Grundlagen der Rasterkraftmikroskopie Prinzipieller Aufbau des AFM

Das Rasterkraftmikroskop gehört zu der großen Familie der im angloamerikanischen Sprachraum als „Scanning Probe Microscopes“ bezeichneten Rastersonden-Mikroskope, deren gemeinsame Eigenschaft das lokal hochaufgelöste Erfassen von Objekteigenschaften im Nahfeld von Oberflächen ist. Demzufolge unterscheidet sich der prinzipielle Aufbau aller Rastersondenmikroskope kaum. Auf die Modifikationen der Sonden, der damit detektierbaren unterschiedlichen Messsignale und der sich daraus ableitenden Mikroskoptypen wird weiter unten detailliert eingegangen. Hinsichtlich der diversifizierten Terminologie der Methode sei klärend bemerkt: Das der Rasterkraftmikroskopie zugrundeliegende Messprinzip hat der Methode ihren Namen verliehen. Wir sprechen häufig von der „Atomic force microscopy (AFM)“ und definieren damit das im folgenden zu beschreibende Messprinzip.

Die elementaren Bestandteile der Rasterkraftmikroskope sind in Abbildung 3 schematisch zusammengefasst.

Abbildung 3 modifiziert nach ¹⁴

Eine, im Idealfall atomar spitze Nadel (Messtip), die nur wenige Mikrometer lang, weniger als 100 Angström dick und am freien Ende eines Federbalkens (Cantilever) befestigt ist, wird mit Hilfe einer mikromotorisch gesteuerten Feinmechanik in den Nahbereich (2-100 Å) der Oberfläche des Untersuchungsobjektes gebracht. Der zwischen Atomen dieser Spitze und Atomen der Probenoberfläche aufgrund interatomarer Wechselwirkungen entstehende Kraftgradient wird auf den Cantilever übertragen, dessen Auslenkung mittels unterschiedlicher Methoden detektiert werden kann. Als Messsignal aller Rasterkraftmikroskope wird also der, in seiner Komplexität noch zu beschreibende Kraftgradient zwischen Messtip und Probe verwendet. Die Auslenkung des Federbalkens wird heutzutage bei den meisten, kommerziell verfügbaren Mikroskopen durch einen auf die goldbedampfte, reflektierende Rückseite des Cantilevers adjustierten Laserstrahl an eine positionssensitive 2- oder 4-Felder-Photodiode (PSPD) weitergegeben, die Deviationen dieses Laserstrahls detektiert und in elektrische Spannungen um-wandelt. Um die Topografie der Probenoberfläche abzubilden, ist es notwendig, die beschriebenen Interaktionen nicht nur punktuell zu messen, sondern ein definiertes x-y-Punktraster in der Probenebene (üblicherweise 256x256 oder 512x512 Punkte) zu erfassen. Diese hochpräzise x-y-Translation realisiert ein piezokeramischer Scanner, der - in Abhängigkeit von der Länge des Scantubus und der angelegten Steuerspannung - verschieden große Areale abrastern kann. Dazu muss die Probe mit dem Scanner mechanisch gekoppelt werden. Hierfür haben sich magnetische Probenträger bewährt. Neben der präzisen Bewegung des Scanners in der Probenebene ermöglicht die spezielle Anordnung piezokeramischer Elemente eine weitere Bewegungskomponente in z-Richtung (senkrecht zur Probenoberfläche). Über einen Rückkopplungsmechanismus wirkt das detektierte Messsignal auf das piezokeramische z-Stellglied und gewährleistet, dass die Interaktionskraft an jedem Punkt innerhalb des x-y-Rasters konstant gehalten wird (“Constant-Force-Mode”). Die Position des z-Stellgliedes, die durch das umgewandelte PSPD-Messsignal jedes x-y-Punktes bestimmt wird, ergibt in Kombination mit den dazugehörigen x-y-Koordinaten ein dreidimensionales Abbild der Oberflächentopografie. Bei bekanntermaßen atomar flachen Proben (Einkristalle, Mica etc.) ist es möglich, den beschriebenen Feed-back-Mechanismus zu umgehen, um höhere zeitliche Auflösung zu erzielen (“Constant-Height-Mode”). Die so ermittelten x-y-z-Koordinaten der Probenoberfläche werden computergestützt prozessiert und gespeichert. Jede x-y-z-Koordinatenkombination besteht zunächst aus drei Spannungswerten:

die x-y-Werte entsprechen den Spannungen, die nötig sind um den piezokeramischen Scanner bis zum entsprechenden x-y-Objektpunkt zu bewegen,
der z- Wert entspricht der Spannung, die am Piezo anliegt, um diesen in Abhängigkeit vom Messsignal in vertikaler Richtung (z-Richtung) zu bewegen (Constant-Force-Mode), oder der Spannung, die direkt an der PSPD abgeleitet werden kann (Constant-Height-Mode)

Der DSP-(Digital Signal Processing) Chip des Computer ordnet den Spannungs-werten numerische x-y-z-Werte zu und bildverarbeitende Software realisiert die z-Wert assoziierte Zuordnung von Grau- bzw. Farbstufen zu jedem x-y-Bildpunkt. Um zu gewährleisten dass die gemessenen x-y-z-Werte die reale Oberflächentopografie wiedergeben, wird der Scanner in regelmäßigen Abständen, mit Hilfe definierter Längen- und Höhenstandards (Kalibrierungsgitter s.u.) kalibriert.

PSI Autoprobe CP ⁸²

Das im Rahmen dieser Arbeit angewandte Mikroskop „Autoprobe CP“ (Abbildung 4) ist ein Produkt der Firma PSI (Park Scientific Instruments). Es ist mit einem 100-µm-Scanner (maximales Probenareal: 100 µm²) und einem 5-µm-Scanner (maximales Probenareal: 5 µm²) ausgerüstet. Zur Messsignaldetektion wird eine Laserdiode (λ = 600 – 700 nm) mit 0,2 mW maximaler Ausgangsleistung

Abbildung 4 modifiziert nach ⁸²

eingesetzt. Die Annäherung des Messtip, welcher austauschbar in eine vertikal bewegliche Arbeitsbühne integriert ist, an die Objektoberfläche wird durch 3 feinmechanische Schrittmotoren (0,4 µm/pro Schritt; maximale Geschwindigkeit 2,0 mm/s) realisiert. Zur manuellen Ausrichtung des Objektes, Laserjustierung und zur Positionierung der Messspitze über der zu untersuchenden Region auf der Objektoberfläche dient ein Lichtmikroskop (Objektiv 10- bis 50fach stufenlos), das über eine hochauflösende CCD-Kamera mit einem Videomonitor verbunden ist. Zusätzlich verfügt das System über Scan-Linearitätssensoren, eine Hardware-Komponente, die intrinsische Nonlinearitäten (s.u.) des piezokeramischen Scanners ausgleicht.

Die verarbeitende und steuernde Computereinheit hat folgende Charakteristik:

CPU: 50 MHz, 486 Prozessor, 256KByte cache memory, 32 MByte RAM
Speicher: 1 GByte Festplatte
Betriebssystem: Windows 95 / später Windows 98
Software: PSI ProScan 1.5 für Mikroskopsteuerung und Bildverarbeitung

Das lokale Experiment – Grundlage der verschiedenen Rastersondenmikroskope ⁸³

Wie bereits beschrieben, ermöglichen Rastersondenmikroskope das lokal hochaufgelöste Erfassen von Objekteigenschaften im Nahfeld von Unter-suchungsoberflächen. Im Falle der Rasterkraftmikroskope erreicht man atomare Auflösung an kristallinen Strukturen, indem eine atomar spitze Sonde mit einem sehr geringen Wechselwirkungsvolumen der zu untersuchenden Objektoberfläche in Wechselwirkung tritt. Dabei bilden interatomare Kräfte zwischen Sonde und Objektoberfläche die Grundlage für die mikroskopische Abbildung der topografischen Objektinformationen. Bekanntermaßen sind Oberflächen amorpher, kristalliner und biologischer Objekte nicht ausschließlich durch ihre topografischen Informationen definierbar. Andere Eigenschaften, wie die elektrische Leitfähigkeit, die Verteilung magnetischer und elektrostatischer Felder, die Ionenstromverteilung an biologischen Proben, die chemische Zusammensetzung, die Elastizität bzw. Viskosität von Oberflächen oder auch die Rezeptor-Ligand-Interaktionsstärke bestimmter Oberflächenproteine, um nur die wichtigsten zu nennen, sind für die Objektcharakterisierung mindestens genauso interessant. Im Falle der Rasterkraftmikroskopie ermöglicht das “lokale Experiment”, Kräfte im Bereich einiger Piconewton zu detektieren. Erreicht wird dies durch die im Rahmen des Nahfeldexperiments gewählte Messsonde (Silizium-Siliziumnitrid-Spitze). Möchte man hingegen die o.g. Eigenschaften der Oberfläche mit hoher lokaler Auflösung detektieren, so kann dies nur mittels spezieller Modifikation der Messsonde erreicht werden. Häufig sind die Geräte optional so ausgelegt, dass mehrere Eigenschaften simultan detektierbar sind. Dadurch können z.B. die Verteilung von Elastizitäten oder die Ladungsverteilung mit der topografischen Morphologie der Oberflächen assoziiert werden. Die Vielfalt der sich daraus ergebenden Rastersondenmikroskope, die bis heute zur Anwendung kommen, wird unter 3.2 beschrieben. Somit ist die Entwicklung neuer Rastersondenmikroskope nur eine Frage der Kreativität der Anwender. Spezifische Oberflächen-assoziierte Fragestellungen werden in Zukunft zunehmend dazu führen, dass man die Messsonden und damit das “lokale Experiment” entsprechend dieser Fragestellung modifiziert. Das allen Rastersondenmikroskopen zugrundeliegende Messprinzip wird also nur hinsichtlich des im Oberflächennahfeld interagierenden Wechselwirkungsvolumens (Messsonde) verändert, um neue Rastersondenmikroskope für neue Fragestellungen zu entwickeln.

Kräfte in der AFM

Als Messsignal wird in der Rasterkraftmikroskopie der Kraftgradient zwischen einer Sondenspitze und der zu untersuchenden Objektoberfläche verwendet. Diese Kräfte entstehen im Nahfeld von Oberflächen (0 - 100Å) durch die Interaktionspotentiale zwischen den Atomen der Messspitze und Atomen der Objektoberfläche. Interatomare Wechselwirkungspotentiale (w) werden durch die Lennard-Jones-Funktion mathematisch beschrieben:

wobei (d)der Abstand der Atome ist und (C1,C2) Konstanten sind.

C1/d¹² beschreibt dabei den abstoßenden Teil der interatomaren Kräfte, welcher hauptsächlich durch ionische- und Paulipotentiale entsteht. Diese Abstoßung tritt nur auf, wenn Körper sich auf weniger als 2 Å annähern. Sie ist demzufolge nur sehr kurzreichweitig. In größeren Abstandsbereichen zwischen 2 Å und 100 Å ziehen sich Atome zweier Körper gegenseitig durch „van der Waals Kräfte“ an. Van der Waals Kräfte entstehen durch die Wechselwirkung fester Dipole, fester Dipole mit induzierten Dipolen und induzierter Dipole mit induzierten Dipolen und können anziehend aber auch schwach abstoßend wirken. Ihre Abstandsabhängigkeit wird in der Lennard-Jones-Funktion durch den Term C2/d⁶ definiert. Die größere Reichweite dieser Wechselwirkung bedingt, dass nur die vorderen Spitzenatome der Abbildung 5 aus ⁸⁵

Messsonde effektiv mit den Atomen der Objekt-oberfläche interagieren und die Summe aller atomaren Interaktionen das Ausmaß der Anziehung oder Abstoßung bestimmt. Die Kraftbeträge liegen im Bereich zwischen 1 nN und 1 pN. Wie groß diese Kraft ist und ob abstoßende oder anziehende Kräfte dominieren, ist also einerseits vom Abstand zwischen den Atomen, andererseits aber auch von deren räumlicher Anordnung abhängig, da im Falle einer atomar spitzen AFM-Messsonde eben nicht nur die vordersten Spitzenatome interagieren. (Abbildung 5). So werden in Abhängigkeit vom Messtip-Objekt-abstand die vordersten Spitzenatome beispielsweise durch ionische- oder Pauliabstoßung beeinflusst, wogegen andere Atome im Wechselwirkungsbereich anziehende van der Waals Kräfte aufeinander ausüben. Selbstverständlich bestehen diese Interaktionen auch innerhalb des Silizium- bzw. Siliziumnitrid-Atomgitters des Messtips zwischen benachbarten Atomen. Neben den erwähnten ionischen-, Pauli- und van der Waals-Kräften spielen eine Reihe anderer Einflüsse eine wichtige Rolle. Bei der rasterkraftmikroskopischen Untersuchung von Oberflächen bildet sich unter Raumbedingungen luftfeuchtigkeitsbedingt auf der Objektoberfläche und an der Messspitze ein hauchdünner Wasserfilm aus. Zwischen diesen Feuchtigkeitsfilmen entstehen bei Annäherung von Messsonde und Objekt stark adhäsive Meniskuskräfte (~100 nN) durch Ausbildung von Wasserbrücken. Durch die mikroskopische Untersuchung in Flüssigkeiten (z.B. zellphysiologische Puffermedien) wird diese unerwünschte Interaktionskraft eliminiert. In wässriger Lösung spielen stark repulsive Kräfte zwischen Objekt und Sondenspitze (sog. double-layer-repulsion) eine Rolle, deren Stärke von der Ionenstärke der Lösung und von der Aufladung von Spitze und Objekt abhängt. Chemisorption, Physiosorption und metallische Adhäsion generieren anziehende interatomare Potentiale.

Abbildung 6: Lennard- Jones- Funktion interatomarer Wechselwirkungen

Der Abstand zwischen Objektoberfläche und Spitze der Messsonde (Tip) kann durch pikometergenaue Stellmechanik (z-Bewegung des Scanners und mikrometergenaue Schrittmotoren) sehr präzise eingestellt werden. Dies ermöglicht für rasterkraftmikroskopische Untersuchungen prinzipiell zwei Mess-methoden. Im sogenannten Contact-Mode hat die Messspitze physika-lischen Kontakt zur Objektoberfläche, wobei die Auflagekraft (~ 1 - 100 pN) von den Federeigenschaften des Cantilevers abhängig ist. Berührt die Spitze die Objektoberfläche nicht, spricht man vom Non-Contact-Mode. Dabei schwebt die Messspitze in einem Abstand von maximal 100 Å über der Objektoberfläche und es dominieren anziehende interatomare Kräfte. Abbildung 6 verdeutlicht die erläuterten Zusammenhänge in vereinfachter Form. Verringert man den Abstand zwischen Messsonde und Objektoberfläche so kommt es im Nahfeldbereich der Oberfläche zunächst zu inkrementalem Anstieg der anziehenden interatomaren Potentiale (vorwiegend van der Waals Kräfte). In diesem Abstandsbereich bewegt sich die Messsonde im Non-Contact-Mode über der Objektoberfläche (1). Je näher die Messspitze an die Probe angenähert wird, umso stärker gewinnen repulsive interatomare Potentiale Einfluss, so dass die noch anziehend wirkende Nettokraft wieder abnimmt bis die Sondenspitze die Oberfläche des Untersuchungsobjektes berührt (2). Jetzt dominieren abstoßende interatomare Kräfte (ionische- und Pauliabstoßung), obgleich auch Interaktionen zwischen weiterentfernten Atomen (siehe Abbildung 5) schwache anziehende Kräfte generieren. Die Komplexität dieser, hier beschriebenen Wechselwirkungskräfte und deren multifaktorielle Abhängigkeit erschwert die Anwendung der Rasterkraft-mikroskopie insbesondere an biologischen Proben erheblich. Häufig zwingt sie den Anwender, die optimalen Abbildungsbedingungen für jedes neue Untersuchungs-objekt empirisch zu ermitteln und zu optimieren.

Die Scannereinheit ⁸⁴

Das extrem hohe Auflösungspotential der Rastersondenmikroskope wird im besonderen durch eine piezokeramische Präzisionsmechanik gewährleistet, welche die Messsonde relativ zur Objektoberfläche bzw. die Oberfläche relativ zur Sonde bewegt.

Design und Funktionsweise

Diese Präzisionsrastereinheiten, im folgenden als Scanner bezeichnet, bestehen aus piezokeramischem Material (vorwiegend Blei-Zirkonium-Titanat (PZT)) und realisieren Translationsbewegungen in allen drei Raumebenen, wobei die maximal erreichbare Auslenkung von der Anordnung, der Geometrie (Länge, Durchmesser und Wanddicke) oder von Materialeigenschaften (piezoelektrischer Kopplungs-koeffizient) der piezokeramischen Elemente abhängt und die erreichbare Stellgenauigkeit von ~ 1 pm (0,01 Å) keine Auflösungsbegrenzung darstellt. Die Bewegungen des Scanners in horizontaler Ebene (x-y-Ebene = Objektebene) wird durch einen computergesteuerten Hochspannungsgenerator erzeugt. Um ein definiert großes, horizontales Areal der Objektoberfläche abzurastern, muss zunächst festgelegt werden, welche x-y-Raumrichtung der „Schnellen-Scan-Richtung (fast-scan-direction)” und welche der „Langsamen-Scan-Richtung (slow-scan-direction)“ entsprechen soll. Außerdem ist die Festlegung der Datenpunktmatrix notwendig. Ein rastersondenmikroskopisches Bild, welches mit einer Scanmatrix von 100x100 Punkten generiert würde, bestünde aus 10.000 Bildpunkten, da an jeder x-y-Position des Scanners ein z-Messwert generiert wird. Üblicherweise werden Matrizen mit 64x64-, 128x128-, 256x256- oder 512x512- Punkten benutzt. Computergesteuert bewegt sich der Scanner entlang der ersten Bildpunktzeile des definierten Areals hin und zurück (schnelle Scanrichtung). Anschließend bewegt er sich rechtwinklig dazu (langsame Scanrichtung), um in die zweite Bildpunktzeile zu gelangen, fährt darauf hin und zurück, springt in die dritte Zeile und so weiter bis er die letzte Zeile des festgelegten Areals erreicht hat (siehe Abbildung 7).⁸⁵

Abbildung 7 aus ⁸⁵

Die Entfernung benachbarter Punkte innerhalb dieser Matrix, welche das laterale Auflösungsvermögen des Scanners beschreibt, ist demnach von der Größe des zu untersuchen-den Areals auf der Probenoberfläche und der gewählten Scanmatrix abhängig. Generiert man beispiels-weise 512x512 Bildpunkte einer Objektoberfläche von 5 µm² Größe, so ist die Entfernung benachbarter Punkte innerhalb der Scanmatrix (Schrittgröße des Scanners) 9,7 nm. Bei 0,5 µm² großem x-y-Scanareal läge diese Schrittgröße des Scanners bei ~ 1 nm, also schon im Bereich atomarer Diameter. Diese Stellgenauigkeit des Piezos wird auch in vertikaler Richtung erreicht, womit eindeutig belegt ist, dass der piezokeramische Scanner das räumliche Auflösungsvermögen der Rastersondenmikroskope nicht limitiert.

Der piezoelektrische Effekt

Die Geschwister Marie und Pierre Curie beschrieben als Erste, dass bei mechanischer Deformierung bestimmter Materialien (Piezokristalle) ableitbare elektrische Spannungen entstehen (direkter piezoelektrischer Effekt). Legt man an einen solchen piezokeramischen Körper eine elektrische Spannung U an, so verformt sich das Kristallgitter, was zur Kontraktion bzw. Expansion des Körpers um den Betrag xo führt (indirekter piezoelektrischer Effekt):

wobei (k) den materialabhängigen, piezoelektrischen Kopplungsfaktor beschreibt, (C) die elektrische Kapazität ist und (C*) die mechanische Steifigkeit des Körpers charakterisiert. ⁸⁴

Natürliche Piezo-Polykristalle bestehen aus ungeordneten Einzelkristallen, wobei jede dieser monokristallinen Strukturen ein eigenes elektrisches Dipolmoment besitzt. Diese Dipolmomente bilden die theoretische Basis des erwähnten piezoelektrischen Effektes.

Herstellung piezokeramischer Präzisionsscanner

Abbildung 8 aus ⁸⁵

Materialien mit piezoelektrischen Eigenschaften werden aus metallischen Pulvern der Einzelkomponenten (z.B. Blei, Titan, Zirkonium) durch Sinterungsprozesse hergestellt. Die Dipolmomente der Monokristalle in diesen Rohpiezos sind jedoch unausgerichtet, so dass die gerichtete Bewegung eines daraus gefertigten Scanner-Tubus quasi unmöglich wäre. Deshalb wird nach Erhitzen auf über 200°C eine DC-Spannung über mehrere Stunden an die gesinterten Scanner-Tuben angelegt, um die ungeordneten Dipolmomente auszu-richten. Nach Abkühlen des Scanners verbleiben die neuorientierten Dipol-kristalle in der ausgerichteten For-mation, wodurch eine spannungs-abhängig sehr genau definierte Be-wegung des Scanners erreicht wird. Der im “PSI Autoprobe CP”-Mikroskop und in vielen, kommerziell verfügbaren Rastersondenmikroskop-en integrierte Scanner ist nach dem Prinzip der unterteilten Tubus-An-ordnung von piezokeramischen Ele-menten (“segmented-tube-design”) aufgebaut (siehe nebenstehende Abbildung 8). Dieses Piezorohr ist in vier gleiche Sektoren in Richtung der Rohrachse unterteilt. An gegen-überliegende Segmente wird eine, relativ zur inneren Elektrode entge-gengesetzte Spannung angelegt. Durch die erzeugte Bewegung des Piezorohres kann jeder Punkt innerhalb eines 2-dimensionalen, horizontalen x-y-Gitters angesteuert werden. Die vertikale Bewegung des Scanners (z-Komponente, Messsignal für Constant-Force-Mode) ermöglicht ein zentral angeordnetes Piezoelement (innere Elektrode).

Eigenresonanz, maximale Scanfrequenz- und geschwindigkeit

Wie bereitst ausgeführt, wird das räumliche Auflösungsvermögen der Rastersondenmikroskope definitiv nicht durch den Scanner eingeschränkt. Betrachtet man das zeitliche Auflösungsvermögen der Methode, erkennt man sofort, dass hierbei der Scanner die limitierende Komponente zu sein scheint. Den Scanprozess als Schwingungsvorgang zwischen zwei benachbarten Punkten der Scanmatrix begreifend, sieht man, dass die Scanfrequenz (Hz) sehr hoch sein muss, um hohe zeitliche Auflösung zu erreichen. Zur Verdeutlichung sei folgendes, sehr vereinfachtes Beispiel angeführt: Ein rastersondenmikroskopisches Bild, das aus 512x512 Bildpunkten bestehen soll, enthält 262144 x-y-z-Koordinatenpaare. Bei 1000 Punkten/s (Hz) würde die Abbildung ungeachtet aller anderen Einflüsse (Computerrechenzeit, Nonlinearitätsausgleich etc.) ca. 4’22’’ dauern. Bei 10 KHz dauerte dies immer noch 26 s, bei 20 kHz 13 s. In diese Berechnung gehen die z-Stellbewegungen des Scanners an jedem x-y-Punkt nicht mit ein, so dass im üblichen Constant-Force-Mode” deutlich längere Abbildungszeiten zu erwarten sind. Die Eigenfrequenzen moderner Scanner liegen im Bereich zwischen 1 kHz und 20 kHz. Die piezokeramischen Elemente sollten allerdings während des Scanvorganges unterhalb ihrer Eigenfrequenz angesprochen werden, um unkontrollierte und destruierende Resonanzschwingungen zu vermeiden. Dies bedeutet, dass für die Untersuchung funktioneller, zellphysiologischer Phänomene wünschenswerte zeitliche Auflösungen im Bereich weniger Millisekunden bei entsprechend hoher räumlicher Auflösung theoretisch unmöglich sind. Bildet man, dem o.g. Rechenbeispiel folgend, allerdings nur 64x64 Bildpunkte ab und benutzt einen Scantubus mit hoher Eigenfrequenz, so sind theoretisch zeitliche Auflösungen im Bereich von ~ 200 ms zu erreichen. Ungeachtet der hier aufgeführten Beispiele kristallisiert sich ein wichtiges Problem der Rastersondenmikroskopie heraus: Hohes zeitliches Auflösungsvermögen des Scanners erfordert die Reduktion der räumlichen Auflösung und umgekehrt sind hohe Bildpunktdichten nur bei relativ langer Abbildungsdauer realisierbar.

Die maximale Scannergeschwindigkeit (Zeilen/s) mit welcher der Scanner relativ zur Probenoberfläche bewegt wird, ist auch von der Größe des zu untersuchenden Oberflächenareals des Objektes abhängig. Beispiel: Rastert man einen 100µm² großen Bereiches mit einer Scanmatrix von 512x512 Bildpunkten, so liegen benachbarte Bildpunkte innerhalb dieses Rasters ~ 0,195 µm voneinander entfernt. Je kleiner das Scanareal, desto geringer ist die Schrittgröße und damit die Schwingungsamplitude des Piezos. Bei konstanter, piezomaterialabhängig begrenzter, maximaler Schwingungsenergie verhalten sich Amplitude und Frequenz umgekehrt proportional zueinander, so dass große Schwingungsamplituden nur bei relativ geringeren Frequenzen realisierbar sind und umgekehrt höhere Frequenzen nur bei relativ kleineren Amplituden erreicht werden. Für die Rastersonden-Mikroskopie bedeutet dies zusammenfassend: Je größer das Scanareal und die Bildpunktanzahl innerhalb der Scanmatrix, umso geringer ist die maximal erreichbare Scangeschwindigkeit. Reduktion der Bildpunktmatrix und der maximalen Scangröße ermöglichen höhere Scangeschwindigkeiten und damit eine Erhöhung des zeitlichen Auflösungsvermögens.

Nichtlineare Effekte

Reproduzierbare rastersondenmikroskopische Abbildungen sind mit hoher Präzision nur dann erzielbar, wenn die Scannermechanik zu jeder Zeit auf definierte Spannungswerte mit richtungs- und betragsmäßig konstanten Translations-bewegungen reagiert. Das o.g. Herstellungsprocedere piezokeramischer Scanner richtet die primär ungeordneten Dipolmomente des polykristallinen Piezomaterials zwar aus, ist aber nicht in der Lage, den so erreichten Polarisationszustand langfristig stabil zu konservieren. Dies bedeutet, dass Piezokeramiken im Laufe der Zeit zunehmend depolarisieren und damit ihre lineare Stellgenauigkeit (bis zu 10 % Abweichung) verlieren. Im folgenden werden einige Besonderheiten piezo-keramischer Materialien und deren Einfluss auf die Linearität der Scanner näher erläutert, da jede rastersondenmikroskopische Abbildung hinsichtlich dieser Einflussfaktoren kritisch diskutiert werden sollte.

Intrinsische Nonlinearität

Abbildung 9 modifiziert nach ⁸⁵

Legt man an ein piezoelektrisches Material schrittweise linear gesteigerte, gerichtete Spannungen an, so sollte die Auslenkung des Materials linearfunktionell von dieser Spannung abhängig sein. In der Realität findet man in Abhängigkeit vom verwendeten Material eine s-förmige Kurvenabweichung von der Linear-funktion. Das Verhältnis der maximalen Abweichung der Kurve (∆y) von der linearen Idealkurve (y) an einer bestimmten Spannung (U) bezeichnet man als intrinsische Nonlinearität (∆y/y) des Scanners. (Abbildung 9)

Die in den Mikroskopen implementierten Scanner weisen intrinsische Non-linearitäten im Bereich zwischen 2 % bis 10 % auf. Selbstredend beeinflusst die-ses Phänomen sowohl die horizontalen als auch die vertikalen Scanner-bewegungen und folglich die Genauig-keit der Längen- und Höhenmessung an den rasterkraftmikroskopisch zu unter-suchenden Objektoberflächen.

Hysterese

Ein weiteres Charakteristikum wird als Hysterese bezeichnet und beschreibt das unterschiedliche Auslenkungsverhalten piezoelektrischer Materialien auf entgegengesetzt gerichtete Spannungen gleichen Betrages. Steigert man die, an ein Piezoelement angelegte Spannung von 0 Volt beginnend graduell bis zu einem bestimmten Wert, so erzeugt das Element eine gerichtete Bewegung (Auslenkung), wobei jeder einzelne Spannungswert eine definierte Auslenkung des Piezos generiert. Legt man nun eine entgegengesetzt gerichtete Spannung gleichen Abbildung 10 modifiziert nach ⁸⁵

Betrages und gleichartiger gradueller Abstufung an den expandierten Scanner an, so müsste im Idealfall die induzierte Retraktionsbewegung durch die selben Spannungsbeträge beschrieben werden wie bei der Expansionsbewegung des Scanners. Dieser Idealfall ist aufgrund hysteretischer Eigenschaften der Piezos nicht zu erreichen. Das bedeutet, dass der Scanner bei Expansions- und Re-traktionsbewegungen unterschiedliche Spannungen benötigt, um gleiche Auslenkung zu erfahren. Als Hysterese wird die maximale Divergenz der Auslenkung zwischen beiden Bewe-gungsrichtungen im Verhältnis zur maximal erreichten Scannerauslenkung bezeichnet (Abbildung 10). Hysterese bedeutet für die mikroskopische Abbildung, dass in der x-y-Ebene eines Objektes topografische Längenabweichungen zwischen Hin- und Rückbewegung des Scanners auftreten und in der vertikalen Richtung topografische Erhebungen und Vertiefungen gleichen Betrages unterschiedlich hoch bzw. tief wiedergegeben werden. Demzufolge ist für die Begutachtung rastersondenmikroskopischer Bilder die Berücksichtigung dieses typischen Phänomens piezoelektrischer Materialien essentiell.

Alterungsprozesse (“Aging”)

Die Anzahl der achsenausgerichteten Dipolmomente innerhalb der poly-kristallinen Piezostruktur bestimmt das Ausmaß der möglichen Translations-bewegung. Naturbedingt verliert ein Teil der Monokristalle die herstellungs-technologisch erzwungene Achsenaus-richtung. Je größer die Anzahl der ausgerichteten Dipolmomente im Scan-ner ist, desto größer ist die Trans-lationsbewegung die ein Scanner nach Anlage einer definierten Spannung vollziehen kann. Dies wird indirekt durch den Kopplungskoeffizienten (k) beschrie-ben. Dieser Koeffizient vermindert sich im Laufe der Zeit exponentiell, wenn der Scanner nicht regelmäßig benutzt wird. Die Alterungsrate von Scannern ist durch die Änderung des piezoelektrischen Kopplungskoeffizienten (∆K) in einem bestimmten Zeitintervall (∆t) definierbar. Regelmäßige Benutzung der Scanner führt zur Reorientierung der zufällig ausgerichteten Dipolmomente und reduziert dadurch die Alterungsrate.

Abbildung 11 modifiziert nach ⁸⁵

Elektrisches “Creeping”

Wenn auf den Scanner abrupte Spannungsänderungen einwirken, so vollzieht sich die gerichtete Auslenkungsbewegung in zwei Phasen (Abbildung 12). Während der ersten Phase, die weniger als 1 ms dauert, realisiert der Scanner den größten Teil der dimensionellen Verän-derungen (∆x). Die der Spannung ent-sprechenden Endauslenkung (∆x+∆xc) wird erst nach einer zweiten Bewe-gungsphase, welche deutlich länger dauert als die erste, erreicht. Das prozentuale Verhältnis der Konformations-änderungen des Scanners während dieser beiden Phasen wird als „Creep“ bezeichnet. Zur genaueren Quanti-fizierung dieses Parameters wird zusätzlich das Zeitintervall (Tcr) vom Beginn der konformationellen Änderung bis zum Erreichen der spannungs-abhängigen Endauslenkung des Piezos angegeben. Die Auswirkungen auf die mikroskopische Abbildung ist schema-tisch im unteren Schema der Abbildung 12 veranschaulicht. Der grau unterlegte Bereich schematisiert die realen Höhenverhältnisse einer Objektoberfläche (Vz) entlang einer Scanlinie (Vx), die perforierte Linie dokumentiert die falsch detektierte Oberflächentopografie.

Abbildung 12 modifiziert nach ⁸⁵

Thermische Drift

Thermische Einflüsse verändern die Entropie der Dipolmomente innerhalb eines piezoelektrischen Materials. Erwärmung der Materialien führt zu größeren Schwingungen der Monokristalle und ihrer Dipolmomente innerhalb des polykristallinen Piezomaterials, wodurch konsekutiv weniger linear ausgerichtete Dipolmomente für gerichtete Translationsbewegungen zur Verfügung stehen. Insbesondere bei Untersuchung temperierter Objekte (z.B. Oberflächen von Zellen in physiologisch temperierten Zellmedien) muss demzufolge eine gute thermische Isolation zwischen Scanner und Probenträger gewährleistet sein, um temperatur-abhängige Nonlinearitäten nicht zu akzentuieren. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten rasterkraftmikroskopischen Untersuchungen an vitalen Zellen wurden bei zellphysiologischen Umgebungsbedingungen durchgeführt. Daher war es nötig, den auf dem Scanner-Tubus befestigten Probenträger zu temperieren (37°C). Hierfür wurde eine speziell konstruierte und thermisch gegen den Scannertubus isolierte Temperiereinrichtung eingesetzt. Details dieser Temperiereinrichtung sind unter 3.1.6.3 beschrieben.

Kreuzkopplung

Abbildung 13 modifiziert nach ⁸⁵

Mit dem Begriff “Cross coupling” beschreibt man das Phänomen, dass jede Scannerbewegung in Richtung der x-Achse oder in Richtung der y-Achse immer mit einer geringen Bewegungs-komponente in Richtung z- Achse verbunden ist (Abbildung 13). Die Ursachen dafür sind von sehr komplexer Natur. Hauptsächlich wird es durch die geometrische Anordnung der Piezo-elemente hervorgerufen. Die meisten Scanelemente moderner Rastersonden-Mikroskope bestehen aus 4-Segment-Röhren (slotted-tube-design; s.o.). Um x-y-Bewegungen zu vollziehen, kontrahiert eines der 4 Röhrenviertel, wobei sich das gegenüberliegende Segment ausdehnt. Demzufolge ist die resultierende horizontale Bewegung des Scanners nicht hundertprozentig achsenparallel, sondern leicht sphärisch ausgerichtet. Diese ungewollte vertikale Bewegung während der x-y-Translation beeinflusst die rastersondenmikroskopische Abbildung in der Form, dass absolut plane Objektoberflächen „schüsselförmig“ abgebildet werden. Dieser piezobedingte Abbildungsfehler wird in Abbildung 14 schematisch verdeutlich. Eine stufenförmige Struktur die entlang der horizontalen x-Achse des Objektes abgebildet wird, erscheint im raster-kraftmikroskopisch detektierten Höhen-Profil konkav gewölbt (perforierte Linie). Derartige Verzerrungen der realen topo-grafischen Information der rasterkraft-mikroskopisch zu untersuchenden Ober-flächen sind durch entsprechende Kalibrierungsmaßnahmen und spezielle Hardware-Korrektursysteme deutlich reduzierbar, aber nicht vollständig eliminierbar, so dass dieser Parameter bei der kritischen Auswertung von AFM-Bildern unbedingt zu berücksichtigen ist.

Abbildung 14 aus ⁸⁵

Kombinierter Einfluss aller Nonlinearitätseffekte

Abbildung 15 aus ⁸⁵

Die wichtigsten Nonlinearitätsparameter des Scanners und deren Einfluss auf die rastersondenmikroskopische Abbildung sind in den vorangehenden Abschnitten beschrieben. Für die Begutachtung und kritische Diskussion rastersonden-mikroskopischer Abbildungen ist die Kenntnis einzelner piezoassoziierter Fehlereinflüsse essentiell. Allerdings muss man sich darüber im Klaren sein, dass die Kombination aller genannten Nonlinearitätseffekte mit der Abbildung interferiert und eine komplexe Fehlerdiskussion dadurch deutlich erschwert wird. Um diese Problematik zu verdeutlichen, ist die Kombination von Hysterese, Creep und Kreuzkopplung und deren Abbildungseinfluss in Abbildung 15 schematisiert.

Korrekturmöglichkeiten

Unkorrigierte Nonlinearitätseffekte erzeugen bis zu 15 %-ige Abweichungen von der realen Oberflächentopografie bei rasterkraftmikroskopischen Untersuchungen. Im Sinne maximaler Abbildungspräzision ist deshalb die Detektion und bestmögliche Korrektur dieser Effekte essentiell. Korrekturen sind möglich, indem man die Nonlinearitäten des piezokeramischen Materials direkt am Scanner mittels spezieller Sensoren permanent detek-tiert und fehlerhafte, nichtlineare Bewegungsabläufe durch zusätzlich applizierte Korrekturspannungen aus-gleicht. Dabei wird jede Bewegungsebene durch einen, am Scannertubus installierten Sensor kontrolliert. (Abbildung 16)

Abbildung 16 modifiziert nach ⁸⁵

Am meisten verbreitet sind optische-, kapazitive- oder Dehnungs-streifensensoren. Optische Sensoren funktionieren wie die oben beschrie-benen positions-sensitiven Photodioden. Die Dehnungsstreifensensoren bestehen ebenfalls aus piezokeramischem Mate-rial und sind aus meiner Sicht nicht geeignet, um Nonlinearitäten piezokeramischer Materialien genau zu detektieren. Kapazitive Sensoren messen die bewegungs-abhängige Kapazitätsänderung zwischen zwei Metallelektroden. Eine dieser Elektroden ist dabei am Scannertubus, die andere stationär in deren Nähe befestigt. Die Orientierung der Sensorikhardware erfolgt im Rahmen eines speziellen Kalibriervorganges, der im folgenden Kapitel beschrieben wird.

Kalibrierung

Um zu gewährleisten, dass der Scanner auf definierte Spannungswerte mit präzisen linearen Translationsbewegungen reagiert, ist die regelmäßige Kalibrierung des Scanners und der beschriebenen Nonlinearitätssensoren unerlässlich. Hierzu bedient man sich bestimmter, zumeist kristalliner Kalibrierstandards, deren Struktur genau definiert ist. Neben der Notwendigkeit jede Scannerbewegungsrichtung separat zu eichen, ist es wichtig, die Größe der Kalibrierstruktur größen-ordnungsmäßig der zu untersuchenden Objektstruktur anzupassen. Untersucht man kleine Oberflächenareale von beispielsweise 1µm² bis 5µm² Größe, so sollten die eingesetzten Kalibrierstrukturen ebenfalls zwischen 1 und 5 µm groß sein. Im Rahmen unserer Untersuchungen wurden zwei verschiedene Scannertuben eingesetzt, die selbstverständlich unabhängig voneinander einzeln kalibriert werden mussten. Hierfür wurden spezielle, im folgenden beschriebene Kalibrierstandards benutzt.

Kalibrierstandards

Abbildung 17

Typischerweise benutzt man für die Kalibrierung der horizontalen Bewegungsebene des Scanners periodisch aufgebaute Kristallgitter. Für größere Scanbereiche wurde ein Gitter mit 10 µm- Periodenabstand, für kleinere Scanbereiche ein 1 µm-periodisches Gitter benutzt. Beide Standards gehören zum Lieferumfang des Autoprobe CP der Firma Park Scientific Instruments. Rastert man während des Kalibriervorganges eine definiert große Objektoberfläche ab, so muss nach Kalibrierung der bekannte Abstand der periodischen Gitterstrukturen mit dem abgebildeten Gitterstrukturabstand genau übereinstimmen. Der Quotient aus bekannten Werten und gemessenen Werten ergibt den Kalibrierungskoeffizienten, der zur Spannungsabstimmung benutzt wird. Im abgebildeten Beispiel wurde ein Kalibrierungsgitter abgebildet, bei welchem der Abstand der Gitterstrukturen 10 µm beträgt. Die abgebildete Fläche ist 42 µm² groß. Misst man parallel zu den Gitterstrukturen den Periodenabstand von 3 aufeinanderfolgenden Strukturen (3x10 µm = 30 µm), so erhält man über mehrere Messungen gemittelt einen Abstand von 30,3 µm. Das mikroskopische Bild erfasst die Gitterstrukturen also dimensionell größer als sie real sind. Demzufolge muss die piezotreibende Steuerspannung betragsmäßig minimal reduziert werden, damit danach gemessene und reale Dimensionen übereinstimmen. Da Auslenkung des Piezos und treibende Spannung linear voneinander abhängen, wird der Betrag der Steuerspannung mit dem errechneten Kalibrierungskoeffizienten multipliziert, um die korrigierte Steuer-spannung zu ermitteln. Dieses Procedere wird für jede Bewegungsebene des Scanners vollzogen, wobei für die vertikale Ebene ein Silizium-Siliziumoxid-Kalibrierstandard mit definierten Höhenstufen (Schichtdickennormal der Physikalisch Technischen Bundesanstalt) zur Anwendung kommt. (Abbildungen 18, 19)

Abbildung 18

Abbildung 19

Auf Mica präparierte 200 nm- Polystyrol- Kügelchen (Nanospheres^TM) sind als Kalibriersubstrat für alle Scannerbewegungen geeignet⁸⁶, aber für den Routinebetrieb nicht zu empfehlen, da deren Herstellung erheblichen präparatorischen Aufwand erfordert.

AFM-Cantilever und Tips

Die Schlüsselkomponente des Rasterkraftmikroskops ist der Cantilever mit dem, an dessen Spitze lokalisierten Messtip. Die detektierten Wechselwirkungskräfte im Nahfeld von Objektoberflächen werden durch die spezielle Anordnung des Messtips am Cantilever direkt auf diesen übertragen. Abbildung 20

(Abbildung 20 - SEM-Aufnahme eines Cantilevers) Demnach darf die Federkraft des Cantilevers nur so groß sein, dass Kräfte im Pikonewtonbereich bereits zu einer vertikalen Auslenkung der Federgabel (Cantilever) führen. Sowohl die Kon-figuration des Cantilevers, als auch die Morphologie des Messtips beeinflussen die Qualität der rasterkraftmikro-skopischen Abbildung entscheidend. In der Praxis haben sich verschiedene Designs der Cantilever und Messtips etabliert. Die gebräuchlichsten und im Rahmen dieser Arbeit zur Anwendung gekommenen Komponenten werden im folgenden beschrieben

Cantilever ⁸⁷

An den tiptragenden Cantilever werden in praxi folgende Anforderungen gestellt:

Seine Federkraft muss kleiner sein als die zu detektierende interatomare Wechselwirkungskraft,
die Resonanzfrequenz muss sehr hoch sein, um mit maximaler Geschwindig-keit auf Veränderungen der Oberflächentopografie reagieren zu können und
seine Grundgeometrie muss den Erfordernissen der rasterkraftmikroskopischen Untersuchung genügen.

Diesen Ansprüchen gerecht werdend, haben sich zwei verschiedene Cantilever-Designs durchgesetzt. Der Balkencantilever erfüllt die o.g. Kriterien, hat sehr geringe Federkonstanten und relativ hohe Resonanzfrequenzen. Die Besonderheit dieses Cantilevers besteht darin, dass er sich bei der Bewegung über die Objektoberfläche sehr leicht entlang seiner Längsachse verwindet. Möchte man laterale Krafteinflüsse detektieren (z.B. Rei-bungskräfte zwischen Objekt und Tip), ist dieser Cantilever hervorragend geeignet.

Abbildung 21 aus ⁸⁷

Oberflächentopografisch orien-tierte Untersuchungen werden durch diese Verwringungskomponente der Balkencantilever artifiziell überlagert, so dass für diese Anwendung vorwiegend Dreieckscantilever eingesetzt werden. Federkonstanten, Resonanzfrequenz und Verwringungsstabilität sind durch Cantilevermaterial- und Geometrie direkt beeinflussbar. Die geometrische Konfi-guration und deren Einfluss auf die Federkonstante (k) der Cantilever ist nebenstehend dargestellt. E bezeichnet hierbei einen speziellen materialabhängigen Elastizitätskoeffizienten, der “Young’s Modulus” genannt wird. Am Balkencantilever gilt :

Die Federkonstante der Dreieckscantilever wird nach folgender Formel berechnet:

wobei t in beiden Formeln die Dicke des Cantilevers beschreibt (siehe Abbildung 21).

Abbildung 22 aus ⁸⁵

Außerdem gilt, dass steifere Cantilever (große Federkonstante) höhere Eigen-resonanzfrequenzen aufweisen als sehr weiche Cantilever. Die Eigenresonanz-frequenz spielt besonders für den, an biologischen Objekte sehr geeigneten Tapping-Mode (siehe unten) eine entscheidende Rolle. Die Auswahl des optimalen Cantilevers für die spezielle AFM-Untersuchung ist also von folgenden Fragestellungen abhängig:

Sollen weiche (biologische) oder har-te (amorphe oder kristalline) Objekt-oberflächen untersucht werden?
Welcher AFM-Modus (Contact-, Non-Contact-, Tapping-Mode) ist für die Untersuchung des speziellen Objektes der optimale?
Welche zeitliche oder räumliche Auf-lösung ist erforderlich?
Erfolgt die Abbildung des Objektes unter Vakuum- oder Raumbedingun-gen oder in wässrigen Lösungen?

Auch hierbei wird der, für das entsprechende mikroskopische Experi-ment optimale Cantilever vom Anwender empirisch ermittelt. Die entsprechende experimentelle Anordnung und Auswahl der mikroskopischen Komponenten wird im Ergebnisteil detailliert beschrieben und begründet.

AFM-Spitzen (Tips) ^{modifiziert nach 87}

Abbildung 23 modifiziert nach ⁸⁴

Das laterale Auflösungsvermögen des AFM ist durch die Schrittweite des Scanners (siehe dort) und durch den Tipradius (R) determiniert. Der Tipradius wird entscheidend durch die Herstellung der Silizium- bzw. Siliziumnitrid-Tips beeinflusst. Abhängig von Herstellungsprocedere unterscheidet man prinzipiell 2 Typen von AFM-Spitzen: pyramidale und konoidale. Je geringer der Radius dieser Spitzen, desto besser ist das laterale Auflösungsvermögen des Rasterkraft-mikroskops.

Pyramidale AFM-Tips

Ein Siliziumkristall wird mit Kalium-hydroxid chemisch geätzt. Das Kalium-hydroxid hat die Eigenschaft in einem Silizium-110-Kristall eine definierte Anzahl von 110 Siliziumschichten zu ätzen. Durch die Größe des Areals auf dem Siliziumkristall, welches mit KOH behandelt wird, definiert man die Größe der Grundfläche des pyramidalen Tips. Dringt das Ätzagens in die Tiefe des Siliziumkristalls ein, entsteht ein pyra-midaler Substanzverlust mit definierter Grundfläche und definierter Tiefe (110 atomare Schichten)(1). Anschließend wird durch LPCVD-Technik (low-pressure chemical vapor deposition) auf der Siliziumoberfläche ein Siliziumnitrid (Si3N4)-Film aufgedampft (2). Hierbei bildet die zuvor geätzte pyramidale Vertiefung in der Siliziumoberfläche die Matrize für den entstehenden Silizium-Nitrid-Tip. Photolithografisch wird dann aus der Siliziumnitridoberfläche die gewünschte Cantileverform ausge-schnitten und ein Glassubstrat anodisch gebunden (3), was später die Cantilever-Tip-Einheit trägt (4). Die Dicke des Can-tilevers ist von der Anzahl der auf-gedampften Siliziumnitridschichten ab-hängig. Der für die resultierende pyramidale Tipform relevante Her-stellungsschritt ist das Ätzen der Tipmatrize, da die Form der Pyramide nur durch deren Grundfläche determiniert wird und in dieser Form hergestellte pyramidale Tips immer eine Höhe von 110 atomaren

Abbildung 24

Siliziumschichten aufweisen. Die im Rahmen dieser Arbeit zur Anwendung gekommenen Cantilever-Tip-Einheiten mit pyramidaler Tipform (Microlever© der Firma Park Scientific Instruments) weisen folgende Charakteristika auf.

Dicke

(µm)

Federkonstante

(N/m)

Resonanzfrequenz

(kHz)

min.

typ.

max.

min.

typ.

max.

min.

typ.

max.

A

100

13

0,5

0,6

0,7

0,03

0,05

0,08

18

22

26

B

100

22

0,5

0,6

0,7

0,01

0,02

0,03

12

15

18

C

100

13

0,5

0,6

0,7

0,006

0,01

0,015

6

7

8

D

100

22

0,5

0,6

0,7

0,02

0,03

0,05

12

15

18

E

200

18

0,5

0,6

0,7

0,06

0,1

0,15

32

38

44

F

200

36

0,5

0,6

0,7

0,3

0,5

0,8

100

120

140

Tabelle 1

Abbildung 25 aus ⁸²

Elektronenmikroskopische Bilder dieser Cantilever-Tip-Elemente zeigt Abbildung 26.

Abbildung 26

Konoidale AFM-Tips

Abbildung 27

Diese Cantilever-Tip-Einheiten bestehen fabrikationsbedingt nicht aus Siliziumnitrid sondern aus reinem Silizium. Auf einer Siliziumoberfläche wird ein rundes Siliziumdioxid-Areal definierter Größe aufgebracht. Der anschließende Trockenätzprozess mit speziellen Ätzgasen greift das Siliziumdioxid nicht an, wohl aber das Silizium selbst. Die Zusammensetzung des Ätzgases determiniert das Verhältnis zwischen vertikaler und lateraler Dimension des Ätzvorganges und folglich die Form des entsehenden Messtips. Der nach diesem Ätzschritt auf der Spitze der Siliziummatrix verbleibende Siliziumdioxid-Rest wird durch Oxydation entfernt und die Oberfläche dieser Matrix mit Bor versetzt, so dass die oberen Silizium Schichten durch den nachfolgenden Ätzprozess nicht mehr angegriffen werden. Schematisch ist dieser Herstellungsprozess in Abbildung 27 verdeutlicht.

Die im Rahmen dieser Arbeit zur Anwendung gekommenen Cantilever-Tip-Einheiten mit konoidaler Tipform (Ultralever© der Firma Park Scientific Instruments) weisen folgende Charak-teristika auf.

Dicke

(µm)

Federkonstante

(N/m)

Resonanzfrequenz

(kHz)

min.

typ.

max.

Min.

typ.

max.

min.

typ.

max.

A

180

25

0,6

0,8

1,0

0,07

0,16

0,31

19

25

31

B

180

38

0,6

0,8

1,0

0,10

0,24

0,47

23

30

37

C

85

18

0,6

0,8

1,0

0,5

1,1

2,1

105

140

175

D

85

28

0,6

0,8

1,0

0,7

1,6

3,1

130

170

210

A

180

25

1,6

1,8

2,0

1,3

1,9

2,6

47

53

59

B

180

38

1,6

1,8

2,0

2,0

2,8

3,8

57

64

71

C

85

18

1,6

1,8

2,0

9,0

13,0

18,0

270

300

330

D

85

28

1,6

1,8

2,0

13,0

18,0

25,0

320

360

400

Tabelle 2

Abbildung 28 aus ⁸²

Elektronenmikroskopische Bilder dieser Cantilever-Tip-Elemente zeigt Abbildung 29.

Abbildung 29

Kontrollstandard zur Evaluierung der Tipgeometrie

Im Idealfall sind die, mittels der o.b. Herstellungsprozesse gefertigten Messspitzen konoidal bzw. pyramidal konfiguriert, atomar spitz und weisen keine Doppelgeometrien auf. Die praktische Erfahrung zeigt jedoch, dass die Messtips nicht alle uniform und normiert sind, sondern dass in Abhängigkeit von der Herstellungscharge, der Lagerung und der Messumgebung (z.B. Elektrolyt) z.T. erhebliche Veränderungen der Spitzengeometrie auftreten können, die ihrerseits den Abbildungsprozess massiv beeinflussen. Aus diesem Grund gehörte es zum routinemäßigen Setup, alle Messspitzen unmittelbar vor deren experimentellem Einsatz hinsichtlich ihrer Spitzengeometrie zu evaluieren. Dazu wurde ein speziell gefertigter Siliziumwafer, welcher hierfür optimierte, geometrische Eigenschaften aufweist, eingesetzt:

ca. 300 Å dicke Siliziumschicht
Gesamtgrundfläche ca. 0,5 x 0,5 cm
Inverse, gleichseitige Pyramiden mit quadratischer Grundfläche (0,1 µm²) sind im regelmäßigen Abstand von 0,1 µm in diese Siliziumschicht eingeätzt, so dass die Grundflächen dieser Pyramiden nach oben gerichtet und die Pyramidenspitzen in den Wafer hineingerichtet sind (siehe Abbildung)

Diese besondere Geometrie des Kalibrierwafers ermöglicht es appositionelle Verunreinigungen oder herstellungstechnisch bedingte Abweichungen von der Idealgeometrie der Messtips zu detektieren, da die Größe der abzubildenden Kalibrierstandards (inverse Pyramiden) im Größenbereich der zu evaluierenden Messtips liegt. Die folgenden Abbildungen zeigen auf der einen Seite die Abbildung des Kalibriergitters mittels eines ideal konfigurierten Messtips und auf der anderen Seite das, mittels einer verunreinigten, oder herstellungs- bzw. lagerungstechnisch alterierten Messspitze generierte Bild des Kalibrierstandards.

Abbildung 30: idealer Messtip

Abbildung 31: Messtip mit Doppelspitze (appositionelle Verunreinigung oder Herstellungsdefekt)

AFM-Messumgebungen

Prinzipiell ist heutzutage die rasterkraftmikroskopische Abbildung in verschiedenen Messumgebungen möglich. Die Rastertunnelmikroskopie (STM) erfordert Vakuumbedingungen, weshalb die ersten AFM-Untersuchungen auch unter diesen Messbedingungen durchgeführt wurden. Viele unerwünschte Interaktionskräfte (z.B. adhäsive Meniskuskräfte) sind im Vakuum nicht vorhanden, was die hochauflösende Abbildung von Strukturen erleichtert. Biologische Proben sind mittels AFM im Vakuum nach elektronenmikroskopischen Präparationen (z.B. Gefriersubstitution)⁸⁸ sehr gut darstellbar. Allerdings besteht einer der wesentlichen Vorteile der Rasterkraftmikroskopie darin, lebende, unfixierte Strukturen in extrem hoher Auflösung abzubilden. Um dies zu realisieren, wurden spezielle Messkammern konzipiert, die zellphysiologische Umgebungsbedingungen während der rasterkraftmikroskopischen Untersuchung ermöglichen. Häufig nähert man sich der objektspezifischen AFM-Untersuchung indem zunächst Experimente unter Raumbedingungen, beispielsweise an luftgetrockneten Zellen durchgeführt werden.

Design der einfachen, offenen Flüssigkeitszelle

Abbildung 32

Im Rahmen dieser Arbeit wurden vordergründig kardiovaskulär relevante Zellen in ihrer physiologischen Umgebung untersucht. Um die Abbildung zellulärer Strukturen zu ermöglichen, muss die Oberfläche des zelltragenden Objektträgers komplett mit zellphysiologischem Puffer bedeckt sein. Außerdem muss die Ablenkung des Lasersignals durch die Vertikalbewegung des Cantilevers weiterhin detektierbar sein. Zu diesem Zweck entwickelten wir eine nicht perfundierbare Flüssigkeitszelle, die in der Handhabung einfach ist und deshalb insbesondere für die Etablierungsphase der Untersuchung eingesetzt wurde. Diese Zelle entsteht, indem auf der Rückseite der keramischen Cantileverkassette ein speziell zugeschnittenes lichtmikroskopisches Deckgläschen mit einem biologisch inerten Klebstoff befestigt wird. Somit bildet man zwischen Probe und Deckgläschen eine nach allen Seiten offene Kammer für die Aufnahme der Flüssigkeiten (Abbildung 32). Makroskopische Meniskuskräfte (Adhäsionskräfte) sorgen dafür, dass die Flüssigkeit in diesem nur wenige Millimeter hohen Spalt gehalten wird. Der Nachteil dieser Zelle besteht darin, dass freies Wasser verdunstet und demzufolge die Ionenkonzentration des Puffers mit zunehmender Dauer der Untersuchung stetig zunimmt. Der Vorteil dieser einfachen Flüssigkeitszelle ist in ihrer exzellenten Handhabbarkeit zu sehen. Aufwendiges Reinigungsprocedere und Justierprobleme sind quasi hinfällig und ermöglichen daher einen raschen Versuchsaufbau.

Kommerzielle, geschlossene, perfundierbare Flüssigkeitszelle

Trotz der beschriebenen Vorteile der einfachen Flüssigkeitszelle ist diese für die Realisierung optimaler zellphysiologischer Umgebungsbedingungen nicht geeignet. Um stabile Temperatur-, pH- und Konzentrationsbedingungen über einen längeren Untersuchungszeitraum zu gewährleisten, ist der Einsatz der geschlossenen und perfundierbaren Flüssigkeitszelle der Firma PSI unumgänglich. Die Abdichtung der Zelle wird durch einen sehr geschmeidigen Silikonring realisiert, der den Scanvorgang nicht behindert. Der Perfusionsvorgang wird durch jeweils ein Einstrom- und Ausstromröhrchen gewährleistet. Da das Gesamtvolumen, welches diese Flüssigkeitszelle aufnehmen kann maximal 0,1 ml beträgt, haben wir den Volumenaustausch manuell, unter Zuhilfenahme von Mikroliterspritzen vorgenommen. Das pH-stabilisierte Pufferreservoir wurde im Wasserbad um 1,5°C wärmer als benötigt auf 38,5°C temperiert. Dadurch wurde der im Schlauchsystem auftretende Wärme-verlust kompensiert, so dass in der Flüssigkeitszelle eine Temperatur von 37°C gewährleistet werden konnte.

Abbildung 33 (PSI^©–Foto)

Um den Abbildungsvorgang selbst durch die zirkulierende Pufferflüssigkeit nicht zu beeinflussen, wurde das Puffervolumen in der Flüssigkeitszelle jeweils in der Pause zwischen zwei aufeinander-folgenden Abbildungsvorgängen kom-plett ausgetauscht. Der während des Scanvorgangs auftretende Wärmeverlust der in der Flüssigkeitszelle befindlichen Pufferflüssigkeit wurde durch ein Miniatur-Thermostat ausgeglichen, welches im nächsten Abschnitt beschrieben wird. Abgesehen vom hohen Pflegeaufwand, Justierproblemen des Laserstrahls und suboptimaler Übertragung der cantilevertreibenden Frequenzen im Non-Contact-Mode (siehe dort) ist die Anwendung der geschlossenen Flüssigkeitszelle unproblematisch und elementare Voraussetzung für die zuverlässige Gewährleistung zellphysiologischer Umgebungsbedingungen während des rasterkraftmikro-skopischen Abbildungsvorganges.

Temperiereinrichtung

Die o.b. Flüssigkeitszelle ist nicht beheizbar, so dass darin zellphysiologische Temperaturen (37°C) nur durch Vorwärmen der Perfusionsmedien erreicht werden können. Da die perfundierbaren Volumina allein durch die Geometrie der Flüssigkeitszelle begrenzt sind und Volumenaustausch nur zwischen den Messphasen vollzogen wird, ist es notwendig, das in der Flüssigkeitszelle befindliche Volumen des Versuchspuffers zusätzlich zu temperieren, um stabile Temperaturbedingen zu garantieren. Zu diesem Zweck wurde an die Unterseite eines metallischen Probenträgers eine speziell konstruierte Miniaturthermostateinheit gekoppelt (Dieter Heinze, Charité Berlin). Um diese Temperiervorrichtung gegen den Scannertubus zu isolieren, wurde diese in ein Kunstharz mit schlechter Wärmeleitfähigkeit eingegossen. Die Kopplung des Objektträgers (z.B. Thermanox^TM-Objektträger mit adhärenten Zellen) an den, auf diese Weise beheizten Probenträger erfolgt durch einen wärmeleitenden Kleber oder einfach durch einen Vaselinefilm.

Zubehör zur Optimierung der Messbedingungen

Die Abschirmung des gesamten Mikroskops gegen terrestrische Schwingungs-einflüsse (Erschütterungen, Schall, Vibrationen von gekoppelten Geräten, etc.) wird nach Einsatz einiger unentbehrlicher Zusatzinstallationen möglich. Zum Lieferumfang des Mikroskops gehören eine Stahl- und eine Glasglocke die zur Abschirmung des interagierenden Sonden-Probenvolumens eingesetzt werden können. Der Nachteil dieser Glocken besteht für die zellphysiologischen Untersuchungen darin, dass lichtmikroskopische Kontrolle des Scanvorganges und Perfusion der Flüssigkeitszelle sowie Steuerung des Miniaturthermostaten nicht mehr möglich sind, wenn diese Abschirmelemente eingesetzt werden. Aus frühen Untersuchungen möglicher Störeinflüsse war uns bekannt, das insbesondere terrestrische Schwingungen sehr stark mit dem Abbildungsvorgang interagieren. Um diesen Einfluss zu minimieren, installierten wir das gesamte Mikroskop inklusive aller gekoppelten Zubehörteile (außer Computer) auf einem pneumatisch gelagerten, schwingungsabsorbierenden Labortisch der Firma Integrated Dynamics Engineering GmbH. Alle von der steuernden Computereinheit ausgehenden Kabel, welche direkte Verbindung zum Mikroskop haben, wurden ebenfalls federnd aufgehangen um Schwingungs-übertragung zu vermeiden. Der Effekt dieser Maßnahmen auf die rasterkraft-mikroskopische Abbildung wurde schrittweise kontrolliert und dokumentiert. Atomare Auflösung an Glimmer beispielsweise wird nur nach Einsatz aller Abschirm-vorrichtungen erzielt. Andere Arbeitsgruppen installieren das gesamte Setup in einem galvanischen Käfig, um elektromagnetische Einflüsse zu eliminieren. Da die atomare Auflösung an zellulären Objekten ohnehin nicht von Interesse ist und aufgrund der Objekteigenschaften biologischer Proben mittels rasterkraft-mikroskopischer Methoden theoretisch nicht erreichbar ist, haben wir auf diese zusätzliche elektromagnetische Abschirmung verzichtet. Die Abbildung atomar flacher Proben (Mica) zeigt nach endgültiger Optimierung des gerätetechnischen Aufbaus ein periodisches Störrauschen, welches ungefähr eine Frequenz von 50 Hz und nach topografischer Analyse Amplituden zwischen 10 und 100 Å aufweist. Für die Abbildung zellulärer Strukturen ist dieser Einfluss vernachlässigbar. Die Abbildung präparierter Einzelproteine wird von diesem Störrauschen viel stärker beeinflusst, da die zu detektierenden Strukturen zwischen 100 und 200 Å, also quasi im selben Auflösungsbereich liegen. Das resultierende Signal-Rausch-Verhältnis (~1,0) ist zu ungunsten des Messsignals artefaktüberlagert, so dass mathematische Filteranalysen des Rohbildes nötig sind, um solche Strukturen bildverarbeitungstechnisch sichtbar zu machen.

Messsignaldetektion

Interatomare Wechselwirkungskräfte werden im Nahfeld von Objektoberflächen durch die beschriebenen, im Idealfall atomar spitzen Messtips detektiert und bedingen eine messbare Auslenkung des Federbalkens (Cantilevers). Diese Auslenkung wird in den meisten, gegenwärtig kommerziell verfügbaren Rasterkraftmikroskopen laseroptisch gemessen. Der Laser wird über eine Spiegeloptik auf die goldbedampfte, reflektierende Rückseite des Cantilevers adjustiert. Der von dort reflektierte Laserstrahl trifft auf eine positionssensitive Photodiode, die dadurch Veränderungen der Cantileverposition erfasst. Eine andere gängige Detektionsmöglichkeit des rasterkraftmikroskopischen Messsignals wurde in unseren Experimenten nicht angewendet und sei daher nur der Vollständigkeit halber kurz beschrieben. Hierbei wird die Verbiegung des Cantilevers mittels piezokeramischer Schichten, die auf die Rückseite desselben aufgebracht werden, unter Ausnutzung des bereits beschriebenen, direkten piezoelektrischen Effekts gemessen. Durch die Piezobeschichtung werden die Federkonstanten der Cantilever jedoch relativ groß, so dass deren Einsatz an biologischen Objekten nicht favorisiert wird.

Positionssensitive Photodioden (PSPD)

Bevor die Messsonde in den Nahbereich der zu untersuchenden Oberfläche gebracht wird, muss der Laserstrahloptik zwischen Laserdiode, Ablenkspiegel, Cantilever und PSPD justiert werden. Zu diesem Zweck positioniert man unter Zuhilfenahme des Ablenkspiegels und lichtmikroskopischer Kontrolle den Laserspot auf der reflektierenden Rückseite des Cantilevers so, dass maximale Fokussierung und Intensität erreicht wird. (Abbildung 34).

Abbildung 34

Die horizontal und vertikal bewegliche PSPD muss nun so eingestellt werden, dass der reflektierte Laserstrahl die Photodiode im Bereich der Grenze zwischen den Segmenten A und B (siehe Abbildung 35) trifft. Die Optimierung der laseroptischen Achse wird zunächst lichtmikroskopisch kontrolliert. Die Feinjustierung wird mit digitalen Messgeräten, die Spannungsdifferenzen zwischen den Segmenten der Photodiode messen, bewerkstelligt. Die Justierspannungen an der PSPD, auf die an dieser Stelle nicht tiefgründiger eingegangen werden soll, sind im AFM-Handbuch dokumentiert. Die so definierte Nullposition des Cantilevers ist Voraussetzung für den erfolgreichen Annäherungsprozess und die AFM-Abbildung. Unter Bedingungen der o.g. Flüssigkeitszellen ändert sich die optische Achse des Laserstrahls erheblich, so dass die Adjustierung häufig misslingt, da sowohl Ablenkspiegel als auch PSPD nur innerhalb eines definierten Bereiches verstellbar sind.

Abbildung 35 aus ⁸⁵

Die Justierung des Lasers gelingt dann nur nach Veränderung der Position des Cantileverchips auf dem Keramikträger. Die Konfiguration der PSPD ist entscheidend für die detektierbaren Auslenkungen des Cantilevers. Neben rein vertikalen Bewegungen, vollzieht der Cantilever im Contact-Mode auch laterale Verwringungsbewegungen. Diese entstehen bei horizontalen Scanbewegungen durch Reibungskräfte zwischen Tip und Probenoberfläche und sind an biologischen Proben, die im Contact-Mode abgebildet werden hauptsächlich für die abbildungsassoziierte Alteration der Objektoberfläche verantwortlich. Um das Ausmaß dieser Reibungskräfte zu quantifizieren, ist es notwendig, 4-Segment-PSPD zu benutzen (Abbildung 35). An biologischen Proben ist die Kenntnis dieser Lateralkräfte von Bedeutung, nicht jedoch deren absolute Quantifizierung. Die destruierende bzw. objekt-alterierende Wirkung dieser Lateralkräfte bei der Abbildung biologischer Objekt-oberflächen im Contact-Mode ist auch bei Auswahl sehr weicher Cantilever (niedrige Federkonstante) nicht voll-ständig zu vermeiden. Deshalb wurden andere Messmodi entwickelt, auf die in den folgenden Abschnitten noch ge-nauer eingegangen wird. Der Einsatz der 4-Segment-PSPD ist demnach für unsere Primärfragestellungen nicht zwin-gend erforderlich. Möchte man jedoch genau diese, aus den Lateralkräften ableitbaren Informationen der Objekt-oberfläche untersuchen, so ist deren Einsatz unerlässlich. Die sich daraus ergebende modifizierte rasterkraft-mikroskopische Methode wird im allgemeinen Sprachgebrauch als “Lateral Force Microscopy” bezeichnet.

Messsignalverarbeitung

Das Ausmaß der interatomaren Wechselwirkungen an jedem Bildpunkt innerhalb des Scanrasters wird in Abhängigkeit von der jeweiligen Laserposition durch die PSPD in definierte Spannungswerte umgesetzt. Diese Spannungen dokumentieren somit indirekt die topografische Höhe (z) jedes Bildpunktes innerhalb eines definierten horizontalen Scanrasters (x, y). Aus der weiteren Verarbeitung dieses Signals ergeben sich prinzipiell zwei gegensätzliche Abbildungsmodi. Bei sehr ebenen Proben, deren vertikale Höhenverteilung im Bereich weniger Nanometer liegt, ist es möglich, das Messsignal der PSPD direkt zur Generierung eines Graustufenbildes zu nutzen. Der Scannertubus vollführt in diesem Modus nur Bewegungen horizontaler Richtung. Demzufolge bleibt der nach Annäherung von Messsonde und Probenoberfläche eingestellte Abstand während des gesamtem Scanvorganges konstant, weshalb dieser Modus als Constant-Height-Mode bezeichnet wird. Für Objekte mit ausgeprägterem Höhenprofil (Mikrometerbereich) und für unbekannte, erstmalig zu untersuchende Oberflächen ist dieser Abbildungsmodus völlig ungeeignet, da der Cantilever größere Höhendifferenzen nicht zu kompensieren vermag und die Probe selbst und meist auch der Cantilever während des Scanprozesses zerstört würden. Abgesehen von der Abbildung bekanntermaßen, atomar glatter Oberflächen (Mica) kam dieser Abbildungsmodus während unserer Untersuchungen nie zur Anwendung. Im sogenannten Constant-Force-Mode oder auch Constant-Signal-Mode wird die nach Annäherung zwischen Messspitze und Probenoberfläche auftretende Interaktionskraft während des gesamten Scanvorganges konstant gehalten. Um dies zu realisieren, wird die PSPD-Signalspannung über eine Rückkopplungsschaltung direkt an den Scannertubus angelegt. In Abhängigkeit von der jeweiligen Spannung vollführt der Scanner kompensatorische Retraktions- bzw. Expansionsbewegungen entlang der vertikalen Achse und reagiert somit auf die detektierte Oberflächentopografie. Der maximal mögliche, vertikale Bewegungsumfang des im Rahmen unserer Experimente zumeist eingesetzten Scanners beträgt 8µm. Objektoberflächen mit noch größeren Höhendifferenzen als 8µm können demzufolge mit unserem mikroskopischen Setup nicht untersucht werden.

Betriebsmodus

Man unterscheidet drei AFM-Betriebsmodi. Contact-Mode und Non-Contact-Mode wurden bereits erwähnt. Der prinzipielle Unterschied zwischen diesen beiden Messmodi besteht darin, dass bei erstgenanntem der atomar spitze Messtip physikalischen Kontakt zur Probe hat, wogegen im Non-Contact-Mode der Cantilever über der Probe schwebt. Die Besonderheit dieses Modus ist darin zu sehen, dass der Cantilever durch einen, in den Cantileverhalter integrierten Minipiezo zu Schwingungen angeregt wird. Die Interaktionskräfte zwischen Probe und Spitze führen zur Veränderung der Schwingungsamplitude bzw. der Schwingungsfrequenz, was, wie unter 3.1.7.1 beschrieben, detektiert wird. Das Messsignal des Non-Contact-Mode ist generell schwächer als das des Contact-Mode, was mit Hilfe der Lennard-Jones-Kurve der interatomaren Wechselwirkung sehr gut zu erklären ist (siehe markierte Messbereiche auf der Lennard-Jones-Kurve, S.23). Im Contact-Mode reichen schon sehr geringe Veränderungen der interatomaren Distanz aus, um große Veränderungen der auf den Messtip wirkenden Kräfte zu induzieren. Im Non-Contact-Mode werden gleich große Kraftänderungen nur durch deutlich größere Atomabstände erreicht. Natürlich erlaubt moderne Messelektronik, das Signal des Non-Contact-Mode zu verstärken. Dabei werden aber auch Störeinflüsse, wie z.B. elektrisches Rauschen mitverstärkt. Deshalb ist es eindeutiger, vom schlechteren Signal-Rausch-Verhältnis zu sprechen. Trotz dieses vermeintlichen Nachteils hat die Non-Contact-AFM-Untersuchung insbesondere an biologischen Proben absolute Berechtigung, weil laterale Kräfte zwischen Probe und Spitze nicht auftreten und deshalb das Objekt nicht destruiert werden kann. Wünschenswert wäre unter diesen Gesichtspunkten die Verfügbarkeit eines Messmodus, der die Vorteile beider genannter Modi vereinigt. Einen solchen Modus stellt der Tapping-Mode dar. Bei diesem Modus wird das Cantilever-Tip-System mittels eines spezifisch konfigurierten Cantileverhalters an seiner Eigenfrequenz angeregt. Im Gegensatz zum Non-Contact-Mode wird die Schwingungsamplitude so eingestellt, dass der Tip bei jedem Schwingungsdurchgang einmal die zu untersuchende Probe berührt. Deshalb sprechen einige Autoren auch vom Intermittent-Contact-Mode. Der Tapping-Mode vereinigt die Vorteile beider o.g. Messmodi. Hiermit wird es möglich, bei gutem Signal-Rausch-Verhältnis die prozedural bedingte Alteration der zu untersuchenden Oberflächen zu minimieren. Erst durch die Einführung dieses Modus in die rasterkraftmikroskopische Technik wurde eine artefaktminimierte Abbildung an Oberflächen vitaler Zellen möglich. Die oszillographische Messung der Eigenfrequenz des Cantilever-Tip-Systems ist beim hier zur Anwendung gekommenen Rasterkraftmikroskop (PSI Autoprobe CP) in der rechnergestützten Mikroskopsteuerung integriert. Das ausführliche Einstellungsprocedere für die einzelnen Messmodi ist im Bedienungshandbuch des Mikroskops eingehend beschrieben.

Kraft-Abstands-Kurven und ableitbare Funktionen^{(modifiziert nach} ⁸⁹ ^, ⁹⁰ ⁾

Landet man mit der Messsonde auf einem definierten Punkt (x,y) der Objektoberfläche, so ergibt sich folgendes Bild (siehe Abbildung 36). Solange Untersuchungsobjekt und Spitze weit genug voneinander entfernt sind, bestehen keine Wechselwirkungen (a) zwischen Atomen der Messsonde und der Oberfläche. Im Nahfeld der Oberfläche dominieren überwiegend anziehende Kräfte, die dazu führen, dass die Spitze und die Proben-oberfläche Kontakt gewinnen (sog. „snap-in-point“ (b)). Abbildung 36 modifiziert nach ⁸⁹

Drückt man nun die Objektoberfläche durch kontrollierte Scannerbewegungen in vertikaler Ebene weiter gegen die Probe, so wird die Beziehung zwischen Ausmaß der Scannerbewegung und resultierender Kraft zwischen Spitze und Objektoberfläche nur von der Federkonstante des Cantilevers bzw. von den elastischen Eigenschaften der Probe beeinflusst. Die maximale Vertikalbewegung des Scanners (c) wird vor Akquirierung der Kraft-Abstands-Beziehung definiert, um die Zerstörung des Cantilevers durch starke mechanische Beanspruchung (Verbiegung) möglichst zu verhindern. Außerdem ist die maximal erreichbare vertikale Auslenkung des Scanners durch seine piezokeramische Geometrie definiert und begrenzt. Während der weiteren Retraktionsbewegung des Scanners bleibt der Kontakt zwischen Messsonde und Objektoberfläche solange bestehen, wie anziehend wirkende Kräfte zwischen Objekt und Sonde gegenüber den Rückstellkräften (Federkraft) des Cantilevers betragsmäßig dominieren. Am sog. „snap-back-point“ (d) ist die Federkraft des Cantilevers und anziehende Kräfte zwischen Tip und Oberfläche gleich groß. Die weitere Retraktionsbewegung des Scanners bewirkt, dass der bestehende Kontakt zwischen dem Objekt und dem Messtip verloren geht und der Federbalken wieder in seine Ausgangsposition (a) zurückspringt. Dieser Untersuchungsablauf wird über mehrere Zyklen wiederholt und die resultierenden Kraft-Abstands-Kurven werden interpoliert. Die in Abbildung 36 dargestellte Beziehung reflektiert das typische Bild der Kraft-Abstands-Kurve, die unter Raumbedingungen akquiriert wurde. Die Erfassung der punktuellen Kraft-Abstandsbeziehungen an Oberflächen der zu untersuchenden Objekte ermöglicht die Detektion störender Interaktionskräfte (Physiosorption, Meniskuskräfte, elektrostatische Kräfte, etc.). Untersucht man Kraft-Abstands-Beziehungen beispielsweise unter Vakuumbedingungen, wo die erwähnten Störfaktoren nicht präsent sind, verändert sich das Bild in der Form, dass „snap-in“- und „snap-back-point“ denselben Punkt beschreiben, und dass die Kraft-Abstands-Kurve, die während der vertikalen Expansionsbewegung des Scanners aufgenommen wurde deckungsgleich zu der Kurve ist, die durch die Retraktionsbewegung des Scanners beschrieben wird. Besonderes Interesse erlangt die rasterkraftmikroskopische Messung von Kraft-Abstands-Kurven unter dem Gesichtspunkt, dass bei bekannter, definierter Federkonstante des Cantilevers, die Kraft-Abstands-Beziehung im Kontaktbereich zwischen Sonde und Oberfläche nur von den elastischen Eigenschaften des Untersuchungsobjektes bestimmt wird. Diese im angloamerikanischen Sprachraum als „visco-elastic-indentation“ bezeichnete „Eindrückbarkeit“ der Oberfläche ist punktuell messbar. Radmacher et al. entwickelten eine Methode („Force-Mapping“) diese punktuell detektierbaren, visko-elastischen Oberflächenparameter an jedem Bildpunkt eines definierten Punktrasters aufzuzeichnen und eröffneten damit die Möglichkeit, topografische und assoziierte visko-elastische Informationen der selben Untersuchungsoberfläche kombiniert zu untersuchen.

Probenpräparation Kardiovaskuläre Zellen aus immortalen Zellkulturen Bovine aortale Endothelzellen (BAEC)

BAEC sind immortale Endothelzellen aus der Rinderaorta, die wir bei ATCC (American Type Culture Collection) kommerziell erwarben. Wir kultivierten diese Zellreihe mit folgenden Medien:

Dulbeccos®- Nährmedium
10 %-iger Zusatz von fötalem Kälberserum (FCS®)
dazu 20 ml SC-Zusatz (Natriumpyruvat, Natriumhydrogenkarbonat, Penicillin/Streptamycin-Antibiotikagemisch) pro Liter Nährmedium.

Die Kultivierung erfolgte nach Passage bzw. nach dem Auftauen der aliquotierten Stammzellen in Zellkulturflaschen (175 cm², Firma Nunc), im Brutschrank bei 37°C und 5 %-iger CO2-Begasung. Die Passagezeit (Zeitraum vom Ausplattieren der Zellen bis zum Erreichen der Konfluenz eines endothelialen Layers) betrug in Abhängigkeit vom Alter der Zellen zwischen 72 und 84 Stunden. Nach dieser Zeit wurden die Zellen mittels Trypsin und mechanisch („rubber-policeman“) vom Boden Zellkulturflasche abgelöst und entweder weiterpassagiert oder für AFM-Versuche auf geeignete Objektträger (CELLocate^®-Coverslips, Firma Eppendorf) ausplattiert. Dreiviertel des nach Zentrifugation in 4 ml Medium resuspendierten Zellpellets wurden in drei neuen Kulturflaschen weiterpassagiert. Das verbliebene Viertel (1 ml) wurde zu gleichen Teilen auf 4 bis 5 mit Laminin (Zellstrukturprotein; 100 µl/1 cm² Laminin) beschichtete CELLocate^® ausplattiert. Nach weiteren 24 bis 36 Stunden im Kulturschrank wurden die Zellen bei erreichter Subkonfluenz rasterkraft-mikroskopisch unter Einsatz der o.b. Flüssigkeitszellen untersucht. In der Etablierungsphase dieses Experiments wurden die Zellen 10 Minuten mit 1 %-igem Glutardialdehyd bei 8°C und bei Raumtemperatur fixiert, um Oberflächenproteine zu vernetzen und damit die Stabilität der Membranoberflächen zu verbessern.

Die ersten Zellen, die rasterkraftmikroskopisch untersucht wurden, waren avitale, im Exsikkator luftgetrocknete BAEC die aber auch unter Bedingungen der Flüssigzelle in PBS (phosphate buffered saline) abgebildet und an den Kraft-Abstands-Untersuchungen vorgenommen wurden. Die gewählten, AFM-spezifischen Abbildungsbedingungen werden im Ergebnisteil ausführlich besprochen.

Myozyten H9C2

H9C2 sind immortale, ventrikuläre, myoblastäre Zellen, die ebenfalls bei ATCC (American Type Culture Collection) kommerziell verfügbar sind. Wir kultivierten diese Zellreihe mit folgenden Medien:

pro 500 ml Lebovitz®- Medium

5 ml PenStrep®
5 ml L-Glutamin
250 mg BSA (500 µg/ml Endkonzentration)
50 ml FCS®
1,05 g NaHCO3 (25 mM Endkonzentration)
5 ml GMSG® (1x) (GIBCO KatNo.: 41400-37)
5 ml Glucose 30 %

Alternativ dazu bietet ATCC H9C2-Medium an, welches folgende Bestandteile enthält:

DMEM® (Dulbeccos modified Eagle Medium) mit Glutamin
10 % FCS (bis 1 % reduzierbar)
5 ml Pen-Strep®

Die Kultivierung erfolgte nach Passage bzw. nach dem Auftauen der aliquotierten Stammzellen in Zellkulturflaschen (175 cm², Firma Nunc), im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO2-Begasung. Die Passagezeit lag bei ca. 60 Stunden. Nach dieser Zeit wurden die Zellen trypsiniert und mechanisch vom Boden Zellkulturflasche abgelöst und entweder weiterpassagiert oder für AFM-Versuche auf geeignete Objektträger nach dem o.b. Schema ausplattiert. Nach weiteren 24 Stunden im Kulturschrank wurden die Zellen bei erreichter Subkonfluenz rasterkraftmikroskopisch unter Einsatz der Flüssigzelle untersucht. Auch diese Zellreihe wurde in der Etablierungsphase des AFM-Experiments 10 Minuten mit 1 %-igem Glutardialdehyd bei 8°C oder bei Raumtemperatur fixiert und unter zellphysiologischen Bedingungen abgebildet. Alle weiteren Versuche wurden an unfixierten, vitalen Zellen durchgeführt.

Aortale Endothelzellen im Gewebsverband

Die Untersuchung von gewebsgebundenen endothelialen Zellverbänden war primär darauf ausgerichtet, die Möglichkeiten der in-vitro-Rasterkraftmikroskopie zu evaluieren. Dazu wurde die thorakale Aorta descendens von Ratten, Meerschweinchen und Kaninchen präpariert. Die hierfür benötigten Tiere wurden im Rahmen geplanter Experimente anderer Arbeitsgruppen unserer Klinik (Langendorf-Herzmodell, isoliert perfundierte Lunge etc.) sediert, thorakotomiert und anschließend versuchsspezifische Organentnahmen durchgeführt. Im Anschluss daran entnahmen wir nach Kanülierung und proximaler Ligatur des Arcus aortae, unter kontinuierlicher Infusion von modifizierter physiologischer Krebs-Henseleit-Lösung (116,4 mM NaCl; 9,9 mM Glukose; 24,9 mM NaHCO3; 5,9 mM Hepes-Puffer, 4,02 mM KCl; 1,26 mM CaCl2; 1,116 mM MgSO4; 1,19 mM KH2PO4) die thorakale Aorta vom Arcus aortae bis zu den proximalen Anteilen der Aa. Iliacae communes. Die so dargestellte und exzidierte Aorta wurde im physiologischen Medium longitudinal auf ganzer Länge inzidiert, um das Gefäßendothel der AFM-Untersuchung zugänglich zu machen. Die Fixierung des Gewebsblocks auf dem magnetischen Scannertubus des AFM erfolgte mittels eines speziell für diese Versuche konzipierten und konstruierten Probenhalters.

Abbildung 37

Bei der in Abbildung 37 schematisierten Probenaufnahme wird der Gewebsblock zwischen einer sterilen HD-PE-Folie und einem Glasdeckgläschen festgeklemmt, so dass die zu untersuchende Region des Aortenendothels unter den Bedingungen der beschriebenen AFM-Flüssigkeitszelle darstellbar ist.

Primär isolierte Zellen Adulte Kardiomyozyten und kardiale FLC (fibrocyte like cells)

Die Primärisolation kardialer Zellen von unterschiedlichen Spezies (Ratte, Mensch) wurde im kardiologischen Forschungslabor der Medizinischen Klinik und Poliklinik der Charité routinemäßig unter Anwendung der Jakobsen-Methode in einer modifizierten Langendorf-Perfusions-Apparatur durchgeführt. Für die Primärisolation humaner Kardiomyozyten wurde linksventrikuläres Myokard verarbeitet, welches im Rahmen herzchirurgisch-resezierender Operationen (linksventrikuläre Aneurys-mektomien, partielle Ventrikulektomie nach Batista) gewonnen wurde. Diese Eingriffe werden in der Herzchirurgischen Klinik der Charité regelmäßig durchgeführt und die Transferzeit von der Entnahme des Resektats bis zum Start des Isolationsprocederes von Primärzellen im Zellkulturlabor betrug 25 bis 40 Minuten. Die Tiere wurden durch intraperitoneale Injektion von Trapanal getötet, anschließend auf einer speziellen Präparierplatte fixiert und die Haut mit unsterilem Besteck abpräpariert. Unter jetzt sterilen Kautelen wurden die Rippen beidseits durchtrennt, das Sternum hochgeklappt und die eröffnete Thoraxhöhle mit kaltem, sterilem PBS gespült. Nachfolgend wurde das Herz chirurgisch unter kontinuierlicher Eiswasserspülung am Gefäßstiel entnommen und an der Aorta ascendens mittels einer Ringligatur in der Langendorfapparatur aufgehängt. Das humane Myokard wurde entweder an einer kanülierbaren Koronararterie des Resektats oder durch interstitielle Kanülierung (4-5 Kanülen) angeschlossen. Das Perikard der Tierherzen wird steril abpräpariert und unmittelbar danach erfolgt die Perfusion mit kalziumhaltigem Krebs-Henseleit Medium (KHM) bis zum steady state (normalisierter und konstanter dp/dt) für ca. 15 min. Unter nachfolgender Perfusion mit kalziumfreiem Krebs-Henseleit Medium für ca. 15 min wird ein kardioplegischer Effekt erzielt und die Herzaktion sistiert. Diese Prä-Perfusionen werden druckkonstant bei 24 mmHg durchgeführt, um das Herz von Blutresten zu säubern und Kalzium aus dem Interstitium zu entfernen, was zu einer Lösung der Disci intercalares führt.

KH-Medium (kalziumfrei):

KH-Medium (kalziumhaltig):

NaCl

6,8 g/l

NaCl

6,8 g/l

Glucose

1,8 g/l

Glucose

1,8 g/l

NaHCO3

2,092 g/l

NaHCO3

2,092 g/l

Hepes

1,4 g/l

Hepes

1,4 g/l

Pyruvat

0,22 g/l

Pyruvat

0,22 g/l

KCl

0,3 g/l

KCl

0,3 g/l

MgSO4

0,29 g/l

MgSO4

0,29 g/l

KH2PO4

0,163 g/l

KH2PO4

0,163 g/l

CaCl2

0,735 g/l

Beide Medien werden mit folgenden antibiotischen Zusätzen versetzt:

1 ml Gentamicin® (50 mg/ml)
10 ml PenStrep® (5000 IU/ml = 5000 µg/ml)

Durch Umlegen eines Drei-Wege-Hahnes wird die Perfusion mit Enzymlösung gestartet. Nach etwa einer Minute wird der Auffangtrichter der Langendorf-Apparatur unter das Herz (humanes Ventrikelresektat) geschwenkt und soweit nach oben geschoben, dass das Herz vollständig in ihm versenkt ist, jedoch frei hängt. Der Verschluss des Trichters mit einem Plexiglasdeckel sorgt nun für den Abschluss der Klimakammer. Das Herz wird nun 30-50 min. perfundiert, um das Bindegewebe zu verdauen. Um Enzymlösung zu sparen, wurde der Puffer in das Vorratsgefäß zurückgepumpt und reoxygeniert, das Herz somit rezirkulierend perfundiert. Der koronare Fluss wurde gemessen und alle zwei Minuten protokolliert. Als Zeichen eines fortschreitenden Bindegewebsverdaus stieg dieser gegen Ende der Enzymperfusion stark an.

Die spezielle Proteasen-Perfusionslösung besteht aus folgenden Substanzen:

10 mg Trypsin / 75 ml kalziumfreies KHM
70 mg Kollagenase Typ II / 75 ml kalziumfreies KHM
120 mg BSA / 75 ml kalziumfreies KHM

Um die für längere Lagerung unerwünschten Enzyme zu entfernen, wurde anschließend noch mit Hoch-Kalium-Puffer für ca. 5 Minuten nachperfundiert. Im Anschluss daran, wird das Herz aus Langendorfapparatur entnommen und in einer sterilen Petrischale werden zuerst die Vorhöfe und die Gefäße abpräpariert, um danach das Herz in kleine Stückchen (2-3 mm²)zu zerschneiden. Das so gewonnene Myokard wird in o.b. Proteasenlösung durch Rückwärtsbegasung ca. 20 min gemischt. Mittels steriler Entnahme kleiner Mengen (Pipette) aus diesem Lysat wird Lyseeffekt regelmäßig mikroskopisch kontrolliert. Im Anschluss daran wird das Lysat durch ein Nylonnetz (200 µm Porengröße) filtriert, um unverdaute Gewebsreste zu entfernen. Das gewonnene Filtrat wird bei 300 U/min, 4 Minuten zentrifugiert. Um optimale Trennung der myozytären Komponenten von den Bindegewebszellen zu erzielen, kann optional eine Zentrifugation bei 800 U/min für 2 Minuten zusätzlich durchgeführt werden. Das zumeist gut sichtbare Zentrifugat (Myozytenpellet) wird nach Absaugen des Überstandes in M 199 mit 20 % fötalem Kälberserum (FCS) aufgenommen und resuspendiert. Mittels einer Neubauer-Zählkammer wurde die Myozytenkonzentration ermittelt. Die auf diese Weise isolierten Myozyten wurden auf speziellen Objektträgern (CELLocate^®) in 6- oder 24- Well-Kammern ausplattiert und für maximal 12h im Brutschrank inkubiert. Die fibrozytären und fibroblastären Elemente werden gewonnen, indem man die o.g. Nylonnetzfiltration unterlässt und im Anschluss daran nur den ersten der beiden Zentrifugationsschritte durchführt. Die daraus hervorgehenden Zellpellets werden ausplattiert ebenfalls in M 199 (+20 % FCS) und man findet neben Myozyten, gehäuft Fibrozyten und Fibroblasten.

Isolation neonataler Ratten Myozyten (NBR-Myozyten)

Wir bezogen 2-3 Tage alte, neonatale Ratten (Schwangerschaftsdauer 3 Wochen) aus dem Tierstall der Charité. Zunächst wurden die Tiere in Aqua dest. und in Ethanol in einer großen Petrischale gewaschen. Unmittelbar danach töteten wir die neonatalen Ratten per Genickbruch mit einer Kocherklemme. Nach Spreizen des Thorax mit einer Pinzette wurde das Sternum durchtrennt und gespreizt. Anschließend entnahmen wir das Herz mit einer sterilen Pinzette und überführten es in eine sterile, vorgekühlte Petrischale mit 30 ml HBSS (Hank´s balanced salts - ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ mit Phenolrot und ohne PenStrep). Die Vorhöfe wurden mit 2 Pinzetten unter ständiger HBSS-Spülung abpräpariert. Die verbleibenden Ventrikel überführten wir im Anschluss daran in eine Petrischale mit 30 ml frischem HBSS. Nachfolgend zerkleinerten wir die so gewonnenen Ventrikel unter der Sterilbank mit 2 Skalpellen in ca. 6-7 Stücke. Nach Präparation von 20 Herzen füllten wir die Petrischale mit 40 ml Trypsinlösung (2,0 ml je Herz) auf. (Trypsin 0,1 % in HBSS [500 mg / 500 ml] pH 7,2, steril filtriert [0,22m Falcon^®-Filter], Trypsin Typ II Sigma T8128 aus Schweinpankreas). Die Andauung der extrazellulären Matrix der neonatalen Ventrikel erfolgte ca. 16h bei 4C im Kühlschrank. Am darauffolgenden Tag wurde die Trypsinierung beendet und die Zellen wurden in 40 ml Medium (Medium M199 + 10 % NBCS [new born calf serum GIBCO KatNo.: 16010-084 Lot: 30F0843D] + 1 % PenStrep^® [GIBCO KatNo.: 15140-023] ausplattiert. Anschließend wurden die Zellen erneut in einer 25 ml Pipette aufgesaugt, und in 70 ml Medium in einem Erlenmeyerkolben mit seitlichem Auslass resuspendiert. Nach 25-minütigem trypsinieren (Resttrypsinaktivität), 6-8 minütigem Repipetting zum Auflösen der letzten Gewebsbestandteile, und 10-minütigem Sedimentieren der Zellen (Bindegewebszellen) im Medium wurde der Überstand erst in ein BlueCap^®, und dann in eine Kulturflasche mit 20 ml Medium (um Flusenfreiheit zu kontrollieren) überführt und resuspendiert. Dieser in der Kulturflasche resuspendierte Überstand wurde 1h im Brutschrank (37C; 5 % CO2) inkubiert und nachfolgend auf die o.b. AFM-Objektträger (CELLocate^®) ausplattiert. Am 3. Tag wurden die Zellen nochmals mit temperiertem Medium gewaschen. Weitere Mediumwechsel wurden alle 2-3 Tage durchgeführt. Nach 5-6 Tagen waren die neonatalen, ventrikulären Myozyten subkonfluent und wurden der rasterkraftmikroskopischen Untersuchung im Zellkulturmedium zugeführt. Um die Bindegewebszellen der neonatalen Rattenherzen zu isolieren, wurden die sedimentierten (s.o.) Zellen, nach Absaugen des Zellkulturmediumüberstandes in o.b. Medium resuspendiert und wie unter 3.2.3.1 beschrieben ausplattiert und kultiviert.

Thrombozyten

Wir präparierten die Blutplättchen zunächst aus Vollblut, welches auf einen silanisierten Glasobjektträger aufgetropft wurde. Nach 5-10 minütiger Inkubationszeit wurde der Blutstropfen mittels mehrmaliger, forcierter Spülung vom Objektträger heruntergewaschen. Die auf dem Objektträger verbleibenden zellulären Bestandteile wurden als kontaktaktivierte Thrombozyten identifiziert und der AFM-Untersuchung zugeführt. Bei initialen Versuchen bedienten wir und dieser einfachen Methode, stellten allerdings fest, dass sowohl Größe als auch Morphologie der rasterkraftmikroskopisch abgebildeten Zellen extrem differierten und der Eindruck entstand, dass neben den aktivierten Thrombozyten auch andere zelluläre Blutbestandteile auf dem Glasobjektträger verbleiben und abgebildet werden. Deshalb entschlossen wir uns, Proben aus Thrombozytenkonzentrate, die uns durch das Institut für Transfusionsmedizin der Charité (Prof. Kiesewetter) zur Verfügung gestellt wurden, für weitere experimentelle Ansätze zu nutzen. Der Reinheitsgrad dieser Präparate ist >99 %, so dass von einer reinen Thrombozytenpopulation in unseren Proben auszugehen war. Diese Thrombozytenkonzentrate wurden auf einen silanisierten Glasobjektträger aufgetropft, unter Brutschrankbedingungen 15 Minuten inkubiert und im Anschluss wie oben beschrieben mittels plasmaisotoner Spüllösung (PBS) gewaschen und unmittelbar danach der AFM-Untersuchung unter zellphysiologischen Bedingungen (PBS-Puffer, 37°C) zugeführt. Für die Untersuchung der Thrombozytenmorphologie auf koronarinterventionellen Stentoberflächen wurde das gleiche präparative Setup verwendet, wobei die Stentoberfläche vor Inkubation mit den Thrombozytenkonzentraten nicht spezifisch vorbehandelt wurde.

20S-Proteasom

Die Präparation der 20S-Proteasomen wurde von Herrn Dr. Christoph Günther (Medizinische Klinik und Poliklinik I der Charité) realisiert. Das angewandte Präparationsprocedere ist im Material- und Methodenteil der Publikation von Stohwasser et al.⁹¹ ausführlich beschrieben. Die in PBS suspendierten Proteasomen wurden unter Raumbedingungen 20 Minuten auf einer Mica-Oberfläche (atomar glatter Glimmer) inkubiert und unter zellphysiologischen Bedingungen der AFM-Untersuchung zugeführt. Die theoretischen Hintergründe dieses Untersuchungs-ansatzes werden im Ergebnisteil ausführlich beschrieben.

Koronarinterventionelle Stents

Es wurden Proben der luminal gerichteten Oberflächen koronarinterventionell relevanter Materialien (Stents) präpariert. Dabei ist das Präparationsschema für die unterschiedlichen Materialien und die verschiedenen Dilatationszustände der Stents normiert. Folgende Schritte sind notwendig :

Entnahme der Stents aus der sterilen Verpackung
Aufziehen des Materials auf einen Silikonschlauch passenden Durchmessers
mikromanipulatorisches Zerteilen (alternativ Laserschneiden) des gesamten Stents in drei gleichgroße Abschnitte (ohne den Stent mechanisch zu deformieren)
tangentiales Auftrennen der zylindrischen Stentanteile, um Einzelmaschen zu präparieren
Aufkleben der Einzelmaschen des Stents auf 25 mm Glasdeckgläschen mittels eines biokompatiblen und thermostabilen Zweikomponenten- Epoxidharzes (EPO- TEC 302-3M) in der Form, dass die konvexe (in-situ abluminal gerichtete) Stentoberfläche mit dem Kleber in Kontakt kommt und die zu untersuchende konkave (in-situ luminal gerichtete) Oberfläche planparallel zum Objektträger nach oben orientiert ist
3-stündige Trocknung bei 65°C im Trockenschrank

Reinigung der Stenoberfläche

Stentmaschen für 2h in hochkonzentriertem Detergens (Tween) einlegen
intensives Spülen mit deionisiertem Aqua bidest.
7 min. Bestrahlung mit UV- Licht (256 nm Wellenlänge)
wiederholtes Spülen mit deionisiertem Aqua bidest.
Ultraschallreinigung in 98 % Ethanol (5 min cont.)
erneutes Spülen mit deionisiertem Aqua bidest.
Plasmaätzen der Probenoberfläche (Institut für Anatomie der Charité)
Überführung und Lagerung der gereinigten Probe im Exsikkator

Dilatation der Stents

Die Stents werden mit dem kommerziell verfügbaren PTCA- Set (Ballonkatheter und Insufflator) dilatiert, wobei das in vivo Elastizitätsmodul der Koronararterienwand mittels eines normierten Silikonschlauches (Innendurchmesser 3,5 mm) in vitro simuliert wird. Dabei sollen die vom Hersteller angegebenen optimalen Dilatationsdrücke (6 –8 atm) insuffliert werden. Danach erfolgte das o.b. Procedere.

Zellpräparation auf Stentoberflächen

Die auf Glasobjektträgern präparierten Einzelmaschen der verschiedenen Stenttypen

und der jeweiligen Dilatationszustände der Stents werden autoklaviert und im Zelllabor mit humanen Thrombozytenkonzentraten inkubiert (s.o.). Die primäre Stentstruktur sollte dabei neben den zellulären Strukturen mikroskopisch erkennbar und beurteilbar bleiben. Deshalb wurden die Thrombozytenkonzentrate 1:10 in PBS verdünnt. Bei Inkubation der präparierten Stentmaschen mit unverdünnten Thrombozytenkonzentraten imponierten die Thrombozyten quasi konfluent auf der Stentoberfläche, so dass eine Beurteilung der zellulären Kontaktzonen mit der Stentoberfläche kaum noch möglich war.

AFM- Abbildung der Stentoberflächen

Messung erfolgt unter Flüssigkeit (Aqua dest. bzw. bei den zellbewachsenen Proben in physiologischem Puffer z.B. PBS) in der Flüssigzelle (PSI- liquid- cell)
Intermittent-Contact-Mode AFM mit Microlever 0,6 µm Typ A (typische Kraftkonstante 0,05 N/m)
Scanareal für Rauhigkeitsanalyse/ Einzelbild 25 µm x 25 µm
Zentralbild des 5x5- Rasters wird hochaufgelöst (100µm2 bis 5µm2)
Registrierung der Topography- und Error-Mode Bilder (512x512 Pixel)
Schnelle-Scan-Richtung bei allen Scans ist x-orientiert
Die Bildreihenfolge der Einzelscans wird wie in der folgenden Abbildung gezeigt, realisiert

Abbildung 38

Bildverarbeitung

Die Analyse und Bildverarbeitung erfolgt mit der Bildverarbeitungssoftware der Firma PSI (Proscan 1.5) und dem Adobe Photoshop (Version 5.0). Näheres hierzu ist im Bedienungs-Handbuch des Mikroskops ausführlich beschrieben.

Rauhigkeitsanalyse der Stentoberflächen

Die in-situ nach endoluminal gerichtete Oberfläche des in Abbildung 39 schematisierten Palmaz-Schatz-Stents wird hinsichtlich der zu ermittelnden Rauhigkeitsparameter in unterschiedlichen Regionen untersucht. Dazu werden Einzelscans der Größe 25µm² aus den entsprechenden Stentregionen akquiriert. Untersucht werden die integrale Oberflächenrauhigkeit (n=30 Einzelscans) und die Rauhigkeit in den Bereichen besonderer, bei Dilatation des Stents auftretender, mechanischer Beanspruchung (Quersteg, Längssteg, Kniebereich des Stents). Von diesen Bereichen werden jeweils 5 repräsentative, 25µm²große Scans akquiriert. Die nach Bildprozessierung und Analyse (Proscan 1.5) ermittelten Rauhigkeitsparameter werden an nativen und an dilatierten Stentoberflächen verglichen, um den Einfluss des Dilatationsprocederes auf die Oberflächenrauhigkeit (möglicher Thrombogenitätsfaktor) zu ermitteln.

Abbildung 39

Berechnete Rauhigkeits-parameter

Digitale Bilder werden durch Pixel beschrieben, wobei sich jeder Bildpunkt aus jeweils einer x-, y- und z- Koordinate zusammensetzt. Im Falle der hier ausgewerteten Topografiebilder (512 x 512 Pixel) werden den z- Werten (256 Graustufen) geometrische Höhen durch Kalibrierung (siehe oben) zugeordnet. Folgende Rauhigkeitsparameter wurden aus diesen Messkoordinaten berechnet:

mean height (mittlere Höhe) :
Der Mittelwert der Grauwerte wird mathematisch wie folgt definiert :
, wobei N = Anzahl der Datenpunkte (512x512 Pixel / Bild)

median height (mediane Höhe) :
Die mediane Höhe ist diejenige Höhe , die das Grauwerthistogramm in zwei gleich große Flächen einteilt. 50 % der Datenpunkte haben höhere Beträge und 50 % der Daten niedrigere Beträge als der Median- Wert.

Rp-v (maximale Höhendifferenz) :
Rp-v wird definiert durch die Differenz des größten und des niedrigsten Wertes innerhalb einer eingeschlossenen Region.

Average (ave)- roughness = R(ave) (mittlere Rauigkeit) :
Die durchschnittliche Rauhigkeit wird durch die mittlere Abweichung vom Mittelwert innerhalb der eingeschlossenen Region definiert.
, wobei = Mittelwert der Datenpunkte

root- mean- squared (rms)- roughness = R(rms) (Standardabweichung) :
, wobei = Mittelwert der Höhenpunkte

Da die Rrms quadratische Werte enthält, werden große Abweichungen vom Mittelwert schwerer gewichtet als durch die Rave. Aus dem gleichen Grund fallen kleine Abweichungen vom Mittelwert bei der Rrms weniger ins Gewicht als bei der Rave.