Was immer Du tun kannst oder erträumst tun zu können, beginne es.
Kühnheit besitzt Genie,
Macht und Magische Kraft.
Beginne es jetzt.
Johann Wolfgang Goethe
Meiner Tochter Clara gewidmet
Die Behandlung vieler Erkrankungen und Verletzungen erfordert oftmals eine chirurgische Intervention mit dem Ziel, Organfunktionen zu erhalten, zu verbessern, zu ergänzen oder gar zu ersetzen. Im Interesse des Behandlungserfolges ist nicht selten der Einsatz einer Vielzahl sog. Biomaterialien wie synthetischer Polymere, Materialien biologischer Herkunft, Metalle und Keramiken notwendig. Die Anwendung solcher Biomaterialien reicht von großvolumigen Vorrichtungen, wie beispielsweise künstlichen Organen, Gefäß- und Gelenkprothesen sowie Epithesen, bis hin zu kleinsten Implantaten wie Herzklappen, Augenlinsen oder extra- und intraoralen Implantaten.
Viele dieser Implantate führten in den letzten Jahrzehnten zu beachtlichen therapeutischen Erfolgen. So werden Biomaterialien zunehmend häufiger zu diagnostischen, therapeutischen und kosmetischen Zwecken eingesetzt. Dennoch stößt deren Anwendung durch die Problematik der Bioverträglichkeit an ihre Grenzen. Hier sind ungünstige Wechselwirkungen zwischen Werkstoffoberflächen und umgebendem Biosystem (host tissue) limitierende Einflussgrößen des Implantaterfolges.
Der Implantaterfolg wird wesentlich von der Biokompatibilität und der chirurgischen Vorgehensweise, respektive der Art der Implantatverankerung bestimmt. Demgegenüber beeinflussen geometrische Konfiguration, mechanische Materialeigenschaften und physikochemische Oberflächeneffekte eines Implantats die Biokompatibilität.
Die Herstellung von Implantaten mit optimaler Oberflächenbeschaffenheit, welche die Zelldifferenzierung unterstützt, erfordert die Kenntnis der komplexen Wechselwirkungen zwischen Oberflächencharakteristika, adsorbierten Proteinen und periimplantärem Gewebe.Auf diesen Erkenntnissen fußend kann die Entwicklung neuerer Werkstoffe auf molekularer Ebene zu verfeinerten bzw. biokompatibleren medizinischen Werkstoffen führen Webb et al. (1998),Williams (1987),Wintermantel et al. (1999).
Die hier vorgelegte Studie befasst sich mit dem Problem der Weichgewebsintegration von Implantaten, speziell von Hautdurchleitungen (Abutments) extraoraler Titan-Implantate. Im Folgenden werden wesentliche Teilaspekte der Zellbiologie und die Wechselwirkungen zwischen Biosystem und Biomaterial dargestellt, aus welchen sich Problemstellung und Zielsetzung der Studie ergeben.
Oberflächliche oder äußerliche Gewebedefekte, insbesondere im Gesicht, werden durch individuell angefertigte Ersatzstücke aus körperfremdem Material (Abb.1a u 1b), sog. Epithesen (griechisch επιθεσισ, abgeleitet vom Verb επιτιθημι = auf etwas legen, um etwas abzudecken oder zu verschließen) gedeckt.
Epithesen dienen überwiegend ästhetischen Zwecken, können aber auch die Funktion eines defekten oder fehlenden Körperteils übernehmen. So kann eine Ohrepithese das Richtungshören verbessern oder eine Brille das Tragen eines Luftleitungshörgerätes ermöglichen Albrektsson (1985),Klein (1999),Tjellström et al. (1981). Klein entwickelte für Patienten mit einseitigem Augenverlust eine Orbita-Epithese, die einen zum gesunden Lid synchronen Lidschlag ermöglicht Klein et al. (1999b),Klein (2001). Hierdurch wird eine noch größere Nähe der Epithese zum natürlichen Erscheinungsbild erzielt.
Das Problem der Fixierung solcher Epithesen wurde früher durch Aufkleben (Cosmesil ®) oder durch Befestigung an einer Brille gelöst. Heute jedoch werden diese mittels Magneten oder Stegen an knocheninserierten Implantaten befestigt. Dies gewährleistet einen sicheren bzw. verrutschfesten Halt Parel et al. (1986),Parel und Tjellström (1991).
BRÅNEMARK, der den Begriff der Osseointegration prägte, wies eine grundsätzliche Überlegenheit der osseointegrierten gegenüber den weichgewebsverankerten Implantaten nach Brånemark und Albrektsson (1982).
Eine Epithese wird von einem Magneten oder einem Steg getragen. Diese sind ihrerseits über eine Distanzhülse mit der Implantatschraube verbunden (Abb. 2),
Während eine feste und reizfreie ossäre Integration des alloplastischen Implantates erreicht und unter funktioneller Beanspruchung aufrechterhalten werden kann Albrektsson et al. (1981),Brånemark et al. (1969),Brånemark et al. (1970), entsteht jedoch durch die Art dieser Epithesenverankerung im Körpergewebe eine neuerliche Problematik: die der ungenügenden Weichgewebeintegration des Implantats. Einerseits soll die Implantatschraube in erster Linie eine sichere Fixierung und Belastungsstabilität gewährleisten, andererseits wird auf Ebene der Haut eine zuverlässige Gewebe-Implantat-Versiegelung zur Vermeidung perkutaner Entzündungen angestrebt. Eine solche Implantatversiegelung konnte bisher nicht befriedigend erzielt werden. Zahlreiche Studien deuten jedoch darauf hin, dass die Implantatintegration in das umgebende Gewebe mittels Modifikationen der Werkstoffoberfläche verbessert werden kann.
In der klinischen und experimentellen Medizin werden Hautdurchleitungen zu therapeutischen und diagnostischen Zwecken eingesetzt. Als gemeinsames Charakteristikum penetrieren diese die Haut durch einen chirurgisch bzw. iatrogen geschaffenen Defekt. Die intakte Haut schützt den Organismus vor Keiminvasion. Durch das Einbringen perkutaner Implantate wird diese Schutzfunktion lokal durchbrochen. Das sekundäre Einwirken mechanischer Kräfte beeinträchtigt das periimplantäre Gewebe zusätzlich.
Nach Große-Siestrup ist „eine Hautdurchleitung (percutaneous device) ein künstlicher Körper aus einem Biomaterial, der iatrogen durch die äußere Haut in den menschlichen oder tierischen Körper geleitet wird“ Große-Siestrup (1998),Recum (1984),Recum und Park (1981). In diesem Sinne sind auch Zahnimplantate künstliche Hautdurchleitungen.
Anwendungsgebiete für Hautdurchleitungen sind Katheter zur Infusionstherapie und zur Kontrolle des Blutdruckes, Sonden zur Messung physiologischer Parameter, Kabel zur Überwachung elektrischer Signale, Drainagen zur Ableitung von Flüssigkeitsansammlungen und Sekreten, Fixierungsvorrichtungen zur externen Stabilisierung von Knochen, Tuben zur Mittelohr- und Nebenhöhlendrainage oder -belüftung, Kornea-implantate sowie Schrauben zur Verankerung von Epithesen.
Die Linie, an der keimhaltige Luft, durchtrennte Haut und Unterhaut sowie Implantat-oberfläche zusammentreffen, wird Dreiphasenlinie (Abb. 3) genannt Große-Siestrup (1998). Die dauerhafte Unterbrechung des Integuments an der Dreiphasenlinie verhindert einen zuverlässigen und beständig keimdichten Verschluss. Solange wie eine Integration der künstlichen Hautdurchleitung in das periimplantäre Gewebe nur ungenügend gelingt, besteht die Gefahr einer Infektion an dieser Stelle – Exit-site-Infektion (ESI) oder Austrittsstelleninfektion (ASI).
Mit der Schaffung einer dauerhaft perkutanen Situation wird nach Nühlen eine latente Entzündungssituation geschaffen, die eine Abheilung verhindert (Abb. 4). Infolgedessen kann nur ein Gleichgewichtszustand zwischen Heilung und Irritation erreicht werden Nühlen und Große-Siestrup (1992). Tatsächlich sind rezidivierende, periimplantäre Entzündungen ein typisches Problem extraoraler Titanimplantate, die zur Implantatabstoßung (Extrusion) führen können Holgers et al. (1992).
Große-Siestrup konnte anhand der histologischen Untersuchung einer natürlich vorkommenden Hautdurchleitung, dem Caninus vom Hirscheber (Babyrussa babyrussa), aufzeigen, dass trotz massiven Keimvorkommens in der Dreiphasenlinie eine entzündungsfreie Hautdurchleitung ohne gewebliche Irritation möglich ist. Die Verankerung in der bis unter die Haut reichenden Knochenscheide und die auf dem Vorderschädel perifokal des perkutanen Zahnes unverschiebliche Haut sind Charakteristika, die auch für das Design künstlicher Hautdurchleitungen genutzt werden können Große-Siestrup (1998). Es handelt sich hier um eine natürliche, permanente, vollständig infektionsfreie und reizlose Hautdurchleitung Knabe et al. (1995).
Während das gingivale Epithel die Fähigkeit besitzt, am Zahnschmelz bzw. an einem enoralen dentalen Titanimplantat zu inserieren, entsteht zwischen extraoralem Epithel und der glatt polierten Titanoberfläche der Distanzhülse keine dichte Versiegelung Gould et al. (1981),Holgers (1994). Allerdings gelang es Große-Siestrup einmalig im Tiermodell bei Titanimplantaten (Ti6AI4V), eine in der Literatur (außer von Jansen bei Hydroxylapatit-Implantaten Jansen et al. (1990a) noch nicht beschriebene Haftung der Epidermis ohne Tiefenwachstum und ein Anhaften des subepithelialen Bindegewebes an der Implantatoberfläche zu erzielen Große-Siestrup (1998).
Nach von Recum sind die wichtigsten Faktoren für einen Misserfolg von Hautdurchleitungen: 1. die ungenügende Biokompatibilität des Implantatmaterials, 2. die mechanische Irritation an der Grenzfläche zwischen Implantat und Gewebe und schließlich 3. die Besonderheiten der epidermalen Heilung Recum und Park (1981). Die physiologischen Vorgänge bei der Wundheilung führen insbesondere in der Epidermis zur Abstoßungsreaktion mit dem Ziel eines Verschlusses der Hautläsion.
Das Integument zeigt einen dreischichtigen Aufbau: 1. Epidermis, 2. Dermis oder Korium und 3. Subkutis oder Hypodermis. Ferner finden sich in der Haut eine Reihe von Anhangsgebilden wie Haare, Nägel, ekrine und apokrine Schweißdrüsen, Talgdrüsen, welche sämtlich epidermale Einstülpungen darstellen und bis in die Subkutis hineinreichen.
Die Epidermis besteht aus zwei unterschiedlichen Zelltypen, Keratinozyten und dendritischen Zellen (überwiegend Melanozyten). Die Keratinozyten sind in vier Schichten angeordnet, der Basalzellschicht, dem Stratum squamosum, dem Stratum granulosum und corneum. Zwischen Letzteren findet sich in einigen Körperregionen, z.B. palmar und plantar, eine zusätzliche Schicht: das Stratum lucidum.
Je vier flache Hornzellen bedecken eine Fläche, der im Basalzelllager einhundert schmale Zellen entsprechen Steigleder (1990). Die Basalzellschicht sitzt der Basallamina auf. Diese trennt die Epidermis von der Dermis und besteht aus Mukopolysacchariden und einem Netzwerk retikulärer Fasern. Über Hemidesmosomen
Während der Zelldifferenzierung erfährt die vertikale Architektur der Haut einen fortschreitenden Strukturwandel. Als Besonderheit imponiert hierbei der epidermale Säulenaufbau (epidermal proliferating unit). Durch die Überlappung der jeweiligen Schichten und Interzellularbrücken, den Desmosomen, stehen diese Säulen untereinander in Verbindung Montagna und Parakkal (1974),Rook (1986). Die Desmosomen zeigen an der Innenseite der Zellmembran Verdichtungen, in die Tonofibrillen, welche die Zellgrenzen nicht überschreiten, inserieren. Die Epidermiszellen wandern jedoch nicht von einer Säule zur nächsten (Abb. 5).
Diesen Säulenformationen kommt die Aufgabe einer zirkulären, keimdichten Versiegelung im Bereich der Hautdurchleitungen zu, indem sie sich rings um den Hautdurchtrittskörper rechtwinklig anlagern Große-Siestrup (1998).
Die Kommunikation zwischen den benachbarten Säulen und die Steuerung der Zellproliferation unterliegen Besonderheiten der Zelladhäsion, die durch spezifische und unspezifische Proteine der Extrazellulärmatrix vermittelt werden Jauregui (1987). So können Implantate nach Beschichtung mit Makromolekülen der Extrazellulärmatrix (Kollagen (Typ I, Typ II und Typ III), Albuminen und Globulin) in unterschiedlichem Ausmaß als Adhäsionspartner für Hautzellen betrachtet werden Hoeft (1989),Kossowsky et al. (1987). Eine solche Beschichtung mit natürlich vorkommenden Proteinen wird als Priming bezeichnet Thiele (1983).
Die Dermis besteht überwiegend aus kollagenem Bindegewebe, in welches mit Elastikafarbstoffen und Silber imprägnierbare Fasern (Vorstufen der elastischen und Kollagen-Fasern) eingelagert sind. Der ubiquitär vorkommende Fibroblast ist der Grundbaustein des Bindegewebes und imponiert als spindelförmige, an Bündeln
Obschon Epidermis und Dermis strukturell erhebliche Unterschiede aufweisen, sind beide Komponenten voneinander abhängig und funktionieren als ein einheitliches Gewebe. Es konnte gezeigt werden, dass isolierte Epidermiszellen, die in Abwesenheit der Dermis kultiviert werden, ihre Säulenformation und die Fähigkeit zur Zellteilung verlieren. Nach Zugabe von dermalem Gewebe gewannen jedoch die Epidermiszellen diese Fähigkeiten zurück Breitkreutz et al. (1989),Recum und Park (1981).
Bindegewebe (connective tissue) ist im Allgemeinen relativ gering differenziert, kann jedoch in spezialisierteren Formen in Erscheinung treten, wobei die eine oder andere Gewebekomponente abhängig vom lokalen strukturellen oder metabolischen Bedarf überwiegen kann. Sämtliche Bindegewebszellen entstammen dem embryonalen Mesenchym, einem Netzwerk primitiver Sternzellen, und besitzen die Fähigkeit zu verschiedenartiger Ausdifferenzierung in Abhängigkeit lokaler Bedingungen. Man nimmt an, dass eine geringe Zahl mesenchymaler Zellen vorzugsweise im Endothel kleinster Blutgefäße des adulten Bindegewebes persistiert. Dort können diese bedarfsweise in die oben angeführten Zellspezies ausdifferenzieren Bereiter-Hahn et al. (1984-86),Montagna (1971).
Bei Transplantationsexperimenten mit Cross-Rekombinanten konnte gezeigt werden, dass das zugrunde liegende Mesenchym sowohl instruktive als auch permissive Einflüsse auf die Morphogenese und Zelldifferenzierung des ausgereiften Epithels ausübt Cunha et al. (1983),Fusenig (1992),Mackenzie et al. (1989).
Wundheilung kann als Defektverschluss durch Ausbildung einer Narbe mit anschließender Epithelisierung verstanden werden. Bei einem Heilungsvorgang mit einem Fremdkörper wird der Raum zwischen Implantat und Gewebe mit Blut ausgefüllt und ein Geflecht aus Fibrin ausgebildet. Plasmaproteine adsorbieren an der Implantatoberfläche. Fibroblasten und Makrophagen werden aktiviert. Das sich um das Implantat entwickelnde Granulationsgewebe wird von Blutgefäßen durchwachsen. Trotz ungestörter Wundheilung verzögert sich dieser Prozess um zwei bis vier Wochen
Bei Organverletzungen werden die Fibroblasten des Stromas stimuliert, proliferieren und besiedeln den Gewebedefekt, wo sie schließlich reichlich Kollagen ablagern und eine fibröse Narbe ausbilden. Gemeinsam mit den Keratinozyten beteiligen sich die Fibroblasten an der Neusynthese der Basallamina. Während der natürlichen Wundheilung adhärieren die Keratinozyten mittels verschiedener Integrine ihrer Membranen an der Basalmembran.
Die während der Wundheilung aktiven Zellen unterliegen morphologischen Veränderungen und zeigen eine wachsende synthetische Aktivität. Es kommt zur Veränderung der Keratinozytenmorphologie, wobei die Desmosomen und Hemidesmosomen aufgelöst werden (Abb. 6). Auch die Tonofilamente werden retrahiert und in der Zellperipherie entstehen zytoplasmatische Aktinfilamente Lodish et al. (1996). Chemotaxis, Lokomotion Weiss (1964), Migration, Zellbewegung und Verdauung sind die zu beobachtenden Vorgänge. Diese Prozesse unterliegen sowohl einer Kontaktführung (contact guidance) seitens beteiligter Strukturen als auch spezifischen Zell-Matrix-Interaktionen.
aus: H.Lodish et al., Molekulare Zellbiologie, de Gruyter, 1994
Bereits wenige Stunden nach einer Hautläsion beginnt die Migration der Epidermiszellen vom Wundrand her über die Defektzone Winter (1962). Die Migration der Zellen wird wesentlich von der Zusammensetzung der Matrixproteine beeinflusst. Während Fibronektin, Kollagen I, IV und V die Zellmigration stimulieren O`Keefe et al. (1985), wird diese von Laminin gehemmt Woodley et al. (1988). Auch das unter den Zellen liegende Substrat beeinflusst den Integrin-vermittelten Funktionswechsel zwischen Bewegung und Haftung Guo et al. (1990).
Hinsichtlich perkutaner Vorrichtungen (Abutments) sind folgende Besonderheiten der Wundheilung von Bedeutung Recum und Park (1981):
Die Umwandlung von Granulationsgewebe in eine reißfeste und haftende Bindegewebsnarbe kann nur erfolgen, wenn eine dichte epidermale Zellschicht das Gewebe vor Austrocknung und Keimbesiedlung schützt.
Epidermiszellen stellen ihr horizontales Wachstum erst dann ein, wenn sie aufeinander treffen und Kontakt miteinander aufnehmen. Dieses Phänomen wird als Kontakthemmung (contact inhibition) bezeichnet Ross (1969). Infolgedessen werden Hautdurchleitungen von an ihnen herabwachsenden, nicht keratinisierten Epidermiszellen umgeben, wodurch ein sinusartiger Raum entsteht. Dieser auch Marsupialisation genannte Vorgang ist ein regelmäßig zu beobachtender Prozess bei Hautdurchleitungen Hall et al. (1975),Holgers et al. (1994),Winter (1974). Eine Ausnahme davon bilden die Zähne. Eine Hypothese besagt, dass hier die Epidermis durch dichte kollagene Brückenbildungen zwischen Zähnen und periodontaler Membran an einem Herabwachsen gehindert wird. Eine fibröse Einkapselung kann nur durch die Verwendung von bioinerten Werkstoffen minimiert werden Williams (1987).
Prozesse der Wundheilung und Zellreifung erzeugen Kräfte, die an der Grenzfläche Implantat-Umgebungsgewebe einwirken Hall et al. (1984) und klinisch zur Extrusion führen können Becker et al. (1983).
Im Falle der Unmöglichkeit, Fremdkörper zu verdauen, wie das bei Implantaten der Fall ist, kommt es zu einer chronischen Entzündung Nühlen und Große-Siestrup (1992).
Nach Williams sind „Biomaterialien... Werkstoffe, die in der Human-, Zahn-, und Veterinärmedizin oder pharmazeutisch angewandt werden und die in unmittelbaren Kontakt mit dem Körpergewebe gelangen und gewöhnlich (jedoch nicht ausschließlich) in dieses implantiert werden“ Williams (1987),Wokalek (1988).
Die Wechselwirkungen zwischen lebenden und nicht lebenden Systemen bieten die Grundlage für die Termini „Biomaterial, bioaktives Material und Gewebebindung“ Gross (1993). Biowerkstoffe lassen sich nach unterschiedlichen Kriterien klassifizieren.
Extrakorporale Vorrichtungen, bei denen es zum Kontakt von Werkstoff und Blutbestandteilen kommt.
Anwendungen, die eine nur vorübergehende Funktion erfüllen und daher kurzfristig im Körper verbleiben.
Materialien, die über eine längere Zeitspanne zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken inkorporiert werden.
Vorrichtungen, die permanent und vollständig in den Körper implantiert werden, wobei entweder erkranktes oder verletztes Gewebe oder die Funktion eines fehlenden oder dysplastischen Organes ersetzt und übernommen wird; hierzu zählen auch Materialien zur Korrektur von Deformitäten und zur Elektrostimulation von Muskel- und Nervengewebe.
Andere Einteilungen von Biomaterialien berücksichtigen ihre chemische Zusammensetzung Helmus und Hubbell (1993).
Die zur Verankerung extra- und intraoraler Implantate standardmäßig verwendeten, polierten Brånemark-Abutments (Distanzhülsen) bestehen aus Reintitan. Zur Materialoptimierung werden die Oberflächen mittels Kugelstrahlen verdichtet, wodurch die Oberflächendruckspannungen erhöht werden. Dies führt zu verbesserter Materialfestigkeit. Die Distanzhülsen sind diskret überdreht und zeigen daher eine Riefung (Ergebnis einer Materialstudie an der Technischen Universität Berlin).
Titan weist an seiner Oberfläche eine typische Abfolge von Oxidation und Hydrolyse auf. Infolge der niedrigen Bindungsenthalpie von TiO2 ist Titan stets von einem Oxidbelag bedeckt (Abb. 7). Bei Feuchtigkeitskontakt brechen diese Oberflächenbindungen auf und es entsteht eine Hydroxylionenoberfläche.
Als Folge des sehr unterschiedlichen Einsatzes anders- oder gleichartiger Werkstoffe zwischen den verschiedenen medizinischen Fachrichtungen wurde in der Vergangenheit der Terminus „Biomaterial“ uneinheitlich definiert. Die Europäische Gesellschaft für Biomaterialien legte 1991 auf der Zweiten Consensus Conference folgende Definition fest: „Ein Biomaterialist ein Material, das mit biologischen Systemen ein Interface (Kontaktfläche) bilden soll, um Gewebe, Organe oder Körperfunktionen zu bewerten, zu behandeln, zu verstärken oder zu ersetzen (a material intended to interface with biological systems to evaluate, treat, augment or replace any tissue, organ or function of the body)” Williams (1987),Williams (1992).
Bei dieser Definition steht allerdings die „Biofunktionalität“ im Vordergrund, wohingegen die Biokompatibilität eines Werkstoffes von vorrangiger Bedeutung ist. Der Begriff Biokompatibilität bezeichnet die Eigenschaft eines Implantates, bei seiner Anwendung eine angemessene Antwort des Empfängers hervorzurufen Remes und Williams (1992).
J. Black nahm 1991 auf der Zweiten Consensus Conference der Europäischen Gesellschaft für Biomaterialien eine Einteilung von Biomaterialien anhand der geschichtlichen Entwicklung bezüglich Bewertung und Anforderungen an derartige Werkstoffe vor Black (1992). Demnach bestand in der Anfangsphase die Forderung nach „inerten“ Materialien, welche nicht toxisch sind, für die Dauer ihres Einsatzes unverändert (inert) bleiben und keine Immunantwort im Wirtsorganismus hervorrufen. Angesichts der Tatsache, dass kein Biowerkstoff einer solchen Forderung gänzlich genügen kann, rückte der Begriff der „Biokompatibilität“ in den Blickpunkt des Interesses.
In letzter Zeit nun richtet sich das Augenmerk auf sog. „lebensfähige“ Biomaterialien (interaktive Biomaterialien), die aus vitalen und avitalen Komponenten bestehen. Die Implantat-Wirt-Beziehungen werden seither eingehender analysiert, wobei nach
Hinsichtlich der Anforderungen an ein Biomaterial werden eine Struktur- von einer Oberflächenverträglichkeit unterschieden. Die Strukturverträglichkeit beschreibt die Anpassung aller auf der Materialstruktur beruhenden Eigenschaften an das Biosystem bzw. die Übertragung von Kräften. Demgegenüber charakterisiert die Oberflächenkompatibilität eine Anpassung der Eigenschaften einer Implantatoberfläche an die nächstbenachbarten Zellen Schmidt (1999),Wintermantel et al. (1999). Die Oberfläche ist stets biologisch reaktiv und grundsätzlich anders als ihr Kern.
Das Design und die Auswahl eines speziellen Biomaterials wird in Abhängigkeit von der Betrachtungsweise, ob medizinisch oder naturwissenschaftlich, und im Hinblick auf seine Anwendung bestimmt: Während beispielsweise im Bereich der Haut Materialeigenschaften gefordert werden, die eine gute Anhaftung der Zellen ermöglichen, sollen sich dahingegen bei intravaskulären Kathetern keine Zellen anlagern Helmus und Hubbell (1993).
Die vielfältigen Wechselwirkungen zwischen Fremdmaterial und Biosystem unter Einbeziehung des Immunsystems werden folglich unter dem Begriff Biokompatibilität subsummiert Klinkmann und Falkenhagen (1989). Wiederholt wurde postuliert, dass dieselbe Immunantwort, mit der sich der Körper gegen fremde Organismen verteidigt, auch durch Biomaterialien hervorgerufen werden kann. Biomaterialien sind jedoch weder lebende noch nicht lebende Organismen, weshalb die Gewebeantwort auf Biomaterialien nicht eindeutig diesen natürlichen Abwehrmechanismen entsprechen muss. Jedoch können diese Abwehrmechanismen verschiedene Komponenten und Prozesse des Immunsystems in Gang setzen, die mit dem Implantat wechselwirken Remes und Williams (1992). Zellen und Mediatoren des Immunsystems können regelmäßig im Umgebungsgewebe von Implantaten nachgewiesen werden Holgers et al. (1992). Diese Agenzien haben wesentlichen Einfluss auf die Bioverträglichkeit und –funktionalität und damit auf die Lebensdauer von Implantaten.
Die Mikrotextur von Fremdkörperoberflächen beeinflusst entscheidend das Wachstums- und Adhäsionsverhalten von Zellen und folglich auch die Integration eines Implantates in das Umgebungsgewebe. Spezifische Oberflächencharakteristika, insbesondere solcher Werkstoffe, die keine oder eine nur geringe biologische Aktivität entfalten, bestimmen die Gewebeantwort Recum et al. (1996).
Harrison beschrieb im Jahre 1911 erstmals die Bedeutung der Oberflächentopographie, die zu einem Orientierungseffekt bei adhärenten Zellen führt Harrison (1911). Er kultivierte verschiedene Zellspezies auf Spinnweben und beobachtete, dass Bewegung, Form und Anordnung der Zellen von diesem Oberflächenmuster beeinflusst wurden. In weiteren Experimenten analysierte Weiss, der den Begriff der Kontaktführung („contact guidance“) einführte, die Zellreaktion auf einem fibrillären Exudat und konnte eine Ausrichtung der Zellen entlang der Fasern nachweisen. Er folgerte daraus, es müsse ein submikroskopisches Exudat für dieses Zellverhalten verantwortlich sein Weiss (1934),Weiss (1945). Erst 1976 konnten Dunn und Heath das Postulat eines submikroskopischen Exudats widerlegen Dunn und Heath (1976).
Fibroblasten und Epithelzellen sind in der Lage, sich an subzellulären Strukturen einer Werkstoffoberfläche auszurichten Curtis und Clark (1990). Auf gerillten Oberflächen, insbesondere auf Texturen im Mikrometerbereich, zeigen Fibroblasten das Phänomen der Kontaktführung Singhvi et al. (1994). Dies bedeutet, dass sich die Zellen in Richtung der Rillen orientieren und ausbreiten Walboomers et al. (1999). Eine erste Erklärung hierfür könnte der innige Kontakt zwischen Zelle und Substrat via fokale Adhäsionen sein Walboomers et al. (1998). Transmissions-elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass fokale Adhäsionen an den Kämmen der Rillen anzubinden und sich an diesen auszurichten vermochten. In diesen Studien fanden sich keine Unterschiede bezüglich des gemessenen Grades der Zellorientierung innerhalb verschiedener Rinnen. Allerdings lagen die auf 1 bis 2µm großen Rillen kultivierten Fibroblasten auf den Kämmen, während bei 5 bis 10µm durchmessenden Rillen die Zellen in die Rillen hinabzusteigen schienen. Walboomers et al. folgerten aus ihren Beobachtungen, dass das Zusammenbrechen von Zellformationen und die Anordnung fibröser, zellulärer Komponenten, insbesondere der Filopodien, wesentlich von den Mikrorillen beeinflusst werden.
Das Phänomen der Anpassung an die Oberflächentopographie ruft höchstwahrscheinlich die Ausrichtung der gesamten Zelle hervor und kann möglicherweise zur gezielten mikromechanischen Verankerung permuköser, intraoraler Implantate genutzt werden Meyle et al. (1994).
Als fokale Adhäsionspunkte werden harte, rechtwinklige Strukturen bis zu einer Größe von 10µm betrachtet Burridge et al. (1988). Falls die Rillen kleinere Ausmaße haben, sind die fokalen Adhäsionspunkte einzig in der Lage, sich auf den Kämmen ausgerichtet selbst zu berühren. Sobald die fokalen Adhäsionen ausgerichtet sind, können sich Aktinfilamente (Vinculin) und somit auch die gesamte Zelle daran orientieren Dunn und Brown (1986),Ohara und Buck (1979).
Chehroudi et al. stellten in Tests mit horizontal und vertikal gerillten Oberflächen eine epitheliale Wachstumshemmung auf den horizontal gerillten fest, während es auf den vertikal gerillten zu gesteigertem Wachstum der Epithelzellen kam. Bei diesen Untersuchungen überbrückten die Epithelzellen 22µm tiefe Rillen und schienen an ihrer Fortbewegung durch die an der Implantatoberfläche haftenden Fibroblasten gehindert zu werden. Im Gegensatz dazu wurde das epitheliale Wachstum an den flacheren, horizontalen Rillen durch Kontaktführung behindert, da hier keine orientierte Fibroblastenhaftung an der Implantatoberfläche erkennbar war Chehroudi et al. (1990). Allerdings unterliegt die Orientierungsreaktion der Zellen einer recht großen Zufallskomponente, insbesondere bei abgeflachten Furchen Clark et al. (1990).
Allerdings kommen verschiedene Analysen des Orientierungsgrades von Zellen an Oberflächen zu teilweise erheblich unterschiedlichen Ergebnissen. Clark et al. schlugen daher vor, Zellen einzig dann als orientiert zu betrachten, wenn die Längsachse der Zellen in einem Winkel von 0–10° zur Längsachse der Rillen verläuft Clark et al. (1990). Null Grad gelten im Allgemeinen als perfekte Zellausrichtung, wobei die mittlere Zellausrichtung zugrunde gelegt wird (Abb. 8). In den meisten Fällen ist die Zellorientierung derart offensichtlich und ausgeprägt, dass die Zellen einzig zwei Pseudopodien an ihren einander gegenüberliegenden Polen ausbilden Curtis und Wilkinson (1997).
Des Weiteren bedingen Oberflächenmerkmale den Grad der Benetzbarkeit (wettability) bzw. die Oberflächenspannung (dyn/cm (1dyn=10-5N)) einer Werkstoffoberfläche Baier und Meyer (1988). Ganz sicher besteht eine Korrelation zwischen kritischer Oberflächenspannung und der Fähigkeit einer Zelloberfläche, die Zelladhäsion zu unterstützen (Abb. 9). Beispielsweise werden keine Blutplättchen abgeschieden an Materialien, die dem Blut ausgesetzt sind, sobald die Oberflächenspannung auf Werte zwischen 20-30 dyn cm –1 abfällt;Zelladhäsion und -ausbreitung befinden sich dann auf einem Minimum Jauregui (1987).
Baier und Mitarbeiter untersuchten glatte Implantatoberflächen mit unterschiedlichen Oberflächenspannungen und konnten an Oberflächen mit hoher Energie einen dreifachen Anstieg von fibroblastisch-fibrozytischen Zellen an den zuvor peinlichst gereinigten Implantaten nachweisen. Diese Zellen zeigten eine abgeflachte Gestalt und produzierten zähe Bandstrukturen, die durch eine dünne, eiweißreiche voradsorbierte Membran verliefen. Im Gegensatz dazu waren die Implantate mit niedriger Oberflächenspannung, wie für dentale Implantate typisch, von einer zellarmen, nicht haftenden fibrösen Kapsel eingemauert Baier et al. (1984).
Die Arbeitsgruppe um DEN BRABER untersuchte silikonbeschichtete glatte und gerillte Oberflächen, die mit UV-Licht bestrahlt wurden. Hierdurch wurde die Oberflächenenergie und vermutlich auch die Proteinadsorption beeinträchtigt. Den Braber kam zu dem Schluss, dass physikochemische Parameter wie Oberflächenenergie und Oberflächenspannung (wettability) zwar das Zellwachstum beeinflussen, jedoch keinen messbaren Einfluss auf Zellform und -orientierung an mikrostrukturierten Oberflächen ausüben den Braber et al. (1995). Diese Ergebnisse deuten an, dass die Oberflächenchemie bei topographischen Zellphänomenen eine nur untergeordnete Rolle spielen Curtis und Wilkinson (1997). Entscheidende Einflussgrößen für die Zellorientierung sind vielmehr Tiefe und Breite der Rillenmuster Weiss (1945).
Die Frage, ob Zellen mehr auf chemische denn auf topographische Signale bzw. Reize reagieren, ist eine oft gestellte Frage. Britland und Kollegen konnten in Untersuchungen mit Laminin als chemischem Effektor an Oberflächen nachweisen, dass Zellen bei einer Rillentiefe von 500nm(10-9m) oder mehr überwiegend auf topographische Reize reagieren, wohingegen bei geringerer Rillentiefe der chemische den topographischen Aktivierungsreiz überlagert. Bei einer Rillentiefe von 5 pm(10-12m) machte der chemische Reiz auf die Zellen 80% und der topographische nur noch 7% aus Britland et al. (1992),Britland et al. (1992).
Curtis und Mitarbeiter erfanden eine Art Falztechnik, mit der sie äußerst kleine Areale chemisch unterschiedlich behandelter Substanzen auf einer Zelle untersuchen konnten. Obschon die chemischen Reize die Zellen zu vermehrter Neuritenbildung anregten,
Das Zytoskelett ist nicht statisch, sondern zeigt eine dynamische Struktur Banes et al. (1995). Äußere Kräfte werden über die fokalen Adhäsionspunkte an das Zytoskelett weitergeleitet. Die Zellen streben hierbei einen Zustand an, in welchem sich innere und äußere Kräfte in einem für die Zelldifferenzierung günstigen Gleichgewicht befinden Ingber (1993),Ingber (1994). Auf mikrogerillten Substanzen kultivierte Zellen können Kraftmustern ausgesetzt werden, in welchen das Gleichgewicht einwirkender Kräfte ausgerichtete bzw. orientierte Zellformen induziert.
Die Integrität der Gewebe, die Platzierung der einzelnen Zellen an der richtigen Position während der Embryogenese und die bakterielle Besiedlung werden wesentlich von Adhäsionsphänomenen bestimmt Grinnel (1978). Die Charakterisierung von Rezeptoren für die Adhäsion der Zelloberflächen ist ein wichtiges Hilfsmittel, um unterschiedliche Bedingungen, welche die Zelladhäsion beeinflussen, zu untersuchen. Serum oder Gewebeproteine unterstützen nicht bloß passiv den Adhäsionsprozess, vielmehr besitzen sie Areale, mit denen sie nach Art einer AntigenAntikörper oder Enzym-Substrat-Bindung an spezifischen Oberflächenrezeptoren der Zellen andocken können.
Integrine (Abb. 10) sind heterodimere Zelloberflächenrezeptoren, die eine Verbindung zu Bestandteilen der extrazellulären Matrix herstellen können Ruoslahti (1991) und als Signalvermittler bei Migrationsprozessen agieren Scharffetter-Kochanek et al. (1992).
Daneben kann auch eine passive Zelladhäsion in austrocknenden Wundflächen auftreten. Diese ist zum Teil das Ergebnis einer Proteinkonzentrierung z.B. an der Grenzfläche Verband/ Wunde, wo eine Art visköser Leim, der die Anhaftung verursacht, entsteht Scales und Winter (1961).
Haftungen zwischen Zellen treten immer dann auf, wenn ein Zellkontakt hergestellt ist und zwei einander gegenüberliegende Zellareale dicht genug beieinander liegen. Dicht genug meint hierbei die einwirkenden Adhäsionskräfte. Es wird angenommen, dass bei Adhäsionsprozessen ein Gleichgewicht zwischen elektrostatischen Kräften, welche geladene Teilchen getrennt halten, und entgegenwirkenden van-der-Waal-Kräften besteht Weiss (1970). Die Adhäsionsarbeit ist die Differenz der je Flächeneinheit gewonnenen zur aufgewandten freien Energie. Sind die beiden in Kontakt gebrachten Körper miteinander identisch, dann entsteht keine neue Grenzfläche, und die hierbei gewonnene Energie wird als Kohäsionsarbeit bezeichnet.
Es werden überwiegend drei Formen der Bioadhäsion beobachtet Manly (1970):
Zell-zu-Zell-Adhäsion, eine Voraussetzung für die Gewebeorganisation,
Adhäsion zwischen vitalen Geweben und avitalen Komponenten eines Organismus,
Adhäsion zwischen Geweben und Fremdkörperoberflächen.
Das Ergebnis einer bakteriellen Oberflächenbesiedlung von Fremdkörpern ist die Bildung eines haftenden Films (Biofilm) An und Friedman (1998). Dieser konstituiert sich aus einer organischen Matrix, in welche die Bakterien eingebettet sind. Diese Calyx besteht aus einem Polysaccharid-Exopolymer, der von den Bakterien gebildet wird, wenngleich auch vom Wirtsgewebe produzierte Substanzen in der Umgebung der Organismen vorhanden sein können Tsiboulakis et al. (1999).
Organismen können Implantate besiedeln, wenn ihre Exopolymere mit den Oberflächen kompatibel sind. Gewöhnlich werden Adhäsionsvorgänge durch die vorher ablaufende Oberflächenadsorption organischer Substanzen gefördert. Ein Werkstoff ist in wässrigen Lösungen bereits nach wenigen Minuten von einer Proteinschicht, die als „Haftvermittler“ für die Zellen dienen können, überzogen Schmidt (1999). Bakterien sind jedoch auch in der Lage, ihre Anhaftungsstrategien an die spezifischen Besonderheiten einer Oberfläche anzupassen. Sobald eine bakterielle Besiedlung stattgefunden hat, sind weitere Bildung und Wachstum des bakteriellen Biofilms vom Material unabhängig. Dieser Biofilm schützt die Bakterien zusätzlich vor antimikrobiellen Substanzen. Die mikrobielle Anhaftung ist die Voraussetzung für eine Implantatentzündung.
Eine Möglichkeit, die frühe Bildung eines solchen Biofilms zu verhindern, ist die Behandlung von Oberflächen mit der sog. „R adio- f requency- g low- d ischarge–“ (RFGD)–Methode Baier und Meyer (1988),Baier et al. (1984),Weiss (1964). Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es nicht nur möglich, Implantatoberflächen zu sterilisieren und zu reinigen, sondern auch ihre Oberflächenenergie zu erhöhen, was zu verbesserter Adhäsivität der Werkstoffoberflächen führt.
Binon et al. stellten an dentalen Titanimplantaten, die mit dem RFGD-Verfahren vorbehandelt wurden, die dünnste Oxidschicht und die sauberste Oberfläche fest Binon et al. (1992). Baier et al. wiesen bei anorganischen Oberflächen, die mit der RFGD-Technik vorbehandelt wurden, eine verstärkte Fibroblastenadhäsion nach (Baier, Meyer et al. 1984). Ebenso konnten WAlboomers et al. in einer Studie des Adhäsionsverhaltens von Fibroblasten auf standardisierten Texturen mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften aufzeigen, dass es auf allen Werkstoffen, die mit dem RFGD-Verfahren vorbehandelt waren, zu einem exponentiellen Zellwachstum kam. Auf den nicht vorbehandelten Materialien kam es hingegen zu einer verzögerten Proliferation Walboomers et al. (1999).
Der Plasmazustand eines Gases wird als vierter Aggregatzustand bezeichnet Niedrig (1992). Er unterscheidet sich durch das Auftreten frei beweglicher Ladungsträger von den anderen drei Aggregatzuständen. Plasmen sind hochionisierte Gase, die sich als Gemisch von Neutralgas, Elektronengas, Ionengas, Gas angeregter Atome und Lichtquantengas aufteilen lassen. Das RFGD (Radio Frequency Glow Discharge) ist ein kaltes Plasma, das bei Zimmertemperatur und Unterdruck erzeugt werden kann. Typische Gastemperaturen liegen zwischen 25 und 60 Grad Celsius und einem Druck von 0,03 und 0,14 Pa Ratner et al. (1996). Durch den hochfrequenten Energieeintrag entsteht eine Elektronenlawine, die das verwendete Gas in den Plasmazustand überführt.
Es ist möglich, unterschiedliche Gase einzusetzen. Beim Plasmaätzen mit Argon, Neon, Stickstoff, Luft und Wasserdampf können folgende Reaktionen an der Materialoberfläche auftreten: 1.) Befreiung der Materialoberfläche von Verunreinigungen, 2.) Entfernung von Atomen und Molekülen an der Oberfläche, 3.) Entstehung von Quervernetzungen, 4.) Aufrauhung der Oberfläche, 5.) Bildung oder Oxidation reaktiver Gruppen und 6.) Erzeugung freier Radikale oder Peroxide an der Oberfläche.
Die Zelladhäsion ist ein dynamischer Vorgang. Während des Adhäsionsvorganges vollzieht sich ein dramatischer, licht- und elektronenmikroskopisch nachweisbarer Wandel von einer runden bis zu einer flach ausgebreiteten Zellform (Abb. 11). Der Vorgang der Zellanhaftung vollzieht sich hierbei in mehreren, im Einzelnen und biochemisch unterscheidbaren Schritten, Multistep Paradigm genannt Grinnel (1978):
Adsorption: Während die Zellhaftung an eiweißfreienSubstraten ein unspezifischer und von der metabolischen Aktivität und dem Entwicklungszustand der Zellen unabhängiger Prozess ist, wird die Adhäsion an proteinbeschichteten Substraten von der Zellphysiologie bestimmt und beschränkt sich auf eine begrenzte Gruppe adsorbierter Proteine.
Contact: Zellkontakt mit dem Substrat; da Zellen bei einem physiologischen pH–Wert negativ geladene Oberflächen haben und die Oberflächen der meisten Substrate ebenfalls negativ geladen sind, besteht zwischen beiden eine elektrostatische Barriere, die von zytoplasmatischen Mikroausstülpungen (Filopodien) überwunden bzw. durchbrochen werden muss, um eine Adhäsion zu ermöglichen. Durch die Ausbildung von Filopodien beginnt die Zelle abzuflachen.
Attachment: Ausbildung fokaler Adhäsionen, welche an proteinbeschichteten Substraten von Ligand-Rezeptor-artigen Interaktionen gesteuert wird.
Spreading: Zellausbreitung, welche nach Anhaftung der Filopodien am Substrat als zunehmende Abflachung der Zelle imponiert, mit dem Resultat einer ansteigenden Festigkeit der Zellanhaftung. Hierbei ist die aktive Spreitung, gekennzeichnet durch Ausbildung von Filopodien, von der passiven zu unterscheiden, bei der sich die Zellen ausgehend von ihrer Kontaktstelle auf dem Substrat kontinuierlich abflachen und ausbreiten Grinnel et al. (1977).
Es existieren verschiedene prophylaktische Ansätze bei der Therapie und Werkstoffherstellung, welche die Häufigkeit periimplantärer Entzündungen reduzieren helfen:
Mittels einer entsprechenden Operationstechnik wird periimplantär ein subkutan ausgedünntes, immobiles und direkt dem Periost aufliegendes Hautareal angestrebt Klein et al. (1998). Gute Funktionszeiten werden beschrieben, wenn die Haut nur gering gegen die knöcherne Unterlage verschieblich ist Albrektsson et al. (1983),Albrektsson et al. (1981). Hierdurch werden mechanische Irritationen und Relativbewegungen zwischen der Haut und subkutanen Strukturen, die ein Abreißen der an der Implantatoberfläche haftenden Haut verursachen, vermieden. Als Stressreduktionszone wird der Konstruktionsteil eines hautdurchgeleiteten Implantates bezeichnet, der über eine innige Verbindung zum subepithelialen Bindegewebe die Beweglichkeit des periimplantären Hautbezirks minimiert.
Überdies wird der Patient zur optimalen periimplantären Hygiene angehalten Menneking et al. (1998). Die nicht vorhandene Haftung der Haut an den vom Hersteller gelieferten Titan-Abutments mit glatter Oberfläche ist allerdings klinisch nicht beeinflussbar.
Unterschiedliche physikochemische und geometrische Eigenheiten von Materialoberflächen können dazu genutzt werden, die begleitende Gewebereaktion zu beeinflussen. Es wird angestrebt, Biomaterialien herzustellen, die eine spezifische Gewebeantwort hervorrufen und dadurch zu einem einheitlichen Heilungsprozess führen Williams (1987).
Das „ideale“ Biomaterial bewirkt einerseits die minimalste Zellanregung und infolgedessen die geringste Ausbildung einer Fibrinkapsel. Das bedeutet andererseits, dass das Implantat vom Umgebungsgewebe ignoriert wird. Im Idealfall wird jedoch eine Wechselwirkung zwischen den Zellen und dem Werkstoff angestrebt, wobei das Epithel aktiv einwächst Schmidt (1999).
Neben den Materialeigenschaften (physikalische und chemische Merkmale, Oberflächentopographie) sind bei der Testung von Werkstoffen für Hautdurchleitungen die lokalen Reaktionen im Umfeld eines Implantates bedeutsam. Von oberflächenmodifizierten Werkstoffen verspricht man sich eine verbesserte Implantatintegration und folglich eine bakteriendichtere Versiegelung. Hierbei ist insbesondere das spezifische Haftungsverhalten einzelner Zellspezies (Keratinozyten/ Fibroblasten) an den unterschiedlichen Oberflächentexturen zu berücksichtigen. Die dabei ablaufenden Prozesse sind komplexer Natur und sollen, um ein weitgehend von Störgrößen freies und standardisiertes Modell zu ermöglichen, einzeln analysiert werden Sauberlich et al. (1999). Die Untersuchung eines Teilsystems wie beispielsweise kultivierter und/ oder perfundierter Haut oder der Einsatz von Zellkulturmodellen ist grundsätzlich möglich. Überdies wird angestrebt, die Anzahl erforderlicher Tierversuche durch die Anwendung von Zellkulturmethoden zu begrenzen.
Wurde in einer vorangegangenen Studie das Adhäsionsverhalten von Keratinozyten an verschiedenartig oberflächenmodifizierten Titan-Hülsenimplantaten untersucht Klein et al. (2000), so soll nun die Fibroblastenadhäsion und –proliferation an gleichartigen Titantexturen mit Hilfe eines eigens zu diesem Zweck entwickelten Zellkulturmodells analysiert werden. Demnach konzentriert die Studie ihre Analyse auf die Gewebe-Implantat-Schnittstelle auf Ebene der Dermis.
Während der Keratinozyt als Grundbaustein der Epidermis fungiert, ist der Fibroblast das vorherrschende Zellelement im darunterliegenden Bindegewebe. Beiden kommt die Aufgabe zu, die Kutis an der Grenzfläche Implantat-Umgebungsgewebe auf unterschiedlichem Niveau zu versiegeln.
Es existiert die Hypothese, dass sich das Tiefenwachstum des Epithels infolge ausbleibender Kontaktinhibition der Keratinozyten durch reife, kollagene Bindegewebsfasern verhindert lässt Brunette und Chehroudi (1999),Chehroudi et al. (1990),Chehroudi et al. (1991),Chehroudi et al. (1989),Winter (1974). Das Herabwachsen des Epithels an den Distanzhülsen könnte demzufolge durch eine verbesserte bzw. vermehrte subepitheliale Fibroblastenhaftung verhindert werden.
Weiterhin soll der Frage nachgegangen werden, ob von einer qualitativen Beurteilung des Zellbewuchses auf den diversen Oberflächen Rückschlüsse auf den zu
Materialeigenschaften wie Benetzbarkeit und Elastizität können ebenso wie Oberflächentopographie (Art der Textur, Größe und Gestalt) das Zellverhalten beeinflussen. Daher werden die polierten Titan-Werkstoffe verschiedenartig chemisch und physikalisch oberflächenmodifiziert. Denn das Design eines idealen Implantats erfordert für jede Zellpopulation, mit welcher der Werkstoff in Berührung kommt, eine spezifische Oberflächentextur bzw. -topographie Chehroudi et al. (1990).
Die Auswahl von Biomaterialien erfordert jedoch den Kompromiss zwischen der für die Integration des Implantats in den Körper erwünschten Zell- und Gewebeadhäsion einerseits und der unerwünschten Adhäsion von Keimen auf der Implantatoberfläche andererseits.
Es existieren diverse Möglichkeiten der Oberflächenmodifikation, wie beispielsweise Schaffung definierter Rauhigkeiten, Belegung mit Sauerstoff, Oberflächenhydrolyse, Funktionalisierung von Ankergruppen (Amino-, Carboxylgruppen etc.), Funktionalisierung mit Peptiden, Beschichtung mit amorphem und kristallinem Hydroxylapatid, Aufrauhung oder Immobilisierung von Kollagen oder Veränderung der Oberflächenenergie. In Anlehnung an vorangegangene Untersuchungen und zwecks Vergleichs der Ergebnisse werden neben polierten Titanoberflächen vier bekannte und bereits erprobte Oberflächenmodifikationen (sandgestrahlte, glaskugelgestrahlte, Kollagen A-beschichtete und silikonbeschichtete) verwendet. Ergänzend wird das oben beschriebene R adio- f requency-glow- d ischarge-Verfahren bei der Hälfte aller oberflächenveränderten Werkstoffe angewandt, um so Vergleichswerte zu erhalten, die aufzeigen, ob und bei welchen Oberflächentexturen das RFGD-Verfahren zu einer verbesserten bzw. verminderten Fibroblastenadhäsion und –proliferation führt. Die gewonnenen Resultate sollen abschließend den Ergebnissen anderer Studien und der Pilotstudie von KLEIN und HOHLFELD, welche die Keratinozytenadhäsion und –proliferation an extraoralen Hülsenimplantaten untersuchten, gegenübergestellt und im Kontext mit der Fachliteratur diskutiert werden.
Während der Vorversuche wurde nach einem Modell gesucht, mit dem die Fibroblastenadhäsion und –proliferation an verschiedenartig modifizierten Titanoberflächen untersucht werden kann. Mittels Zählung der von den Implantaten abgelösten Fibroblasten kann auf das Adhäsions- und Proliferationsverhalten an den unterschiedlichen Werkstoffoberflächen rückgeschlossen werden. Daneben dienten die Vorversuche dem Erlernen der Zellkultivierung und dem Zweck, eine geeignete Zellzahl und Kultivierungsdauer zu ermitteln, unter der es zu optimalen Wachstums- und Adhäsionsbedingungen für die Fibroblasten in den Wells der 96er Mikrotiterplatten kommt. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass Zellen metabolisch aktiv sind und fortwährend Stoffe und Mikroexudate in das Zellmedium und auf die Substratoberfläche sezernieren. Daher kann die Dauer eines Zellkulturversuchs infolge der Akkumulation synthetisierter Substanzen die intrinsische Zelladhäsion beeinflussen Grinnel (1978).
Es wurden Mengen von 0.5, 0.7, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 und 5.0 x 104 Zellen/ ml verwendet. Die Kontrollen erfolgten jeweils nach 1, 2, 3 und 4 Tagen Kultivierungsdauer per Lichtmikroskopie und anschließender Zellzählung in der Neubauer-Zählkammer. Das Nährmedium wurde einmal täglich gewechselt. Lichtmikroskopisch wurden insbesondere die Zellrasen neben den Titanplättchen bzw. auf den werkstofffreien Bodenflächen der Kontrollwells hinsichtlich Vitalität respektive Avitalität sowie Zelldichte und –verteilung beurteilt. Der Zellbewuchs ist allerdings auf den Titanplättchen mit Hilfe der Lichtmikroskopie nicht beurteilbar.
Kam es nach einer dreitägigen Kultivierung mit 2 x 104 Zellen/ ml zum Phänomen der Überkonfluenz, d.h. zu einem Überwachsen der Zellen mit konsekutivem Nährstoffverbrauch, erkennbar an der Abnahme der ermittelten Zellmenge, war dahingegen nach einer nur zweitägigen Kultivierung mit gleicher Zellmenge ein lichtmikroskopisch gesunder, monolayerartiger Zellrasen erkennbar. Andererseits fanden sich bei Zellmengen von 0.5 x 104 Zellen/ ml nur spärlich ausgebildete Zellrasen. Es war erforderlich, eine Zellkonzentration zu ermitteln, bei der das Ausmaß von Adhäsion und Proliferation an den unterschiedlich modifizierten Werkstoffoberflächen nach einem bzw. drei Tagen zweifelsfrei differenzier- und messbar ist und bei der das Phänomen der Überkonfluenz vermieden werden kann.
Die Ergebnisse waren teilweise widersprüchlich und die Ursache hierfür nicht immer ersichtlich. Da mit zunehmender Dauer der Vorversuche einheitlichere Ergebnisse erzielt wurden, muss auch mangelnde Routine und Erfahrung im Umgang mit der Zellkultivierung als Grund hierfür angenommen werden. Mit einer Zellmenge von 1 x 104/ ml für einen und drei Kultivierungstage konnten schließlich stabile und reproduzierbare Ergebnisse für sämtliche Oberflächenmodifikationen erzielt werden. Aufgrund der starken Proliferation der Fibroblasten ist eine Kultivierung mit einer Zelldichte von 4 x 104 Zellen/ ml (∅ 6,5mm) bei einer Kultivierungsdauer von drei Tagen entsprechend den in der Vorläuferstudie untersuchten Keratinozyten nicht sinnvoll Klein et al. (2000).
Überdies dienten die Vorversuche dem Ziel, eine geeignete Methode zur Auszählung bzw. Mengenbestimmung adhärierender Fibroblasten zu finden. Bei der lichtmikroskopischen Zellzählung in der Neubauer-Zählkammer konnten anfangs nur äußerst niedrige Zellzahlen ermittelt werden. Zudem waren die Zählergebnisse sehr uneinheitlich und widersprüchlich. Eine Erklärung hierfür lag in einer zu kurzen Trypsinierungsdauer der Abutments und daraus resultierend mangelhafter Zellablösung. Des Weiteren ließen sich zu Beginn keine signifikanten Unterschiede bezüglich der ermittelten Zellzahlen an den unterschiedlich oberflächenmodifizierten Abutments feststellen. Dies veranlasste, zunächst nach einer alternativen Methode zu suchen, die reproduzierbare Ergebnisse liefert und weitgehend frei von Einflüssen seitens des Untersuchers bzw. fehlerhafter Technik ist.
Um eine Zellzahlbestimmung via Neubauer-Zählkammer zu umgehen, wurde eine Methode zur indirekten Bestimmung der von den Werkstoffen abgelösten Zellmengen gewählt. Zunächst erfolgte nach vorangegangener Lysierung der Fibroblasten die Proteinbestimmung. Die hierbei ermittelten Ergebnisse waren schon deutlich verwertbarer, jedoch war übersehen worden, dass ein Viertel aller Zellträger mit Kollagen beschichtet war.
Da Kollagen ein Eiweiß (aus der Gruppe der fibrillären Proteine) ist, verfälscht es die Ergebnisse zu höheren Werten. Daher wurde nach Ablösen und Lysieren der
Wacker et al. beschrieben 1956 diese hier angewandte Methode zur LDH-Bestimmung mittels Laktat als Substrat und NAD als Koenzym Wacker (1956). Die Laktatdehydrogenase ist eine NAD+ Oxidoreduktase und katalysiert die Oxidation von Laktat zu Pyruvat unter Verwendung von NAD+ als H+ Akzeptor
Um fehlerhafte Ergebnisse auszuschließen, ist es erforderlich, die Enzymaktivität im linearen Bereich, also bei konstanter Enzymaktivität, zu messen. Die Linearität der Enzymaktivität ist ablesbar an der gleichbleibenden Differenz der über eine Dauer von fünf Minuten fünfmalig gemessenen Optischen Dichte, d.h. die gemessene Optische Dichte als Maß für die LDH-Aktivität nimmt pro Minute um einen konstanten Betrag ab. Mit zunehmendem Nachlassen der Enzymaktivität flacht die Aktivitätskurve ab.
Im Falle eines zu großen zeitlichen Abstands der LDH-Bestimmung zur Zugabe des Koenzyms NAD+ in die Suspension kommt es zu einem vorzeitigen LDH-Verbrauch mit folglich ausbleibenden Messwerten. Daher musste die Zugabe des Koenzyms unmittelbar vor Beginn der Messung erfolgen.
Während der Vorversuche wurden anfangs die Konzentrationen adhärenter Fibroblasten von je vier Abutmenthälften bzw. Plättchen in einem Eppendorf-Röhrchen bestimmt.
Hierbei ergab sich ein lineares Verhältnis von Zellzahl zu LDH-Konzentration. Im Koordinatensystem lies sich daher die entsprechende Anzahl adhärenter Zellen unmittelbar ablesen (Abb. 12).
Da die wegen der Vielzahl an Proben extrem aufwendige Messung die Kapazität des Routine-Labors gesprengt hätte, musste auf ein Mikrotiter-System der Firma Dynatech (DYNATECH MR5000, Dynatech Laboratory Products, Microtiter® MIC-2000® MICROELISA®) zurückgegriffen werden. Hierbei wurden die Zellen einer Versuchsreihe von den einzelnen Trägern abgelöst und die gewonnenen Zellsuspensionen in eine frische 96er-Mikrotiterplatte, in der anschließend die Photoextinktionsmessung erfolgte, umgesetzt. Um direkt auf die Zellzahlen rückschließen zu können, wurde die Optische Dichte zusätzlich in 2 mal 7 Standards mit definierten Zellkonzentrationen (n = 1250, 2500, 5000, 10000, 20000, 40000 und 60000 Zellen/ ml) gemessen.
Es ergab sich jedoch ein neuerliches Problem: lichtmikroskopisch war regelmäßig Zelldetritus in den Wells nachweisbar. Dieser führte bei der Extinktionsmessung infolge uneinheitlicher Lichtabsorption (Wellenlände 340 nm) zu fehlerhaften Werten. Ein vollständiges Abzentrifugieren des Zelldetritus in den hier verwandten Mikrotiterplatten war im Gegensatz zu den Eppendorf-Röhrchen wegen Ermangelung einer ausreichend hochtourigen Zentrifuge (für 96er Mikrotiterplatten) nicht möglich. Da sich der Zelldetritus in den Mikrotiterplatten nicht komplett abzentrifugieren ließ und die LDH–
Zur Kontrolle der vollständigen Ablösung aller an den Werkstoffen haftenden Fibroblasten wurden die Träger nach erfolgter Zellablösung nochmals dem gleichen o.a. Ablösungsverfahren unterzogen und anschließend die LDH-Messung wiederholt. Bei ausbleibender Aktivität der Laktatdehydrogenase galt die komplette Zellablösung als bewiesen. Überdies konnten hierdurch das Ablöseverfahren getestet und die erforderliche Menge an Detergenz, die Ultraschalldauer sowie die benötigte Trypsinmenge und Trypsinierungsdauer ermittelt werden.
Um eine sichere Fixierung der Abutments (Hülsenimplantate) auf der Bodenfläche der Wells zu gewährleisten, wurden diese zunächst in einer eigens hierfür angefertigten Apparatur mittels diamantierter Trennscheibe halbiert. Aufgrund der beim Durchtrennungsvorgang entstehenden Hitzeentwicklung kam es hierbei jedoch zu lokalen Schmelzvorgängen an den Kanten der Implantathälften, weshalb eine vollkommen gleichmäßige Halbierung nicht zu erzielen war.
Zudem können die von der Nährstoffoberfläche herabsinternden Fibroblasten, noch ehe der Adhäsionsprozess stattfindet, von den konvexen Abutmentoberflächen abgleiten (Abb. 13). Dies ist umso wahrscheinlicher, als die Zellaktivität durch die vorangegangene Trypsinierung deutlich herabgesetzt ist Grinnel (1978). Darüber hinaus unterliegen Zellen zeitabhängigen Reparationsprozessen z.B. nach Trypsinbehandlung, was wiederum die Zellhaftung beeinträchtigt.
Es werden insgesamt 200 Titanplättchen eingesetzt. Die vorgenommenen Modifikationen der Oberflächen sind in Tab. 2 aufgelistet.
Die sand- und kugelgestrahlten Werkstoffoberflächen werden nach Herstellung, um verfahrensbedingte Rückstände an den Oberflächen nachzuweisen, dem sog. EDAX-Verfahren unterzogen (Abb. 14). Da sich hierbei regelmäßig Silikate nachweisen lassen (auf den sandgestrahlten Plättchen höhere Konzentrationen als auf den glaskugelgestrahlten), müssen diese Rückstände ausgewaschen werden.
Vor Verwendung und Beschichtung werden die Werkstoffe zunächst mit einer feinen, weichen Dentalbürste und in einem 15 minütigem Ultraschallbad Cheung und Luk (2000) gereinigt. Im Anschluss folgt die Sterilisierung.
Die Silikonbeschichtung (lufttrocknendes Silikon, Rehau 1511/THF (Tetrahydrophan) 1:4) erfolgt nach vorherigem Auftragen eines Primers (Wacker Grundierung G790). Die Beschichtung mit Kollagen A geschieht, indem die Plättchen über 2 Stunden bei 37°C in 100µl einer Lösung mit 50µg Kollagen A inkubiert werden. Diese Vorgehensweise orientiert sich an früheren Untersuchungen von 0`Keefe und Woodley O`Keefe et al. (1985),Woodley et al. (1988). Die mit Silikon zu beschichtenden Titanplättchen werden erst nach Beschichtung sterilisiert.
Die polierten, nicht oberflächenmodifizierten Plättchen, deren Oberflächen denen der konventionellen polierten Abutments entsprechen, dienen als Kontrollgruppen. Um herauszufinden, für welche Oberflächenart das RFGD-Verfahren von Vorteil ist, wird die Hälfte aller oberflächenmodifizierten Titanplättchen zusätzlich dem Radio- frequency-glow- discharge- Treatment (RFGDT) unterzogen (Abb. 15). Hierdurch entsteht für jede Oberflächenart eine weitere Modifikation.
Die Ermittlung der Zellzahl entsprechend einer Konzentration von 1 x 104 Zellen und die Berechnung der hierzu erforderlichen Menge an Zellmedium erfolgt nach Passagieren der Fibroblastenkulturen (primäre Zellkultur von humanen Hautfibroblasten).
Die Mikrotiterplatten werden nun entsprechend der Inkubationsplanung für die Dauer von 12 und 72 Stunden bei 37°C und 5,0% CO2-Atmosphäre bebrütet (Inkubationsschrank Fa. Heraeus, Hanau, BRD). Während der Versuchsphase werden die Zellrasen in den Wells seitlich der Plättchen auf den werkstofffreien Bodenflächen und in den leeren Kontrollwells einmal täglich lichtmikroskopisch auf Vitalität und Dichte überprüft.
Nach 12 bzw. 72 Stunden werden die Titanplättchen aus den Wells entnommen und in freie Wells der 96er Mikrotiterplatte umgesetzt (Abb. 16). Dort erfolgt nun die Trypsinierung, indem die Wells mit je 50µl Trypsin ((1:250) 2,5% (w/v)) aufgefüllt werden. Die Neutralisierung des Trypsins geschieht durch weiteres Auffüllen der Wells mit 100 µl Nährstofflösung.
Jedes der vier auszuzählenden Quadrate hat eine Fläche von 1mm2 und eine Tiefe von 0,1mm entsprechend einem Volumen von 0,1µl. Um die Zellkonzentration pro Milliliter zu erhalten, wird der Mittelwert aus den 4 Quadraten mit 104 multipliziert. Jede der Zählungen erfolgt wenigstens zweimal. Avitale Zellen werden mitgezählt.
Die Zelldichte pro Flächeneinheit errechnet sich, indem die Zellzahl des über der Fläche abgemessenen Volumens durch die Größe der Fläche geteilt wird:
Einmalig zu Beginn der Versuchsreihen werden die Titanplättchen nach einem Kultivierungsdurchgang von einem bzw. drei Tagen einer Kontrolle auf komplette Zellablösung (siehe Kap. 3.1, S. 30) unterzogen, um so die komplette Zellablösung zu gewährleisten.
Zwecks elektronenmikroskopischer Untersuchung werden parallel zu jedem Versuchsdurchgang je zwei Titanplättchen pro Oberflächenart in gleicher Weise mit Fibroblasten beschickt und bebrütet. Nach 12 bzw. 72 Stunden werden die auf den Titanplättchen gezüchteten Zellkulturen dreimal mit PBS gewaschen und für mindestens 6 Stunden mit Glutaraldehyd 2% in Sörensens Phosphatpuffer (0,06 M, pH 7,2) fixiert. Anschließend erfolgt die Entwässerung der Proben in aufsteigender Alkoholreihe (stufenweise Steigerung der Alkoholkonzentration um 10%). Danach werden die Proben für 2 mal 10 Min. mit Hexamethyldisilazan (HMDS Sigma®) infiltriert, 24 Stunden luftgetrocknet und abschließend mit Gold (BAL-TEC MED 020) beschichtet Brat et al. (1997),Bray et al. (1993). Die elektronenmikroskopische Untersuchung wird mit einem Rasterelektronenmikroskop DSM 982 Gemini der Fa. Zeiss durchgeführt.
Die hier verwendeten Fibroblasten der Fa. Cell-Lining, Berlin, (HIFB Cryopreserved or Proliferating) entstammen einer in antibiotikafreiem Zellmedium gezüchteten Zelllinie menschlicher Hautzellen (23jährige Kaukasierin, Blutgruppe 0 positiv). Es handelt sich um eine Primärzellkultur (Primaria). Proben der Zelllinie werden entsprechend der Richtlinien der Europäischen und Amerikanischen Gesellschaft für Pharmakologie in bakterienhaltiges Medium überimpft und bei 30-35° parallel inkubiert. Um temperaturempfindliche Keime besser erkennen zu können, werden Proben jeder Passage bei drei unterschiedlichen Temperaturbereichen (20-25, 30-35 und 35-39°) bebrütet. Während der Zellzüchtung erfolgt fortlaufend eine lichtmikroskopische Kontrolle der Kulturen. Vor Auslieferung werden die Chargen als kontaminationsfrei verifiziert und für weitere zwei Wochen nach Auslieferung auf mögliche Keimbesiedlung untersucht.
Unmittelbar nach Erhalt einer Zell-Charge erfolgt die sofortige Passage der Zellen. Die Zellen werden hierbei auf vier Kulturflaschen und zusätzlich auf eine Einfrierkapsel verteilt. Nur während der ersten fünf Zellpassagen wird ein Teil der Fibroblasten mittels Tiefkühlung in flüssigem Stickstoff für eventuelle spätere Tests konserviert. Auf diese Weise ist die Durchführung aller Testreihen mit derselben Charge einer Zelllinie gewährleistet.
Zwecks Passage werden die Fibroblasten nach zweimaliger Spülung mit PBS (Dulbeccos Phosphate Buffered Saline ohne Ca++, Mg++) mittels Trypsin (Trypsin (1:250) 2,5% (w/v) in PBS w/o Ca++, Mg++) abgelöst. Der Trypsinierungsprozess wird unter dem Phasenkontrastmikroskop beobachtet. Die Zellen nehmen hierbei eine typisch kugelförmige Gestalt an, schwimmen auf der Oberfläche und lassen sich bereits durch Abklopfen („Shake-off“-Verfahren) vom Substrat lösen. Nach Resuspension von 20ml Nährlösung werden die abgelösten Zellen direkt in vier Kulturflaschen überführt. Um eine schonende Zellpassage durchzuführen, wird nach Ablösen der Zellen auf ein Zentrifugieren verzichtet. Zur Kontrolle auf vollständige Ablösung der Fibroblasten erfolgt eine abschließende lichtmikroskopische Kontrolle der Kulturflaschenböden.
Der Nährmediumwechsel in den Kulturflaschen geschieht dreitägig, mit Ausnahme des ersten Mediumwechsels am ersten Tag nach Passage. Dahingegen erfolgt bei den Versuchsreihen am zweiten Kultivierungstag ein einmaliger Nährmediumwechsel in den Mikrotiterplatten.
Die in den Vor- und Hauptversuchen verwendeten Materialien sind der Tabelle 11 im Anhang 8.1, S.130 zu entnehmen.
Die mathematisch-statistische Auswertung erfolgt mit Hilfe des Softwareprogramms SPSS, die Aufarbeitung der statistischen Graphik zusätzlich mit Microsoft® Excel 98.
Zur Beurteilung des RFGD-Verfahrens wird der U-Test von Mann und Whitney verwendet.
Zur statistischen Beantwortung der Frage nach der besten Oberflächenmodifikation bezüglich des Gesamteffektes von Adhäsion und Proliferation sowie zur Beurteilung der höchsten Adhäsivität einer Oberfläche wird das Teilmengen-Auswahlverfahren von Hsu eingesetzt.
Die abschließende Signifikanztestung erfolgt für die 12-h-Werte mit dem Kruskal-Wallis-Test und für die 72-h-Werte mit dem U-Test von Mann und Whitney.
Die elektronenmikroskopischen Befunde in Abhängigkeit der Kulturdauer werden anhand eines Scores ausgewertet und deskriptiv-statistisch analysiert.
Schon während der Vorversuche war eine Beeinflussung des von diversen Oberflächen abhängigen Wachstumsverhaltens der Fibroblasten erkennbar. Allerdings wurden in dieser Versuchsphase einzig polierte, sandgestrahlte, kollagen- und silikonbeschichtete, nicht aber kugelgestrahlte Titan-Abutments und keine Titanplättchen verwendet. Die mit Hilfe des in-vitro Assays zur Bestimmung der LDH-Aktivität ermit-telten Resultate entsprachen tendenziell den späteren Ergebnissen und der parallel zu den Hauptversuchen durchgeführten elektronenmikroskopischen Auswertung, die anhand eines Bewertungsscores (s.a. Tab. 9, S. 77) vorgenommen wurde.
Interessant war, dass die silikonbeschichteten Titan-Abutments die niedrigste LDH-Konzentration und damit den geringsten Zellbewuchs aufwiesen. Überdies führte die RFGD-Behandlung der silikonbeschichteten Oberflächen zu keiner nennenswerten Steigerung des Zellbewuchses nach 72 Stunden.
Während nach einer 12-stündigen Kultivierungsdauer an den polierten, nicht RFGD-vorbehandelten Titan-Abutments die höchsten LDH-Konzentrationen (72 U/L) nachweisbar waren, wurden nach 72 Stunden die höchsten LDH-Konzentrationen (259 U/L) an den kollagenbeschichteten und RFGD-vorbehandelten Titan-Abutmentsbestimmt. Des Weiteren übertraf nach 72 Stunden das Zellwachstum an den polierten plus RFGD-vorbehandeltenTitan-Abutments das Wachstum der auf den polierten, nicht RFGD-vorbehandelten Abutments kultivierten Fibroblasten. In der Gruppe der polierten, mit und ohne RFGD vorbehandelten Abutments ergaben sich nach 72 Stunden umgekehrte Wachstumsverhältnisse gegenüber einer 12-stündigen Kultivierungsdauer, bei der gegenüber den RFGD-vorbehandelten plus polierten Oberflächen höhere Zellzahlen an den RFGD-unbehandelten und polierten nachgewiesen werden konnten.
Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass nicht allein die Oberflächenbeschichtung, sondern auch die Kultivierungsdauer der Fibroblasten auf das Adhäsions- und Proliferationsverhalten der Fibroblasten einwirkt. Offensichtlich kommt es hinsichtlich der Fibroblastenadhärenz und –proliferation an unterschiedlichen Oberflächentexturen zu quantitativen Verschiebungen in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer. Die anfängliche Adhäsionsaktivität der Fibroblasten an einer Oberflächenart wird
Mittels unterschiedlich langer Kultivierungsphasen können demnach einerseits die Fibroblastenadhäsion, und andererseits die Fibroblastenproliferation quantitativ erfasst werden.
Der in-vitro Assay zur Bestimmung der LDH-Aktivität ergab eine nahezu lineare Beziehung der LDH-Konzentration zur Zellzahl (Abb. 17). Die pro Oberflächenart ermittelten Zellzahlen lagen allerdings insgesamt unter denen der im Hauptversuch ausgezählten.
Die Zellzahlen wurden abgelesen aus einem Liniendiagramm (s.a. Kap. 3.1, S.44), welches anhand der in den Standards mit vorgegebenen Zellmengen (n = 1250, 2500, 5000, 10000, 20000, 40000 und 60000 Zellen/ ml) berechneten LDH-Konzentrationen erstellt wurde.
Die Auswertung der ermittelten Zellzahlen erbrachte nach 12 Stunden folgende Ergebnisse (Tab. 4):
Adhäsion: das RFGD-Verfahren ist überlegen bei kugelgestrahlter, sandgestrahlter oder kollagenbeschichteter Oberfläche, unterlegen bei Silikonbeschichtung. Bei Polierung lässt sich keine klare Aussage treffen.
Proliferation: Werden allein die am Ende der 72stündigen Kultivierung gemessenen Zellzahlen miteinander verglichen, ist wie bei der Adhäsion das RFGD-Verfahren bei den gleichen Oberflächen überlegen, außerdem noch bei polierter Oberfläche. Es ist unterlegen bei Silikonbeschichtung.
Die Tabellen „RFGD-Verfahren versus ohne RFGD-Verfahren“ enthalten die p-Werte der U-Tests von Mann und Whitney. Die p-Werte zeigen, dass die Verteilung der Zellzahlen nicht symmetrisch ist.
Zur statistischen Beantwortung der Frage nach der besten Oberflächenart wird das verteilungsfreie Auswahlverfahren von Hsu angewendet, wobei eine Untermenge aus einer Oberflächenart selektiert wird (Tab. 6 Die vorliegenden Berechnungen sind alle zur statistischen Sicherheit (1 - α = 1 - 0.05 = 0.95) durchgeführt.
Betrachtet man alle 10 Oberflächenarten zusammen, so ist mit einer Wahrscheinlichkeit von 95% eine der fünf ausgewählten die am besten geeignete Oberfläche. Da diese fünf Oberflächenarten in den 12h-Werten im statistischen Test (Kruskal-Wallis-Test) nicht signifikant voneinander verschieden sind (p-Wert > 0.05), lässt sich die Aussage des Auswahlverfahrens in diesem Fall nicht noch weiter eingrenzen.
Dasselbe gilt analog auch für die vier ausgewählten aus den Oberflächenarten mit RFGDT und für die einzige, aus den fünf Oberflächenarten ohne RFGDT ausgewählte.
Die 72-h-Stundenwerte allein auszuwerten bedeutet, gewissermaßen den Gesamteffekt von Adhäsion und Proliferation nach 72 Stunden zu beurteilen (Tab. 7). Auch hierbei wird zur statistischen Beantwortung der Frage nach der besten Oberflächenart das verteilungsfreie Auswahlverfahren von Hsu angewendet.
Für die 10 Oberflächenarten zusammen betrachtet ist mit einer Wahrscheinlichkeit von 95% die am besten geeignete Oberfläche eine der beiden ausgewählten (poliert plus RFGDT, Kollagen A plus RFGDT). Da die beiden Oberflächenarten bezüglich der 72h–Werte im statistischen Test nicht signifikant voneinander verschieden sind, lässt sich die Aussage des Auswahlverfahrens in diesem Fall nicht noch weiter eingrenzen.
Interessant ist, das sich in der Gruppe der nicht RFGD-vorbehandelten Oberflächen im Gegensatz zur Gruppe der RFGD-behandelten nach 12 und 72 Stunden Zellkultivierung nur eine einzige, nämlich die polierte Titanoberfläche, als die Beste herausstellt. Des Weiteren ist unter allen Teilmengen die Gruppe der polierten Oberflächen entweder die beste oder bei den am besten geeigneten Oberflächen.
Eine zusammenfassende, klassenbezogene Darstellung der an den diversen Werkstoffoberflächen ermittelten Zellzahlen geben nachfolgende Histogramme (Abb. 20, 21).
Während die RFGD-Behandlung der silikonbeschichteten Titanplättchen zu einer verringerten Zellanhaftung (12h) und –proliferation (72h) und an den polierten RFGD-behandelten Titanplättchen zu keiner verbesserten Zellhaftung (12h) führt, scheint dieses Verfahren dahingegen bei allen anderen Werkstoffoberflächen signifikant von Vorteil.
Die genauere Betrachtung der zeitabhängigen Wachstumsvorgänge an den einzelnen Werkstoffoberflächen zeigt auf, dass es offensichtlich bei den kugelgestrahlten und RFGD-vorbehandelten Titanplättchen zu einer deutlicheren Steigerung der Adhäsion als der Proliferation kommt. Bei den sandgestrahlten und RFGD-vorbehandelten Titanplättchen besteht kein signifikanter Unterschied bezüglich Adhäsion (12h-Wert) und Proliferation (72h-Wert). Insbesondere wird die Fibroblastenproliferation an den polierten (79%-ige Zunahme) und an den kollagenbeschichteten Plättchen (114%-ige Zunahme) durch die RFGD-Behandlung erheblich gesteigert (Tab. 8).
Die statische Betrachtungsweise der ermittelten Zellzahlen allein am Ende einer 12– und 72–stündigen Zellkultivierung reicht nicht aus, da hierbei die divergierenden Zuwachs- bzw. Proliferationsraten der Fibroblasten auf den unterschiedlich oberflächenmodifizierten Trägern unberücksichtigt bleiben. Um die tatsächlichen Proliferationsraten der Fibroblasten beurteilen zu können, ist eine dynamische, also auf einen Zeitraum bezogene Betrachtungsweise der Wachstumsvorgänge auf den verschiedenartigen Titanträgern erforderlich, welche die unterschiedlichen Wachstumsraten nach
erfolgter Adhäsion der Zellen berücksichtigt. Jedoch können die prozentualen Zuwächse im vorliegenden Studiendesign mit statistischen Tests nicht
Die größte Zunahme des Zellbewuchses nach 72 Stunden zeigen demnach weiterhin 1.) die polierten plus RFGD-behandelten (≥1,5fache Zunahme) sowie 2.) die Kollagen plus RFGD-behandeltenTitanplättchen (>1,5fache Zunahme). Zwischen beiden Oberflächenarten besteht eine Differenz von 17% zugunsten der polierten Plättchen.
Hinsichtlich der Zuwachsraten im Zeitraum 12h bis 72h schneiden die silikonbeschichteten Oberflächen am schlechtesten ab. Das RFGD-Treatment führt hier zu keiner Verbesserung des Zellwachstums auf den Silikonoberflächen. Zudem zeigen die silikonbeschichteten Oberflächen von allen Oberflächenmodifikationen den schlechtesten Zellbewuchs jeweils nach 12 und 72 Stunden. Den prozentualen Zuwachs des Zellbewuchses in diesem Zeitraum abhängig von der Oberflächenmodifikation veranschaulicht nachfolgende Abbildung (Abb. 22).
Wenngleich die kugelgestrahlten und RFGD-behandelten Plättchen gegenüber den unbehandelten eine deutlich geringere Zunahme des Zellbewuchses nach 72 Stunden Kultivierung zeigen, so weisen sie am Ende dennoch einen stärkeren Bewuchs auf als
Es läßt sich festhalten: Der anfängliche Eindruck eines Vorteils der RFGD-Behandlung für die Zellproliferation an kugelgestrahlten Trägern scheint trügerisch. Tatsächlich ist bei diesen Oberflächen die Proliferationrate nach RFGD-Behandlung im Vergleich zu den unbehandelten niedriger. Die nach 72 Stunden höheren Zellzahlen bei den RFGD-behandelten und kugelgestrahlten Titanträgern kommen schlicht dadurch zustande, dass nach erfolgter Zelladhäsion die Ausgangswerte (Zahl adhärenter Zellen) über denen der physikalisch unbehandelten liegen. Trotz geringerer Proliferationsraten liegen daher am Ende einer 72-stündigen Kultivierung die an den RFGD-behandelten Oberflächen gemessenen Zellzahlen über denen der unbehandelten. Möglicherweise wäre bei einer längeren Kultivierungsdauer gegenüber den nicht-RFGD-behandelten Plättchen ein geringerer Bewuchs auf den RFGD-behandelten kugel- und sandgestrahlten Plättchen nachweisbar.
Die Ausbildung des Zellrasens einer Fibroblastenkultur erinnert in ihrem Muster an die Papillarleisten einer Fingerbeere. Offensichtlich bewegen sich einzelne, anfangs weit voneinander getrennt liegende Zellen aufeinander zu, wodurch einzelne Zellnester entstehen, die wiederum an ihrer Peripherie aufeinander zuwachsen. Hierbei sind die Fibroblasten in strang- und palisadenartigen, teilweise radiär verlaufenden Formationen angeordnet. Diese Zellformationen sind mit zunehmender Zelldichte ausgeprägter, wodurch sich dieser Eindruck licht- und elektronenmikroskopisch verstärkt. Je dichter die Zellen aneinander liegen, umso mehr werden sie durch Orientierung an den Nachbarzellen ausgerichtet (Abb. 23). Schon hinsichtlich dieser Zellformationen lassen sich die Fibroblasten gut von den Keratinozyten, die ein pflastersteinförmiges Relief aufweisen, unterscheiden. Auf allen Oberflächentexturen sind diese Zellformationen mehr oder weniger deutlich ausgeprägt nachzuweisen.
a) sandgestrahlten Titanplättchen (mit RFGDT) nach 12 h Kultivierung, (Vergr.fakt. x 1000)
b) kugelgestrahlten Titanplättchen (mit RFGDT) nach 12 h Kultivierung, (Vergr.fakt. x 1000)
Diese Zellgestalt weicht nach 72 Stunden einer länglich ausgezogenen und weitgehend an den Nachbarzellen parallel orientierten Form, wobei das radiäre Muster des Zellrasens z.T. erhalten bleibt (Abb. 25).
Auch hier ist nach 72 h Kultivierung die Zellform länglich ausgezogen, und die Zellen sind überwiegend parallel zueinander ausgerichtet (Abb. 27).
Auf den kollagenbeschichteten, planen Titanträgern zeigen die Fibroblasten eine nahezu identische Gestalt. Nach 72 h Kultivierung ist hier im Vergleich zu allen übrigen Oberflächen der am stärksten ausgebildete Polylayer zu beobachten (Abb. 29).
a) ohne RFGDT nach 72 h Kultivierung, (Vergr.fakt. x 1000)
b) mit RFGDT nach 72 h Kultivierung, (Vergr.fakt. x 3000)
Bis auf die silikonbeschichteten Träger findet sich nach 72 h auf allen übrigen Oberflächen ein durchgängiger Zellbewuchs und ein Polylayer unterschiedlichen Ausmaßes (Abb. 31)
a) ohne RFGDT, (Vergr.fakt. x 200);
b) mit RFGDT, (Vergr.fakt. x 200)
Der Zellbewuchs auf den Trägern wird anhand der elektronenmikroskopischen Aufnahmen auf Grundlage eines Scores (7 Klassen) ausgewertet (Tab. 9), wobei der Grad des Bewuchses jeweils nach 12 h und 72 h beurteilt wird:
Bezüglich der 12–h–Werte decken sich die Ergebnisse der deskriptiven, elektronenmikroskopischen Auswertung der Bewuchsraten weitgehend mit den durch die Zellzählung ermittelten Resultaten. Beide Untersuchungen zeigen bei Kollagen A‑dotierten und RFGD-behandelten Titanoberflächen den besten Proliferationseffekt (72-h-Wert).
Die Oberflächen der sand- und kugelgestrahlten Plättchen zeigen in der Elektronenmikroskopie ein äußerst ähnliches Bild von Tälern und Wellen, wobei sich zwischen beiden Oberflächenarten, bedingt durch eine teilweise tiefere und kantigere Furchung der sandgestrahlten Texturen, ein diskreter Unterschied ergibt.
Den bei sand- und kugelgestrahlten Titanplättchen gleichartigen Oberflächentexturen entsprechend, zeigen Fibroblasten auf diesen Trägern ein identisches, diffuses
Die Benetzbarkeit der verwendeten Oberflächenarten wurde mit Hilfe eines Wassertropfens untersucht und photografisch dargestellt. Das RFGD-Treatment blieb hierbei aus Ermangelung eines RFGD-Gerätes unberücksichtigt. Die rechnergestützt ermittelten Kontaktwinkel veranschaulichen nachfolgende Abbildungen.
Die an der TU-Berlin durchgeführte Vergleichsanalyse der Titanplättchen mit den klinisch verwendeten Brånemark-Hülsenimplantaten weist nur geringfügige Unterschiede bezüglich der Konzentration an Spurenelementen nach:
Der Titangehalt bei beiden Materialien beträgt jeweils mehr als 99%.
Auf organotypische Keratinozytenkulturen und Kokulturen mit Fibroblasten, die eine weitergehende natürliche Differenzierung ermöglichen Fusenig (1992) und somit ein besseres Modell der Haut darstellen, wurde wegen der größeren Anzahl von möglichen Störgrößen verzichtet, weil diese eine Standardisierung der Testmethode erschweren oder gar unmöglich machen können. Auch im Hinblick auf die Vergleichbarkeit mit den Ergebnissen früherer Untersuchungen der Adhäsion und Proliferation von Keratinozyten an diversen Titanoberflächen wurde einer Monozellkultur der Vorzug gegeben. Man muss jedoch berücksichtigen, dass sich derartige Zelllinien von den Eigenschaften ihrer Ursprungszellen unterscheiden. Ein Unterschied betrifft dabei die verminderte bzw. ausbleibende Kontakthemmung durch andere Zellen des Umgebungsgewebes.
Die Verwendung von Hautzellen, die direkt von menschlicher Haut isoliert werden, hat gegenüber der Verwendung von tierischen Zellen den Vorteil, dass die Ergebnisse nicht erst auf Ergebnisse von Zellen menschlicher Herkunft übertragen werden müssen. Von Nachteil ist aber die mangelhafte Homogenität und Standardisierbarkeit von Zellen individueller Spender mit sehr unterschiedlichen Hauteigenschaften. Hautzelllinien von Mammaliern sind einfach zu handhaben, bereiten jedoch bei der Kultivierung Schwierigkeiten, da sie leichter von unerwünschten Keimen befallen werden können.
Die anfänglich verwendeten Abutmenttypen sind sämtlich konventionelle Brånemark-Hülsenimplantate (Fa. Entific Medical Systems) und werden nur poliert geliefert. Werkstoffe mit in dieser Studie verwendeten Oberflächenmodifikationen sind kommerziell nicht erhältlich und wurden eigens für die Versuche angefertigt. Wenngleich ursprünglich angestrebt wurde, das Adhäsionsverhalten von Fibroblasten an handelsüblichen, halbierten Titan-Abutments zu untersuchen, so wurden wegen der Möglichkeit eines seitlichen Abgleitens der Fibroblasten von den konvexen Oberflächen statt der Abutmenthälften plane Titanplättchen verwendet. Diese bestehen aus einem nahezu identischen Werkstoff, dem Rein-Titan. Die im Hauptversuch verwendeten Titanplättchen weisen nur geringfügige Unterschiede der Konzentrationen von Spurenelementen und ein gleichartiges Verteilungsmuster dieser Elemente auf. Die gewonnenen Resultate können daher auf das Wachstumsverhalten von Fibroblasten an Brånemark-Hülsenimplantaten (Abutments) übertragen werden. Eine solche
Da Titan als gut bioverträglich gilt Albrektsson et al. (1983),Albrektsson et al. (1981),Trentz et al. (1997), ist es der konventionelle Werkstoff extra- und intraoraler Implantate, zu denen die hier verwendeten Distanzhülsen zählen. Wenngleich Titan die Anhaftung der Haut ermöglicht Powers et al. (1986), kann diese wegen des Elastizitätsunterschiedes von Titan gegenüber Haut in der Dreiphasenlinie leicht abreißen Daly (1980). Daher ist Titan für Hautdurchleitungen weniger gut geeignet. Mechanische Scherkräfte werden als die Hauptursache für das Auftreten von Zellnekrosen im Gewebe-Implantat-Interface angesehen Rosengren et al. (1999). Diesen Kräften versucht man einerseits mittels Oberflächenmodifikationen Chehroudi et al. (1990),Chehroudi et al. (1991),Chehroudi et al. (1989), die zu verbesserter Haftung des Umgebungsgewebes führen sollen, und andererseits während der Phase der Wundheilung mit Hilfe von Scheiben, die einen direkten Haut- und Weichgewebsandruck auf das Periost erzeugen, entgegenzusteuern Klein et al. (1999a).
Titan als ein oft eingesetztes Biomaterial weist eine gute Resistenz gegen Korrosion auf Albrektsson et al. (1983). Die Korrosionsfestigkeit wird durch eine Passivierungsschicht an der Oberfläche gewährleistet, welche sich in feuchter Umgebung und bei Beschädigung rasch neu bildet und durch anodische Oxidation verstärkt werden kann Gilbert et al. (1998),Newesely (1981).
Experimentell wurde Titan transkutan in die Bauchwand eingesetzt Rostlund und Thompson (1990),Thomsen und Bjursten (1982). Ein Titanfasergeflecht wird als Alternative zu den subkutanen Dacronvelour- und Dacronfilzmanschetten vorgeschlagen, weil es weniger Fremdkörper- und Entzündungsreaktionen hervorruft Paquay und Ruijter (1994). Ungeachtet ihrer großen Oberfläche konnten bei in der Peritonealhöhle platzierten Linksherzunterstützungssystemen, Pumpen mit einer Oberfläche aus einer Titanlegierung (T-6Al-4V), selbst nach bis zu 153 Tagen keine Entzündungs- oder Abstoßungsreaktionen gefunden werden, auch nicht nach Anwendung von immunhistochemischen und ultrastrukturellen Untersuchungsmethoden Capek und Kadipasaoglu (1992). Histologische Untersuchungen von im Trommelfell implantierten Titanröhrchen bestätigten die ausgezeichnete Bioverträglichkeit des Titans. Auch Powers et al. zeigten anhand histologischer Untersuchungen von im Trommelfell implantierten Titanröhrchen auf, dass Zeichen einer akuten oder
Um die unerwünschte Adhäsion von Plaque-Bakterien und Zahnbelag zu verhindern, werden intraoral polierte Titan-Abutments verwandt. Extraoral bestehen jedoch andersartige physiologische Bedingungen, insbesondere findet sich hier eine differente saprophytäre Bakterienflora. Eine keimdichte Versiegelung mit den herkömmlichen, polierten Hülsenimplantaten gelingt extraoral nicht Toljanic und Morello (1995).
SALTHOUSE wies in vivo auf rauhen Teflon-Oberflächen eine gegenüber glatten Oberflächen desselben Materials vielfach höhere Anzahl von Makrophagen nach. Diese Affinität der Makrophagen gegenüber rauhen Oberflächen wurde auch in vitro beobachtet. SALTHOUSE konnte nachweisen, dass Makrophagen die Fibroblastenaktivität und hierdurch indirekt die Kollagensynthese und damit die Gewebeorganisation und –ausformung kontrollieren. Während nach einem Monat auf glatten Implantatoberflächen die Makrophagen nicht mehr nachweisbar waren und sich eine dünne Bindegewebskapsel ausgebildet hatte, ließen sich an rauhen Oberflächen noch nach drei Monaten Makrophagen und Riesenzellen nachweisen. Er folgerte daraus, dass glatte Oberflächen bioverträglicher sind Salthouse (1984).
Die Verwendung von sand- und kugelgestrahlten Werkstoffen erfolgte unter Berücksichtigung thematisch ähnlich gelagerter Untersuchungen, in denen aufgezeigt wurde, dass es auf mikrotexturierten und damit oberflächenvergrößerten Titanoberflächen zu einer verbesserten Anhaftung von Zellen verschiedener
Hierbei sei insbesondere auf die Darstellung von Brunette verwiesen, in der vier mögliche Ursachen zellulärer Beeinflussung durch Oberflächentopographien von Implantaten eingehend beschrieben werden Brunette (1988),Grinnel et al. (1987). Das Phänomen der Kontaktführung bedingt die Ausrichtung der Zellen speziell kollagener Fasern auf Implantatoberflächen mit feinen Furchen und Rillen Chehroudi et al. (1992),Ohara und Buck (1979). Als Rugophilie wird die Tendenz z.B. von Makrophagen bezeichnet, rauhe Oberflächen zu bevorzugen Salthouse (1984). Der Zwei-Zentrum-Effekt beschreibt das Phänomen, dass sich Zellen auf Substraten, welche unterschiedliche Haftungseigenschaften aufweisen, in Richtung des Areals mit hohen adhäsiven Eigenschaften orientieren und solche mit nur schlechter Haftung meiden. Dieses Verhalten der Zellen ist für die Akzeptanz eines Fremdkörpers (Zell-zu-Fremdkörper-Adhäsion) von entscheidender Bedeutung, da sich bei einem Werkstoff mit nur geringen adhäsiven Eigenschaften die Zellen überwiegend aneinander orientieren (Zell-zu-Zell-Adhäsion) und damit eine Abkapselung des Implantates herbeiführen können. Die dabei stattfindende gerichtete Zellbewegung auf Fremdkörperoberflächen in Abhängigkeit vom Adhäsionsgradienten wird als Haptotaxis bezeichnet Carter (1965). Das Adhäsionsverhalten verschiedener Zellspezies wird folglich durch diverse Oberflächenmodifikationen ganz unterschiedlich beeinflusst und kann durch diese verbessert werden.
Oberflächentopographie und -chemie spielen eine kritische Rolle bei Adhäsionsvorgängen an Biomaterialien Baier (1970). Diese Oberflächencharakteristika betreffen:
die Porosität, welche z.B. das Verhalten von in einer organotypischen Zellkultur gezüchteten Endothelzellen beeinflusst Brunette (1988), die Neovaskularisation der das Implantat umgebenden Bindegewebskapsel induziert und den Transport kleiner dem Blut entstammender Moleküle steigert Sharkawy et al. (1998);
die Oberflächentopographie, die einerseits die Osteoblastendifferenzierung und –proliferation sowie die Matrixbildung Martin et al. (1995), und andererseits die Formung, Orientierung und das Wachstum von Fibroblasten der Haut stimuliert, indem die Oberflächenstrukturen an den fokalen Adhäsionspunkten der Zellen einwirken Kononen et al. (1992);
die Benetzbarkeit von Materialoberflächen als eine weitere Einflussgröße bei Adhäsionsvorgängen, welche die Anhaftung humaner Fibroblasten und Endothelzellen sowie die Plasmaeiweißadsorption beeinflusst Ruardy et al. (1995).
Die Oberflächentopographie wird als eine entscheidende Einflussgröße bei vielen Entwicklungsprozessen betrachtet. Zelluläre Eigenschaften wie die Formierung des Zytoskeletts, die Zelladhäsion und die Interaktion mit anderen Zellen sind Faktoren, welche die Fähigkeit einer Zelle zur Anpassung an eine Oberfläche bestimmen Clark et al. (1990). Materialspezifische Charakteristika scheinen hierbei den von den Oberflächentexturen hervorgerufenen Orientierungseffekt auf die Zellen nicht zu beeinflussen den Braber et al. (1998).
Im Allgemeinen führen hydrophile Oberflächen zu einer verbesserten Zellaffinität, wohingegen die Proteinadsorption durch hydrophobe Oberflächen gefördert wird Altankov und Groth (1994),Kothari et al. (1995),Weiss und Blumenson (1967). Neue Biomaterialien sollen eine gezielte Rekrutierung, Steuerung der Wanderung, Aktivierung und Differenzierung von Zellen sowie Produktion von extrazellulärer Matrix und gegebenenfalls deren Mineralisation ermöglichen Gross (1993).
Die In vivo Biokompatibilität von Silikonimplantaten wird zurzeit heftig debattiert. Das Hauptaugenmerk richtet sich auf die ursächliche Beziehung zwischen silikonhaltigen Biomaterialien und der möglichen Entstehung von Autoimmunerkrankungen, was allerdings nicht bewiesen ist. Jedoch ist die Ausbildung einer bleibenden periimplantären Kapsel um das Silikonimplantat das bedeutendere Problem van Kooten et al. (1998). Einerseits bestätigten Untersuchungen hinsichtlich der Keratinozytenadhäsion, dass Silikon als Polymer besonders gute Haftungs-eigenschaften besitzt und damit für die Verwendung von Hautdurchleitungen geeignet sei Große-Siestrup (1998),Knabe et al. (1997), andererseits konnte in einer elektronenmikroskopischen Studie der Arbeitsgruppe von DEN BRABER nachgewiesen werden, dass die Materialeigenschaften von Silikon keinen Einfluss auf Zellorientierung und Proliferation von Fibroblasten (rat dermal fibroblasts, RDF) ausüben den Braber et al. (1998). Zudem wurde eine gegenüber Silikontexturen erheblich höhere Proliferationsrate der Fibroblasten auf Titanoberflächen nachgewiesen den Braber et al. (1995). McCAULEY et al. dokumentierten an Fibroblasten der Haut, die Komponenten einer Silikongelprothese ausgesetzt wurden, einen signifikanten
In der hier vorgelegten Studie erfolgte die Kollagen-Beschichtung unter Berücksichtigung der Untersuchungen von O`Keefe et al., die aufzeigten, dass lösliches, humanes Plasmafibronektin und Kollagen vom Typ I und IV in Abhängigkeit von Inkubationszeit und Konzentration effektive Agentien für eine verbesserte Zellausbreitung der Hautzellen sind. Das natürliche Vorkommen bestimmter extrazellulärer Matrixproteine im Bereich der Basallamina kann demzufolge für Einheilungsprozesse künstlich eingebrachter Vorrichtungen nutzbar gemacht werden.
Das von uns verwendete Kollagen IV ist eines von vielen Bestandteilen der ECM (Fibronectin, Kollagene, Laminin, Thrombospondin). Kollagen A ist zu 5% in der Laborzubereitung (95%Kollagen I + 5% Kollagen IV) enthalten. Das Kollagen IV sorgt als Bestandteil der Basallamina des Epithels für den Halt des Epithels auf der Dermis.
Die Produktion von Fibronektin bzw. Kollagen und die Zellantwort darauf ist bei Fibroblasten und Keratinozyten die Gleiche und veranschaulicht, dass Fibronektin und Kollagen als Matrixfaktoren für beide Zellspezies fungieren können O`Keefe et al. (1985). Beispielsweise interagiert Fibronectin mit biologischen Liganden wie Fibrinogen, Fibrin, Kollagenen und Glycosaminoglycan, Makromolekülen der Extrazellulärmatrix. Curtis und McGrath wiesen bei Beschichtungstests von Kontaktflächen eine verbesserte Adhäsion und ansteigende Zellausbreitung in Gegenwart des „Signalmoleküls“ Fibronectin nach; zu verzeichnen war jedoch ein quantitativer Rückgang dieser Zellaktivitäten bei einer Oberflächenbeschichtung mit bovinem Serumalbumin (BSA), welches ein steter und unverzichtbarer Bestandteil in Nährlösungen für Zellkulturen ist Curtis et al. (1992). Die hier vorgestellte Studie kommt zu vergleichbaren Ergebnissen (s.a. Kap. 5.3, S.97).
Typ-I-Kollagen bindet beispielsweise Osteoblasten über spezifische Zelloberflächen-rezeptoren, die Integrine. In einer Studie der Arbeitsgruppe von BASLÉ et al. waren auf Kollagen-I-beschichteten Biomaterialien aus Rinderknochen kultivierte Osteoblast-like Cells (Saos-2) in der Form elongiert und entlang der trabekulären Architektur und dem oberflächlichen Kollagengeflecht ausgerichtet. Nach 14 Tagen flossen die Zellen zusammen, die Oberfläche des Biomaterials war durch eine Zelllage bedeckt. Dahingegen zeigten sich auf der Oberfläche des entproteinisierten Biomaterials die Zellen globulär, ohne spezifische Ausrichtung und nur teilweise der Oberfläche
Da diverse Studien eine wesentliche Beeinflussung der Zelladhäsion durch die Plasmasterilisierung von Implantatoberflächen nachwiesen, wurde das Radio–Frequency–Glow–Discharge–Treatment (RFGDT) bei der Hälfte aller Werkstoffe ergänzend angewendet Baier et al. (1984),Jansen et al. (1989). Die Ergebnisse in der Literatur sind allerdings uneinheitlich und widersprüchlich. Nach GROSSE-SIESTRUP führen alle geprüften Variationen der Glimmentladung meist zu einer Steigerung der Zelladhäsion bei Silikon, teilweise wird aber auch eine chemisch bewirkte, verbesserte Adhäsion durch Glimmentladung rückgängig gemacht Große-Siestrup (1998). Untersuchungen von BAIER et al. demonstrierten, dass Fibroblasten (New Zealand White rabbits) an niedrig geladenen Oberflächen, die mittels stearinsaurer Lösung vorbehandelt oder mit Silikon beschichtet wurden, eine nur geringgradige Zellantwort zeigten. Jedoch erwies sich das RFGD-Verfahren hierbei als eine effektive Methode, anorganische Werkstoffe zu sterilisieren und damit in einen Zustand hoher Oberflächenenergie zu versetzen. Diese Oberflächen korrelierten mit der höchsten Adhäsionsrate Baier et al. (1984). Allerdings ist der Grad der Zellanhaftung und –proliferation abhängig von der Anwendungsdauer des Plasmasterilisierungsverfahrens.
Die Behandlung mit Argon-Plasma führt zum Entweichen von Sauerstoff, der die Titanoberflächen stets bedeckt. Ebenso entweicht Wasserstoff, dessen Konzentration in der unmittelbar unter der Materialoberfläche liegenden Region abnimmt Aronsson et al. (2001).
Die Steigerung der Oberflächenenergie durch das RFGD-Verfahren führt bekanntermaßen zu einer erhöhten Oberflächenspannung, was wiederum die Benetzbarkeit verbessert. Die Benetzbarkeit (wettability) ist ein werkstoffseitiger Parameter, der auf den Grad der Zelladhäsion Einfluss nimmt Baier (1970),Baier et al. (1984),Schmidt (1999),Weiss und Blumenson (1967). Beträgt der Kontaktwinkel ϑ
Da die verschiedenen Arbeitsgruppen unterschiedlichste Werkstoffe bzw. Implantatoberflächen sowie Zellen verschiedener Spezies und Herkunft verwenden, gibt es bislang noch keine standardisierten und damit vergleichbaren Untersuchungen bezüglich des Adhäsionsverhaltens von Zellen an mit dem Glow-Discharge-Verfahren behandelten Werkstoffen. In der Literatur werden einerseits unterschiedliche Plasmasterilisierungsverfahren und andererseits verschieden lange Anwendungszeiten einer solchen physikalischen Oberflächenbehandlung beschrieben.
Wie gemeinhin für jedes in vitro Modell Grenzen bestehen und bei der Datenerhebung berücksichtigt und akzeptiert werden müssen, so wurde auch in diesem Modell nur ein Teilaspekt der komplexen Vorgänge an der Grenzfläche zwischen Implantat und Biosystem untersucht. Das Haftungs- und Wachstumsverhalten im Verbund mit anderen Hautzellen und die Implantatumgebung wurden außer Acht gelassen. Die
Bei der erforderlichen Versiegelung der Haut im Dreiphasenbereich steht die Haftung von Fibroblasten und Keratinozyten im Vordergrund, weshalb man sich methodisch unter Verzicht auf metabolische und biochemische Kriterien auf morpholgische Kriterien (Zellzahlen) konzentrieren kann Baier (1970),Baier und Meyer (1988),Baier et al. (1984).
Andere Parameter wie die Art und Weise der Implantatapplikation, die Verweildauer des Implantats und die Belastungsverhältnisse am Gewebe-Implantat-Interface sind bei Implantat-Gewebe-Interaktionen gleichermaßen von Bedeutung. Diese können jedoch nur am lebenden Organismus untersucht werden. Schließlich kann aus andersartigen in vitro Bedingungen ein verändertes Zellverhalten resultieren. So zeigen Knorpel-zellkulturen einen veränderten Phänotypus, wenn sie nicht wie unter in vivo Verhältnissen zyklischen Belastungen ausgesetzt werden Larson et al. (1991),Rosengren et al. (1999).
Werden in vitro Methoden durch lokale Einflüsse des Biowerkstoffes auf das Umgebungsgewebe sowie durch Wechselwirkungen zwischen Implantat und Wirt kompliziert und überlagert, so ist die Aussagekraft solcher Testmethoden eingeschränkt oder nicht gegeben. Da die Wirkungen körperfremder Substrate auf isolierte Organe oder Gewebe nicht unmittelbar auf die komplexeren Verhältnisse in vivo übertragen werden können, vermögen in vitro Modelle Tierversuche unmittelbar vor der Anwendungsphase am Menschen oftmals nicht zu ersetzen. In vitro Versuche geben jedoch erste Hinweise z.B. auf das Zellverhalten an der Grenzfläche: Implantat-Umgebungsgewebe. Die vergleichende Gegenüberstellung der einzelnen Untersuchungen ermöglicht letztlich richtungsweisende Einsichten.
Um zwischen der Fibroblastenadhäsion und –proliferation unterscheiden zu können, wurden Kultivierungszeiträume von 12 und 72 Stunden gewählt. Von JANSEN et al. durchgeführte Pilotstudien zeigten, dass das Maximum der Fibroblastenadhäsion nach vier Stunden erreicht wird und die Proliferation etwa 24 Stunden nach Zellaussaat beginnt Jansen et al. (1991). Hinsichtlich der Zellzählung war zu beachten, dass diese Methode für ältere, geschichtete Kulturen unzuverlässige Ergebnisse liefert. Dahingegen ist die Zellzählung nach Zellisolierung während der ersten Kultivierungstage möglich Fusenig (1986). Da in dieser Studie relativ kurze
Die Grundfläche eines halbierten Abutments ist gering größer als seine Auflagefläche. Die verwendeten 96er-Mikrotiterplatten (Firma Falcon) besitzen einen Durchmesser von dWB = 6,5mm pro Well. Nach der Formel F=π x r2 ergibt sich eine Wellbodenfläche von FWB = 33,18mm 2. Die Fläche eines halbierten Abutments berechnet sich nach der Formel:
Fläche nach Längsschnitt (FLs) = Abutmentdurchmesser (dAb) x Abutmenthöhe(hAb)
FLs = dAb x hAbèFLs= 4,5mm x 4mm = 18mm2
Demnach werden 54% der Wellbodenfläche von einer Abutmenthälfte besetzt. Da jedoch die Oberfläche eines Abutments gekrümmt ist, muss dieser Flächenwert nach oben korrigiert werden.
Unter Berücksichtigung des beim Zerlegen durch die Trennscheibe entstehenden Schnittverlustes von 0,5mm pro Abutmenthälfte wird eine solche konvexe Fläche folgendermaßen berechnet:
Da die plane Fläche eines Titanplättchens (F=π x r2), welches in den Hauptversuchen die Abutmenthälften ersetzte, 19,63 mm 2 beträgt, besetzt ein Plättchen nur 59% der Wellbodenfläche. Es kommt also gegenüber den Abutmenthälften zu einem 28%-igen Flächenverlust entsprechend 7,64 mm2. Dieser Flächenverlust beeinträchtigt jedoch nicht die Vergleichsmöglichkeit mit den Ergebnissen der Pilotstudie von KLEIN und Hohlfeld Hohlfeld (2000),Klein et al. (2000), die bei ihren Versuchen konvexe Abutmenthälften verwendeten. Denn schließlich werden die ermittelten Zellmengen relativ zueinander in Beziehung gesetzt.
Um die die Zellhaftung und –proliferation beeinflussenden werkstoffseitigen Parameter (physikalische, mechanische) besser von chemischen bzw. biochemischen Einflussgrößen unterscheiden zu können, wurde auf die Kollagenbeschichtung der sandgestrahlten Werkstoffe verzichtet. Andernfalls hätten zwei Einflussgrößen, nämlich eine (bio-)chemische (Kollagen) und eine mechanische (Oberflächenvergrößerung durch Sandstrahlung), auf das Wachstumsverhalten der Fibroblasten gleichzeitig eingewirkt. Zudem war zu klären, inwiefern eine Kollagen A–Beschichtung allein schon zu einer Verbesserung der Adhäsion und Proliferation bei Fibroblasten führt.
Als statistische Tests kommen in dieser Untersuchung generell nur parameterfreie Tests infrage, also keine t-Tests, da die Daten nicht mit der Normalverteilung verträglich sind. Hierbei kommen oft nur wenige, voneinander verschiedene Zellzahlen vor und die Verteilungen sind nicht symmetrisch. Zur statistischen Beantwortung der Frage nach der besten Oberflächenart bezüglich der Adhäsion (12h-Werte) und des Gesamteffektes von Adhäsion und Proliferation (72h-Werte) eignet sich ein Teilmengen-Auswahlverfahren, das aus mehreren Populationen, die jeweils durch eine Stichprobe vertreten sind, eine Untermenge aussondert, die mit einer hohen statistischen Sicherheit die beste Population enthält. Im vorliegenden Anwendungsfall wird durch das Auswahlverfahren eine Untermenge von Oberflächenarten selektiert, unter denen sich mit hoher statistischer Sicherheit die beste Oberflächenart hinsichtlich der 12- und 72-Stunden-Werte befindet (höchste 12-/ 72h-Werte). Aufgrund der Dateneigenschaften (keine Verträglichkeit mit Normalverteilung) kommt ein verteilungsfreies Auswahlverfahren, das Verfahren von Hsu, zur Anwendung Horn und Vollandt (1995).
Will man jedoch statt der 72-Stunden-Werte die Differenzen innerhalb des Zeitraumes von 12 bis 72 Stunden auswerten, so ist das nur möglich, wenn sich jedem einzelnen 12-h-Wert eindeutig ein 72-h-Wert zuordnen lässt, was mit dem vorliegenden Studiendesign nicht realisierbar ist. Daher wird hier die deskriptive Datenanalyse, mit Hilfe derer eine Tendenz im Proliferationsverhalten der Fibroblasten erkennbar wird, angewendet.
Neben der lichtmikroskopischen Kontrolle der Zellkulturen diente die Elektronenmikroskopie zur Darstellung der Zellmorphologie und des Zellwachstums auf den verschiedenartig texturierten Titanträgern. Aufgrund des wegen der hohen Kosten beschränkten Stichprobenumfanges (eine elektronenmikroskopische Abbildung je Vergrößerung, Oberflächenart und Kultivierungsdauer) musste auf statistische Testverfahren der konfirmatorischen Datenanalyse verzichtet werden. Vielmehr wurden die Bilder anhand eines Scores explorativ analysiert, wobei das zeitabhängige Wachstum der Fibroblasten ausgewertet und graphisch in Form eines Polarplots (siehe Kap.4.4.2, S. 77 - 55) dargestellt wurde. Es zeigte sich, dass von der Zellmorphologie und der Art des Oberflächenbewuchses Rückschlüsse auf das zu erwartende Ausmaß der Zellanhaftung möglich sind, weniger jedoch auf das Ausmaß der Zellproliferation nach abgeschlossener Adhäsion. Eine solche visuelle Auswertung des Zellbewuchses anhand eines Scores liefert für geschichtete Zellkulturen ungenaue Ergebnisse, da die tiefer liegenden Zellschichten nicht sicher beurteilbar sind. Dies veranschaulichen die mittels Polarplot analog dargestellten, quantitativ (Zellzählung) und qualitativ (Score) ermittelten Ergebnisse (Abb. 32 u. 33, S. 80).
Eine vergleichende Einordnung der Ergebnisse in die bestehende Literatur ist nicht leicht möglich, da einerseits mit unterschiedlichen Zellspezies, und andererseits mit divergenten Versuchsmodellen gearbeitet wurde. Ausgangspunkt der Arbeit waren Untersuchungen von KLEIN und HOHLFELD Klein et al. (2000), die eine immortalisierte Zelllinie menschlicher Keratinozyten (HaCat-Zellen) auf verschiedenartigen Titanträgern kultivierten.
In einer Vielzahl von in vitro Tests zur Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von Zellen an diversen Oberflächen werden bis heute unterschiedlichste Materialien wie Silikone, Polystyrene, Perspex, Epoxy, Titane etc. verwendet. Diese Werkstoffe sind bezüglich ihrer Oberflächenchemie und -topographie voneinander deutlich verschieden. Es muss angenommen werden, dass die beobachteten Unterschiede bezüglich des Zellverhaltens an Oberflächen durch die verschiedenen Materialeigenschaften verursacht werden.
Von zahlreichen Autoren, die in ihren Untersuchungen sowohl Keratinozyten als auch Fibroblasten verwendeten, wird die Oberflächentopographie als die vorherrschende Einflussgröße hinsichtlich der Zellantwort auf unterschiedliche Materialien und die Kontaktführung als das Resultat einer vorzugsweisen Proteinadsorption auf scharfkantigen Oberflächenrauhigkeiten betrachtet. Dahingegen konnten WAlboomers et al. nachweisen, dass auch eine plane titanbeschichtete Polystyrene-Textur eine Kontaktführung induziert. Daraus folgerten sie, dass die Theorie einer vorzugsweisen Proteinadsorption vermutlich nicht gültig ist, dass vielmehr die Kontaktführung von an den Filopodien einwirkenden mechanischen Kräften verursacht wird, wodurch die Zellen angeregt werden, Aktinfilamente auszubilden und sich dadurch der Werkstoffoberfläche anpassen Walboomers et al. (1999).
Die in dieser Studie durchgeführte Rasterelektronenmikroskopie bestätigt die Ergebnisse von WALBOOMERS und zeigt auf den planen im Vergleich zu den übrigen Oberflächen die ausgeprägteste Spreitung der Fibroblasten; deren Gestalt ist nach allen Seiten hin plan ausgezogen und am deutlichsten abgeflacht. Ebenso findet sich hier die stärkste Ausbildung von Aktinfilamenten. Die Anpassung der Fibroblasten an die plane Titanoberfläche erscheint perfekt.
RÄISÄNEN et al. belegten, dass insbesondere glatte Titanoberflächen für die Adhäsion und Ausbreitung epihelialer Zellen günstigere Bedingungen bieten als nicht metallische
Eine zusätzliche RFGD-Behandlung der polierten Titanträger führt zwar nach 12 Stunden zu keiner Steigerung der Zellanhaftung, jedoch nach 72 Stunden sowohl zu den höchsten Proliferationsraten als auch zum stärksten Fibroblastenbewuchs. Nur die RFGD-vorbehandelten plus kollagendotierten planen Titanoberflächen zeigen nach 72 Stunden einen geringgradig stärkeren Fibroblastenbewuchs. Eine Oberflächenvergrößerung und -texturierung durch Sand- und Kugelstrahlung erbringt gegenüber den polierten, nicht RFGD-behandelten Titanplättchen keinen Vorteil. Bei den angerauhten Titanträgern führt jedoch die RFGD-Behandlung zu einer Angleichung der nach 12 Stunden gemessenen Zellzahlen an die Verhältnisse bei den polierten, nicht RFGD-behandelten Trägern, sodass sich keine signifikanten Unterschiede mehr ergeben.
Des Weiteren bestätigt die vorliegende Studie eine eindeutige Überlegenheit der Titanoberflächen gegenüber den silikonbeschichteten, bei denen die RFGD-Behandlung zu einer verminderten Adhäsion und Proliferation der Fibroblasten führt. Dies deckt sich mit einer Vielzahl anderer Untersuchungen den Braber et al. (1998),den Braber et al. (1998).
Der elektronenmikroskopische Vergleich der RFGD-behandelten mit den physikalisch unbehandelten Oberflächen dokumentiert zwar (mit Ausnahme bei silikonbeschichteten Oberflächen) den positiven Einfluss der RFGD-Behandlung auf das Fibroblastenwachstum, jedoch ist kein erkennbarer Einfluss auf die Zellorientierung und -gestalt der Fibroblasten nachweisbar. Diese Ergebnisse entsprechen den Resultaten von DEN BRABER und Kollegen, die den Effekt der Oberflächenbehandlung mit dem Glow-Discharge-Verfahren an glatten und mikrotexturierten Silikonsubstraten untersuchten den Braber et al. (1995).
Die Ergebnisse dieser Studie sind nur eingeschränkt mit denen von KLEIN und HOHLFELD vergleichbar, da diese zur Untersuchung der Keratinozytenadhäsion einerseits eine doppelt so lange Kultivierungszeit, nämlich 24 statt 12 Stunden, anwendeten, und andererseits anstelle der planen Titanträger konvexe Abutmenthälften in ihren Versuchsreihen einsetzten. Überdies wurden einzig RFGD-behandelte Träger (halbierte Abutments) eingesetzt. Physikalisch unbehandelte Träger wurden von KLEIN und HOHLFELD nicht untersucht. Inwieweit also das RFGD-Verfahren für Haftung und
KLEIN und HOHLFELD kamen zu folgenden Ergebnissen:
Nach 72 Stunden zeigte sich ein deutlicher Vorteil der Kollagen A-dotierten gegenüber den übrigen Oberflächentexturen. Die RFGD-behandelten, polierten Oberflächen schnitten hier bezüglich der initialen Anhaftung der Keratinozyten und des Gesamteffektes von Adhäsion und Proliferation am schlechtesten ab.
Eine Oberflächenvergrößerung und -anrauhung führte bei Keratinozyten zu verbesserter Haftung und erhöhtem Bewuchs (Gesamteffekt von Adhäsion und Proliferation).
Die silikonbeschichteten Oberflächen waren im Hinblick auf die Keratinozytenadhäsion und -proliferation sowohl den sandgestrahlten als auch den Kollagen A-dotierten deutlich unterlegen, schnitten jedoch besser ab als die polierten Träger. Hierbei war tendenziell erkennbar, dass Polymeroberflächen im Vergleich mit reinen Titanoberflächen zu verbesserter Keratinozytenadhäsion führen können. Jedoch bot eine Silikonbeschichtung gegenüber den angerauhten bzw. sandgestrahlten Oberflächen auch für Keratinozyten keinen nennenswerten Vorteil.
Vergleicht man nun die bei Fibroblasten und Keratinozyten gemessenen Zellzahlen, so ergeben sich folgende Unterschiede (Abb. 36):
Während eine Oberflächenvergrößerung durch Sandstrahlung bei Keratinozyten zu verbessertem Bewuchs führt bietet diese keinen Vorteil für Fibroblasten.
Fibroblasten zeigen an polierten Oberflächen das beste Haftungs- und Wachstumsverhalten; dahingegen sind die polierten Oberflächen im Vergleich zu allen übrigen Oberflächen (silikon- u. kollagenbeschichtete, sandgestrahlte) für das Wachstum der Keratinozyten am ungünstigsten.
An silikonbeschichteten Oberflächen zeigen Fibroblasten das schlechteste Haftungs– und Wachstumsverhalten, jedoch sind Silikonoberflächen insbesondere hinsichtlich des Gesamteffektes von Adhäsion und Proliferation der Keratinozyten den polierten Titanoberflächen überlegen.
In den Untersuchungen zur Keratinozytenadhäsion und –proliferation an oberflächenmodifizierten Hülsenimplantaten wurden lediglich die ermittelten Zellzahlen am Ende der jeweiligen Kultivierungszeiträume verglichen. Die zeitgebundenen Wachstumsvorgänge an der Grenzfläche Werkstoff-Biosystem blieben unberücksichtigt. Über die Proliferationsraten der Keratinozyten im Zeitraum nach erfolgter Zellanhaftung bis zum Ende der Wachstumsphase (72h) wurde keine Aussage gemacht. Da für beide Kultivierungszeiträume (12 h und 72 h) unterschiedliche Zellmengen (2 x 104/ µl und 4 x 104/ µl) eingesetzt wurden, ließ sich hierüber ohnehin nichts aussagen.
Der Vergleich der Proliferationsraten mit den am Ende der Zellkultivierung gemessenen Zellzahlen ermöglicht es zu erkennen, ob ein ausreichend langer Kultivierungszeitraum zur Beurteilung der auf die Zellproliferation günstig oder ungünstig einwirkenden Oberflächeneffekte gewählt wurde. Denkbar ist nämlich, dass erst nach einem längeren Kultivierungszeitraum eine schlechtere Anhaftung von Zellen an einer Oberfläche durch
Wenngleich eine statistische Analyse der Proliferationsraten aufgrund des in der hier vorliegenden Studie gewählten Versuchsmodells nicht möglich ist, so lässt sich dennoch eine Tendenz im Proliferationsverhalten der Fibroblasten aufzeigen, da für beide Kultivierungszeiträume (12 h und 72 h) die gleichen Zellmengen (1 x 104/ µl) verwendet wurden.
Mit dem in dieser Studie angewandten Zellkulturmodell lässt sich die Frage, ob eine durch eine spezifische Oberflächenart bedingte, verbesserte Zellhaftung zwangsläufig auch zu gesteigertem Zellwachstum führt, nicht beantworten. Weitere Studien und die Entwicklung eines hierfür geeigneten Studiendesigns sind nötig, dieser Frage auf den Grund zu gehen.
Es ist nicht auszuschließen, dass es in vivo noch zu Veränderungen im Wachstumsverhalten von Fibroblasten und Keratinozyten kommen kann, weil die in dieser Untersuchung verwendeten Kultivierungszeiträume recht kurz gewählt sind und beim lebenden Organismus in den Zeitraum der Entzündungsphase, die der Implantation eines Biomaterials folgt, fallen würden. Eine Überprüfung der gewonnenen Erkenntnisse kann daher erst am lebenden Organismus erfolgen.
Da die Kollagen A-Beschichtung bei beiden Zelltypen, Fibroblasten und Keratinozyten, zu signifikant verbessertem Zellwachstum führt, erscheint eine in vivo Versuchsreihe mit Kollagen-A-beschichteten und RFGD-vorbehandelten Hülsenimplantaten (Abutments) sinnvoll. Überdies ist eine Kollagen A-Dotierung die am einfachsten herzustellende Oberflächenmodifikation.
Des Weiteren wäre abzuklären, ob entweder durch verbesserte Zellhaftung am Implantat oder durch vermehrtes Wachstum auf der Implantatoberfläche das Risiko einer periimplantären Entzündung vermindert wird. Vermutlich aber ist hier der Gesamteffekt von Adhäsion und Proliferation der Zellen am Implantat entscheidend.
Die vorliegende Studie vermag nicht zu klären, ob eine anfänglich keimdichte Versiegelung in vivo dauerhaft bestehen bleibt. Hier sind ganz sicher sowohl lokal einwirkende, biomechanische Krafteinflüsse als auch Entzündungsfaktoren von Bedeutung.
Angesichts der nahezu unüberschaubaren Fülle an Studien zur Problematik „Grenzfläche: Implantat-Biosystem“ und der sich laufend verbessernden Technologien erscheint eine Synopse der Fachliteratur der letzten Jahre unentbehrlich. Die Vielzahl der bei Adhäsionsvorgängen beteiligten Einflussgrößen (materialseitige und zellbiologische) erschwert zusätzlich die vergleichende Bewertung unterschiedlicher Implantatwerkstoffe. Umso mehr sind in vivo Testungen von Implantaten unumgänglich.
Was zählt, ist letztlich die Entzündungsfreiheit und damit der Implantaterfolg.
Bei Hautdurchleitungen besteht durch den iatrogen geschaffenen und permanenten Hautdefekt eine spezifische Problematik in der Dreiphasenlinie, in welcher Implantat-oberfläche, Umgebungsgewebe und Luft bzw. Körpersekrete aufeinandertreffen. Hierdurch wird das Eindringen von Keimen in das Gewebe begünstigt. Für den Heilungsprozess im Bereich der Haut sind zwei Gegebenheiten von Bedeutung: erstens der epitheliale und zweitens der bindegewebige Heilungsprozess. Folglich wird nach einem Biomaterial respektive einer Oberfläche gesucht, welche für Keratinozyten wie auch für Fibroblasten die günstigsten Bedingungen zur Anhaftung und Proliferation am Implantat bietet.
Reintitan ist der einzige bei extraoralen Hülsenimplantaten eingesetzte Biowerkstoff, welcher zwar die Osseointegration, nicht aber eine sichere Implantat-Gewebe-Versiegelung im Niveau der Haut ermöglicht. Um jedoch den klinischen Erfolg von Hautdurchleitungen zu gewährleisten, ist eine ausreichend dichte Material-Gewebe-Versiegelung erforderlich, welche eine Keimpenetration und -invasion und die Ablagerung von Debris in den subepithelialen Gewebeschichten verhindern hilft. Dies gelingt jedoch klinisch bisher nicht. Daher erhofft man sich, mittels Modifikationen der Titanoberflächen eine verbesserte Gewebe-Implantat-Versiegelung erzielen zu können.
Vorgestellt wird ein in vitro Modell, das die Untersuchung der Adhäsion, Zellspreitung und Proliferation von humanen Fibroblasten an unterschiedlich oberflächenmodifizierten Werkstoffen unter konstanten und reproduzierbaren Bedingungen ermöglicht.
Im Hinblick auf die Vergleichbarkeit mit vorangegangenen Studien der Keratinozytenadhäsion und –proliferation wurden fünf verschiedenartig mechanisch und (bio–)chemisch oberflächenmodifizierte Titanplättchen (kugelgestrahlte, sandgestrahlte, polierte, silikon- sowie kollagenbeschichtete) eigens hergestellt und untersucht. Die Hälfte aller Plättchen wurde noch zusätzlich physikalisch mit einem Plasmasterilisierungsverfahren, dem Radio-frequency-glow-discharge-treatment (RFGDT), vorbehandelt. Hierdurch ergaben sich insgesamt 10 verschiedene Oberflächen. Jeweils zehn Plättchen einer Werkstoffart wurden in Wells einer 96er Mikrotiterplatte eingebracht und nach Auffüllen der Wells durch Nährstofflösung mit 1 x 104 Fibroblasten (humane Fibroblasten) beschickt. Die Fibroblasten konnten so gleichmäßig verteilt auf die Oberflächen der Titanplättchen herabsintern, an diesen adhärieren und anschließend proliferieren. Zwecks Beurteilung der Adhäsion wurde die Zellkultivierung
Die Studie kommt zu folgenden Ergebnissen:
Bezüglich der Fibroblastenadhäsion ist die Plasmasterilisierung (RFGD-Verfahren) bei kugelgestrahlter, sandgestrahlter und Kollagen-A-beschichteter Oberfläche den physikalisch unbehandelten Oberflächen überlegen, bei Silikonbeschichtung aber von Nachteil.
Das RFGD-Verfahren ist hinsichtlich des Gesamteffekts von Adhäsion und Proliferation der Fibroblasten bei den gleichen Oberflächen überlegen, außerdem noch bei polierter Oberfläche.
Die höchsten Zuwachsraten im Zeitraum zwischen 12 und 72 Stunden weisen sowohl die polierten plus RFGD-behandelten als auch die Kollagen-A-beschichteten plus RFGD-behandelten Oberflächen auf.
Trotz eines niedrigeren Zellbewuchses am Ende einer 72stündigen Fibroblastenkultivierung kann ein höherer Zellzuwachs nach erfolgter Adhäsion vorgelegen haben. Es ist möglich, dass eine schlechtere Anhaftung von Zellen an einer Oberfläche durch eine verbesserte Proliferation wett gemacht wird.
Die Auswertung der Elektronenmikroskopie bestätigt die quantitativen, zellbiologischen Ergebnisse.
Der Vergleich der vorliegenden Studie mit den Untersuchungen zur Keratinozytenadhäsion und –proliferation zeigt ein zum Teil andersartiges Haftungs- und Wachstumsverhalten der Fibroblasten an gleichartig oberflächenmodifizierten Titanwerkstoffen. Im Vergleich zu allen übrigen Werkstoffoberflächen führt jedoch die Kollagen-A-Dotierung der Titanoberflächen bei Fibroblasten und Keratinozyten gleichermaßen zum größten Ausmaß von Adhäsion und Proliferation.
Aufgrund der Komplexität und Vielzahl an Einflussgrößen, welche sich unter verschiedenen Bedingungen unterscheiden können, ist der detaillierte Vergleich des in vitro und in vivo Zellverhaltens auf mikrotexturierten Materialien problematisch. Weitere Studien sind notwendig, um den bindegewebigen und epithelialen Organisations-prozess in der Implantatumgebung besser verstehen zu können.
Meinem Doktorvater, Herrn Privatdozent Dr. med. Dr. dent. M. Klein, leitender Oberarzt der Klinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie, Charité - Campus Virchow-Klinikum, gilt mein besonderer Dank für die Überlassung des Themas und für die engagierte Betreuung meiner Arbeit.
Herrn Privatdozent Dr. Ch. Große-Siestrup, Leiter des tierexperimentellen Instituts des Forschungshauses der Charité, danke ich sowohl für seine Bereitschaft zu offenem Gespräch, die vielen Gedankenanstöße und fundierten Informationen bezüglich der Problematik von Hautdurchleitungen als auch für die Bereitstellung des Zellkulturlabors seines Instituts, ohne welche die Durchführung der Zellkulturversuche wohl kaum möglich gewesen wäre.
Frau Vildan Essig gilt mein Dank für Ihre unermüdliche Hilfsbereitschaft, die vielen nützlichen Tipps beim Erlernen der Zellkultivierung, ihre Mithilfe bei der Materialbeschaffung und der Ermöglichung meines Zugangs zu anderen Fachabteilungen des Forschungshauses der Charité, Campus Virchow-Klinikum.
Frau Gudrun Holland von der Abteilung für Elektronenmikroskopie des Forschungshauses der Charité bin ich zu außerordentlichem Dank für ihre vortreffliche Unterstützung bei der Erstellung und Archivierung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen verpflichtet.
Herrn Priv.-Doz. Dr. med. A. Kage und Herrn A. Salomon danke ich für ihre stets freundschaftliche Kooperation, die vielen intensiven und informativen Fachgespräche, die Bereitstellung ihres Zellkulturlabors im Forschungshaus sowie die fundierte Beratung hinsichtlich der diversen labortechnischen Vorversuche.
Besonderer Dank gilt auch Frau Karsten und Herrn Baudisch vom Institut für Statistik der Humbold-Universität Berlin, die mir einen wesentlichen Beitrag bei der statistischen Versuchsplanung leisteten. Für die statistische Auswertung bin ich Frau Dipl.-Math. Brandstaedt vom Institut für Medizinische Statistik, Informatik und Dokumentation der Friedrich-Schiller-Universität Jena sehr zu Dank verpflichtet.
Ferner bedanke ich mich bei Herrn F. Hafner für seine exzellenten Fotoarbeiten.
Herrn Ernesto Miranda aus Chicago, USA, danke ich für seine vorzüglichen und prägnanten Zeichnungen.
Herrn Dr. - Ing. G.N. Duda von der Abteilung für Biomechanik des Forschungshauses der Charité, Campus Virchow-Klinikum, danke ich für die Bereitstellung der Räumlichkeiten und der Messapparaturen zur Durchführung der Ausziehversuche im Rahmen der Vorversuche.
Für die abschließende Durchsicht des Manuskripts danke ich meinem Vater, Prof. Dr. med. K.-E. Richard und Frau Judith Dirks.
Allen Freunden und Familienangehörigen danke ich für ihre moralische Unterstützung.
Ganz besonders aber bin ich meiner kleinen Tochter, Clara, die unendliche Geduld aufbringen und so oft auf mich verzichten musste, in Dankbarkeit verbunden.
Ausbildung:
Anstellungen:
Ich erkläre an Eides Statt, dass die Dissertation von mir selbst und ohne die (unzulässige) Hilfe Dritter verfasst wurde, auch in Teilen keine Kopie anderer Arbeiten darstellt und die benutzten Hilfsmittel sowie die Literatur vollständig angegeben sind.