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5  Diskussion

5.1 Diskussion des Materials

Auf organotypische Keratinozytenkulturen und Kokulturen mit Fibroblasten, die eine weitergehende natürliche Differenzierung ermöglichen Fusenig (1992) und somit ein besseres Modell der Haut darstellen, wurde wegen der größeren Anzahl von möglichen Störgrößen verzichtet, weil diese eine Standardisierung der Testmethode erschweren oder gar unmöglich machen können. Auch im Hinblick auf die Vergleichbarkeit mit den Ergebnissen früherer Untersuchungen der Adhäsion und Proliferation von Keratinozyten an diversen Titanoberflächen wurde einer Monozellkultur der Vorzug gegeben. Man muss jedoch berücksichtigen, dass sich derartige Zelllinien von den Eigenschaften ihrer Ursprungszellen unterscheiden. Ein Unterschied betrifft dabei die verminderte bzw. ausbleibende Kontakthemmung durch andere Zellen des Umgebungsgewebes.

Die Verwendung von Hautzellen, die direkt von menschlicher Haut isoliert werden, hat gegenüber der Verwendung von tierischen Zellen den Vorteil, dass die Ergebnisse nicht erst auf Ergebnisse von Zellen menschlicher Herkunft übertragen werden müssen. Von Nachteil ist aber die mangelhafte Homogenität und Standardisierbarkeit von Zellen individueller Spender mit sehr unterschiedlichen Hauteigenschaften. Hautzelllinien von Mammaliern sind einfach zu handhaben, bereiten jedoch bei der Kultivierung Schwierigkeiten, da sie leichter von unerwünschten Keimen befallen werden können.

Die anfänglich verwendeten Abutmenttypen sind sämtlich konventionelle Brånemark-Hülsenimplantate (Fa. Entific Medical Systems) und werden nur poliert geliefert. Werkstoffe mit in dieser Studie verwendeten Oberflächenmodifikationen sind kommerziell nicht erhältlich und wurden eigens für die Versuche angefertigt. Wenngleich ursprünglich angestrebt wurde, das Adhäsionsverhalten von Fibroblasten an handelsüblichen, halbierten Titan-Abutments zu untersuchen, so wurden wegen der Möglichkeit eines seitlichen Abgleitens der Fibroblasten von den konvexen Oberflächen statt der Abutmenthälften plane Titanplättchen verwendet. Diese bestehen aus einem nahezu identischen Werkstoff, dem Rein-Titan. Die im Hauptversuch verwendeten Titanplättchen weisen nur geringfügige Unterschiede der Konzentrationen von Spurenelementen und ein gleichartiges Verteilungsmuster dieser Elemente auf. Die gewonnenen Resultate können daher auf das Wachstumsverhalten von Fibroblasten an Brånemark-Hülsenimplantaten (Abutments) übertragen werden. Eine solche [Seite 60↓]Vergleichbarkeit wird auch durch Studien der Arbeitsgruppe von KELLER und Mitarbeitern bestätigt, die ein identisches Ausmaß von Zelladhäsion und –anpassung an unterschiedlichen Titanoberflächen nachwiesen Keller et al. (1994).

Da Titan als gut bioverträglich gilt Albrektsson et al. (1983),Albrektsson et al. (1981),Trentz et al. (1997), ist es der konventionelle Werkstoff extra- und intraoraler Implantate, zu denen die hier verwendeten Distanzhülsen zählen. Wenngleich Titan die Anhaftung der Haut ermöglicht Powers et al. (1986), kann diese wegen des Elastizitätsunterschiedes von Titan gegenüber Haut in der Dreiphasenlinie leicht abreißen Daly (1980). Daher ist Titan für Hautdurchleitungen weniger gut geeignet. Mechanische Scherkräfte werden als die Hauptursache für das Auftreten von Zellnekrosen im Gewebe-Implantat-Interface angesehen Rosengren et al. (1999). Diesen Kräften versucht man einerseits mittels Oberflächenmodifikationen Chehroudi et al. (1990),Chehroudi et al. (1991),Chehroudi et al. (1989), die zu verbesserter Haftung des Umgebungsgewebes führen sollen, und andererseits während der Phase der Wundheilung mit Hilfe von Scheiben, die einen direkten Haut- und Weichgewebsandruck auf das Periost erzeugen, entgegenzusteuern Klein et al. (1999a).

Titan als ein oft eingesetztes Biomaterial weist eine gute Resistenz gegen Korrosion auf Albrektsson et al. (1983). Die Korrosionsfestigkeit wird durch eine Passivierungsschicht an der Oberfläche gewährleistet, welche sich in feuchter Umgebung und bei Beschädigung rasch neu bildet und durch anodische Oxidation verstärkt werden kann Gilbert et al. (1998),Newesely (1981).

Experimentell wurde Titan transkutan in die Bauchwand eingesetzt Rostlund und Thompson (1990),Thomsen und Bjursten (1982). Ein Titanfasergeflecht wird als Alternative zu den subkutanen Dacronvelour- und Dacronfilzmanschetten vorgeschlagen, weil es weniger Fremdkörper- und Entzündungsreaktionen hervorruft Paquay und Ruijter (1994). Ungeachtet ihrer großen Oberfläche konnten bei in der Peritonealhöhle platzierten Linksherzunterstützungssystemen, Pumpen mit einer Oberfläche aus einer Titanlegierung (T-6Al-4V), selbst nach bis zu 153 Tagen keine Entzündungs- oder Abstoßungsreaktionen gefunden werden, auch nicht nach Anwendung von immunhistochemischen und ultrastrukturellen Untersuchungsmethoden Capek und Kadipasaoglu (1992). Histologische Untersuchungen von im Trommelfell implantierten Titanröhrchen bestätigten die ausgezeichnete Bioverträglichkeit des Titans. Auch Powers et al. zeigten anhand histologischer Untersuchungen von im Trommelfell implantierten Titanröhrchen auf, dass Zeichen einer akuten oder [Seite 61↓]chronischen Entzündung ausblieben und dass sich das Epithel direkt an die Titanoberfläche anlagerte Powers et al. (1986). Dahingegen wurde in einer von Mostardi et al. durchgeführten Studie der Fibroblastenreaktion auf Titan-Abriebpartikel bei Endoprothesen eine von einer Schwellendosis abhängige Nekrose und Gestaltänderung dieser Zellen nachgewiesen Mostardi et al. (1999). Die Ursache hierfür wird mit dem Auftreten von Entzündungsmediatoren bzw. der Freisetzung von Zytokinen während des Prothesenabriebs, bei dem Titanpartikel in Lösung gehen, begründet. Ein solcher Abrieb tritt bei hautdurchgeleiteten Implantaten nicht auf, da hier ein Festkörper-Festkörper-Kontakt nicht zustande kommt. Derartige Titanpartikel sind ungeachtet ihrer Herkunft Mediatoren einer Makrophagenaktivierung Maloney et al. (1998). Offensichtlich besteht aber hinsichtlich der Reaktion des Umgebungsgewebes auf Fremdkörper ein Unterschied zwischen hautdurchgeleiteten und komplett inkorporierten Implantaten. Dies wird damit erklärt, dass bei Hautdurchleitungen die mangelhafte Versiegelung des Implantats in der Dreiphasenlinie eine Keimpenetration und damit Entzündungen ermöglicht Große-Siestrup (1998).

Um die unerwünschte Adhäsion von Plaque-Bakterien und Zahnbelag zu verhindern, werden intraoral polierte Titan-Abutments verwandt. Extraoral bestehen jedoch andersartige physiologische Bedingungen, insbesondere findet sich hier eine differente saprophytäre Bakterienflora. Eine keimdichte Versiegelung mit den herkömmlichen, polierten Hülsenimplantaten gelingt extraoral nicht Toljanic und Morello (1995).

SALTHOUSE wies in vivo auf rauhen Teflon-Oberflächen eine gegenüber glatten Oberflächen desselben Materials vielfach höhere Anzahl von Makrophagen nach. Diese Affinität der Makrophagen gegenüber rauhen Oberflächen wurde auch in vitro beobachtet. SALTHOUSE konnte nachweisen, dass Makrophagen die Fibroblastenaktivität und hierdurch indirekt die Kollagensynthese und damit die Gewebeorganisation und –ausformung kontrollieren. Während nach einem Monat auf glatten Implantatoberflächen die Makrophagen nicht mehr nachweisbar waren und sich eine dünne Bindegewebskapsel ausgebildet hatte, ließen sich an rauhen Oberflächen noch nach drei Monaten Makrophagen und Riesenzellen nachweisen. Er folgerte daraus, dass glatte Oberflächen bioverträglicher sind Salthouse (1984).

Die Verwendung von sand- und kugelgestrahlten Werkstoffen erfolgte unter Berücksichtigung thematisch ähnlich gelagerter Untersuchungen, in denen aufgezeigt wurde, dass es auf mikrotexturierten und damit oberflächenvergrößerten Titanoberflächen zu einer verbesserten Anhaftung von Zellen verschiedener [Seite 62↓]Körpergewebe kommt (s.a. Kap.1.8, S.26) Chehroudi et al. (1990),Chehroudi et al. (1991),Chehroudi et al. (1989),Gipson und Grill (1983).

Hierbei sei insbesondere auf die Darstellung von Brunette verwiesen, in der vier mögliche Ursachen zellulärer Beeinflussung durch Oberflächentopographien von Implantaten eingehend beschrieben werden Brunette (1988),Grinnel et al. (1987). Das Phänomen der Kontaktführung bedingt die Ausrichtung der Zellen speziell kollagener Fasern auf Implantatoberflächen mit feinen Furchen und Rillen Chehroudi et al. (1992),Ohara und Buck (1979). Als Rugophilie wird die Tendenz z.B. von Makrophagen bezeichnet, rauhe Oberflächen zu bevorzugen Salthouse (1984). Der Zwei-Zentrum-Effekt beschreibt das Phänomen, dass sich Zellen auf Substraten, welche unterschiedliche Haftungseigenschaften aufweisen, in Richtung des Areals mit hohen adhäsiven Eigenschaften orientieren und solche mit nur schlechter Haftung meiden. Dieses Verhalten der Zellen ist für die Akzeptanz eines Fremdkörpers (Zell-zu-Fremdkörper-Adhäsion) von entscheidender Bedeutung, da sich bei einem Werkstoff mit nur geringen adhäsiven Eigenschaften die Zellen überwiegend aneinander orientieren (Zell-zu-Zell-Adhäsion) und damit eine Abkapselung des Implantates herbeiführen können. Die dabei stattfindende gerichtete Zellbewegung auf Fremdkörperoberflächen in Abhängigkeit vom Adhäsionsgradienten wird als Haptotaxis bezeichnet Carter (1965). Das Adhäsionsverhalten verschiedener Zellspezies wird folglich durch diverse Oberflächenmodifikationen ganz unterschiedlich beeinflusst und kann durch diese verbessert werden.

Oberflächentopographie und -chemie spielen eine kritische Rolle bei Adhäsionsvorgängen an Biomaterialien Baier (1970). Diese Oberflächencharakteristika betreffen:

Die Oberflächentopographie wird als eine entscheidende Einflussgröße bei vielen Entwicklungsprozessen betrachtet. Zelluläre Eigenschaften wie die Formierung des Zytoskeletts, die Zelladhäsion und die Interaktion mit anderen Zellen sind Faktoren, welche die Fähigkeit einer Zelle zur Anpassung an eine Oberfläche bestimmen Clark et al. (1990). Materialspezifische Charakteristika scheinen hierbei den von den Oberflächentexturen hervorgerufenen Orientierungseffekt auf die Zellen nicht zu beeinflussen den Braber et al. (1998).

Im Allgemeinen führen hydrophile Oberflächen zu einer verbesserten Zellaffinität, wohingegen die Proteinadsorption durch hydrophobe Oberflächen gefördert wird Altankov und Groth (1994),Kothari et al. (1995),Weiss und Blumenson (1967). Neue Biomaterialien sollen eine gezielte Rekrutierung, Steuerung der Wanderung, Aktivierung und Differenzierung von Zellen sowie Produktion von extrazellulärer Matrix und gegebenenfalls deren Mineralisation ermöglichen Gross (1993).

Die In vivo Biokompatibilität von Silikonimplantaten wird zurzeit heftig debattiert. Das Hauptaugenmerk richtet sich auf die ursächliche Beziehung zwischen silikonhaltigen Biomaterialien und der möglichen Entstehung von Autoimmunerkrankungen, was allerdings nicht bewiesen ist. Jedoch ist die Ausbildung einer bleibenden periimplantären Kapsel um das Silikonimplantat das bedeutendere Problem van Kooten et al. (1998). Einerseits bestätigten Untersuchungen hinsichtlich der Keratinozytenadhäsion, dass Silikon als Polymer besonders gute Haftungs-eigenschaften besitzt und damit für die Verwendung von Hautdurchleitungen geeignet sei Große-Siestrup (1998),Knabe et al. (1997), andererseits konnte in einer elektronenmikroskopischen Studie der Arbeitsgruppe von DEN BRABER nachgewiesen werden, dass die Materialeigenschaften von Silikon keinen Einfluss auf Zellorientierung und Proliferation von Fibroblasten (rat dermal fibroblasts, RDF) ausüben den Braber et al. (1998). Zudem wurde eine gegenüber Silikontexturen erheblich höhere Proliferationsrate der Fibroblasten auf Titanoberflächen nachgewiesen den Braber et al. (1995). McCAULEY et al. dokumentierten an Fibroblasten der Haut, die Komponenten einer Silikongelprothese ausgesetzt wurden, einen signifikanten [Seite 64↓]Gestaltwandel und eine zunehmende Abnahme der Zellproliferation McCauley et al. (1990). Die niedrigere Proliferationsrate und der Formwandel der Fibroblasten auf Silikonoberflächen wird auch in der hier vorliegenden Untersuchung bestätigt.

In der hier vorgelegten Studie erfolgte die Kollagen-Beschichtung unter Berücksichtigung der Untersuchungen von O`Keefe et al., die aufzeigten, dass lösliches, humanes Plasmafibronektin und Kollagen vom Typ I und IV in Abhängigkeit von Inkubationszeit und Konzentration effektive Agentien für eine verbesserte Zellausbreitung der Hautzellen sind. Das natürliche Vorkommen bestimmter extrazellulärer Matrixproteine im Bereich der Basallamina kann demzufolge für Einheilungsprozesse künstlich eingebrachter Vorrichtungen nutzbar gemacht werden.

Das von uns verwendete Kollagen IV ist eines von vielen Bestandteilen der ECM (Fibronectin, Kollagene, Laminin, Thrombospondin). Kollagen A ist zu 5% in der Laborzubereitung (95%Kollagen I + 5% Kollagen IV) enthalten. Das Kollagen IV sorgt als Bestandteil der Basallamina des Epithels für den Halt des Epithels auf der Dermis.

Die Produktion von Fibronektin bzw. Kollagen und die Zellantwort darauf ist bei Fibroblasten und Keratinozyten die Gleiche und veranschaulicht, dass Fibronektin und Kollagen als Matrixfaktoren für beide Zellspezies fungieren können O`Keefe et al. (1985). Beispielsweise interagiert Fibronectin mit biologischen Liganden wie Fibrinogen, Fibrin, Kollagenen und Glycosaminoglycan, Makromolekülen der Extrazellulärmatrix. Curtis und McGrath wiesen bei Beschichtungstests von Kontaktflächen eine verbesserte Adhäsion und ansteigende Zellausbreitung in Gegenwart des „Signalmoleküls“ Fibronectin nach; zu verzeichnen war jedoch ein quantitativer Rückgang dieser Zellaktivitäten bei einer Oberflächenbeschichtung mit bovinem Serumalbumin (BSA), welches ein steter und unverzichtbarer Bestandteil in Nährlösungen für Zellkulturen ist Curtis et al. (1992). Die hier vorgestellte Studie kommt zu vergleichbaren Ergebnissen (s.a. Kap. 5.3, S.97).

Typ-I-Kollagen bindet beispielsweise Osteoblasten über spezifische Zelloberflächen-rezeptoren, die Integrine. In einer Studie der Arbeitsgruppe von BASLÉ et al. waren auf Kollagen-I-beschichteten Biomaterialien aus Rinderknochen kultivierte Osteoblast-like Cells (Saos-2) in der Form elongiert und entlang der trabekulären Architektur und dem oberflächlichen Kollagengeflecht ausgerichtet. Nach 14 Tagen flossen die Zellen zusammen, die Oberfläche des Biomaterials war durch eine Zelllage bedeckt. Dahingegen zeigten sich auf der Oberfläche des entproteinisierten Biomaterials die Zellen globulär, ohne spezifische Ausrichtung und nur teilweise der Oberfläche [Seite 65↓]anhaftend. Nach 14–tägiger Kultivierung blieben große Teile der Biomaterialoberfläche unbedeckt. Es ließ sich keine spezifische Verbindung mit dem entproteinisierten Biomaterial erkennen. Diese Ergebnisse ließen darauf schließen, dass das Vorhandensein von Typ-I-Kollagenfasern im knöchernen Biomaterial eine Bedeutung in der zellulären Adhäsion, der Verbreitung und der Orientierung bei der Interaktion zwischen Typ-I-Kollagen und der ß1-Integrin-Untereinheit der Osteoblasten hat Baslé et al. (1998). Die Orientierung und Verteilung von Zellen hängt essentiell vom Mechanismus der Zelladhäsion sowie von den Interaktionen zwischen Zellmembran und Unterlage ab Boyan et al. (1996).

Da diverse Studien eine wesentliche Beeinflussung der Zelladhäsion durch die Plasmasterilisierung von Implantatoberflächen nachwiesen, wurde das Radio–Frequency–Glow–Discharge–Treatment (RFGDT) bei der Hälfte aller Werkstoffe ergänzend angewendet Baier et al. (1984),Jansen et al. (1989). Die Ergebnisse in der Literatur sind allerdings uneinheitlich und widersprüchlich. Nach GROSSE-SIESTRUP führen alle geprüften Variationen der Glimmentladung meist zu einer Steigerung der Zelladhäsion bei Silikon, teilweise wird aber auch eine chemisch bewirkte, verbesserte Adhäsion durch Glimmentladung rückgängig gemacht Große-Siestrup (1998). Untersuchungen von BAIER et al. demonstrierten, dass Fibroblasten (New Zealand White rabbits) an niedrig geladenen Oberflächen, die mittels stearinsaurer Lösung vorbehandelt oder mit Silikon beschichtet wurden, eine nur geringgradige Zellantwort zeigten. Jedoch erwies sich das RFGD-Verfahren hierbei als eine effektive Methode, anorganische Werkstoffe zu sterilisieren und damit in einen Zustand hoher Oberflächenenergie zu versetzen. Diese Oberflächen korrelierten mit der höchsten Adhäsionsrate Baier et al. (1984). Allerdings ist der Grad der Zellanhaftung und –proliferation abhängig von der Anwendungsdauer des Plasmasterilisierungsverfahrens.

Die Behandlung mit Argon-Plasma führt zum Entweichen von Sauerstoff, der die Titanoberflächen stets bedeckt. Ebenso entweicht Wasserstoff, dessen Konzentration in der unmittelbar unter der Materialoberfläche liegenden Region abnimmt Aronsson et al. (2001).

Die Steigerung der Oberflächenenergie durch das RFGD-Verfahren führt bekanntermaßen zu einer erhöhten Oberflächenspannung, was wiederum die Benetzbarkeit verbessert. Die Benetzbarkeit (wettability) ist ein werkstoffseitiger Parameter, der auf den Grad der Zelladhäsion Einfluss nimmt Baier (1970),Baier et al. (1984),Schmidt (1999),Weiss und Blumenson (1967). Beträgt der Kontaktwinkel ϑ[Seite 66↓](zwischen Flüssigkeit und Materialoberfläche) weniger als 90°, so spricht man von Benetzung, bei einem Kontaktwinkel ϑ von mehr als 90° von Nichtbenetzung (s.a. S. 57, 58). Die für diese Studie durchgeführte Untersuchung der Benetzbarkeit wies eine Nichtbenetzbarkeit von Silikon (Kontaktwinkel ϑ > 90°) und eine Benetzbarkeit von planen bzw. polierten (ϑ = 75,8°) sowie durch Sandstrahlung oberflächenvergrößerten Titanoberflächen (ϑ = 65,8°) nach. Dies entspricht den Ergebnissen der Arbeitsgruppe von BAIER et al. Baier und Meyer (1988). Die in der hier vorliegenden Studie untersuchten silikonbeschichteten Oberflächen zeigten bezüglich der Benetzbarkeit eine Analogie zu den nach 12 und 72 Stunden ermittelten Zellzahlen und wiesen den niedrigsten Zellbewuchs auf. Auf den polierten Titanoberflächen waren trotz einer schlechteren Benetzbarkeit gegenüber aufgerauhten Oberflächen die höchsten Zahlen adhärenter Zellen nachweisbar. Offensichtlich spielt die Benetzbarkeit als alleiniger Parameter eine nur untergeordnete Rolle bei der zu erwartenden Zellanhaftung. Physikochemische Parameter wie Oberflächenenergie und Benetzbarkeit beeinflussen zwar das Zellwachstum auf mikrogerillten Oberflächentexturen, haben jedoch keinen messbaren Einfluss die Gestalt und Orientierung der Zellen den Braber et al. (1995).

Da die verschiedenen Arbeitsgruppen unterschiedlichste Werkstoffe bzw. Implantatoberflächen sowie Zellen verschiedener Spezies und Herkunft verwenden, gibt es bislang noch keine standardisierten und damit vergleichbaren Untersuchungen bezüglich des Adhäsionsverhaltens von Zellen an mit dem Glow-Discharge-Verfahren behandelten Werkstoffen. In der Literatur werden einerseits unterschiedliche Plasmasterilisierungsverfahren und andererseits verschieden lange Anwendungszeiten einer solchen physikalischen Oberflächenbehandlung beschrieben.

5.2 Diskussion der Methode

Wie gemeinhin für jedes in vitro Modell Grenzen bestehen und bei der Datenerhebung berücksichtigt und akzeptiert werden müssen, so wurde auch in diesem Modell nur ein Teilaspekt der komplexen Vorgänge an der Grenzfläche zwischen Implantat und Biosystem untersucht. Das Haftungs- und Wachstumsverhalten im Verbund mit anderen Hautzellen und die Implantatumgebung wurden außer Acht gelassen. Die [Seite 67↓]Einfachheit des hier vorgestellten Modells erlaubt jedoch weitere Untersuchungen des Haftungs- und Wachstumsverhaltens anderer Zellspezies an diversen Werkstoffen in einer standardisierten und reproduzierbaren Umgebung und ermöglicht somit vergleichbare Ergebnisse.

Bei der erforderlichen Versiegelung der Haut im Dreiphasenbereich steht die Haftung von Fibroblasten und Keratinozyten im Vordergrund, weshalb man sich methodisch unter Verzicht auf metabolische und biochemische Kriterien auf morpholgische Kriterien (Zellzahlen) konzentrieren kann Baier (1970),Baier und Meyer (1988),Baier et al. (1984).

Andere Parameter wie die Art und Weise der Implantatapplikation, die Verweildauer des Implantats und die Belastungsverhältnisse am Gewebe-Implantat-Interface sind bei Implantat-Gewebe-Interaktionen gleichermaßen von Bedeutung. Diese können jedoch nur am lebenden Organismus untersucht werden. Schließlich kann aus andersartigen in vitro Bedingungen ein verändertes Zellverhalten resultieren. So zeigen Knorpel-zellkulturen einen veränderten Phänotypus, wenn sie nicht wie unter in vivo Verhältnissen zyklischen Belastungen ausgesetzt werden Larson et al. (1991),Rosengren et al. (1999).

Werden in vitro Methoden durch lokale Einflüsse des Biowerkstoffes auf das Umgebungsgewebe sowie durch Wechselwirkungen zwischen Implantat und Wirt kompliziert und überlagert, so ist die Aussagekraft solcher Testmethoden eingeschränkt oder nicht gegeben. Da die Wirkungen körperfremder Substrate auf isolierte Organe oder Gewebe nicht unmittelbar auf die komplexeren Verhältnisse in vivo übertragen werden können, vermögen in vitro Modelle Tierversuche unmittelbar vor der Anwendungsphase am Menschen oftmals nicht zu ersetzen. In vitro Versuche geben jedoch erste Hinweise z.B. auf das Zellverhalten an der Grenzfläche: Implantat-Umgebungsgewebe. Die vergleichende Gegenüberstellung der einzelnen Untersuchungen ermöglicht letztlich richtungsweisende Einsichten.

Um zwischen der Fibroblastenadhäsion und –proliferation unterscheiden zu können, wurden Kultivierungszeiträume von 12 und 72 Stunden gewählt. Von JANSEN et al. durchgeführte Pilotstudien zeigten, dass das Maximum der Fibroblastenadhäsion nach vier Stunden erreicht wird und die Proliferation etwa 24 Stunden nach Zellaussaat beginnt Jansen et al. (1991). Hinsichtlich der Zellzählung war zu beachten, dass diese Methode für ältere, geschichtete Kulturen unzuverlässige Ergebnisse liefert. Dahingegen ist die Zellzählung nach Zellisolierung während der ersten Kultivierungstage möglich Fusenig (1986). Da in dieser Studie relativ kurze [Seite 68↓]Kultivierungszeiträume von 12 h und 72 h gewählt wurden, ist hier eine Zellzählung zulässig. Die gewählte Methode der Zellzählung zur Bestimmung am Implantat adhärenter Zellen wurde bereits von verschiedenen Arbeitsgruppen und Autoren erfolgreich angewandt Große-Siestrup (1998),Hohlfeld (2000),Jansen et al. (1991),Srivastava et al. (1990). Um eine Überkonfluenz, die bei Fibroblasten im Gegensatz zu den von KLEIN und HOHLFELD untersuchten Keratinozyten auftritt, sicher zu vermeiden, wurde erstens der Zeitraum, der für die Zelladhäsion zur Verfügung stand, halbiert (von 24 auf 12 Stunden) und zweitens für die Zellkultivierung im Zeitraum der Adhäsion nur die Hälfte und im Zeitraum der Proliferation nur ein Viertel der von KLEIN und HOHLFELD verwendeten Zellmengen eingesetzt Hohlfeld (2000),Klein et al. (2000). Die von KLEIN und HOHLFELD durchgeführten Untersuchungen zur Keratinozytenadhäsion und –proliferation an oberflächenmodifizierten Hülsenimplantaten dienten als Vergleichsarbeit, da diese einen ähnlichen Versuchsaufbau wählten und deren Ergebnisse eine notwendige Ergänzung zu der hier vorgelegten Studie darstellen.

Die Grundfläche eines halbierten Abutments ist gering größer als seine Auflagefläche. Die verwendeten 96er-Mikrotiterplatten (Firma Falcon) besitzen einen Durchmesser von dWB = 6,5mm pro Well. Nach der Formel F=π x r2 ergibt sich eine Wellbodenfläche von FWB = 33,18mm 2. Die Fläche eines halbierten Abutments berechnet sich nach der Formel:

Fläche nach Längsschnitt (FLs) = Abutmentdurchmesser (dAb) x Abutmenthöhe(hAb)

FLs = dAb x hAbèFLs= 4,5mm x 4mm = 18mm2

Demnach werden 54% der Wellbodenfläche von einer Abutmenthälfte besetzt. Da jedoch die Oberfläche eines Abutments gekrümmt ist, muss dieser Flächenwert nach oben korrigiert werden.

Unter Berücksichtigung des beim Zerlegen durch die Trennscheibe entstehenden Schnittverlustes von 0,5mm pro Abutmenthälfte wird eine solche konvexe Fläche folgendermaßen berechnet:

 

0,5 x Außenfläche Abut (FAH )

=

0,5 x Höhe Abut (hAb) x (Umfang Abut (UAb) - Schnittverlust)

=

Außenfläche Abutmenthälfte

=

0,5 x FAH

=

0,5 x hAb x (π x d ) - 1mm

=

0,5 x 4mm x (3,14159 x 4,5mm) - 1mm

=

0,5 x 55,54mm2

=

27,27mm 2


[Seite 69↓]

Die reale, durch eine Abutmenthälfte angebotene Fläche entspricht daher 82% einer Wellbodenfläche, welche tatsächlich für die Anhaftung der Fibroblasten zur Verfügung stand. Die nicht genutzte freie Fläche neben einem Abutment diente als Kontrollzellrasen.

Da die plane Fläche eines Titanplättchens (F=π x r2), welches in den Hauptversuchen die Abutmenthälften ersetzte, 19,63 mm 2 beträgt, besetzt ein Plättchen nur 59% der Wellbodenfläche. Es kommt also gegenüber den Abutmenthälften zu einem 28%-igen Flächenverlust entsprechend 7,64 mm2. Dieser Flächenverlust beeinträchtigt jedoch nicht die Vergleichsmöglichkeit mit den Ergebnissen der Pilotstudie von KLEIN und Hohlfeld Hohlfeld (2000),Klein et al. (2000), die bei ihren Versuchen konvexe Abutmenthälften verwendeten. Denn schließlich werden die ermittelten Zellmengen relativ zueinander in Beziehung gesetzt.

Um die die Zellhaftung und –proliferation beeinflussenden werkstoffseitigen Parameter (physikalische, mechanische) besser von chemischen bzw. biochemischen Einflussgrößen unterscheiden zu können, wurde auf die Kollagenbeschichtung der sandgestrahlten Werkstoffe verzichtet. Andernfalls hätten zwei Einflussgrößen, nämlich eine (bio-)chemische (Kollagen) und eine mechanische (Oberflächenvergrößerung durch Sandstrahlung), auf das Wachstumsverhalten der Fibroblasten gleichzeitig eingewirkt. Zudem war zu klären, inwiefern eine Kollagen A–Beschichtung allein schon zu einer Verbesserung der Adhäsion und Proliferation bei Fibroblasten führt.

Als statistische Tests kommen in dieser Untersuchung generell nur parameterfreie Tests infrage, also keine t-Tests, da die Daten nicht mit der Normalverteilung verträglich sind. Hierbei kommen oft nur wenige, voneinander verschiedene Zellzahlen vor und die Verteilungen sind nicht symmetrisch. Zur statistischen Beantwortung der Frage nach der besten Oberflächenart bezüglich der Adhäsion (12h-Werte) und des Gesamteffektes von Adhäsion und Proliferation (72h-Werte) eignet sich ein Teilmengen-Auswahlverfahren, das aus mehreren Populationen, die jeweils durch eine Stichprobe vertreten sind, eine Untermenge aussondert, die mit einer hohen statistischen Sicherheit die beste Population enthält. Im vorliegenden Anwendungsfall wird durch das Auswahlverfahren eine Untermenge von Oberflächenarten selektiert, unter denen sich mit hoher statistischer Sicherheit die beste Oberflächenart hinsichtlich der 12- und 72-Stunden-Werte befindet (höchste 12-/ 72h-Werte). Aufgrund der Dateneigenschaften (keine Verträglichkeit mit Normalverteilung) kommt ein verteilungsfreies Auswahlverfahren, das Verfahren von Hsu, zur Anwendung Horn und Vollandt (1995).


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Die Berechnung der statistischen Sicherheit erfolgt nach der Formel: 1 - α = 1 - 0.05 = 0.95, wobei Alpha das Signifikanzniveau des Tests repräsentiert. Zeigt das Testergebnis wie im vorliegenden Fall Signifikanz an, so bedeutet dies: Die Wahrscheinlichkeit dafür, dass die Signifikanzaussage falsch ist, ist nicht größer als Alpha. Bei der Testentscheidung auf Signifikanz irrt man sich also maximal mit einer Wahrscheinlichkeit von 5%. Der Wert 5% ist eine Schranke, die sich allgemein eingebürgert hat. Im Beispiel des angewendeten Auswahlverfahrens heißt das: Mit einer Wahrscheinlichkeit von maximal 5% ist die in Wirklichkeit beste Oberfläche eine andere als die vom Verfahren als beste ausgewählte.

Will man jedoch statt der 72-Stunden-Werte die Differenzen innerhalb des Zeitraumes von 12 bis 72 Stunden auswerten, so ist das nur möglich, wenn sich jedem einzelnen 12-h-Wert eindeutig ein 72-h-Wert zuordnen lässt, was mit dem vorliegenden Studiendesign nicht realisierbar ist. Daher wird hier die deskriptive Datenanalyse, mit Hilfe derer eine Tendenz im Proliferationsverhalten der Fibroblasten erkennbar wird, angewendet.

Neben der lichtmikroskopischen Kontrolle der Zellkulturen diente die Elektronenmikroskopie zur Darstellung der Zellmorphologie und des Zellwachstums auf den verschiedenartig texturierten Titanträgern. Aufgrund des wegen der hohen Kosten beschränkten Stichprobenumfanges (eine elektronenmikroskopische Abbildung je Vergrößerung, Oberflächenart und Kultivierungsdauer) musste auf statistische Testverfahren der konfirmatorischen Datenanalyse verzichtet werden. Vielmehr wurden die Bilder anhand eines Scores explorativ analysiert, wobei das zeitabhängige Wachstum der Fibroblasten ausgewertet und graphisch in Form eines Polarplots (siehe Kap.4.4.2, S. 77 - 55) dargestellt wurde. Es zeigte sich, dass von der Zellmorphologie und der Art des Oberflächenbewuchses Rückschlüsse auf das zu erwartende Ausmaß der Zellanhaftung möglich sind, weniger jedoch auf das Ausmaß der Zellproliferation nach abgeschlossener Adhäsion. Eine solche visuelle Auswertung des Zellbewuchses anhand eines Scores liefert für geschichtete Zellkulturen ungenaue Ergebnisse, da die tiefer liegenden Zellschichten nicht sicher beurteilbar sind. Dies veranschaulichen die mittels Polarplot analog dargestellten, quantitativ (Zellzählung) und qualitativ (Score) ermittelten Ergebnisse (Abb. 32 u. 33, S. 80).


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5.3  Diskussion der Ergebnisse

Eine vergleichende Einordnung der Ergebnisse in die bestehende Literatur ist nicht leicht möglich, da einerseits mit unterschiedlichen Zellspezies, und andererseits mit divergenten Versuchsmodellen gearbeitet wurde. Ausgangspunkt der Arbeit waren Untersuchungen von KLEIN und HOHLFELD Klein et al. (2000), die eine immortalisierte Zelllinie menschlicher Keratinozyten (HaCat-Zellen) auf verschiedenartigen Titanträgern kultivierten.

In einer Vielzahl von in vitro Tests zur Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von Zellen an diversen Oberflächen werden bis heute unterschiedlichste Materialien wie Silikone, Polystyrene, Perspex, Epoxy, Titane etc. verwendet. Diese Werkstoffe sind bezüglich ihrer Oberflächenchemie und -topographie voneinander deutlich verschieden. Es muss angenommen werden, dass die beobachteten Unterschiede bezüglich des Zellverhaltens an Oberflächen durch die verschiedenen Materialeigenschaften verursacht werden.

Von zahlreichen Autoren, die in ihren Untersuchungen sowohl Keratinozyten als auch Fibroblasten verwendeten, wird die Oberflächentopographie als die vorherrschende Einflussgröße hinsichtlich der Zellantwort auf unterschiedliche Materialien und die Kontaktführung als das Resultat einer vorzugsweisen Proteinadsorption auf scharfkantigen Oberflächenrauhigkeiten betrachtet. Dahingegen konnten WAlboomers et al. nachweisen, dass auch eine plane titanbeschichtete Polystyrene-Textur eine Kontaktführung induziert. Daraus folgerten sie, dass die Theorie einer vorzugsweisen Proteinadsorption vermutlich nicht gültig ist, dass vielmehr die Kontaktführung von an den Filopodien einwirkenden mechanischen Kräften verursacht wird, wodurch die Zellen angeregt werden, Aktinfilamente auszubilden und sich dadurch der Werkstoffoberfläche anpassen Walboomers et al. (1999).

Die in dieser Studie durchgeführte Rasterelektronenmikroskopie bestätigt die Ergebnisse von WALBOOMERS und zeigt auf den planen im Vergleich zu den übrigen Oberflächen die ausgeprägteste Spreitung der Fibroblasten; deren Gestalt ist nach allen Seiten hin plan ausgezogen und am deutlichsten abgeflacht. Ebenso findet sich hier die stärkste Ausbildung von Aktinfilamenten. Die Anpassung der Fibroblasten an die plane Titanoberfläche erscheint perfekt.

RÄISÄNEN et al. belegten, dass insbesondere glatte Titanoberflächen für die Adhäsion und Ausbreitung epihelialer Zellen günstigere Bedingungen bieten als nicht metallische [Seite 72↓]Oberflächen Räisänen et al. (2000). Analog zu diesen Ergebnissen zeigen in der hier durchgeführten Untersuchung die Fibroblasten den höchsten Adhäsionsgrad an polierten Titanoberflächen.

Eine zusätzliche RFGD-Behandlung der polierten Titanträger führt zwar nach 12 Stunden zu keiner Steigerung der Zellanhaftung, jedoch nach 72 Stunden sowohl zu den höchsten Proliferationsraten als auch zum stärksten Fibroblastenbewuchs. Nur die RFGD-vorbehandelten plus kollagendotierten planen Titanoberflächen zeigen nach 72 Stunden einen geringgradig stärkeren Fibroblastenbewuchs. Eine Oberflächenvergrößerung und -texturierung durch Sand- und Kugelstrahlung erbringt gegenüber den polierten, nicht RFGD-behandelten Titanplättchen keinen Vorteil. Bei den angerauhten Titanträgern führt jedoch die RFGD-Behandlung zu einer Angleichung der nach 12 Stunden gemessenen Zellzahlen an die Verhältnisse bei den polierten, nicht RFGD-behandelten Trägern, sodass sich keine signifikanten Unterschiede mehr ergeben.

Des Weiteren bestätigt die vorliegende Studie eine eindeutige Überlegenheit der Titanoberflächen gegenüber den silikonbeschichteten, bei denen die RFGD-Behandlung zu einer verminderten Adhäsion und Proliferation der Fibroblasten führt. Dies deckt sich mit einer Vielzahl anderer Untersuchungen den Braber et al. (1998),den Braber et al. (1998).

Der elektronenmikroskopische Vergleich der RFGD-behandelten mit den physikalisch unbehandelten Oberflächen dokumentiert zwar (mit Ausnahme bei silikonbeschichteten Oberflächen) den positiven Einfluss der RFGD-Behandlung auf das Fibroblastenwachstum, jedoch ist kein erkennbarer Einfluss auf die Zellorientierung und -gestalt der Fibroblasten nachweisbar. Diese Ergebnisse entsprechen den Resultaten von DEN BRABER und Kollegen, die den Effekt der Oberflächenbehandlung mit dem Glow-Discharge-Verfahren an glatten und mikrotexturierten Silikonsubstraten untersuchten den Braber et al. (1995).

Die Ergebnisse dieser Studie sind nur eingeschränkt mit denen von KLEIN und HOHLFELD vergleichbar, da diese zur Untersuchung der Keratinozytenadhäsion einerseits eine doppelt so lange Kultivierungszeit, nämlich 24 statt 12 Stunden, anwendeten, und andererseits anstelle der planen Titanträger konvexe Abutmenthälften in ihren Versuchsreihen einsetzten. Überdies wurden einzig RFGD-behandelte Träger (halbierte Abutments) eingesetzt. Physikalisch unbehandelte Träger wurden von KLEIN und HOHLFELD nicht untersucht. Inwieweit also das RFGD-Verfahren für Haftung und [Seite 73↓]Wachstum von Keratinozyten einen Vorteil gegenüber physikalisch unbehandelten Oberflächen erbringt, liess sich daher nicht entscheiden. Ein Vergleich der Ergebnisse mit polierten, nicht RFGD-vorbehandelten Titanoberflächen ist jedoch sinnvoll, da diese die handelsüblichen Oberflächen bei den gängigen Brånemark-Hülsenimplantaten darstellen.

KLEIN und HOHLFELD kamen zu folgenden Ergebnissen:

Vergleicht man nun die bei Fibroblasten und Keratinozyten gemessenen Zellzahlen, so ergeben sich folgende Unterschiede (Abb. 36):

Abb. 36: Ergebnisvergleich beider Studien (Zellzahlen nach 12 bzw. 24h und nach 72h Kultivierung); die schwarzen Säulen repräsentieren die bei Fibroblasten, die weißen Säulen die bei Keratinozyten (KLEIN und HOHLFELD) ermittelten Zellzahlen (auf 1 x 10 4/ µl korrigierte Werte).

In den Untersuchungen zur Keratinozytenadhäsion und –proliferation an oberflächenmodifizierten Hülsenimplantaten wurden lediglich die ermittelten Zellzahlen am Ende der jeweiligen Kultivierungszeiträume verglichen. Die zeitgebundenen Wachstumsvorgänge an der Grenzfläche Werkstoff-Biosystem blieben unberücksichtigt. Über die Proliferationsraten der Keratinozyten im Zeitraum nach erfolgter Zellanhaftung bis zum Ende der Wachstumsphase (72h) wurde keine Aussage gemacht. Da für beide Kultivierungszeiträume (12 h und 72 h) unterschiedliche Zellmengen (2 x 104/ µl und 4 x 104/ µl) eingesetzt wurden, ließ sich hierüber ohnehin nichts aussagen.

Der Vergleich der Proliferationsraten mit den am Ende der Zellkultivierung gemessenen Zellzahlen ermöglicht es zu erkennen, ob ein ausreichend langer Kultivierungszeitraum zur Beurteilung der auf die Zellproliferation günstig oder ungünstig einwirkenden Oberflächeneffekte gewählt wurde. Denkbar ist nämlich, dass erst nach einem längeren Kultivierungszeitraum eine schlechtere Anhaftung von Zellen an einer Oberfläche durch


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eine verbesserte Proliferation wett gemacht wird. Mit anderen Worten: Nach einer gegenüber anderen Oberflächen deutlich gesteigerten Zellproliferation können am Ende dennoch niedrigere Zellzahlen ermittelt werden, wenn der Zeitraum, der zum Ausgleich einer zu Beginn schlechteren Zellhaftung zur Verfügung stand, zu kurz gewählt wurde. So zeigten beispielsweise die kugelgestrahlten plus RFGD-behandelten Titanplättchen gegenüber den unbehandelten einen deutlich geringeren Fibroblastenzuwachs im Kultivierungszeitraum zwischen 12 und 72 Stunden, jedoch wiesen sie am Ende einen stärkeren Bewuchs als die physikalisch unbehandelten kugelgestrahlten Titanplättchen auf. Dies ist ein wesentlicher Nebenbefund der hier vorgelegten Studie.

Wenngleich eine statistische Analyse der Proliferationsraten aufgrund des in der hier vorliegenden Studie gewählten Versuchsmodells nicht möglich ist, so lässt sich dennoch eine Tendenz im Proliferationsverhalten der Fibroblasten aufzeigen, da für beide Kultivierungszeiträume (12 h und 72 h) die gleichen Zellmengen (1 x 104/ µl) verwendet wurden.

5.4 Fazit und Ausblick

Mit dem in dieser Studie angewandten Zellkulturmodell lässt sich die Frage, ob eine durch eine spezifische Oberflächenart bedingte, verbesserte Zellhaftung zwangsläufig auch zu gesteigertem Zellwachstum führt, nicht beantworten. Weitere Studien und die Entwicklung eines hierfür geeigneten Studiendesigns sind nötig, dieser Frage auf den Grund zu gehen.

Es ist nicht auszuschließen, dass es in vivo noch zu Veränderungen im Wachstumsverhalten von Fibroblasten und Keratinozyten kommen kann, weil die in dieser Untersuchung verwendeten Kultivierungszeiträume recht kurz gewählt sind und beim lebenden Organismus in den Zeitraum der Entzündungsphase, die der Implantation eines Biomaterials folgt, fallen würden. Eine Überprüfung der gewonnenen Erkenntnisse kann daher erst am lebenden Organismus erfolgen.

Da die Kollagen A-Beschichtung bei beiden Zelltypen, Fibroblasten und Keratinozyten, zu signifikant verbessertem Zellwachstum führt, erscheint eine in vivo Versuchsreihe mit Kollagen-A-beschichteten und RFGD-vorbehandelten Hülsenimplantaten (Abutments) sinnvoll. Überdies ist eine Kollagen A-Dotierung die am einfachsten herzustellende Oberflächenmodifikation.


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Die periimplantäre Taschenbildung (durch ausbleibende Kontakthemmung und Herabwachsen des Epithels) wird als wesentliche Ursache für einen Implantatentzündung angesehen, weshalb einer verbesserten Fibroblastenanhaftung besondere Bedeutung zukommt. Da polierte Oberflächen das Wachstum von Fibroblasten am günstigsten, das der Keratinozyten jedoch am ungünstigsten beeinflussen, wäre auch eine sog. zweiphasische Titanoberfläche denkbar. Ein solches Hülsenimplantat bestünde hierbei aus einem polierten Anteil auf Höhe der Dermis und einem sandgestrahlten plus kollagenbeschichteten Anteil im Niveau der Epidermis. Hiermit ließe sich vermutlich das Tiefenwachstum der Keratinozyten am Hülsenimplantat verhindern.

Des Weiteren wäre abzuklären, ob entweder durch verbesserte Zellhaftung am Implantat oder durch vermehrtes Wachstum auf der Implantatoberfläche das Risiko einer periimplantären Entzündung vermindert wird. Vermutlich aber ist hier der Gesamteffekt von Adhäsion und Proliferation der Zellen am Implantat entscheidend.

Die vorliegende Studie vermag nicht zu klären, ob eine anfänglich keimdichte Versiegelung in vivo dauerhaft bestehen bleibt. Hier sind ganz sicher sowohl lokal einwirkende, biomechanische Krafteinflüsse als auch Entzündungsfaktoren von Bedeutung.

Angesichts der nahezu unüberschaubaren Fülle an Studien zur Problematik „Grenzfläche: Implantat-Biosystem“ und der sich laufend verbessernden Technologien erscheint eine Synopse der Fachliteratur der letzten Jahre unentbehrlich. Die Vielzahl der bei Adhäsionsvorgängen beteiligten Einflussgrößen (materialseitige und zellbiologische) erschwert zusätzlich die vergleichende Bewertung unterschiedlicher Implantatwerkstoffe. Umso mehr sind in vivo Testungen von Implantaten unumgänglich.

Was zählt, ist letztlich die Entzündungsfreiheit und damit der Implantaterfolg.


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12.01.2005