1 



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12.01.2005