Vergleichende Permeabilitäts- und Penetrationsstudien in vitro an Schweinekornea und Rindernasenmukosa sowie biophysikalische Untersuchungen an potentiellen Formulierungen (Mikroemulsionen)

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Pharmazie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Telse Erika Richter
geboren am 06.07.1971
in Karlsruhe

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter/innen:
1. Frau Prof. Dr. Sigrid Keipert
2. Herr Prof. Dr. Hans-Hubert Borchert
3. Herr Prof. Dr. Dietmar Möbius

Tag der mündlichen Prüfung: 05. April 2004

Inhaltsverzeichnis

• Vorwort
• 1 Einleitung
• 2 Problemstellung
• 3  Theoretische Grundlagen
  • 3.1  Anatomie und Physiologie des Auges
    • 3.1.1  Kornea
    • 3.1.2 Tränenfilm
    • 3.1.3 Enzyme
  • 3.2 Anatomie und Physiologie der Nase
    • 3.2.1  Nasenmukosa
    • 3.2.2 Enzyme
  • 3.3 Auge und Nase als Applikationsorgane für Arzneistoffe
  • 3.4 Verwendete Wirkstoffe
    • 3.4.1  Androstendion und Testosteron
    • 3.4.2 Fluorescein
  • 3.5 Verwendete Hilfsstoffe
    • 3.5.1  Cremophor^®EL
    • 3.5.2  Propylenglykol
    • 3.5.3 Isopropylmyristat
    • 3.5.4 Cyclodextrine
• 4 Ergebnisse und Diskussion
  • 4.1  Mikroemulsionssysteme
    • 4.1.1  Allgemeines
    • 4.1.2 Zusammensetzung
    • 4.1.3 Charakterisierung
      • 4.1.3.1  Theoretischer Hintergrund
      • 4.1.3.2 Physikalisch-chemische Parameter
      • 4.1.3.3 DSC-Messungen
      • 4.1.3.4 Röntgenkleinwinkelstreuung
    • 4.1.4 Arzneistoff-Wechselwirkungen
      • 4.1.4.1  Verteilungskoeffizient
      • 4.1.4.2 Sättigungslöslichkeit
      • 4.1.4.3 Cyclodextrin-Einschluss des AD
  • 4.2 Permeationsstudien
    • 4.2.1 Einführung
    • 4.2.2 Theoretischer Hintergrund
    • 4.2.3 Ergebnisse
      • 4.2.3.1  Androstendion
        • 4.2.3.1.1  Untersuchungen mit HP-γ-CD
        • 4.2.3.1.2 Untersuchungen mit Cremophor^® EL
        • 4.2.3.1.3 Untersuchungen mit den Mikroemulsionen ME-PG und ME-CD
        • 4.2.3.1.4 Untersuchungen mit der Mikroemulsion ME-ION und mit HTAP-β-CD
        • 4.2.3.1.5 Permeationsrate
        • 4.2.3.1.6 Kapitel-Zusammenfassung
      • 4.2.3.2 Testosteron
      • 4.2.3.3 Fluorescein-Na
  • 4.3 Penetrationsstudien
    • 4.3.1 Einführung
    • 4.3.2 Rindernasenmukosa
    • 4.3.3 Schweinekornea-Epithel
  • 4.4 In-vivo-Studien
  • 4.5 Biophysikalische Untersuchungen
    • 4.5.1  Theoretische Grundlagen
    • 4.5.2 Ergebnisse
      • 4.5.2.1  Spreitung von MGS auf Wasser/Puffer
      • 4.5.2.2 Subphasen-Zusatz: Cremophor^®EL
      • 4.5.2.3 Subphasen-Zusatz: Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin
      • 4.5.2.4 Subphasen-Zusatz: Hydroxytrimethylammoniopropyl-β-Cyclodextrin
      • 4.5.2.5 Subphasen-Zusatz: Propylenglykol
      • 4.5.2.6 Subphasen-Zusatz: Mikroemulsion ME-CD
      • 4.5.2.7 Subphasen-Zusatz: Mikroemulsionen ME-PG bzw. ME-ION
      • 4.5.2.8 Subphasen-Zusatz: Mischungen aus CrEL mit HP-γ-CD bzw. HTAP-β-CD
      • 4.5.2.9  ^{Subphasen-Zusatz:} Fertigarzneimittel liposic^®
• 5 Experimenteller Teil
  • 5.1 Substanzen
  • 5.2 Methoden
    • 5.2.1  Gehaltsbestimmungen
      • 5.2.1.1  Androstendion und Testosteron
      • 5.2.1.2 Fluorescein
    • 5.2.2 Herstellung der Mikroemulsionen
    • 5.2.3 Färbemethode
    • 5.2.4 Polarisationsmikroskopie
    • 5.2.5 Physikalisch-chemische Untersuchungen
      • 5.2.5.1 Viskosität
      • 5.2.5.2 Dichte
      • 5.2.5.3 pH-Wert
      • 5.2.5.4 Brechungsindex
      • 5.2.5.5 Tonizität
      • 5.2.5.6 Oberflächenspannung
      • 5.2.5.7 Dielektrizitätskonstante
    • 5.2.6 Kalorimetrische Messungen
    • 5.2.7 Röntgenkleinwinkelstreuung
    • 5.2.8 Verteilungskoeffizient
    • 5.2.9 Sättigungslöslichkeit
    • 5.2.10 In-vitro-Permeationsstudien
      • 5.2.10.1  Präparieren des Gewebes
      • 5.2.10.2 Synthetische Membran
    • 5.2.11 Penetrations- und Metabolisierungs-Studien
      • 5.2.11.1  Rindernasenschleimhaut
      • 5.2.11.2 Schweinekornea
    • 5.2.12 In-vivo-Studien
    • 5.2.13 Biophysikalische Untersuchungen
    • 5.2.14 Statistik
• 6 Zusammenfassung
• Danksagung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis

Tabellenverzeichnis

• Tabelle 1: Physikalisch-chemische Parameter der Tränen
• Tabelle 2: Gegenüberstellung der Absorptionsvoraussetzungen von Auge und Nase
• Tabelle 3: Einfluss von Formulierungsparametern auf die Absorption von Arzneistoffen nach okularer und nasaler Applikation
• Tabelle 4: Prozentuale Zusammensetzung [g/g] der Mikroemulsionen
• Tabelle 5: Physikalisch-chemische Parameter der Mikroemulsionen
• Tabelle 6: Oberflächenspannung verschiedener Cremophor^® EL-Mischungen
• Tabelle 7: Mischungsenthalpien von ME-CD mit unterschiedlichem Kotensid-Gehalt und Androstendion
• Tabelle 8: Verteilungskoeffizienten (VK) von Androstendion (AD) und Fluorescein-Na (FSC) mit verschiedenen Zusätzen
• Tabelle 9: Rel. Molmasse (M_rel), Geradenanstieg (tan α) bei molarer Auftragung und K_stab für Androstendion-Komplexe mit HP-γCD und HTAP-βCD
• Tabelle 10: P_eff und Lag-time für AD (25 µg/ml) aus EBS und Formulierungen mit HP-γ-CD
• Tabelle 11: P_eff und Lag-time für AD (25 µg/ml) aus EBS und mit CrEL-Zusatz
• Tabelle 12: P_eff und Lag-time für AD (25 µg/ml) aus EBS, ME-PG und ME-CD
• Tabelle 13: P_eff und Lag-time von AD (25 µg/ml) durch Nephrophan^® unter Einfluss von 9% PG und 1% CrEL
• Tabelle 14: P_eff und Lag-time für AD (25 µg/ml) aus ME-ION und mit HTAP-βCD
• Tabelle 15: Kumulierte AD-Mengen (Q) [µg/ml] ^a nach der jeweiligen Gesamtpermeationszeit
• Tabelle 16: P_eff und Lag-time von AD und TST (beide 25 µg/ml) jeweils aus EBS
• Tabelle 17: P_eff und Lag-time von FSC (25 µg/ml) durch Kornea und Nephrophan^®
• Tabelle 18: Penetration und Metabolisierung von AD aus EBS in Mukosa
• Tabelle 19: Penetration und Metabolisierung von TST aus EBS in Mukosa
• Tabelle 20: Penetration und Metabolisierung von AD im Kornea-Epithel
• Tabelle 21: Penetration und Metabolisierung von TST im Kornea-Epithel
• Tabelle 22: Physikalisch-chemische Parameter des MGS (vgl. auch Tabelle 1)
• Tabelle 23: Parameter der HPLC-Analytik für AD und TST
• Tabelle 24: Entnahmezeiten für die Proben in den Permeationsstudien
• Tabelle 25: Ermittelte Lag-time [min] für AD-Permeationen durch Mukosa bei unterschiedlichen Rotationsgeschwindigkeiten [min^-1]
• Tabelle 26: Wiederfindungsraten für AD [%] mittels der unterschiedlichen Methoden in Abhängigkeit von der Ausgangskonzentration
• Tabelle 27: Übersicht über die durchgeführten Messungen am Langmuir-Trog

Abbildungsverzeichnis

• Abb. 1: Anatomie des menschlichen Auges; nach [26]
• Abb. 2: Schematischer Querschnitt durch die Kornea; nach [ 14]
• Abb. 3: Schematisierter Aufbau des Tränenfilms; nach [21]
• Abb. 4: Anatomie der menschlichen Nase: A = Nasenvorhof, B = Atrium, C = Respirationszone (c1-3 = Nasenmuscheln s.Text), D = Geruchszone; nach [32]
• Abb. 5: Querschnitt durch die Nasenschleimhaut; nach [32]
• Abb. 6: 4-Androsten-3,17-dion (Androstendion, AD)
• Abb. 7:17β-Hydroxy-4-androsten-3-on (Testosteron, TST)
• Abb. 8: 2-(6-Hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)benzoesäure, Dinatriumsalz  (Fluorescein-Na, FSC)
• Abb. 9: SAXS-Diffraktogramme der Zubereitungen ME-CD, ME-ION sowie einer CrEL-Lösung (20% in Wasser)
• Abb. 10: Sättigungslöslichkeiten (c_S) von AD in verschiedenen Formulierungen sowie in IPM, Wasser und EBS (25 °C ± 0,5); ± SD; ** = signifikant (p < 0,01); n = 4
• Abb. 11: DSC-Thermogramm: (A) AD, (B) HTAP-βCD, (C) AD/HTAP-βCD-Lyophilisat, (D) physiksalische Mischung aus AD und HTAP-βCD
• Abb. 12: Löslichkeitsisothermen von AD in Gegenwart von HP-γCD bzw. HTAP-βCD bei 25 °C; ± SD; n = 4
• Abb. 13: P_eff von AD (25 µg/ml) durch Mukosa für unterschiedlich hergestellte ME-CD bzw. ME-Grundmischung (ME-GM)
• Abb. 14: Plasma-Zeit-Profile nach nasaler Applikation unterschiedlicher AD-Formulierungen an Kaninchen
• Abb. 15: Schematischer Querschnitt durch eine Meibom’sche Drüse im oberen Augenlid sowie durch den vorderen Augenabschnitt; nach [159]
• Abb. 16: Skizze eines Langmuir-Trogs: Amphiphile Moleküle vor (links) und nach (rechts) beendeter Komprimierung durch eine bewegliche Barriere
• Abb. 17: MGS (10 µg) auf Wasser bei 76% Komprimierung (A=173 cm²)
• Abb. 18: MGS (60 µg) auf EBS bei 98% Komprimierung (A=119 cm²)
• Abb. 19: MGS (10 µg) auf CrEL (0,1 % in Wasser) bei 29% Komprimierung (A=284 cm²)
• Abb. 20: Schub (blau) und Potential (orange) von MGS (10 µg) auf CrEL (0,1% in Wasser)
• Abb. 21: MGS (10 µg) auf HP-γ-CD (1% in Wasser) bei 29% Komprimierung (A=284 cm²)
• Abb. 22: MGS (10 µg) auf HP-γ-CD (1% in Wasser) bei 80% Expansion nach erfolgter Kompression (A=305 cm²)
• Abb. 23: MGS (10 µg) auf HTAP-β-CD (1% in Wasser) bei 50% Komprimierung (A=233 cm²)
• Abb. 24: MGS (10 µg) auf PG (1,0% in Wasser) bei 95% Komprimierung (A=127 cm²)  (Das regelmäßige Streifenmuster ist bedingt durch die Bildbearbeitung.)
• Abb. 25: MGS (10 µg) auf ME-CD (0,1% in Wasser) bei 18% Komprimierung (A=310 cm²)
• Abb. 26: MGS (10 µg) auf ME-CD (0,1% in Wasser) bei 69% Komprimierung (A=189 cm²)
• Abb. 27: MGS (10 µg) auf ME-CD (0,1% in Wasser) bei 75% Komprimierung (A=173,7 cm²)
• Abb. 28: MGS (10 µg) auf ME-CD (0,1% in Wasser) bei 15% Expansion (A=149,7 cm²)
• Abb. 29: MGS (10 µg) auf ME-CD (0,1% in Wasser) bei 71% Expansion (A=284 cm²)
• Abb. 30: Schub (blau) und Potential (orange) von MGS (10 µg) auf ME-CD (0,1%)
• Abb. 31: MGS (10 µg) auf ME-CD (1,0% in Wasser) bei 66% Expansion (A=272 cm²)
• Abb. 32: MGS (10 µg) auf ME-ION (1,0% in Wasser) bei 33% Komprimierung (A=275 cm²)
• Abb. 33: MGS (10 µl) auf liposic^® (0,1% in Wasser) bei 75% Komprimierung (A=174 cm²)
• Abb. 34: Skizze der Permeationszellen: Querschnitt durch den Mittelpunkt, nicht maßstabs-getreu
• Abb. 35: Abbildung des Versuchsaufbaus: Langmuir-Trog mit Schwingkondensator (A), Wilhelmy-Waage (B) und beweglicher Barriere (C) a) ohne BAM, b) mit BAM (D)