4 Ergebnisse und Diskussion

4.1  Mikroemulsionssysteme

4.1.1  Allgemeines

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Als „Mikroemulsion“ (ME) werden tensidhaltige Mehrkomponentensysteme bezeichnet, die thermodynamisch stabil und transparent bis leicht opaleszierend sind. Diese Systeme sind zusammengesetzt aus einer wässrigen und einer öligen Komponente sowie einem Tensid und in der Regel einem Kotensid, dessen Aufgabe es ist, die Grenzflächenfluidität durch Störung und damit Auflockerung des Tensidfilms zu erhöhen [ 60]. Je nach Komposition können wasser-, öl- oder bikontinuierliche Systeme entstehen.

Über den genauen Aufbau dieser Systeme gibt es unterschiedliche Ansichten, und den zahlreichen, verschiedenartig zusammengesetzten Formulierungen liegen differenzierte Strukturen zugrunde. Bevorzugt ist eine ME als Lösung aller Komponenten ineinander zu beschreiben, deren Moleküle sich sehr rasch bewegen und in einem dynamischen Gleichgewicht stehen mit strukturierten Mikrobereichen [ 61 - 62 63]. Andere Strukturvorstellungen gehen von einem mizellaren Aufbau aus, wobei die Moleküle der in Mizellen eingeschlossenen Phase relativ frei beweglich sind. Man spricht in diesem Fall von „geschwollenen Mizellen“. Als weiteres Modell für den Aufbau einer ME sei hier die Vorstellung einer bikontinuierlichen Struktur genannt. In diesem Fall sind Wasser- und Ölphase, häufig bei annähernd gleichen Volumenfraktionen, schwammartig ineinander verteilt und durch einen flexiblen Tensidfilm voneinander getrennt [67].

ME können sehr vielseitig eingesetzt werden und als Darreichungsform Vorteile für die Verabreichung von Arzneistoffen auf unterschiedlichen Applikationswegen bieten. Beispielsweise kann bei topischer Anwendung einer ME eine erhöhte Penetration eines eingearbeiteten Arzneistoffs erreicht werden [66], da die Formulierung aufgrund geringer Grenzflächenspannungen relativ schnell in das Stratum corneum der Haut gelangt. Aufgrund der besonderen ME-Strukturen wird auf diese Weise der eingearbeitete Wirkstoff in relativ kurzer Zeit im Stratum corneum verteilt.

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Als Beispiel eines Fertigarzneimittels auf ME-Basis sei das Sandimmun® Optoral genannt, das allerdings peroral verabreicht wird. Hier soll die schlechte Bioverfügbarkeit des Wirkstoffs Ciclosporin durch die Verabreichung einer Ciclosporin-ME in einer Weichgelatinekapsel verbessert werden.

Vielversprechend scheint auch die okulare Applikation von ME in wirkstofffreier oder -haltiger Form zu sein [64 - 65, 66 67]. Durch den lipophilen Anteil in der Zubereitung ist einerseits eine erhöhte Verweildauer auf der Kornea des Auges zu erwarten im Gegensatz zu rein wässrigen Systemen, andererseits wird der physiologische hydrophil-lipophile Aufbau des Tränenfilms unterstützt. Darüber hinaus bietet eine Träger-ME ein hinreichendes Lösungsvermögen für lipophile Wirkstoffe, die ansonsten in einem rein lipophilen Träger, einer Makroemulsion oder als Suspension verabreicht werden müssten. Der gravierende Nachteil öliger oder ölhaltiger Zubereitungen am Auge ist die mögliche Sichtbehinderung, die zumeist nur eine Applikation zur Nacht erlaubt. Da ME transparent und niedrig-viskos sind, sollten sie das Sehvermögen jedoch in weit geringerem Maße als herkömmliche Formulierungen einschränken.

Für die Entwicklung einer nasalen Arzneiform sollte Beachtung finden, dass eine homogene, versprühbare Zubereitung entsteht, die sich mit einem handelsüblichen Zerstäuber dosieren lässt. Das setzt eine möglichst niedrig-viskose Formulierung voraus. ME-Formulierungen zeigen neben einer geringen Viskosität aufgrund ihres „mehrphasigen“ Aufbaus oft sehr gute Lösungseigenschaften für die einzuarbeitenden Wirkstoffe sowie eine gute Wassermischbarkeit. Diese drei Kriterien, Applizierbarkeit durch einen Zerstäuber, gute Lösungseigenschaften für den Wirkstoff und einen Wasseranteil über 10%, legten Li et al. [68] bei der Entwicklung ihrer ME-Grundlagen zur nasalen Anwendung zu Grunde.

4.1.2 Zusammensetzung

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Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei ME-Systeme untersucht, von denen zwei bereits früher in der Arbeitsgruppe entwickelt [73, 74] und teilweise charakterisiert wurden. Die Zusammensetzung der Systeme ist Tabelle 4 zu entnehmen.

Alle drei Systeme sind mischbar mit Wasser und enthalten als lipophile Komponente 5% IPM sowie als Tensid das CrEL. Die Zubereitungen unterscheiden sich qualitativ durch die enthaltenen Kotenside:

Durch Zugabe von 9% PG entstand die Formulierung ME-PG, die von Haße [ 69] mit einer etwas niedrigeren PG-Konzentration (5%) als potentielles ophthalmologisches Trägersystem entwickelt und charakterisiert wurde. Das System ME-CD enthält HP-γ-CD und wurde von Berndt [ 70] im Rahmen seiner Dissertation als mögliches Trägersystem zur nasalen Verabreichung von AD konzipiert. Die Kombination einer ME mit einem CD (β-CD bzw. -Derivate) wurde auch von Dalmora et al. [71, 72] sowie Maldonado und Lawrence [73] untersucht, wobei allerdings in deren Studien das CD der ME zusätzlich hinzugefügt wurde und nicht an deren Bildung im Sinne eines Kotensids beteiligt war.

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Tabelle 4: Prozentuale Zusammensetzung [g/g] der Mikroemulsionen

Bestandteile

ME-PG

ME-CD

ME-ION

Isopropylmyristat

5

5

5

Cremophor ® EL

20

20

15

Propylenglykol

9

-

-

HP-γ-CD

-

9

-

HTAP-β-CD

-

-

9

Wasser

66

66

71

Aus der Literatur ist eine Wechselwirkung zwischen kationischen Substanzen und Epithelzellen bekannt [ 74, 75]. Benita [ 76] beschreibt elektrochemische Wechselwirkungen zwischen einer positiv-geladenen Submikronemulsion und dem Kornea-Epithel von Ratten sowie Radikalfänger-Eigenschaften dieser Zubereitung. Klang et al. [ 77] berichten von einer Verbesserung der Befeuchtung der Augenoberfläche durch eine positiv geladene Submikronemulsion. Da diese Eigenschaft für eine okulare Anwendung beim „Trockenen Auge“ vorteilhaft sein kann, wurde in der vorliegenden Arbeit durch Austausch von HP-γ-CD gegen das kationische CD HTAP-β-CD eine quantitativ geringfügig variierte ME mit ionischem Charakter formuliert (ME-ION).

Die Herstellung und Beschreibung der untersuchten ME ist im Kap.  5.2.2 beschrieben. Alle Systeme waren transparent und bildeten sich spontan nach Mischen der Komponenten. Um den Charakter und das Mischungsverhalten der ME zu beschreiben, wurden alle drei Zubereitungen mit eingearbeitetem Arzneistoff (AD) nach Vermischen mit einer wässrigen Methylenblau-Lösung makro- und mikroskopisch betrachtet (s. Kap. 5.2.3). Sie zeigten eine spontane und einheitliche Anfärbung. Ein ähnlich gutes Mischverhalten ergab sich für eine lipophile Oil-Red-0-Lösung in IPM, allerdings waren anfangs rote Schlieren und Tröpfchen der Farbstofflösung erkennbar, die erst nach mechanischer Durchmischung verschwanden. Alle drei Systeme sind demnach als wasserkontinuierliche ME zu klassifizieren. Sie sind in der Lage, sowohl hydrophile als auch lipophile Zusätze aufzunehmen, ohne in mehrere Phasen zu brechen.

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Darüber hinaus wurden alle drei Systeme durch ein Polarisationsmikroskop betrachtet. Alle Präparate waren klar und von gleichbleibender Helligkeit und Farbe, was das Vorliegen von optisch isotropen Mikroemulsionsstrukturen unterstreicht.

Die Formulierungen ohne Zusatz von Kotensid (Grundmischungen, GM) waren unmittelbar nach der Herstellung ebenfalls homogen und klar. Allerdings zeigte sich nach 24stündiger Lagerung (bei RT) eine leichte Opaleszenz, die sich nach weiteren 24 Stunden verstärkte und in eine deutliche Trübung überging. Eine Zugabe von Kotensid ist daher für die Stabilität der Formulierungen erforderlich.

Im Folgenden wurden die physikalisch-chemischen Parameter bestimmt sowie Stabilitäts- und Strukturuntersuchungen durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Inkorporierbarkeit des Wirkstoffs AD in die einzelnen Formulierungen untersucht. Für die Zubereitung ME-PG kann zusätzlich auf die Untersuchungen von Haße [73] verwiesen werden, deren System ME4 als Basis für ME-PG diente und lediglich im PG-Gehalt reduziert ist (5 : 9%, s. oben!). Die Strukturuntersuchungen von Haße [73] an ihrem System ME4 ergaben das Vorliegen von typischen ME-Strukturen wie gequollenen Mizellen und Mizellaggregaten.

Stabilität

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Die physikalische Stabilität von ME-CD bzw. ME-ION wurde nach Lagerung bei drei verschiedenen Temperaturbereichen durch visuelle Betrachtung beurteilt. Dazu wurden die Zubereitungen autoklaviert (121 °C, 2•105 Pa, 15 min), wonach sich bei beiden Systemen keine sichtbaren Veränderungen zeigten. Jeweils sechs autoklavierte Proben wurden bei Raumtemperatur (20 bis 25 °C), im Kühlschrank (2 bis 8 °C) bzw. im Gefrierschrank (-15 bis -18 °C) gelagert. Nach zunächst einwöchigen und dann jeweils vierwöchigen Zeitabständen wurde das Aussehen der Proben begutachtet.

Dabei zeigten die bei 2 - 8 °C gekühlten ME-CD-Proben nach sechs Wochen eine erste leichte Trübung, die bei Temperierung auf Raumtemperatur (RT) verschwand; nach 18 Wochen waren sie milchig-weiß und blieben auch nach Temperierung auf RT opaque-trüb. Drei der eingefrorenen Proben waren nach 18 Wochen unverändert klar, während die restlichen leicht opaque-trüb erschienen. Die durchgehend bei RT gelagerten Proben erschienen dagegen alle auch nach 18wöchiger Lagerung vollkommen klar.

Im Falle von ME-ION zeigten die bei den niedrigen Temperaturbereichen gelagerten Proben nach kürzeren Lagerzeiten als bei ME-CD erste Trübungen: die eingefrorenen Proben erschienen bereits nach einer Woche leicht opaleszierend und waren nach sechs Wochen alle milchig-weiß (jeweils nach Temperierung auf RT); die Proben aus dem Kühlschrank zeigten ebenfalls bereits nach einer Woche eine deutliche Trübung, die allerdings nach Temperierung auf RT verschwand; nach einer Lagerdauer von zwei Wochen behielten zwei Proben das opaque-trübe Aussehen auch bei RT, und nach 10 Wochen wurde keine der Proben mehr klar; die bei RT gelagerten ME-ION-Proben blieben jedoch über den gesamten Prüfzeitraum von 18 Wochen klar und unverändert.

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Das System ME-PG wurde bereits von Haße ausführlich auf seine Stabilität geprüft, wobei über einen Zeitraum von 12 Wochen bei einer Lagertemperatur von 25 °C keine Veränderung des Aussehens sowie des mittleren Teilchendurchmessers (gemessen mittels PCS) festgestellt wurde [73].

Das verwendete Tensid, CrEL, zeigt selbst eine zunehmende Trübung bei Temperaturen unterhalb Raumtemperatur (laut Herstellerangaben bis 26 °C [55]) aufgrund der Bildung fester Assoziate, die in der flüssigen Substanz ausfallen. Aufgrund des Volumenanteils von 15 bzw. 20% in den ME ist eine Trübung der Systeme bei niedrigen Temperaturen möglicherweise auf ähnliche Phänomene wie in der Reinsubstanz des Tensids zurückzuführen. Des Weiteren können Instabilitäten der Einzelbestandteile der ME aufgrund durch Lichteinfluss oder durch Reaktion mit dem Glas der Primärverpackung veränderter physikalisch-chemischer Parameter des Systems nicht ausgeschlossen werden und zu Trübungen führen, da sich die thermodynamische Stabilität immer auf eine bestimmte Zusammensetzung bezieht [78]. Untersuchungen zur Stabilität des eingearbeiteten Wirkstoffs wurden nicht durchgeführt.

4.1.3 Charakterisierung

4.1.3.1  Theoretischer Hintergrund

Die auffallendsten Eigenschaften einer ME sind ihre thermodynamische Stabilität und ihre Transparenz. Oftmals werden diese beiden Charakteristika daher als Hauptkriterien für die Definition einer ME herangezogen [64]. Für eine allgemeine Charakterisierung, besonders im Hinblick auf eine pharmazeutische Verwendung, können auch im Falle von ME physikalisch-chemische Parameter, wie Viskosität, pH-Wert, Tonizität und Oberflächenspannung, dienen. Für eine nähere Strukturaufklärung kommen eine Vielzahl unterschiedlicher Analysemethoden zur Anwendung.

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Definitionsgemäß soll in ME die Teilchengröße unterhalb 140 nm liegen [67]. Daher stellt diese ein wichtiges Kriterium zur Beurteilung der Systeme dar. Als Methode zur Bestimmung der Teilchengröße kann beispielsweise die Elektronenmikroskopie dienen, die jedoch eine aufwändige Vorbereitung der Proben erfordert. Zudem können durch Einfrieren der Proben eventuelle Strukturänderungen verursacht werden, so dass allenfalls eine „statische“ Momentaufnahme des Systems erhalten wird [67]. Weiterhin stehen verschiedene Streulichtmethoden (z.B. Quasielastic Light Scattering [79], Small Angle Neutron Scattering [97]) zur Verfügung, zu denen auch die in dieser Arbeit angewandte Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS, vgl. Kap. 4.1.3.4) gehört. Diese Methoden bieten den Vorteil, dass auch Wechselwirkungen zwischen den „Teilchen“ erfasst und mittels deren Translationsbewegungen zusätzliche Aussagen über das Vorliegen bzw. den Aufbau von Assoziaten innerhalb des Mikroemulsionssystems getroffen werden können [65, 80].

Darüber hinaus kann mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (Photon Correlation Spectroscopy, PCS), die ein dynamisches Lichtstreuverfahren darstellt, eine Detektion der Partikelgrößen durch Messen der Fluktuation von Brechungsintensitäten über die Zeit, hervorgerufen durch die Braun’sche Molekularbewegung der Teilchen [67], vorgenommen werden [ 81 -82 83]. Um interpartikuläre Interferenzen möglichst zu vermeiden, sollte die Probe ausreichend verdünnt sein und ihre „innere Phase“ einen Anteil von 5-10% nicht übersteigen. Darüber hinaus kann die Polydispersität eines Systems bestimmt und daraus die Partikelgrößenverteilung ermittelt werden. Allerdings sollte zuvor weitgehend Klarheit über die generelle Systemstruktur bestehen, da PCS-Messungen einer bikontinuierlichen ME nur bedingt sinnvoll interpretiert werden können [85].

Weiterhin ist von Interesse, eine ME abzugrenzen von flüssigkristallinen Systemen, was beispielsweise mittels der Betrachtung im Polarisationsmikroskop [64, 65] (vgl. Kap. 4.1.2) gelingt. Auch die Kernresonanzspektroskopie kann Auskunft geben über flüssigkristalline Bereiche in einem System und darüber hinaus Hinweise über Wechselwirkungen zwischen Tensiden und Kotensiden [67]. Die „Phasenlage“ einer Formulierung kann ebenso wie in einer Makroemulsion durch Leitfähigkeitsmessungen [64] bestimmt werden. Informationen zu Wechselwirkungen des eingearbeiteten Wassers bzw. Änderungen des Energieinhalts des Systems sind mittels Differenzialthermoanalyse (Differential Scanning Calorimetry, DSC) zu erzielen [84, 85] (vgl. Kap. 4.1.3.3).

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Neben den hier erwähnten Untersuchungstechniken können im Einzelfall weitere Methoden sinnvoll sein. Welche Methoden für die einzelnen Formulierungen Anwendung finden, hängt in hohem Maße von der spezifischen Zusammensetzung der jeweiligen Zubereitung ab. Es ist schwierig, nicht zuletzt aufgrund der unterschiedlichen Strukturtheorien, konkrete Aussagen zu treffen über den genauen Aufbau einer entwickelten Mikroemulsion.

4.1.3.2 Physikalisch-chemische Parameter

Die physikalisch-chemischen Parameter wurden in der Regel jeweils für die wirkstofffreien Systeme ermittelt. Tabelle 5 gibt die einzelnen Messwerte für die drei untersuchten ME-Formulierungen wieder. Die Durchführung der einzelnen Messungen ist in Kap. 5.2.5 beschrieben.

Die Viskositäten der drei Zubereitungen nehmen in der Reihenfolge ME-ION < ME-CD < ME-PG zu, liegen aber alle in dem für Augenarzneien empfohlenen Bereich von 10 – 25 mPa•s [26]. Eine Berechnung der Gesamtviskositäten der Systeme als Summe der anteiligen Einzelviskositäten der jeweiligen Komponenten ergab in jedem Fall höhere Werte von 117,25 mPa•s für ME-ION, 156,25 mPa•s für ME-CD (die CD bleiben jeweils unberücksichtigt) und 161,29 mPa•s für ME-PG. Da die gemessenen, tatsächlichen Werte lediglich in der Reihenfolge jedoch nicht in der Größenordnung mit den errechneten Werten übereinstimmen, werden Wechselwirkungen zwischen Tensid und jeweiligem Kotensid vermutet, die geänderte Strukturen in den ME verbunden mit einer deutlich reduzierten Viskosität zur Folge haben.

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Alami et al. [86] haben Komplexbildung zwischen hydroxypropylierten CD (α, β, γ) und einem neu entwickelten nicht-ionischen Tensid mittels SANS (small angle neutron scattering) nachgewiesen und ein Aufbrechen der Mizellen detektiert. Die Interaktionen mit HP-βCD waren hierbei am deutlichsten. Derartige Wechselwirkungen sind auch in den ME denkbar, wobei unterschiedliche Qualitäten dieser Interaktionen möglicherweise für die deutlich verschiedenen Viskositäten verantwortlich sein können.

Tabelle 5: Physikalisch-chemische Parameter der Mikroemulsionen

 

ME-PG

ME-CD

ME-ION

Viskosität [mPa•s] (25 °C)

24,43 ± 0,130

14,35 ± 0,157

6,22 ± 0,056

Dichte [g/cm³] (25 °C)

1,012

1,035

1,028

pH (RT)

6,86

6,8

6,5

Brechungsindex (25 °C)

1,380

1,382

1,372

Tonizität [mOsmol/kg]

2296 ± 36,5+

211 ± 0,71

310 ± 6,85

Oberflächenspannung [mN/m] (RT)

32,61 ± 0,03

30,96 ± 0,10

30,69 ± 0,12

Leitfähigkeit [µS/cm] (25 °C)

144,0
(bei einem Zusatz von 5% PG, [73])

148,6

6606

+ gemessen für ME-PG mit 25 µg/ml FSC

Wechselwirkungen zwischen CD und CrEL könnten sich weiterhin auf die Oberflächenspannung auswirken. In der oben zitierten Literatur [90] wird ein Anstieg der Oberflächenspannung als Folge der beschriebenen Komplexbildung zwischen Tensid und CD erwähnt. Für einfache, wässrige Mischungen aus CrEL und HP-γ-CD bzw. HTAP-β-CD konnte hier ebenfalls ein signifikanter Anstieg der Oberflächenspannungen ermittelt werden (Tabelle 6). PG blieb dagegen ohne messbaren Einfluss auf die Oberflächenspannung der 20%igen Tensidlösung (Tabelle 6).

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Im Gegensatz dazu war die Oberflächenspannung in den ME-Systemen generell reduziert und lag zwischen 30,7 und 32,6 mN/m (Tabelle 5). Wenn man von den allgemeinen Strukturvorstellungen von ME ausgeht, wonach Tensid und Kotensid vollständig die Grenzflächen zwischen Öl- und Wasser-Bereichen belegen [66], könnte auch im vorliegenden Fall eine zusätzliche Reduzierung der Oberflächenspannung auf eine Oberflächenbelegung nicht nur mit Tensid, sondern auch mit Kotensid zurückgeführt werden. Die in den Mischungen aus Tabelle 6 beobachteten Effekte auf die Oberflächenspannung treten in den ME-Systemen offensichtlich nicht mehr auf, was das Vorliegen von geänderten Strukturen in den ME unterstreicht.

Tabelle 6: Oberflächenspannung verschiedener Cremophor® EL-Mischungen

CrEL (20%)

36,33 ± 0,02 mN/m

CrEL (20%) + HP-γ-CD (9%)

37,61 ± 0,17 mN/m*

CrEL (15%) + HTAP-β-CD (9%)

38,31 ± 0,20 mN/m*

CrEL (20%) + PG (9%)

36,35 ± 0,15 mN/m

gemessen bei 22 °C
* = signifikant (p < 0,01)

Die Werte für Dichte, pH-Wert und Brechungsindex liegen für alle ME in der gleichen Größenordnung und lassen keine Unverträglichkeiten im Falle einer okularen oder nasalen Anwendung vermuten. Anders verhalten sich die Tonizitäten der Formulierungen. Im physiologisch verträglichen Bereich (280 - 300 mosmol/kg) liegt annähernd nur der Wert von ME-ION. ME-CD ist hypoton und sollte durch Zusatz eines Isotonisierungsmittels an den physiologischen Tonizitätsbereich angeglichen werden. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass ein Arzneistoffzusatz in jedem Fall einen Anstieg der Tonizität zur Folge hat. ME-PG ist stark hyperton1 und kann vermutlich nicht schmerzfrei appliziert werden.

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Die Leitfähigkeit liegt für alle Systeme deutlich über der des destillierten Wassers (1 µS/cm) und weist wie zu erwarten bei der ionischen ME (ME-ION) den höchsten Wert auf. Die Formulierungen sind demnach alle wasserkontinuierlich, wobei ein Austausch der beiden Kotenside HP-γ-CD und PG die Leitfähigkeit der entsprechenden ME kaum beeinflusst.

Weiterhin wurden für alle Systeme Messungen der Dielektrizitätskonstanten (DK) durchgeführt. Mittels der hier verwendeten Methode konnten jedoch keine Werte bestimmt werden, da der zulässige Höchstwert von 80 bei allen Zubereitungen überschritten wurde.

4.1.3.3 DSC-Messungen

Bei der Methode der Differentialthermoanalyse (differential scanning calorimetry, DSC) können Temperaturänderungen in einer Probe detektiert werden, die durch physikalische oder chemische Effekte während einer standardisierten Erwärmung hervorgerufen werden. Die Versuchsdurchführung erfolgt, indem die Probe neben einer Vergleichssubstanz durch einen definierten Wärmefluss erhitzt und über ein getrennt angebrachtes Thermoelement die von ihr abgegebene oder aufgenommene Wärmemenge registriert wird. Eine Kompensationsheizung hält dabei die Temperatur in der Probe mit der Temperatur in der Vergleichssubstanz auf gleicher Höhe. Ein endothermer Vorgang in der Analyse ergibt daher ein positives Signal des Wärmeflusses, da von der Heizquelle zusätzliche Wärme abgegeben werden muss. Der Wärmefluss [J/s] wird mit zunehmender Temperatur aufgezeichnet, und aus den resultierenden Peakflächen kann die von der Probe abgegebene oder aufgenommene Wärmemenge errechnet werden.

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In der Pharmazie wird die DSC unter anderem eingesetzt zur Überprüfung der Reinheit und Identität von Substanzen sowie zur Bestimmung von Wärmekapazität und Schmelzwärme [ 87]. In dieser Arbeit sollte die Wärmemenge bei der ME-Bildung erfasst werden. Dazu wurden Mischungen von Tensid und Lipid bzw. von Wasser und Kotensid, entsprechend der Vorgehensweise bei der ME-Herstellung (vgl. Kap. 5.2.2), getrennt voneinander vortemperiert und nachfolgend durch Rotieren des Thermostaten miteinander vermischt. Von besonderem Interesse waren der Einfluss des Kotensids sowie des eingearbeiteten Arzneistoffs AD, was am Beispiel von ME-CD untersucht wurde.

In Tabelle 7 sind die Mischungsenthalpien aufgeführt, die für ME-CD mit 7%, 9% und 11% Kotensid sowie unter Zusatz von 25 µg/ml AD zu ME-CD (9% HP-γ-CD) ermittelt wurden (s. Kap. 5.2.6). Alle Enthalpie-Werte waren exotherm, d.h. Wärme wurde vom System abgegeben, und wiesen zwischen den getesteten Zubereitungen keine signifikanten Unterschiede auf. Darüber hinaus wurde das Dreikomponentensystem, IPM, CrEL und Wasser, d.h. ohne HP-γ-CD, vermessen. Ohne Kotensid erfolgte jedoch keine vollständige Vermischung von IPM/CrEL mit dem Wasser, so dass im inneren Zylinder Reste der IPM/CrEL-Mischung verblieben.

Als Hauptursache für die gemessenen Wärmeeffekte werden Wechselwirkungen des Wassers mit den anderen Komponenten angesehen. Die Menge an zugesetztem Kotensid hatte dabei auf die freigesetzte Wärmemenge keinen messbaren Einfluss. Jedoch schien das Kotensid ein Vermischen der Komponenten zu beschleunigen.

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Tabelle 7: Mischungsenthalpien von ME-CD mit unterschiedlichem Kotensid-Gehalt und Androstendion

Zubereitung ME CD

Mischungsenthalpie [J/g]

mit 7% HP-γ-CD

11,45 ± 0,87

mit 9% HPγCD

12,09 ± 0,19

mit 11% HP-γ-CD

11,88 ± 0,11

mit 25 µg/ml AD

12,05 ± 0,06

Haße [73] unternahm DSC-Messungen unter anderem an ME-PG mit 5% PG, indem zur Mischung aus Wasser, IPM und CrEL das Kotensid PG zugegeben wurde. Die ermittelte Enthalpie war ebenfalls exotherm, lag jedoch mit 30,1 J/g deutlich höher als die hier detektierten Mischungsenthalpien. Vermutlich wurde bei der Messung von Haße [73] der höhere Wert unter anderem durch den Lösungsvorgang des PG verursacht, während bei den vorliegenden Untersuchungen das Kotensid (HP-γ-CD) vor dem Mischungsvorgang bereits im Wasser gelöst vorlag. Da jedoch in diesen beiden Untersuchungen unterschiedliche Einzelkomponenten beteiligt waren, ist ein Vergleich der Ergebnisse nicht aussagekräftig.

Eine Interpretation und Einordnung der DSC-Ergebnisse gestaltet sich schwierig, da die gemessenen Absolut-Werte abhängig sind von der jeweiligen Vorgehensweise. So können grundsätzlich Messungen im Scanning-Betrieb, wobei die zuvor gefrorene Probe kontinuierlich erhitzt wird und dabei Schmelzenthalpien detektiert werden, oder wie im vorliegenden Fall im isothermen Messbetrieb durchgeführt werden. Bei isothermen Messungen bestehen in Abhängigkeit von der jeweiligen Fragestellung unterschiedliche Möglichkeiten, die Einzelkomponenten zu mischen, was zu abweichenden Ergebnissen führt. Eine Übersicht von Literaturdaten zur DSC-Analytik von ME hat Kielhorn [89] in seiner Arbeit zusammengestellt: Rosano et al. [88] ermittelten beispielsweise durch isotherme DSC-Messungen die notwendige Menge an Kotensid für eine entwickelte ME, indem Mischungsenthalpien nach Zugabe unterschiedlicher Kotensid-Konzentrationen detektiert wurden.

4.1.3.4 Röntgenkleinwinkelstreuung

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Eine weitere Methode zur Strukturaufklärung der ME stellt die Röntgenkleinwinkelstreuung (small angle X-ray scattering, SAXS) dar, wofür es bereits einige Literaturdaten gibt [89 - 90, 91, 92 93]. Das Prinzip der Röntgenstreuung beruht allgemein auf der Beugung von Röntgenstrahlen an geordneten Strukturen in einer Probe und der Detektion der hervorgerufenen Streumuster. Vor allem zur Analyse kristalliner Strukturen leistet die Röntgenstreuung einen wertvollen Beitrag. Dabei werden Reflexe im Bereich größerer Streuwinkel detektiert. Demgegenüber werden die SAXS-Streumuster in einem Winkelbereich von 0-10° untersucht und erfassen Strukturen mit einer Größenordnung von 1-50 nm.

Aufgrund der speziellen ME-Strukturen ergeben sich charakteristische Diffraktogramme mit einem einzelnen breiten Peak und einem flachen Kurvenverlauf für große x-Werte [94]. Die Lage des Peak-Maximums wird beeinflusst durch die Tensid-Konzentration [94, 96]. Das Wasser/Öl-Verhältnis in der Zubereitung nimmt Einfluss auf die Peak-Höhe [94].

Abb. 9 zeigt die Ergebnisse für die Messungen2 der Zubereitungen ME-CD und ME-ION sowie davon abgeleitete Rezepturvarianten; dabei sind die ermittelten Intensitäten gegen den reziproken Abstand (s) der „Teilchen“ aufgetragen. In Kap. 5.2.7 sind die Versuchsbedingungen beschrieben. Beide Systeme wurden jeweils auch ohne CD-Zusatz vermessen, ME-CD darüber hinaus mit Arzneistoffzusatz (25 µg/ml AD) und nach vorherigem Autoklavieren der Zubereitung. Als Vergleich wurde eine 20%ige Lösung von CrEL in Wasser untersucht.

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Die ermittelten ME-Kurven zeigen den für Mikroemulsionen oben beschriebenen, charakteristischen Verlauf (Abb. 9). Bei der Messung der Tensid-Wasser-Lösung (schwarze Kurve) resultierte dagegen ein deutlich differenzierter Kurvenverlauf. Es ist davon auszugehen, dass sich die Tensidmoleküle in wässriger Lösung zu unterschiedlich großen Mizellen zusammenlagern, die im Gleichgewicht stehen zu einzelnen Molekülen oder Molekül-Dimeren [26]. Im Bereich von s = 0,1 – 0,15 lässt sich ein schwaches Maximum erkennen (Abb. 9), das durch Streuungen an den unterschiedlich großen Mizellen erklärbar sein könnte. Vorwiegend lamellare Strukturen ergeben dagegen schmalere Peaks [97] und können hier für die 20%ige CrEL-Lösung weitgehend ausgeschlossen werden.

Abb. 9: SAXS-Diffraktogramme der Zubereitungen ME-CD, ME-ION sowie einer CrEL-Lösung (20% in Wasser)

Alle ME und deren Rezepturvarianten führten zu Intensitätsmaxima bei s-Werten um 0,05. Dieser Wert entspricht einem größeren Abstand der „Teilchen“ als bei der CrEL-Lösung, was für die in ME angenommenen Strukturen im Gegensatz zu mizellaren Lösungen auch zu erwarten ist. Die vermutlich als Solubilisat vorliegenden Grundmischungen (GM, vgl. Kap. 4.1.2) zeigten annähernd den für ME typischen Kurvenverlauf, wobei jedoch der breite Peak wesentlich weniger ausgeprägt war und die Kurven mit zunehmenden x-Werten steiler abfielen (Abb. 9).

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Die höchste Streuungsintensität zeigte ME-CD, unbeeinflusst durch einen AD-Zusatz oder vorheriges Autoklavieren. Eine deutlich geringere Intensität im Maximum (s = 0,05) resultierte bei ME-ION. Die differenzierten Streuungsintensitäten wurden vermutlich durch die qualitativ bzw. quantitativ unterschiedliche Zusammensetzung der Systeme ME-CD und ME-ION (Wasser/Öl-Verhältnisse: ME-CD = 13,2:1; ME-ION = 14,2:1) verursacht. Der unterschiedliche Tensid-Gehalt in ME-ION (15% im Gegensatz zu 20% in ME-CD) machte sich durch eine nur sehr geringe Links-Verschiebung des Peaks bemerkbar (Abb. 9).

Im Falle der GM dagegen konnte lediglich die geringe Links-Verschiebung aufgrund des ungleichen Tensid-Gehalts detektiert werden, wobei der Unterschied der Intensitätsmaxima ausblieb (Abb. 9, offene Kreise). Diese Beobachtungen deuten, ebenso wie der abweichende Kurvenverlauf der GM, darauf hin, dass die Kotenside HP-γ-CD bzw. HTAP-β-CD in beiden ME-Systemen einen wichtigen Beitrag leisten zur ME-Bildung und im Vergleich zu den Solubilisaten (GM) vermutlich differenzierte Strukturen ausbilden.

Aus diesen Befunden lässt sich schlussfolgern, dass ME-CD und ME-ION typische ME-Strukturen aufweisen, wofür der charakteristische, auch in der Literatur beschriebene [94] Kurvenverlauf, spricht. Allerdings kann aus den bisherigen Untersuchungen nicht abgeleitet werden, ob die ME wasserkontinuierliche Systeme mit geschwollenen Mizellen oder mit bikontinuierlicher Struktur darstellen. Eine strukturelle Veränderung des Systems ME-CD durch Arzneistoffzusatz oder eine Dampfdruckbehandlung konnte mittels dieser Methode nicht festgestellt werden.

4.1.4 Arzneistoff-Wechselwirkungen

4.1.4.1  Verteilungskoeffizient

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Die Polarität und das Verteilungsverhalten eines Arzneistoffs in den Formulierungskomponenten ist ein wichtiges Kriterium für die Bewertung der nachfolgenden Permeationsstudien (s. Kap. 4.2) und wird über den Verteilungskoeffizienten (VK) ermittelt. Der VK der beiden Substanzen AD und FSC (Tabelle 8) verdeutlicht deren ausgeprägte Lipo- bzw. Hydrophilie. Es wurde der Oktanol/Puffer(EBS)-VK (VKokt) bestimmt und darüber hinaus in Anlehnung an die ME-Rezepturen der VK zwischen EBS-Puffer und IPM (VKipm) (s. Kap. 5.2.8).

Die Werte für VKokt und VKipm unterscheiden sich dahingehend, dass die Oktanol-Werte für das lipophile AD durchweg höher und für das hydrophile FSC durchweg niedriger als die entsprechenden IPM-Werte ausfallen. Der jeweilige Charakter der Substanz bewirkt, dass sich das lipophile AD in höherer und das hydrophile FSC in niedrigerer Konzentration in Oktanol lösen als in IPM. Im Vergleich zu Oktanol stellt IPM aufgrund seiner Esterfunktion das weniger lipophile Medium dar.

Der Einfluss der verschiedenen Zusätze (Kotenside) zur wässrigen Phase ist daher erwartungsgemäß für AD weitaus deutlicher als für FSC. Im Falle des FSC führt lediglich der Zusatz von HP-γCD (9%) zu einem signifikanten Absinken der VK. Die Substanz wird in diesem Falle vermutlich aufgrund von Wechselwirkungen oder Inklusion durch das CD verstärkt in der wässrigen Phase gehalten. Der Effekt, den PG auf die FSC-Verteilung zwischen IPM und Pufferlösung ausübt, ist nicht eindeutig. Ein Anstieg des VKipm (s. Tabelle 8) bedeutet genau genommen eine größere Lipophilie der Testsubstanz. Denkbar wäre eine Anordnung der PG- und IPM-Moleküle in der Art, dass die Lipophilie der IPM-Phase herabgesetzt wird und sich aufgrund dessen mehr FSC in die IPM-Phase verteilen kann. Für die nachfolgenden Untersuchungen kann aufgrund dieser Werte allerdings von einer nahezu vollständigen Verteilung des FSC in die wässrigen Bereiche der ME ausgegangen werden.

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Tabelle 8: Verteilungskoeffizienten (VK) von Androstendion (AD) und Fluorescein-Na (FSC) mit verschiedenen Zusätzen

System

Test-
substanz

Zusätze zur wässrigen Phase

  

ohne (Referenz)

PG
(9%)

HP-γ-CD
(9%)

HTAP-β-CD
(9%)

Oktanol/EBS

AD

592,79 ± 22,89

330,40 ± 4,15*

3,18 ± 0,016*

20,64 ± 1,44*

 

FSC

0,235 ± 0,129

0,219 ± 0,023

0,021 ± 0,011

0,128 ± 0,102

IPM/EBS

AD

149,66 ± 0,72

80,80 ± 6,6*

0,43 ± 0,005*

0,81 ± 0,05*

 

FSC

0,806 ± 0,012

1,294 ± 0,028*

0,200 ± 0,198*

0,831 ± 0,089

n = 3; * = signifikant (p < 0,01) zum jeweiligen Wert ohne Zusatz

Im Falle von AD bewirken alle drei zum Puffer zugefügten Kotenside eine signifikante Reduzierung der VK sowohl gegen Oktanol als auch gegen IPM in der Reihenfolge PG << HTAP-β-CD < HP-γ-CD, was gleichbedeutend damit ist, dass mehr AD in der wässrigen Phase verbleibt. Während also ein Zusatz von PG lediglich eine leichte Tendenz zeigt, die Arzneistoffkonzentration in der wässrigen Phase zu erhöhen, ist dieser Effekt bei den beiden CD wesentlich stärker ausgeprägt, wobei auch hier HP-γCD den größten Einfluss hat. Es muss von einer Inklusion des AD in die CD-Kavität ausgegangen werden (vgl. Kap. 4.1.4.3), woraus eine höhere Konzentration in der wässrigen Phase resultiert.

Für die ME-Systeme lässt sich aufgrund dieses Verteilungsverhaltens diskutieren, dass die jeweiligen Kotenside möglicherweise den zusätzlichen Effekt haben, den Wirkstoff in den wässrigen Bereichen der Zubereitung zu halten, aus denen eine bevorzugte Freigabe erfolgen kann. Hierfür sprechen auch die Ergebnisse der Versuche zur Sättigungslöslichkeit von AD (s. folgendes Kap. 4.1.4.2). Für das AD-Freigabeverhalten könnte daher eine Reihenfolge von ME-CD > ME-ION > ME-PG erwartet werden.

4.1.4.2 Sättigungslöslichkeit

↓43

AD weist eine so geringe Wasserlöslichkeit auf, dass eine rein wässrige AD-Formulierung nicht in Betracht kommt. Durch Verwendung einer ME als Trägersystem ist eine deutliche Löslichkeitsverbesserung zu erwarten. Peltola et al. [94] konnten dies für das strukturverwandte Estradiol in unterschiedlichen ME-Systemen erreichen und in ihren Untersuchungen eine deutliche Steigerung des Estradiol-Fluxes durch Humanhaut nachweisen.

Abb. 10 stellt die ermittelten Sättigungslöslichkeiten (s. Kap. 5.2.9) für AD in den drei ME dar. Zum Vergleich sind zusätzlich die Werte für EBS (pH 7,4) und Wasser sowie für die wässrigen, 9%igen CD-Lösungen und IPM angegeben. Alle Hilfsstoffe und Formulierungen bewirkten einen signifikanten Anstieg der Löslichkeit gegenüber Wasser bzw. EBS.

Die CD-haltigen Systeme waren der CD-freien ME-PG beide signifikant überlegen, indem sie die doppelte (ME-ION) bzw. dreifache (ME-CD) AD-Konzentration in Lösung brachten. Die resultierende Reihenfolge ME-CD > ME-ION > ME-PG steht in guter Übereinstimmung mit den in Kap. 4.1.4.1 bestimmten AD-Verteilungskoeffizienten. Verglichen mit der reinen IPM-Lösung ergab ME-CD eine signifikant höhere Löslichkeit für AD, während ME-ION keine Verbesserung und ME-PG eine signifikante Verschlechterung bewirkte. Gegenüber den entsprechenden wässrigen Kotensid-Lösungen (HP-γ-CD bzw. HTAP-β-CD) konnten ME-CD und ME-ION ebenfalls signifikant mehr Arzneistoff in Lösung bringen. Die Sättigungslöslichkeit für AD in einer 10%igen, wässrigen CrEL-Lösung wurde von Berndt [74] zu 0,9 mg/ml bestimmt. Im Gegensatz dazu war durch alle hier getesteten Formulierungen bzw. Einzelsubstanzen eine deutliche, 5-15fache Löslichkeitsverbesserung für AD zu erreichen.

↓44

Die AD-Löslichkeit in den ME ist demzufolge nicht allein auf den Gehalt an IPM bzw. CrEL (vgl. Tabelle 4) zurückzuführen, sondern es ist anzunehmen, dass die enthaltenen CD sowohl durch Bildung von AD-Einschlusskomplexen in der wässrigen Region als auch durch Co-Solubilisierung mit dem Tensid einen steigernden Effekt auf die AD-Löslichkeit ausübten. Diese Beobachtungen korrelieren ebenfalls mit den Ergebnissen der VK-Bestimmungen (vgl. Kap. 4.1.4.1).

Abb. 10: Sättigungslöslichkeiten (cS) von AD in verschiedenen Formulierungen sowie in IPM, Wasser und EBS (25 °C ± 0,5); ± SD; ** = signifikant (p < 0,01); n = 4

Die wässrigen CD-Lösungen sowie auch IPM erhöhten die Sättigungslöslichkeit des AD über den Wert von ME-PG (HP-γ-CD bzw. IPM signifikant) hinaus, so dass die CD-freie ME aus Sicht der Löslichkeitsverbesserung als weniger geeignet zu beurteilen ist. ME-CD und ME-ION bieten dagegen hervorragende Lösungseigenschaften für den lipophilen Arzneistoff AD.

↓45

Bei nasaler Applikation mittels Dosierspray wird mit einem Sprühstoß ein Volumen von ca. 50 µl verabreicht. Bei einer akzeptablen Dosierung von 3 x täglich 2 Sprühstößen könnte mit ME-CD als potentiellem Trägersystem eine therapeutische Dosis von ~4 mg/d AD (50 µl enthalten 0,7 mg AD) erreicht werden. Allerdings bleibt zu berücksichtigen, dass die Zubereitung eine ausreichende Stabilität aufweisen und der Arzneistoff über einen längeren Zeitraum vollständig in Lösung verbleiben muss. Eine Zubereitung an der Grenze der Sättigungslöslichkeit wird diesen Anforderungen nicht genügen können.

Für die lokale Anwendung am Auge sind vermutlich deutlich geringere AD-Konzentrationen erforderlich [95], so dass hier alle Systeme ein ausreichendes Lösungsvermögen für AD aufweisen dürften und andere Parameter, wie beispielsweise die physiologische Verträglichkeit, im Vordergrund stehen.

4.1.4.3 Cyclodextrin-Einschluss des AD

Differential Scanning Calorimetry (DSC)

Um zu prüfen, ob eine Einschlussverbindung von AD in HTAP-βCD entsteht, wurden DSC-Messungen (vgl. auch Kap. 4.1.3.3) im Scanning-Betrieb durchgeführt (s. Kap. 5.2.6). Zwischen HP-γCD und AD wurde bereits von Berndt [74] die Bildung einer Inklusion u. a. auch mit dieser Methode nachgewiesen.

↓46

Kontinuierliches Erhitzen einer reinen, kristallinen Substanz führt bei Erreichen ihres Schmelzpunktes zu einem endothermen Schmelzpeak. Wird eine physikalische Mischung aus zwei oder mehreren Bestandteilen erhitzt, so sind in der Regel die Schmelzpeaks der Einzelkomponenten zu detektieren, wohingegen bei Vorliegen einer Inklusion oder eines Komplexes die entsprechenden Peaks nicht mehr erscheinen dürften [96], was allerdings abhängig ist von der Konzentration der Reaktanten. Damit kann ein Vergleich entsprechender Thermogramme auch zum Nachweis einer Komplexbildung mit CD herangezogen werden [ 97].

Abb. 11: DSC-Thermogramm: (A) AD, (B) HTAP-βCD, (C) AD/HTAP-βCD-Lyophilisat, (D) physiksalische Mischung aus AD und HTAP-βCD

In Abb. 11 ist der relevante Temperaturbereich um den Schmelzpeak des AD (vgl. Kurve A, Ton = 178 °C) gezeigt. HTAP-β-CD (Kurve B) weist im untersuchten Bereich keine Peaks auf, so dass bei einer physikalischen Mischung aus beiden Komponenten nur der AD-Peak zu detektieren ist (Kurve D). Der Peak in Kurve D erscheint etwas schwächer aufgrund einer Überlagerung beider Kurven und einer nicht ganz auszuschließenden partiellen Ausbildung von Einschlusskomplexen, bedingt durch die intensive mechanische Verreibung beider Stoffe während der Herstellung der Testmischung. Konzentrationsbedingte Unterschiede können ausgeschlossen werden, da in allen Messungen die gleiche Einwaage an AD (5 mg) verwendet wurde.

↓47

Bei Vermessen des Lyophilisats aus AD und HTAP-β-CD ist der AD-Peak nicht mehr zu detektieren (Kurve C), so dass ein Einschlusskomplex beider Substanzen anzunehmen ist. Diese Messungen stehen in guter Übereinstimmung mit dem von Berndt [74] für das HP-γ-CD erzielte Resultat. Die im Lyophilisat gefundene Komplexierung war weiterhin im Hinblick auf die relevanten Formulierungen auch für die AD/CD-Lösung zu überprüfen.

Löslichkeitsmethode

Die Einschlusskomplexbildung zwischen AD und den beiden getesteten CD wurde mit der Löslichkeitsmethode näher charakterisiert (s. Kap. 5.2.9), und die Komplexbildungskonstanten wurden bestimmt.

Abb. 12 zeigt die ermittelten Löslichkeitsisothermen für HP-γCD und HTAP-βCD in Gegenwart von AD. In beiden Fällen resultieren Geraden mit R² > 0,99. Somit handelt es sich in diesem Konzentrationsbereich um Löslichkeitsdiagramme vom AL-Typ, die sich durch einen linearen Löslichkeitsanstieg auszeichnen.

↓48

Unter Annahme eines 1:1-Komplexes wurden die apparenten Komplexstabilitätskonstanten K stab nach der Formel von Higuchi und Connors [98] berechnet:

wobei tan α die Steigung der Löslichkeitsisotherme und c s die Sättigungslöslichkeit des Arzneistoffs in Wasser angibt.

↓49

Abb. 12: Löslichkeitsisothermen von AD in Gegenwart von HP-γCD bzw. HTAP-βCD bei 25 °C; ± SD; n = 4

Dabei ist zu berücksichtigen, dass Wechselwirkungen des Arzneistoffs, beispielsweise mit der CD-Außenhülle, oder anders geartete Assoziatbildungen nicht einbezogen werden. Man spricht daher von der apparenten oder virtuellen Komplexstabilitätskonstante.

Bei molarer Auftragung errechnen sich die apparenten Stabilitätskonstanten K stab zu den in Tabelle 9 aufgelisteten Werten.

↓50

Tabelle 9: Rel. Molmasse (Mrel), Geradenanstieg (tan α) bei molarer Auftragung und Kstab für Androstendion-Komplexe mit HP-γCD und HTAP-βCD

CD

M rel

tan α

K stab [1/mol]

HP-γ-CD

1355

0,330

1932

HTAP-β-CD

1670

0,324

1882

Für den AD-Einschluss durch HP-γ-CD wurde bereits von Berndt [74] die Kstab bestimmt und ein Wert von 947,6 gefunden. Da die von Berndt [74] ermittelte Löslichkeitsisotherme jedoch einen identischen Verlauf zu der hier detektierten (Abb. 12) zeigte, ist die Ursache für die Diskrepanz unklar. Eine Nach-Berechnung von Kstab anhand der oben beschriebenen Formel aus der von Berndt [74] abgebildeten Löslichkeitsisothermen ergab mit 1892 nahezu den gleichen Wert, der hier gefunden wurde (Tabelle 9).

Albers und Müller [99] untersuchten die Löslichkeit von TST unter Zusatz von HP-β-CD und gelangten zu vergleichbaren Werten. Gute Übereinstimmung besteht auch mit den K stab strukturverwandter Substanzen [60]. In Anlehnung an weitere Literaturdaten [100, 101, 102], die sich auf Komplexe zwischen β-CD-Derivaten und Steroiden beziehen, wird für HTAP-β-CD und AD ein 1:1-Komplex angenommen, wohingegen für γ-CD möglicherweise auch Komplexe im Verhältnis 1:2 oder 2:1 in Betracht kommen, wie sie beispielsweise für das Antiallergikum Tranilast beschrieben wurden [103].

4.2 Permeationsstudien

4.2.1 Einführung

↓51

Um an ihren Wirkort zu gelangen, müssen viele Arzneistoffe zuvor eine Membran durchdringen, wie beispielsweise die Haut, die Darmwand oder die Nasenschleimhaut. Aber auch bei lokaler Therapie stellt der Permeationskoeffizient des applizierten Arzneistoffs ein wichtiges Bewertungskriterium für die Substanz bzw. für die Zubereitung dar. In dieser Arbeit sollten die beiden unterschiedlichen Barrieren Nasenschleimhaut und Hornhaut des Auges hinsichtlich ihrer Permeabilität verglichen und der Einfluss der Zubereitungen bzw. ihrer Bestandteile auf die Permeation der Testsubstanzen bewertet werden.

Die beiden Gewebe lassen schon allein aufgrund ihrer Dicke eine unterschiedliche Permeabilität erwarten (vgl. Tabelle 2 und 3). Hinzu kommt der sandwichartige Aufbau der Kornea aus abwechselnd hydro- und lipophilen Schichten (vgl. Kap. 3.1.1), der die meisten Substanzen, wenn überhaupt, nur zu einem sehr geringen Teil permeieren lässt. Darüber hinaus hat das korneale Epithel die Aufgabe, einerseits ein Eindringen von Wasser und Elektrolyten in das Augeninnere sowie andererseits einen Austritt von physiologischen Substanzen zu unterbinden und somit die Homöostase aufrecht zu erhalten [20, 44]. Das Kornea-Epithel ist daher vergleichsweise noch schlechter durchlässig als andere Epithelien.

Ein aussagekräftiges Kriterium für das zu erwartende korneale Permeationsverhalten einer Substanz stellt deren Verteilungskoeffizient dar, der in einem Bereich von 100 – 1000 (gemessen für Oktanol/ Wasser) optimale Durchtrittsraten erwarten lässt [16, 27, 47]. Für die hydrophileren Substanzen repräsentiert das lipophile Epithel die geschwindigkeitsbestimmende Barriere [20]. Lipophile Stoffe können dagegen nur langsam in das wässrige Stroma eindringen [104]. Im Gegensatz dazu ist die Nasenmukosa einheitlich zusammengesetzt (vgl. Kap. 3.2.1) und stellt im Allgemeinen eine eher schwache Barriere mit guten Resorptionseigenschaften für viele Arzneistoffe dar [32]. Dabei spielt der hydro- oder lipophile Charakter der Substanz eher eine untergeordnete Rolle [48], und Merkmalen wie Molekülgröße und Struktur kommt mehr Bedeutung zu [32, 105].

↓52

Aufgrund dieser Membranunterschiede ist zu vermuten, dass verschieden zusammengesetzte Trägerformulierungen individuell Einfluss nehmen können auf das Permeationsverhalten einer Substanz an der jeweiligen Membran. Des Weiteren ist unter dem Aspekt, dass okular applizierte Arzneistoffe über den Tränen-Nasen-Kanal rasch die Nasenschleimhaut erreichen und dort systemisch resorbiert werden können [106], ein Vergleich der Permeabilitäten beider Gewebe von Interesse.

Die Permeationsstudien wurden in vitro mit biologischem Gewebe von Schlachttieren durchgeführt, das in der Regel kostengünstig und unproblematisch beschafft werden kann. Kornea von Schweinen dient in der Literatur in zahlreichen Untersuchungen als Permeationsbarriere [106, 107 - 108, 109, 110 111] und wurde aufgrund der Ähnlichkeit von Anatomie und Physiologie zur menschlichen Hornhaut ausgewählt. Daneben kam Nasenmukosa vom Rind zum Einsatz, da auch hierfür bereits umfangreiche Literaturdaten [74, 112 - 113, 114 115] vorlagen und die Präparation der Gewebestücke und Mukosa für diese Tierart in der Arbeitsgruppe bereits etabliert war [74]. Seit kurzem stehen jedoch auch Daten über Nasenmukosa vom Schwein als Permeationsbarriere in der Literatur zur Verfügung [116 -117 118]. Darüber hinaus findet korneales Gewebe von Kaninchen [z.B. 44, 119 -120 121] in der Forschung seit langem weit verbreitete Anwendung und gelangt, ebenso wie Nasenmukosa von Kaninchen [43, 53, 122, 123], Schafen oder Hunden [117] zum Einsatz bei In-vitro-Permeationsstudien.

Um darüber hinaus membranunabhängige Vergleichswerte für das Permeationsverhalten der Substanzen aus den unterschiedlichen Zubereitungen zu erhalten, wurden die Versuche in gleicher Art und Weise mit einer synthetischen Membran aus regenerierter Cellulose (Nephrophan®) mit einem Porendurchmesser von 2,4 nm und einer Dicke von 14-15 µm durchgeführt.

↓53

Als Testsubstanzen gelangten das stark lipophile AD sowie das sehr hydrophile FSC zur Auswahl (s. Kap. 3.4.1 und 3.4.2). FSC wird oft als Marker-Substanz bei der Durchführung von Permeationsstudien eingesetzt und kann Auskunft geben über die Integrität der Membran sowie die Funktionsweise des verwendeten Permeationsmodells [52 -53 54]. AD stellt einen potentiellen Arzneistoff dar, der sowohl nasal bzw. systemisch [11] als auch okular [9, 10] Anwendung finden kann und für den die ME-Systeme mögliche Trägerformulierungen in einem Arzneimittel repräsentieren können.

4.2.2 Theoretischer Hintergrund

Die Permeation beschreibt den Stoffdurchgang einer Substanz durch eine Barriere, die ein Donorkompartiment von einem Akzeptorkompartiment trennt. Zu Beginn ist der Stoff vollständig im Donor gelöst, und im Akzeptor befindet sich das reine Lösungsmittel. Die Substanz beginnt im Verlaufe des Versuchs, durch die Barriere hindurch in die Akzeptorphase zu diffundieren. Dabei ist es für die Erhaltung des Flux in Akzeptorrichtung wichtig, die Konzentration im Akzeptorkompartiment möglichst niedrig zu halten, so dass Sink-Bedingungen gegeben sind (< 10% der Sättigungslöslichkeit).

Nach einer bestimmten Zeit (Lag-time, s.u.!) hat sich in der Barriere ein konstantes Konzentrationsgefälle gebildet, das ein zeitunabhängiges Verhältnis der Donor- und Akzeptorkonzentration zur Folge hat [91]. Das System befindet sich dann im Fließgleichgewicht oder Steady-state. Wenn weiterhin gegeben ist, dass die ruhenden Schichten an den Grenzflächen der Barriere keinen wesentlichen Einfluss auf die Permeation haben und die Übergangswiderstände klein sind [91], kann der Permeabilitätskoeffizient P eff einer Substanz durch eine Membran nach folgender Gleichung berechnet werden:

↓54

Hierbei bedeuten dc/dt die Konzentrationsänderung im Akzeptorkompartiment über die Zeit, was gleichbedeutend ist mit der Steigung einer aus der Konzentration über die Zeit aufgetragenen Geraden. V steht für das Akzeptorvolumen, A für die Fläche der Barriere und c 0 für die Ausgangskonzentration im Donator. Der Faktor 60 ergibt sich aus der Umrechnung der üblicherweise in Minuten angegebenen Versuchszeit in Sekunden, da die gängige Einheit des Permeationskoeffizienten cm/s ist.

Der Steady-state-Zustand muss nicht von Beginn an herrschen. Es kann sich vielmehr erst nach einer Verzögerungszeit, die benötigt wird, um einen einheitlichen Konzentrationsgradienten in der Barriere aufzubauen, ein Fließgleichgewicht einstellen. Diese Zeit ergibt sich aus der Extrapolation des linearen Teils der Geraden aus Konzentration über Zeit auf die x-Achse und wird auch als Lag-time bezeichnet. Die Lag-time ist proportional zum Quadrat der Barrierendicke und damit stark abhängig von dieser Größe.

4.2.3 Ergebnisse

↓55

Die Permeationsstudien wurden durchgeführt mit in der Arbeitsgruppe entwickelten [ 124] und weiter modifizierten Ussing-Kammern. Besonderes Augenmerk war dabei auf die unterschiedlichen Membran-Beschaffenheiten zu legen, die ein Aufrechterhalten der Wölbung im Falle der Kornea und ein ausreichendes Abdichten der Kammer mit der dünnen Mukosa erforderten. Diesen Anforderungen wurde durch zwei unterschiedliche Methoden, die Membran zu fixieren, Rechnung getragen (s. Kap. 5.2.10). Alle versuchsrelevanten Parameter der Kammern, wie Kammervolumina und Permeationsfläche, blieben jedoch gleich.

Die jeweiligen Permeationskoeffizienten (Peff) konnten nur dann berechnet werden (s. Kap. 4.2.2), wenn folgende Voraussetzungen für die Versuchsreihe gegeben waren:

  1. Pro Einzelversuch (d.h. pro Kammer) konnten mindestens zu den drei letzten Probeentnahmezeiten von 0 verschiedene Konzentrationen bestimmt werden.
  2. Die gemessenen Werte standen bei Auftragung über die Zeit in einem linearen Zusammenhang (R² > 0,95).
  3. Die Ergebnisse jeder einzelnen Kammer einer Versuchsreihe (n = 5-23) entsprachen mindestens diesen genannten Voraussetzungen.

↓56

Vor allem für die verhältnismäßig dicke Kornea ergab sich in mehreren Fällen eine ausgedehnte Lag-time, so dass teilweise erst zur vorletzten oder letzten Entnahmezeit Substanz im Akzeptor detektiert werden konnte. Für diese Versuchsreihen konnte daher kein Peff berechnet werden, so dass für eine Interpretation und Einordnung der Daten mit den über die Gesamtversuchszeit (90 bzw. 300 min) kumulierten Substanzmengen Q gearbeitet wurde.

4.2.3.1  Androstendion

Für einen Vergleich aller drei Membranen (Schweinekornea, Rindernasenmukosa, Nephrophan®) wurde der Peff für AD jeweils aus EBS-Puffer-Lösung sowie aus den ME-Zubereitungen ME-CD und ME-PG bestimmt. Um weiterhin den Einfluss der Einzelbestandteile der ME auf die AD-Permeation zu ermitteln, erfolgte deren Zugabe zur AD/EBS-Lösung im Donatorkompartiment. In weiteren Experimenten wurde die jeweilige Membran mit einer arzneistofffreien Pufferlösung der entsprechenden Testsubstanz vorinkubiert (vgl. Kap. 5.2.10). Um deren Einfluss auf die Membranintegrität zu prüfen, wurde anschließend AD aus EBS durch diese vorbehandelte Membran permeiert. Für alle Testzubereitungen lag die AD-Konzentration einheitlich bei 25 µg/ml (0,087•10-6 Mol/ml).

Für die Kornea ergab sich bereits bei der Permeation von AD aus EBS eine Lag-time, die bei den anderen Geweben teilweise erst nach Hinzufügen eines Adjuvans auftrat. Die jeweiligen Verzögerungszeiten sind in den folgenden Tabellen (Tabelle 10 ff.) unter dem zugehörigen Peff-Wert aufgeführt. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass für die Versuchsreihen, für die kein Peff bestimmt werden konnte (s. oben!), folglich auch keine Lag-time zu berechnen war. Werte für die Lag-time, die unterhalb der ersten Probenahmezeit lagen, sind nicht angegeben.

4.2.3.1.1  Untersuchungen mit HP-γ-CD

↓57

Erwartungsgemäß unterschieden sich die Peff von AD für Kornea und Mukosa deutlich. In Tabelle 10 sind die ermittelten Peff für AD aus EBS sowie unter Einfluss von HP-γCD dokumentiert.

Die Versuche mit Nephrophan® wurden sowohl in den Kammern für Mukosa mit den entsprechenden Probenahmezeiten (s. Kap. 5.2.10) als auch im Kornea-Modell mit den größeren Probezeitintervallen und der längeren Versuchsgesamtdauer durchgeführt. Beim Vergleich der resultierenden Peff aus den 90 min- und 300 min-Versuchen unter Zusatz von 9% HP-γ-CD ergab sich für die Messreihen ein statistisch signifikanter Unterschied, so dass die Nephrophan®-Ergebnisse im Folgenden den Versuchszeiten entsprechend aufgeführt werden. Als mögliche Ursache für den Unterschied der HP-γ-CD-Werte kann eine anfängliche Retardierung der AD-Permeation, die jedoch keine Lag-time ergab, aufgrund von Assoziat- oder Schichtbildung der HP-γ-CD-Moleküle auf der Membran in Betracht gezogen werden. Die aus den Versuchen resultierenden Geraden unterschieden sich daher aufgrund der unterschiedlichen Gesamtversuchszeiten bzw. Probenahmeintervalle in ihren Steigungen. In ME-CD (Tabelle 12) kam dieser Effekt aufgrund von Wechselwirkungen bzw. Konkurrenz der Einzelkomponenten mit der CD-Kavität nicht zum Ausdruck.

Für die Permeation aus EBS-Lösung ergibt sich ein annäherndes Verhältnis der Werte Mukosa : Kornea : Nephrophan® von 3 : 1 : 4, was bereits die relativ gute Permeabilität der Mukosa erkennen lässt. Allerdings bleibt dieses Verhältnis für die weiteren Versuche nicht in jedem Fall bestehen.

↓58

Tabelle 10: Peff und Lag-time für AD (25 µg/ml) aus EBS und Formulierungen mit HP-γ-CD

Formulierung

P eff [10 -5 •cm/s] a

Lag-time [min] a

 

Mukosa

Kornea

Nephrophan ®

   

90 min

300 min

EBS

2,19 ± 0,78

Ø

0,73 ± 0,15

44,9 ± 23,0

2,82 ± 0,58

Ø

3,09 ± 0,84

Ø

HP-γ-CD (1:1)

2,02 ± 1,34

Ø

0,88 ± 0,14 *

66,5 ± 16,3

3,30 ± 0,79

Ø

3,00 ± 0,36

Ø

HP-γ-CD (1:2)

2,01 ± 0,42

Ø

0,91 ± 0,10 **

69,2 ± 19,1

3,32 ± 0,20

Ø

3,45 ± 0,21

Ø

HP-γ-CD 9%

1,31 ± 0,84

Ø

nicht berechenbar

nicht berechenbar

0,93 ± 0,05 **

Ø

1,15 ± 0,12 **

Ø

HP-γ-CD vi

1,58 ± 0,43

Ø

0,50 ± 0,08 **

63,9 ± 12,2

2,82 ± 0,73

Ø

nicht durchgeführt

a ± SD, n ≥ 5; vi = vorinkubiert
* signifikant (* p < 0,05;** p < 0,01) zum EBS-Wert des betreffenden Gewebes

Um die kumulierte Arzneistoffgesamtmenge nach Permeation durch Mukosa und Kornea vergleichen zu können, wurde eine Versuchsreihe mit AD/EBS durch Kornea über 90 min mit den analogen Entnahmezeiten der Mukosa-Studien durchgeführt. Es resultierte nach Versuchsende für die Kornea ein Q90-Wert von 0,89% ± 0,42 und für die Mukosa von 6,23% ± 2,68 bezogen auf eine jeweilige Ausgangskonzentration von 25 µg/ml AD. Bei gleichen Versuchsbedingungen beträgt demnach die Permeationsrate nach 90 min für die Kornea lediglich ein Siebtel der AD-Menge, die in der gleichen Zeit durch Mukosa permeiert. Peff (0,64 ± 0,32•105 cm/s) und Lag-time (43,3 ± 2,6 min) durch Kornea nach 90 min unterschieden sich dagegen nicht von den Werten, die nach 300 min erhalten wurden (vgl. Tabelle 10).

Der Zusatz von HP-γ-CD in einem molaren Verhältnis zu AD von 1:1 (entsprechend 0,012% CD) und 1:2 (entsprechend 0,024% CD) führte im Fall der Kornea zu einem signifikanten Anstieg der Peff. Bei den beiden anderen Barrieren war der Unterschied statistisch nicht relevant. Addition von 9% HP-γCD (entsprechend einem molaren AD/CD-Verhältnis von 1:764) hingegen, was der Konzentration in der ME-Komposition (ME-CD) entspricht, führte mit Ausnahme der Mukosa zum signifikanten Absinken der Permeabilitätskoeffizienten.

↓59

In der Literatur wird von maximalen Permeationsraten in Gegenwart von CD berichtet, wenn diese Hilfsstoffe lediglich in Konzentrationen zugegeben werden, die gerade zum vollständigen Auflösen des Arzneistoffs erforderlich sind [105, 106, 125], was einer maximalen CD-Zugabe entsprechend dem molaren Verhältnis des gebildeten Einschluss-Komplexes gleichzusetzen ist. Bei Überschreiten dieses Verhältnisses wird der Anteil an komplexiertem Arzneistoff aufgrund der erhöhten CD-Konzentration angehoben. Damit liegt weniger diffusionsfähiger unkomplexierter Arzneistoff vor und die Verfügbarkeit der Substanz wird abgesenkt [16, 126].

Die Ergebnisse der Versuche mit der hohen HP-γ-CD-Konzentration von 9% sind sicher im Einklang mit diesen Literaturdaten zu interpretieren. Andererseits macht der Vergleich der CD-beeinflussten Permeabilitäten der verschiedenen Gewebe deutlich, dass lediglich für die Kornea mit geringer CD-Konzentration (1:1 und 1:2, s. Tabelle 10) ein positiver Effekt erzielt werden konnte, was letztlich für eine gewisse Spezifität der Gewebe spricht und Verallgemeinerungen erschwert.

Wie bereits in Kap. 3.1.2 beschrieben, besitzt das Epithel der Kornea eine fest anhaftende Glykokalix, die unter physiologischen Bedingungen die Mukusschicht des Tränenfilms „befestigt“ und der Epithel-Oberfläche einen hydrophilen Charakter verleiht [22]. Aufgrund ihrer Verankerung in der Zellmembran wird vermutet, dass die Glykokalix und damit die oberflächliche Hydrophilisierung des Epithels während der durchgeführten Experimente erhalten bleibt. Das zur Molekülaußenseite hin hydrophile CD kann somit als Carrier für das inkludierte lipophile AD fungieren und seine Konzentration am Epithel deutlich steigern, wie es auch für andere Gastmoleküle gefunden wurde [16]. Im Falle der Mukosa dagegen kann das AD direkt in die nach außen lipophilen Epithelzellen penetrieren, und bei der Nephrophan®Membran erfolgt eine Porendiffusion, wobei in beiden Fällen keine permeationsfördernde Wirkung des CD zu erwarten ist.

↓60

Um einen direkten Einfluss des CDs auf die Membranintegrität zu erfassen, wurden die Gewebe mit einer 9%igen HP-γCD Lösung vorinkubiert (s. Kap. 5.2.10) und anschließend die Permeationsrate von AD aus EBS bestimmt. Lediglich bei der Kornea zeigte sich ein signifikanter Effekt mit einer wider Erwarten reduzierten Permeabilität. Als mögliche Erklärung dafür bietet sich an, dass bei der Vorinkubation CD-Moleküle durch Wechselwirkungen mit der Glykokalix oder mit Mukusresten an der Epitheloberfläche fixiert werden. Ein nachfolgendes Eindringen des AD in die Membran könnte dann durch Interaktionen mit diesen CD-Molekülen behindert sein, was sich zudem in einer erhöhten Lag-time widerspiegelte (vgl. Tabelle 10). Bei einer Membranschädigung wäre dagegen ein signifikanter Anstieg der Permeabilität zu erwarten [125, 127], hervorgerufen durch die potentielle Fähigkeit der CD, Membranbestandteile, wie Phospholipide und Cholesterol, zu extrahieren [128]. In der Literatur werden viele CD im Allgemeinen als gut membranverträglich beschrieben [6, 59, 129, 130]. Für HP-γ-CD werden seine Fähigkeit, Cholesterol zu solubilisieren sowie seine hämolytische Aktivität als gering eingestuft [6].

Bemerkenswert bei den Kornea-Resultaten (vgl. Tabelle 10) ist, dass auch in den Versuchsreihen mit den molaren AD/CD-Verhältnissen (1:1 bzw. 1:2 AD/HP-γ-CD) bei signifikant erhöhten Peff die Lag-time verlängert war. Diese Ergebnisse könnten ein weiterer Hinweis auf die oben diskutierte Carrier-Funktion des CDs sein. Einerseits wird die Verweildauer und Konzentration des AD an der „hydrophilisierten“ Membran (s. oben!) durch die Komplexierung mit dem CD erhöht, andererseits jedoch muss die Substanz vor einer Penetration in das Kornea-Epithel zuerst aus der CD-Kavität diffundieren. Einen ähnlichen Mechanismus beschreiben Kristinsson et al. [131] für Co-Komplexe aus CD und lipophilem Arzneistoff mit Hydroxypropylmethylcellulose.

Die Vorinkubation von Nephrophan® diente der Beweisführung hinsichtlich des vollständigen Ausspülens der CD-Lösung aus der Kammer bzw. von der Membranoberfläche und führte erwartungsgemäß zum gleichen Peff-Wert wie bei der Referenz mit EBS ohne Vorbehandlung (s. Tabelle 10).

4.2.3.1.2 Untersuchungen mit Cremophor® EL

↓61

Tabelle 11 zeigt die Peff-Werte unter Einwirkung von CrEL, wobei, wie auch in allen weiteren Tabellen zu den Permeationsstudien, als Bezugsgröße die EBS-Werte aus Tabelle 10 wiederholt sind. Bei Zugabe von 20% CrEL zur AD-Lösung wurden alle Permeationskoeffizienten hoch signifikant reduziert. Für Kornea und Nephrophan® (90 min) ließ sich aufgrund der großen Lag-time kein Peff-Wert und damit auch kein Wert für die Lag-time berechnen. Für die Mukosa bewirkte der Zusatz von CrEL die einzige signifikante Reduzierung des Peff.

Es ist davon auszugehen, dass der lipophile Arzneistoff von dem Tensid CrEL durch Mizelleinschluss solubilisiert [74] und in den Mizellen relativ fest fixiert wird (CMC von CrEL, 20%ig in Wasser < 0,1%). Eine Gegenüberstellung zu den mit 9% HP-γCD erhaltenen Peff-Werten (vgl. Tabelle 10) verdeutlicht für alle drei Membranen eine weitere Reduzierung, die im Falle von Nephrophan® statistisch signifikant ist. Offenbar ist der Mizelleinschluss des Arzneistoffs stabiler als der CD-Einschlusskomplex.

Tabelle 11: Peff und Lag-time für AD (25 µg/ml) aus EBS und mit CrEL-Zusatz

Formulierung

P eff [10 -5 •cm/s] a

Lag-time [min] a

 

Mukosa

Kornea

Nephrophan ®

   

90 min

300 min

EBS

2,19 ± 0,78

Ø

0,73 ± 0,15

44,9 ± 23,0

2,82 ± 0,58

Ø

3,09 ± 0,84

Ø

CrEL 20%

0,50 ± 0,11 **

Ø

nicht berechenbar

nicht berechenbar

nicht berechenbar

nicht berechenbar

0,15 ± 0,03 **

Ø

CrEL vi

1,61 ± 0,59

Ø

0,55 ± 0,12 *

78,3 ± 20,9

3,31 ± 0,68

Ø

nicht ermittelt

a ± SD, n ≥ 5; vi = vorinkubiert
* signifikant (* p < 0,05;** p < 0,01) zum EBS-Wert des betreffenden Gewebes

↓62

Eine Vorinkubierung der Gewebe mit einer 20%igen CrEL/EBS-Lösung hatte wiederum allein für die Permeabilität der Kornea eine signifikante Reduzierung zur Folge. Viele Tenside weisen eine permeationsfördernde Wirkung auf, die darauf beruht, dass die Tensidmoleküle partiell in die Membran eingelagert werden und bei steigender Konzentration Lipide herauslösen bzw. solubilisieren können [ 132]. Darüber hinaus wird für einige Tenside auch eine direkte Wirkung auf die Tight-junctions diskutiert [136]. Für CrEL kann unter den Versuchsbedingungen angenommen werden, dass kein membranschädigender Effekt auf die biologischen Membranen ausgeübt wird, da ansonsten eine erhöhte Permeationsrate die Folge sein müsste. Dieser Befund bestätigt die Ergebnisse von Berndt [74]. Bei den Daten für die Kornea fällt wiederum eine signifikante Verlängerung der Lag-time auf, die in diesem Fall mit einer Belegung der Membranoberfläche mit Tensid-Molekülen begründet werden kann. Die Cellulosemembran wurde ebenfalls vorinkubiert, um sicher zu gehen, dass keine in der Kammer verbleibenden Reste der Tensidlösung die nachfolgende Permeation beeinflussen, sondern quantitativ ausgespült werden, was durch den von der Referenz nicht verschiedenen Peff bestätigt wurde.

4.2.3.1.3 Untersuchungen mit den Mikroemulsionen ME-PG und ME-CD

Im Hinblick auf eine potentielle Anwendung als Arzneistoffträgersysteme war eine Untersuchung der AD-Permeation aus den beiden Zubereitungen ME-PG und ME-CD (Zusammensetzung vgl. 4.1.2) von besonderem Interesse. Beide ME bewirkten ein Absinken des Peff (Tabelle 12), was aber nur bei der Kornea und Nephrophan® signifikant und im Fall von ME-PG jeweils stärker ausgeprägt war. De facto erfolgte aus ME-PG durch Nephrophan® bis zu 300 min überhaupt keine Diffusion, und für die Kornea war für ME-CD bzw. ME-PG erst nach 240 bzw. 300 min eine sehr geringe AD-Konzentration zu detektieren, so dass sich weder Peff noch Lag-time berechnen ließen (vgl. Tabelle 12).

Es ist zu vermuten, dass bei diesen heterogenen Mehrkomponentensystemen der Verteilungskoeffizient des AD in der Formulierung sowie zwischen Trägersystem und Membran eine wesentliche Rolle spielt und das CD dabei einen entscheidenden Einfluss ausübt. Wie unter Kap. 4.1.4.1 beschrieben, bewirkte ein HP-γ-CDZusatz zur wässrigen AD-Lösung eine Reduzierung des VKipm von 149,66 auf 0,43, wohingegen PG lediglich auf einen Wert von 80,80 reduzierte. In der ME mit HP-γCD kann das AD durch Einschluss in die CD-Kavität vermutlich in den wässrigen Bereichen des Systems gehalten werden, aus denen die Penetration in die Barriere möglich ist. Ohne CD wird sich der lipophile Wirkstoff vorrangig zu den lipophilen Bereichen der ME orientieren und aufgrund seines relativ hohen VKipm wenig Tendenz zeigen, in die wässrigen Regionen und von dort in die Membran zu diffundieren. Für eine Wechselwirkung des HP-γCD mit AD im ME-System spricht auch die deutlich höhere Sättigungslöslichkeit von AD in ME-CD im Vergleich zu ME-PG (s. Kap. 4.1.4.2).

↓63

Tabelle 12: Peff und Lag-time für AD (25 µg/ml) aus EBS, ME-PG und ME-CD

Formulierung

P eff [10 -5 •cm/s] a

Lag-time [min] a

 

Mukosa

Kornea

Nephrophan ®

   

90 min

300 min

EBS

2,19 ± 0,78

Ø

0,73 ± 0,15

44,9 ± 23,0

2,82 ± 0,58

Ø

3,09 ± 0,84

Ø

ME-PG

1,98 ± 0,47

25,1 ± 12,5

nicht berechenbar

nicht berechenbar

0,00 ± 0 *

nicht berechenbar

0,00 ± 0 *

nicht berechenbar

ME-CD

1,78 ± 0,89

22,5 ± 15,6

nicht berechenbar

nicht berechenbar

0,61 ± 0,13 **

15,3 ± 9,8

0,72 ± 0,04 **

Ø

a ± SD, n ≥ 5; * signifikant (* p < 0,05;** p < 0,01) zum EBS-Wert des betreffenden Gewebes

Abweichend hiervon ergaben die Peff der ME für die Mukosa keinen Unterschied zum EBS-Wert (Tabelle 12). Das Verteilungsverhalten von AD in der Zubereitung und zur Membran nimmt hier offenbar keinen Einfluss auf die Permeation des Wirkstoffs. Der Lipidgehalt der Mukosa, der von Corbo et al. [48] für Kaninchen mit 12% ermittelt wurde, scheint in diesem Fall eine zusätzliche lipophile Phase darzustellen, durch die AD relativ leicht zu permeieren vermag. Allerdings beginnt aus beiden ME die Mukosa-Permeation verzögert, wie aus der ermittelten Lag-time (Tabelle 12) zu ersehen ist. Der Konzentrationsgradient in der Membran kann sich vermutlich, bedingt durch die verlangsamte Diffusion von AD aus dem Trägersystem an die Grenzfläche, nur verzögert aufbauen.

Für eine weitere Interpretation dieser Ergebnisse könnte eine Permeation aus IPM hilfreich sein. Diese war jedoch zum gegebenen Zeitpunkt nur noch für Nephrophan® und Kornea durchführbar, da Arbeiten mit Rinder-Mukosa aufgrund der nach der BSE-Krise drastisch erhöhten Sicherheitsauflagen (Arbeiten mit Hochrisiko-Material) nicht mehr durchgeführt werden konnten. Aus der lipophilen Grundlage IPM permeierte AD erwartungsgemäß weder durch Kornea noch durch Nephrophan® innerhalb der Versuchszeiten. Möglicherweise ist jedoch eine Permeation des AD durch die lipophile Mukosa zu einem gewissen Grad möglich und könnte den im Vergleich zu den anderen Membranen kaum reduzierten Peff aus ME-PG erklären. Berndt [74] fand aus Rizinusöl eine stark verminderte, aber messbare Permeation von AD durch Rindernasenmukosa.

↓64

Um den Einfluss von HP-γ-CD in ME-CD auf das AD-Permeationsverhalten durch Mukosa differenziert beurteilen zu können, wurden Versuche mit der ME-Grundmischung (GM), d.h. ohne HP-γ-CD im Trägersystem (s. Kap. 4.1.2), durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Herstellung von ME-CD in der Weise variiert, dass AD in die isolierte lipophile Phase (ADlip), anstatt wie üblich in die hydrophile Phase, inkorporiert wurde (s. Kap. 5.2.2). Die gemessenen Peff sind in Abb. 13 als Balkendiagramm dargestellt, um den Trend der Werte zu veranschaulichen, da sich bei der statistischen Auswertung der Daten keine signifikanten Unterschiede ergaben.

Abb. 13: Peff von AD (25 µg/ml) durch Mukosa für unterschiedlich hergestellte ME-CD bzw. ME-Grundmischung (ME-GM)

Der Zusatz von CD, sowohl bei Einarbeitung von AD in die lipophile (ADlip) als auch in die wässrige Phase (ME-CD) scheinen die Permeation der Substanz gegenüber der GM tendenziell zu begünstigen. Der Peff von AD aus ME-GM liegt in der Größenordnung des Wertes, der mit der 20%igen CrEL-Lösung erhalten wurde (s. Tabelle 11). Wie schon bei den SAXS-Untersuchungen in Kap. 4.1.3.4 angenommen, stellt die GM ein Solubilisat dar, in dem vermutlich auch der zugesetzte Arzneistoff durch CrEL solubilisiert und daher, ebenfalls wie in der 20%igen CrEL-Lösung, in Mizellen eingeschlossen vorliegt (vgl. Kap. 4.2.3.1.2). ADlip stellt ein ME-System dar und weist damit andere innere Strukturen auf, so dass möglicherweise die Fixierung des Arzneistoffs hier schwächer ist, als in den AD-Solubilisaten ME-GM und der 20%igen AD/CrEL-Lösung. Aufgrund der Vorgehensweise bei der Herstellung von ME-CD wird angenommen, dass HP-γ-CD durch Inkludierung das lipophile AD verstärkt in den wässrigen Bereichen der Formulierung halten kann (s. oben!).

↓65

Um weiterhin den membranunabhängigen Einfluss des Kotensids PG sowie den konzentrationsabhängigen Einfluss des Tensids CrEL auf die AD-Permeation näher zu beleuchten, wurde der Peff für 9% PG und 1% CrEL in EBS durch Nephrophan® bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 dargestellt.

Tabelle 13: Peff und Lag-time von AD (25 µg/ml) durch Nephrophan® unter Einfluss von 9% PG und 1% CrEL

Formulierung

P eff [10 -5 •cm/s] a

Lag-time [min] a

 
 

Nephrophan ®

 

90 min

300 min

EBS

2,82 ± 0,58

Ø

3,09 ± 0,84

Ø

PG, 9%

3,72 ± 0,41 *

Ø

3,75 ± 0,3 *

Ø

CrEL ,1%

nicht ermittelt

nicht ermittelt

2,00 ± 0,56 **

Ø

a ± SD, n = 5-6;
* signifikant (* p<0,05;** p<0,01) zum EBS-Wert des betreffenden Gewebes

Die gemessenen Werte sind alle signifikant unterschiedlich zum jeweiligen EBS-Wert. PG hat einen permeationsfördernden, CrEL einen -vermindernden Effekt. Da in einer Tensidlösung oberhalb der CMC die Anzahl an gebildeten Mizellen mit steigender Konzentration linear zunimmt bis schließlich höher organisierte Strukturen auftreten [91], ist das signifikant bessere Permeationsverhalten des AD aus einer 1%igen CrEL-Lösung gegenüber einer 20%igen (Peff: 0,15 bzw. 2,00•10-5 cm/s) mit der geringeren Anzahl an Mizellen zu erklären. Möglicherweise liegen in der 20%igen CrEL-Lösung bereits vereinzelt Bereiche mit einem höheren mizellaren Ordnungszustand vor, wobei allerdings in den SAXS-Messungen (vgl. Kap. 4.1.3.4) lamellare Strukturen ausgeschlossen werden konnten. Bereits in der 1%igen Lösung wurde AD jedoch mizellar solubilisiert (CMC < 0,1%), wodurch seine Permeationsrate im Vergleich zu EBS vermindert war. Die permeationssteigernde Wirkung des PG könnte auf einer Hydrotropisierung des Arzneistoffs [26] und einer damit verbundenen verbesserten Diffusion des AD zur Membran beruhen. In der Formulierung ME-PG scheint dieser Effekt auf die AD-Permeation jedoch keinen Einfluss zu nehmen (s. Tabelle 12).

4.2.3.1.4 Untersuchungen mit der Mikroemulsion ME-ION und mit HTAP-β-CD

↓66

In weiteren Experimenten wurde das Permeationsverhalten von AD aus dem System ME-ION (Zusammensetzung vgl. Kap. 4.1.2) mit dem kationischen HTAP-βCD sowie der Einfluss dieses ionischen CDs auf die Membranen Kornea und Nephrophan® untersucht (Tabelle 14).

Tabelle 14: Peff und Lag-time für AD (25 µg/ml) aus ME-ION und mit HTAP-βCD

Formulierung

P eff [10 -5 •cm/s] a

Lag-time [min] a

 
 

Kornea

Nephrophan ®

  

300 min

EBS

0,73 ± 0,15

44,9 ± 23,0

3,09 ± 0,84

Ø

HTAP-β-CD, 9%

0

Ø

1,55 ± 0,08 **

Ø

ME-ION

0

Ø

1,13 ± 0,10 **

Ø

a ± SD, n ≥ 5
** signifikant (p < 0,01) zum EBS-Wert des betreffenden Gewebes

In diesem Fall wurde mit Nephrophan® lediglich der 300 min-Versuch durchgeführt, da Mukosa nicht mehr mit einbezogen werden konnte (s. vorn!). Das kationische CD (vgl. Kap. 3.5.4) wurde mit der Erwartung ausgewählt, dass durch die der biologischen Membran entgegengesetzte Ladung die Konzentration an AD/CD-Komplexen an der Barriere erhöht werden könnte [78].

↓67

Durch die Cellulose-Membran permeierte aus den ionischen CD-Formulierungen nach 300 min signifikant weniger AD als aus EBS. Andererseits lagen die Nephrophan®-Werte für ME-ION tendenziell höher als für ME-CD (s. Tabelle 12, Peff = 0,72 cm/s) bzw. für HTAP-β-CD höher als unter Zusatz von HP-γCD (s. Tabelle 10, Peff = 1,15 cm/s), ergaben jedoch keine Signifikanzen zu diesen Werten.

Wie in Kap. 4.1.4.3 nachgewiesen, wurde AD von HTAP-β-CD inkludiert, wobei für diesen Komplex annähernd dieselbe Komplexstabilitätskonstante ermittelt wurde wie für den HP-γ-CD-Komplex. Aus diesem Grund kann eine Reduzierung der AD-Permeation mit HTAP-β-CD in gleicher Weise diskutiert werden, wie unter HP-γ-CD-Zusatz (s. Tabelle 10 und nachfolgenden Text!).

In Analogie zum Permeationsverhalten aus ME-CD ist auch für ME-ION zu vermuten, dass das CD den Arzneistoff in den wässrigen Bereichen des Systems zurückhält (s. oben!). Der Arzneistoff liegt somit in gelöster Form an der Membran vor. Die Reduzierung des VKipm (s. Kap. 4.1.4.1) durch HTAP-βCD von 149,66 auf 0,81 ± 0,05 unterstützt diese Annahme.

↓68

Darüber hinaus ist eine elektrochemische Wechselwirkung zwischen der negativ geladenen Kornea-Epithel-Oberfläche [71] und dem kationischen CD denkbar und könnte eine Kumulierung von Arzneistoff am Epithel bewirken bzw. einen enhancenden Effekt ausüben [79]. Jedoch erfolgte keine Erhöhung der Permeationsrate. Klang et al. [I_Ref40634332">81] fanden dagegen bei In-vivo-Studien an Kaninchen erhöhte Wirkstoffspiegel für Indomethacin im Kammerwasser und in der Netzhaut nach Verabreichung aus einer kationischen im Vergleich zu einer negativ geladenen Submikronemulsion und führen dies auf eine verlängerte Wechselwirkung zwischen Formulierung und Epithel zurück.

4.2.3.1.5 Permeationsrate

Der Vollständigkeit halber und zum besseren Vergleich der Daten sind in der folgenden Tabelle (Tabelle 15) die kumulierten Substanzmengen für die Versuche aufgelistet, für die infolge zu langer Lag-time kein Peff berechnet werden konnte. Die betreffenden Werte sind grau unterlegt dargestellt, da daneben die Ergebnisse für die nicht betroffenen Membranen sowie alle EBS-Werte zum Vergleich aufgelistet sind.

Die beiden ME-Zubereitungen erreichten für die Mukosa gleiche Durchtrittsraten, wiesen aber für die Kornea und Nephrophan® tendenzielle bzw. signifikante Unterschiede auf. Hier scheint in beiden Fällen ME-CD die geeignetere Grundlage für eine AD-Permeation zu sein. Die Zusätze von HP-γ-CD und CrEL führten, insbesondere bei der Kornea, zu extrem niedrigen Durchtrittsraten. Im Falle der Mukosa fällt lediglich die Reduzierung durch CrEL als signifikant auf.

↓69

Tabelle 15: Kumulierte AD-Mengen (Q) [µg/ml] a nach der jeweiligen Gesamtpermeationszeit

Formulierung

Mukosa

Kornea

Nephrophan ®

 

90 min

300 min

90 min

300 min

EBS

1,56 ± 0,67

0,73 ± 0,15

1,62 ± 0,36

6,66 ± 1,75

HP-γ-CD, 9%

0,84 ± 0,60

0,09 ± 0,07 **

0,75 ± 0,08 **

3,30 ± 0,26 **

CrEL, 20%

0,41 ± 0,14 **

0,05 ± 0,04 **

0,21 ± 0,18 **

0,40 ± 0,07 **

ME-PG

1,00 ± 0,44

0,02 ± 0,02 **

0,00 ± 0 **

0,00 ± 0 **

ME-CD

1,00 ± 0,69

0,11 ± 0,04 **

0,43 ± 0,11 **

1,95 ± 0,13 **

a ± SD, n ≥ 5
** signifikant (p < 0,01) zum EBS-Wert des betreffenden Gewebes

4.2.3.1.6 Kapitel-Zusammenfassung

Die wichtigsten Resultate der vorangehend beschriebenen Permeationsstudien mit AD werden nachfolgend stichpunktartig aufgelistet:

4.2.3.2 Testosteron

↓70

Ein Vergleich mit dem Permeationsverhalten des TST aus EBS durch alle Membranen erbrachte signifikant niedrigere Peff als für AD (Tabelle 16).

Bei der In-vitro-Permeation von AD, der physiologischen Vorstufe des TST, resultierte für alle drei Gewebe eine höhere Permeationsrate. Vor allem die Kornea zeigte für AD eine doppelt so hohe Permeabilität wie für TST. Aus der Literatur konnte entnommen werden, dass TST einen höheren Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten aufweist als AD [ 133; in 134 angegeben als log p = 3,22], so dass eine Verschlechterung der Permeationsrate - besonders für Nephrophan® und Kornea – zumindest partiell mit der erhöhten Lipophilie des Wirkstoffs zu erklären ist.

Da aber auch für die eher lipophile Mukosa ein signifikanter Rückgang des Peff bei TST ermittelt wurde, müssen weitere Faktoren auf die Permeabilität dieses Arzneistoffs Einfluss nehmen. Im Fall der biologischen Gewebe kann ein, im Vergleich zu AD möglicherweise bevorzugter, enzymatischer Umsatz des TST in Betracht gezogen werden, der für Kornea und Mukosa mehrfach beschrieben [43, 135 - 136, 137 138] und in Kap. 4.3 näher untersucht wird. Möglicherweise sind die Schwankungen der Lag-time durch Kornea ebenfalls auf einen Einfluss von Enzymen zurückzuführen.

↓71

Tabelle 16: Peff und Lag-time von AD und TST (beide 25 µg/ml) jeweils aus EBS

Wirkstoff

P eff [10 -5 •cm/s] a

Lag-time [min]

 

Mukosa *

Kornea **

Nephrophan ®

   

90 min **

300 min *

AD

2,19 ± 0,78

Ø

0,73 ± 0,15

44,9 ± 23,0

2,82 ± 0,58

Ø

3,09 ± 0,84

Ø

TST

1,58 ± 0,97

Ø

0,32 ± 0,21

42,6 ± 44,9

1,52 ± 0,30

Ø

2,26 ± 0,33

Ø

a ± SD, n ≥ 5
Signifikanzen der Peff-Werte ermittelt im t-Test: * p < 0,05, ** p < 0,01

Aufgrund der erzielten Ergebnisse ist eine gesteigerte Bioverfügbarkeit des AD im Gegensatz zu TST anzunehmen. Diese Beobachtung war hier unabhängig vom getesteten Membrantyp prinzipiell zu konstatieren, wobei aber für eine Wertung der Ergebnisse der Vergleich mit In-vivo-Studien unbedingt erforderlich ist.

4.2.3.3 Fluorescein-Na

Um die unterschiedlichen Trägersysteme sowie das Arzneistoff-Verteilungsverhalten in diesen bzw. gegenüber der Membran näher zu charakterisieren und die Auswirkungen auf die Permeabilitäten von Schweinekornea3 und Nephrophan® weiter zu untersuchen, wurden Studien mit der hydrophilen Modellsubstanz Fluorescein-Na (FSC) durchgeführt.

↓72

FSC durchdringt eine biologische Membran bevorzugt auf parazellulärem Wege, während bei dem lipophilen AD der transzelluläre Permeationsweg dominiert. Eine parazelluläre Permeation wird in stärkerem Maße von Parametern, wie der Molekülgröße der Substanz [19, 20, 139], dem pH-Wert [43, 140] sowie dem Elektrolytgehalt in der Lösung [44], und auch weiteren Komponenten der Formulierung [112] beeinflusst. Beispielsweise bewirkt ein Absenken der Ca2+-Konzentration durch Applikation eines Chelat-Bildners eine Expansion der Interzellularräume und damit einen Anstieg der parazellulären Permeabilität [141, 142]. Der FSC-Transport ist daher abhängig von der Größe und Anzahl wässriger Poren in der Membran sowie vom Zustand der Tight-junctions, die die Zellzwischenräume nach außen hin mehr oder weniger abdichten. Die ermittelten Peff und die jeweilige Lag-time aus den Permeationsstudien mit FSC sind in Tabelle 17 aufgeführt.

Die für Nephrophan® ermittelten Peff lagen für FSC in der gleichen Größenordnung wie die Werte für AD (vgl. Tabelle 10 – 14), wohingegen die Kornea für FSC weniger permeabel war und Permeationskoeffizienten ergab, die um eine Zehnerpotenz niedriger lagen als für AD. Diese Ergebnisse korrelieren gut mit dem bereits erwähnten und aus der Literatur bekannten Zusammenhang zwischen Verteilungskoeffizient (vgl. Kap. 4.1.4.1) und Permeation [47, 143]. Ein Vergleich mit Peff-Werten für FSC durch Kaninchenkornea aus der Literatur ergibt ebenfalls eine gute Übereinstimmung [144]. Die Zugabe der Formulierungshilfsstoffe und ME zur Donatorlösung bewirkte ein signifikantes Absinken der Peff-Werte gegenüber der Referenz mit EBS, mit Ausnahme der ME-ION, die für die biologische Membran nur eine tendenzielle Minderung der Permeabilität erbrachte.

Ein Zusatz von 9% HP-γ-CD bzw. HTAP-β-CD senkte die Permeation von FSC durch Nephrophan® und Kornea signifikant, wobei HTAP-β-CD den tendenziell stärkeren Einfluss ausübte (Tabelle 17). Für die Lag-time der Kornea-Versuche konnte unter Zugabe der CD eine Abnahme detektiert werden (signifikant für HTAP-β-CD). Die Wechselwirkung zwischen FSC und den CD wurde nicht näher untersucht, aber aufgrund der Permeationsergebnisse ist eine Inklusion der Substanz in beide CD nicht auszuschließen. In der Literatur konnten Hinweise auf CD-Inklusionsbildungen mit hydrophilen Stoffen gefunden werden [101, 128, 145].

↓73

Tabelle 17: Peff und Lag-time von FSC (25 µg/ml) durch Kornea und Nephrophan®

Formulierung

P eff [10 -6 •cm/s] a

Lag-time [min] a

 
 

Kornea

Nephrophan ®

  

300 min

EBS

0,99 ± 0,86

120,2 ± 22,2

34,3 ± 5,4

Ø

HP-γ-CD 9%

0,37 ± 0,29 *

94,1 ± 37,3

17,2 ± 1,2 **

Ø

HP-γ-CD vi

0,49 ± 0,70

123,8 ± 36,3

nicht ermittelt

CrEL 20%

0,15 ± 0,08 **

95,5 ± 30,1

22,8 ± 1,7 **

Ø

CrEL vi

0,48 ± 0,48

121,1 ± 21,9

nicht ermittelt

HTAP-β-CD 9%

0,18 ± 0,24 **

72,6 ± 56,7**

14,5 ± 1,0 **

Ø

HTAP-β-CD vi

0,74 ± 0,55

126,7 ± 25,9

nicht ermittelt

ME-PG

nicht berechenbar

nicht berechenbar

19,1 ± 1,6 **

79,5 ± 27,8**

ME-CD

0,13 ± 0,05 **

145,4 ± 22,7

11,8 ± 1,7 **

56,0 ± 9,5**

ME-ION

0,48 ± 0,26

151,8 ± 20,7

15,4 ± 1,3 **

Ø

a ± SD, n ≥ 9
* signifikant (* p<0,05;** p<0,01) zum EBS-Wert des betreffenden Gewebes

Auch hydrophile Interaktionen mit der äußeren Hülle der CD-Moleküle kommen in Betracht. Für HTAP-βCD sind darüber hinaus aufgrund der gegensätzlichen Ladung zu FSC ionische Wechselwirkungen anzunehmen, die die stärkere Reduzierung der FSC-Permeation gegenüber HP-γ-CD erklären könnten.

Mit den CD vergleichbare Effekte bewirkte ein Zusatz von CrEL (Tabelle 17), der den Permeabilitätskoeffizienten und ebenfalls die Lag-time für den Durchtritt von FSC durch Kornea absenkte. Im Fall von Nephrophan® war die FSC-Permeation mit CrEL im Vergleich zu HP-γ-CD und HTAP-β-CD signifikant höher, jedoch gegenüber EBS ebenfalls signifikant reduziert. Für das hydrophile FSC wird im Gegensatz zum lipophilen AD keine Einlagerung in die Tensid-Mizellen, sondern eher eine Interaktion mit den hydrophilen Kopfgruppen des CrEL angenommen. Möglicherweise sind die Tensid-Wechselwirkungen in diesem Fall schwächer als die CD-Interaktionen und können die unterschiedlichen Peff durch Nephrophan® erklären.

↓74

Eine Vorinkubierung des biologischen Gewebes mit den CD bzw. CrEL führte lediglich zu einem tendenziellen aber nicht signifikanten Absinken der Permeabilität. Die Lag-time blieb nach Vorinkubation mit allen drei Adjuvantien unverändert. Da im Gegensatz hierzu in Anwesenheit der drei Zusätze im Donatormedium jeweils kürzere Verzögerungszeiten ermittelt wurden, ist anzunehmen, dass ein reversibler, eventuell primär enhancender Effekt auf das Kornea-Epithel ausgeübt wird. Es wäre denkbar, dass die CD ein temporäres Öffnen der Tight-junctions, wie Marttin et al. [146] für RAMEB4 beschreiben, Poren oder eventuell Ionenkanäle [6] initiieren. CrEL dagegen kann sich durch seinen amphiphilen Charakter, wie schon bei den AD-Versuchen angenommen (vgl. Kap. 4.2.3.1.2), an die biologische Membran anlagern oder aber aufgrund von Wechselwirkungen mit der Zellmembran den Zellverband auflockern und ein Eindringen von Substanzen erleichtern [136]. Es ist anzunehmen, dass diese Effekte jedoch hauptsächlich auf den parazellulären Transportweg beschränkt bleiben, da vergleichbare Beobachtungen für AD nicht gemacht werden konnten.

Allerdings müssen bei einer Interpretation dieser Ergebnisse die Fehlergrenzen der Peff berücksichtigt werden (Tabelle 17), die für das biologische Gewebe sehr hoch lagen. Vor allem für die Vorinkubationsversuche wurden extrem hohe Standardabweichungen detektiert. Als Ursache werden Veränderungen der parazellulären Membrandurchlässigkeit angenommen, die für das isolierte Epithel beispielsweise mittels TEER-Messungen (Transepithelial electrical resistance) nachgewiesen werden könnten [147]. Möglicherweise war die Vorinkubationszeit von 30 min für eine gleichmäßige Equilibrierung des Gewebes nicht ausreichend, oder die Vorinkubationssubstanz konnte nicht hinreichend aus der Donatorkammer bzw. von der Membranoberfläche, wie auch in den AD-Versuchen (vgl. Kap. 4.2.3.1.1 bzw. 4.2.3.1.2) beobachtet, ausgewaschen werden.

Zur Erläuterung des Einflusses der Additiva auf das Permeationsverhalten von FSC muss differenziert werden zwischen direkten Effekten dieser Substanzen an der Membran und Wechselwirkungen mit dem FSC, die bereits in der Donatorlösung stattfinden. Die Passage des lipophilen Kornea-Epithels stellt für das hydrophile FSC den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Permeation dar [20]. Wenn bei einigen Messungen die Lag-time deutlich reduziert war (beide CD und CrEL, Tabelle 17), ist für diese Additiva eine reversible Verbesserung der Permeabilität des Epithels für FSC zu diskutieren (s. oben!). Andererseits können aber parallel dazu auch Wechselwirkungen der Komponenten in der Donatorlösung für einen permeationsmindernden Effekt verantwortlich sein, wofür die durch die Additiva signifikant erniedrigten Peff durch Nephrophan® sprechen. Für die künstliche Membran kann eine direkt permeationsfördernde Modifikation ausgeschlossen werden. Die hydrophile Glykokalix auf dem Kornea-Epithel wird für die Permeation des hydrophilen FSC als wenig bedeutsam erachtet.

↓75

Für die drei ME ergab sich eine Reihenfolge der Peff des FSC durch Kornea von ME-ION > ME-CD > ME-PG, wobei ME-ION und ME-CD statistisch nicht signifikant voneinander verschieden sind. Durch Nephrophan® zeigte ME-PG gegenüber den anderen ME-Systemen einen signifikant höheren Peff, so dass eine Reihenfolge von ME-PG > ME-ION > ME-CD mit jeweils signifikanten Unterschieden resultierte.

Das System ohne CD (ME-PG) verminderte also im Vergleich zu den CD-haltigen Systemen die FSC-Permeation durch Nephrophan® in geringerem Ausmaß. Das enthaltene Tensid CrEL bewirkte als Einzelsubstanz bei Nephrophan® im Vergleich zu den CD eine schwächere Minderung der FSC-Peff (s. oben!), so dass die beobachteten Effekte bei den ME-Permeationen teilweise durch ihre differenzierte Zusammensetzung (vgl. Tabelle 4) begründet sein können, wobei allerdings der Einfluss von PG nicht im Einzelnen berücksichtigt ist. Die erhöhte Lag-time bei ME-CD bzw. ME-PG wurde vermutlich durch Interaktionen der Substanzen in der Donatorlösung hervorgerufen, da Effekte an der synthetischen Membran ausgeschlossen werden können.

Für die Kornea erreichte ME-ION als einzige ME eine zur EBS-Lösung statistisch nicht unterschiedliche FSC-Permeation (Tabelle 17), was bedeutet, dass die Wechselwirkungen der Einzelkomponenten CrEL und HTAP-β-CD mit FSC nicht dominiert haben. Da die Lag-time ebenfalls deutlich anstieg, scheinen die Effekte der Einzelkomponenten am Kornea-Epithel ebenfalls abgeschwächt zu sein, was genauso für ME-CD zutreffend ist. Beachtenswert ist zudem, dass durch Nephrophan® aus ME-ION im Gegensatz zu den anderen ME keine Lag-time ermittelt wurde, was ebenfalls für geringe Wechselwirkungen der Substanzen in der Donatorlösung spricht.

Kapitel-Zusammenfassung

↓76

Bei den Permeationsstudien mit dem hydrophilen FSC konnten sowohl Effekte der einzelnen Additiva an der biologischen Membran als auch Wechselwirkungen der Komponenten in der Donatorlösung, die bei den Nephrophan®-Versuchen zum Ausdruck kamen, festgestellt werden. Die Diskussion der wichtigsten Ergebnisse der FSC-Permeationsstudien lässt sich stichpunktartig folgendermaßen zusammenfassen:

4.3 Penetrationsstudien

4.3.1 Einführung

Im Gegensatz zur Permeation, die den Stoffdurchgang durch zwei Grenzflächen meint, beschreibt die Penetration den Stoffübergang einer Substanz von einer Phase durch eine Grenzfläche in eine zweite Phase [91].

↓77

Die im Folgenden beschriebenen Penetrationsstudien (vgl. Kap. 5.2.11) wurden durchgeführt, um das Verteilungsverhalten von AD bzw. TST zwischen Schweinekornea-Epithel bzw. Rindernasenmukosa und Inkubationsmedium zu erfassen. Die Penetrations- bzw. Permeationsrate einer Substanz sowie ihre Verteilungskoeffizienten für die Systeme Oktanol/ Wasser bzw. Donatorlösung/ Membran stehen in engem Zusammenhang [148] und können Hinweise auf die Absorption einer Substanz aus einer Formulierung geben.

Darüber hinaus kann eine Substanz während ihres Membrandurchtritts einem enzymatischen Abbau unterliegen, wodurch die entsprechende Verfügbarkeit dieser Substanz vermindert wird. Wie unter Kap. 5.2.10 beschrieben, war bei einigen Permeationsstudien mit AD durch Mukosa vor allem unter schwacher Agitation der Kammern ein Auftreten von TST im Akzeptorkompartiment zu konstatieren. Die physiologische Umwandlung des AD in TST erfolgt durch das Enzym 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase mit NADH + H+ als Redoxpartner und Coenzym. Für die Nasenschleimhaut sowie für mehrere Gewebe am Auge wurde eine Aktivität dieses Enzyms nachgewiesen [34, 139, 140], so dass anzunehmen ist, dass nach Applikation von AD vor und während der Absorption eine enzymatische Umwandlung in TST erfolgen kann. Für den Steroid-Metabolismus zusätzlich von Relevanz ist unter anderem die 5α-Reduktase, die TST und AD hauptsächlich in die Metaboliten 5αDihydroxytestosteron bzw. 5α-Androstandion umwandelt, was aber mit der hier angewandten Analytik nicht nachgewiesen wurde. Die beiden Testsubstanzen (AD und TST) konnten jedoch mittels HPLC parallel analysiert werden.

Am Beispiel des Kornea-Epithels wurde außerdem der Einfluss der drei ME (vgl. Tabelle 4) bzw. deren Einzelkomponenten HP-γ-CD, HTAP-β-CD, CrEL und PG auf die Gewebekonzentration des Wirkstoffs (AD bzw. TST) sowie den enzymatische Umsatz von AD zu TST und umgekehrt untersucht. Die Wirkstoffkonzentration wurde in allen Versuchen jeweils nach Inkubation des Gewebes (vgl. Kap. 5.2.11) im Überstand der zentrifugierten Probelösung bestimmt und mit dem Gewicht der einzelnen Gewebeprobe normiert.

4.3.2 Rindernasenmukosa

↓78

Die Mukosa enthält neben der 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (17β-HSD) eine Reihe weiterer Enzyme, die die Permeation einer Substanz beeinträchtigen können und somit eine Art zusätzliche „Barriere“ bilden [14]. Für Cytochrom P-450-Enzyme wurde sogar eine höhere Aktivität nachgewiesen als in der Leber [34]. Daraus muss jedoch prinzipiell keine schlechtere Resorption des betreffenden Wirkstoffs folgen. Für eine Reihe von Substanzen wurde nach nasaler Applikation eine absolute Bioverfügbarkeit von nahezu 100% nachgewiesen, so z.B. für Progesteron, Testosteron, Estradiol, Naloxon oder Propranolol [ 149]. Möglicherweise ist für diese Stoffe die Permeabilität so hoch, dass die Kontaktzeit mit der Membran bzw. deren Enzymen minimal ist. Anders verhält es sich beispielsweise bei der nasalen Resorption von Proteinen oder Peptiden, die zu einem beträchtlichen Anteil von Peptidasen oder Esterasen metabolisiert werden [150].

In Tabelle 18 sind die Ergebnisse für die Penetration und Metabolisierung von AD in Rindernasenmukosa angegeben. Die Wirkstoffkonzentration in der Lösung wurde mit dem jeweiligen Gewicht des inkubierten Gewebestücks normiert, so dass die dargestellten Werte keine Gewebekonzentrationen bedeuten, sondern die Konzentration im Überstand der Lösung angeben (vgl. Kap. 5.2.11.1).

Die Mukosa wurde in diesen Studien nicht zerkleinert, sondern, wie für die Permeationsstudien beschrieben (vgl. Kap. 5.2.10.1), gewonnen und als intakte Membran verwendet, so dass in den Zellen lokalisierte Enzyme möglicherweise nur partiell in die Lösung gelangen und mit dem Substrat in Kontakt kommen konnten. Andererseits ist zu erwarten, dass aufgrund der Diffusion des Wirkstoffs und seines Metaboliten sowohl ein intra- als auch extrazellulärer Umsatz stattfindet. Für die 17β-HSD wurde zudem eher eine Lokalisierung an der Gewebeoberfläche gefunden [43].

↓79

Tabelle 18: Penetration und Metabolisierung von AD aus EBS in Mukosa

Ausgangsmenge [µg/ml•mg Gewebe] a

AD [µg/ml•mg Gewebe] b

TST [µg/ml•mg Gewebe] b

0,749 ± 27,1

0,757 ± 0,225
[101,1%]

0,034 ± 0,019
[4,5%]

a Mittelwert ± relativer Fehler [%], n = 10 b Mittelwert ± SD, n = 10,
Prozent der Ausgangskonzentration in eckigen Klammern

In diesem Versuch wurde praktisch die eingesetzte Gesamtmenge an AD vollständig im Zentrifugat wiedergefunden (Tabelle 18), so dass sowohl eine Verteilung ins Gewebe als auch ein enzymatischer Umsatz zu weiteren Metaboliten allenfalls in sehr geringem Maße stattgefunden hat. Abweichungen der AD-Wiederfindungsrate über 100% der Ausgangs-Konzentration resultieren aus der Normierung der Werte mit dem Gewebegewicht und anschließender Mittelwertbildung.

Tabelle 19: Penetration und Metabolisierung von TST aus EBS in Mukosa

Ausgangskonz. [µg/ml•mg Gewebe] a

TST [µg/ml•mg Gewebe] b

AD [µg/ml•mg Gewebe] b

0,600 ± 33,9

0,687 ± 0,324
[114,5%]

0,037 ± 0,015
[6,2%]

a Mittelwert ± relativer Fehler [%], n = 10 b Mittelwert ± SD, n = 10,
Prozent der Ausgangskonzentration in eckigen Klammern

↓80

Ein Vergleich mit den Permeationsergebnissen aus Kap. 4.2.3.1 zeigt, dass AD aus EBS ohne Verzögerung durch die Mukosa permeierte und annähernd der gleiche Peff-Wert resultierte wie bei der Porendiffusion durch Nephrophan®, was theoretisch einen nahezu ungehinderten Durchtritt des AD durch die Mukosa bedeutet. Es wird daher vermutet, dass sich während des Penetrationsversuches innerhalb kurzer Zeit die Konzentration von AD im Gewebe im Gleichgewicht mit der Lösungskonzentration befindet. Eine Wiederfindung von nahezu 100% bedeutet daher vermutlich nicht, dass die Membran kein Lösungsvermögen für die Substanz aufweist, sondern eher dass keine Kumulation bzw. Adsorption im oder am Gewebe stattfindet.

Entsprechend der unter Kap. 5.2.11.1 beschriebenen Versuchsanordnung wurde zudem der AD-Gehalt in den Gewebestücken bestimmt und eine mittlere Konzentration von 0,041 µg/mg Gewebe ± 28,0% gefunden. Bei dieser Versuchsreihe war in keiner der Proben (n = 10) TST zu detektieren, so dass möglicherweise ein zytosolischer Umsatz von AD auszuschließen ist, vermutlich aber die Konzentration an TST im Gewebe unter der Nachweisgrenze (vgl. Kap. 5.2.1.1) lag.

Die Penetration und Metabolisierung von TST zu AD in der Rindernasenmukosa ergab vergleichbare Werte, die in Tabelle 19 aufgelistet sind.

↓81

Die Permeation von TST durch Mukosa war signifikant geringer als der AD-Durchtritt (vgl. Tabelle 16), lag aber wiederum in einer ähnlichen Größenordnung wie durch Nephrophan®. Es wird daher vermutet, dass TST ein ähnliches Penetrationsverhalten zeigt, wie es für AD diskutiert wurde (s. oben!) und in dieser Versuchsanordnung einer mit dieser Substanz vergleichbaren Metabolisierung durch 17β-HSD unterliegt.

4.3.3 Schweinekornea-Epithel

Für die Studien an Schweineaugen wurde lediglich das lipophile Epithel der Kornea genutzt, da eine Verteilung des Arzneistoffs primär zwischen der applizierten Lösung bzw. Formulierung und dieser Schicht stattfindet. Eine potentielle enzymatische Metabolisierung während einer Arzneistoffpermeation ist ebenfalls verstärkt im Epithel zu vermuten.

Das Stroma macht ca. 90% der Kornea insgesamt aus, ist aber nur zu 10% aus zellulären Bestandteilen aufgebaut, so dass sein Anteil an Enzymen als bedeutungslos erachtet werden kann [13]. Das Endothel zeigt wesentlich geringere Aktivitäten für NADPH-abhängige Enzyme, wie beispielsweise die Glutathionreduktase und die Isocitratdehydrogenase, als das Epithel [13], so dass auch für die NAD-abhängige 17β-HSD eine niedrigere Aktivität zu erwarten ist, und diese Gewebeschicht in den vorliegenden Studien nicht berücksichtigt wurde. Das Kornea-Epithel kam als Gewebehomogenat zur Anwendung (vgl. Kap. 5.2.11.2), da es nicht als zusammenhängende Schicht gewonnen werden konnte. Entsprechend dieser Versuchsdurchführung war ein höherer enzymatischer Umsatz zu erwarten als bei einer Passage der Substanz durch die Membran, da sich vermehrt Enzyme aus dem Zellinneren in Lösung befinden [31].

↓82

In den nachfolgenden Tabellen (Tabelle 20 und 21) sind die jeweilige Penetration und Metabolisierung von AD bzw. TST im Kornea-Epithel aufgeführt, wobei die analytische Erfassung der beiden Wirkstoffe wiederum als Restkonzentration in der zentrifugierten Lösung erfolgte. Darüber hinaus wurden die AD- bzw. TST-Verteilung und Metabolisierung am Kornea-Epithel aus den drei ME sowie deren Einzelkomponenten in EBS-Puffer (HP-γ-CD, HTAP-β-CD, CrEL, PG) untersucht. Die Wirkstoffkonzentration in der Lösung wurde hier ebenfalls mit dem jeweiligen Gewicht des inkubierten Gewebehomogenats normiert, so dass die dargestellten Werte wiederum keine Gewebekonzentrationen bedeuten.

Tabelle 20: Penetration und Metabolisierung von AD im Kornea-Epithel

Testlösung

Ausgangskonz. a [µg/ml•mg Gewebe]

AD b [µg/ml•mg Gewebe]

TST b [µg/ml•mg Gewebe]

EBS

0,40 ± 6,5

0,114 ± 0,012
[28,5%]

0,0045 ± 0,0007
[1,1%]

HP-γ-CD (9%)

0,54 ± 6,7

0,375 ± 0,026**
[69,4%]

0,0042 ± 0,0003
[0,8%]

HTAP-β-CD (9%)

0,51 ± 11,9

0,299 ± 0,038**
[58,6%]

0,0042 ± 0,0006
[0,8%]

CrEL (20%)

0,41 ± 15,4

0,408 ± 0,025**
[99,5%]

0,0068 ± 0,0069
[1,7%]

PG (9%)

0,45 ± 6,0

0,140 ± 0,021
[31,1%]

0,0095 ± 0,0030
[2,1%]

ME-CD

0,43 ± 4,8

0,427 ± 0,111**
[99,3%]

0,0135 ± 0,0127
[3,1%]

ME-ION

0,59± 8,9

0,523 ± 0,028**
[88,6%]

0,0071 ± 0,0025
[1,2%]

ME-PG

0,40 ± 7,9

0,382 ± 0,043**
[95,5%]

0,0141 ± 0,0016
[3,5%]

a Mittelwert ± relativer Fehler [%], n = 5 b Mittelwert ± Standardabweichung, n = 5
signifikant (** p<0,01) zum EBS-Wert
Prozent von der Ausgangskonzentration in eckigen Klammern

Bei einem Vergleich der EBS-Werte in Tabelle 20 bzw. Tabelle 21 mit Tabelle 18 bzw. Tabelle 19 fällt auf, dass die kornealen Wiederfindungsraten sehr viel geringer sind als bei Mukosa und die Umwandlung von TST in AD im Kornea-Epithel in sehr viel höherem Maße stattfand als in Rindernasenschleimhaut. Bei beiden Geweben wurde ein Umsatz von AD zu TST von 4 – 4,5% der wiedergefundenen Arzneistoffgesamtmenge detektiert, während die Metabolisierung von TST zu AD im Kornea-Epithel 50% der wiedergefundenen Gesamtmenge gegenüber nur 5% in der Rindernasenmukosa betrug.

↓83

Tabelle 21: Penetration und Metabolisierung von TST im Kornea-Epithel

Testlösung

Ausgangskonz. a [µg/ml•mg Gewebe]

TST b [µg/ml•mg Gewebe]

AD b [µg/ml•mg Gewebe]

EBS

0,39 ± 8,4

0,058 ± 0,0136
[14,9%]

0,055 ± 0,010
[14,1%]

HP-γ-CD (9%)

0,47 ± 8,5

0,452 ± 0,0350**
[96,2%]

0**
[0%]

HTAP-β-CD (9%)

0,44 ± 4,7

0,391 ± 0,0226**
[88,9%]

0**
[0%]

CrEL (20%)

0,43 ± 7,7

0,372 ± 0,0298**
[86,5%]

0,044 ± 0,0264
[10,2%]

PG (9%)

0,38 ± 7,5

0,092 ± 0,0128
[24,2%]

0,051 ± 0,0052
[13,4%]

ME-CD

0,38 ± 7,8

0,387 ± 0,0408**
[101,8%]

0,060 ± 0,0317
[15,8%]

ME-ION

0,39 ± 12,5

0,396 ± 0,06**
[101,5%]

0,037 ± 0,0301
[9,5%]

ME-PG

0,38 ± 9,1

0,377 ± 0,0766**
[99,2%]

0,026 ± 0,0267
[6,8%]

a Mittelwert ± relativer Fehler [%], n = 5 b Mittelwert ± Standardabweichung, n = 5,
signifikant (* p<0,05;** p<0,01) zum EBS-Wert des betreffenden Gewebes
Prozent von der Ausgangskonzentration in eckigen Klammern

Die Daten für das Kornea-Epithel zeigen Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Ploc et al. [142], die für Rinderkornea-Epithel einen Umsatz von TST in AD zu 48,3% und umgekehrt von AD in TST lediglich zu 9,8% der wiedergefundenen Menge ermittelten. Die Autoren begründen diese unterschiedlichen Metabolismusraten nicht weiter. Möglicherweise sind ein begrenztes Coenzym-Angebot oder parallel ablaufende anderweitige Redox-Prozesse, die den Oxidationsvorgang am TST begünstigen, unter In-vitro-Verhältnissen für diesen Unterschied verantwortlich, wobei jedoch in der Regel steroidhydroxylierende Systeme eine hohe Substrat- und Wirkungsspezifität aufweisen [151].

Die im Kornea-Epithel gegenüber Mukosa deutlich reduzierten Wiederfindungsraten können ein gutes Lösungsvermögen des Kornea-Epithels für die beiden Testhormone andeuten, sind jedoch unter den gewählten Versuchsbedingungen vermutlich eher auf die Zerstörung der kornealen Gewebestrukturen und eine damit einhergehende verstärkte Adsorption von AD bzw. TST an Zellbestandteile oder zytosolische Substanzen zurückzuführen.

↓84

Die zugesetzten Hilfsstoffe, mit Ausnahme von PG bei AD als Substrat, sowie die ME-Systeme verminderten verglichen mit Puffer die Verteilung von AD bzw. TST in das Gewebe (Tabelle 20 und 21) und bewirkten einen deutlichen Anstieg der wiedergefundenen Arzneistoffgesamtmenge im Zentrifugat. Dieses Verteilungsverhalten steht im Einklang mit den Resultaten der Permeationsstudien (vgl. Kap. 4.2.3.1), in denen jeglicher Zusatz zur Donatorlösung eine verminderte AD-Permeationsrate zur Folge hatte (s. Tabelle 10-14), sowie partiell mit dem für AD gemessenen Verteilungskoeffizienten (vgl. Kap. 4.1.4.1), der durch CD-Zugabe vermindert wurde. Ein verminderter Durchtritt von AD durch die Kornea unter dem Einfluss der getesteten Additiva und ME könnte demnach durch eine herabgesetzte Verteilung des Arzneistoffs in das Epithel verursacht werden.

Bei Zufügung von HP-γ-CD bzw. HTAP-β-CD zum EBS-Inkubationsmedium verblieb verglichen mit der EBS-Referenz ein deutlich höherer Anteil der jeweiligen Ausgangsverbindung (AD bzw. TST) in der Lösung, während die Konzentration des betreffenden Metaboliten in beiden Fällen sank (Tabelle 20 und 21). Die Verminderung sowohl der Penetration als auch der Metabolisierung von AD bzw. TST ist für beide Substanzen mit einem Einschluss in die jeweilige CD-Kavität zu erklären, der für AD in dieser Arbeit nachgewiesen wurde (vgl. Kap. 4.1.4.3).

Da der Rückgang des Umsatzes von TST unter Zugabe beider CD sehr viel deutlicher war als der von AD - in reiner Puffer-Lösung lag die Hälfte an gemessenem TST metabolisiert als AD vor (Tabelle 21) - wird angenommen, dass die relevante funktionelle Gruppe des TST (OH-Gruppe an C17) sowohl durch HP-γ-CD als auch durch HTAP-β-CD besser abgeschirmt wurde als die Keto-Gruppe des AD und für das entsprechende Enzym nicht mehr zugänglich war. Das wäre beispielsweise durch eine höhere Komplexstabilitätskonstante des TST/CD-Komplexes erklärbar, oder aber durch einen räumlich anders orientierten Einschluss der Moleküle AD bzw. TST. Brewster et al. [I_Ref47197235">56] fanden beispielsweise für eine Inkludierung durch HP-β-CD von Pregnanolon und Pregnenolon, die sich lediglich durch eine Doppelbindung in Ring B des Steroidgerüstes unterscheiden, deutlich verschiedene Komplexstabilitätskonstanten von 4760 mol-1 und 9000 mol-1.

↓85

Ein Zusatz von PG zum Inkubationsmedium bewirkte für TST als Substrat einen nicht signifikanten Anstieg der Wiederfindungsrate (Tabelle 21), was für den AD-Versuch nicht zutrifft (Tabelle 20). Möglicherweise begünstigt die zusätzliche OH-Gruppe am C17 (vgl. Abb. 6 und 7) eine Hydrotropisierung durch PG, wodurch mehr TST in Lösung verbleibt. Eine allgemeine Verwendung von PG als Lösungsvermittler ist bekannt [26]. Aufgrund dieses selektiven Effektes wäre denkbar, dass in PG/EBS bei quantitativ gleicher Metabolisierungsrate von TST zu AD die Konzentration an Substrat (TST) in der Lösung anstieg. Bezogen allerdings auf die Gesamt-Wiederfindungsrate nahm die Metabolisierung von TST zu AD verglichen zum EBS-Wert ab. Im Falle von AD als Substrat (Tabelle 20) hatte PG weder auf dessen Metabolisierung noch auf die detektierte Substratmenge Einfluss, was wiederum mit dem ermittelten Oktanol-Verteilungskoeffizienten unter PG-Zusatz korreliert (vgl. Kap. 4.1.4.1).

Das in hypermizellarer Konzentration eingesetzte Tensid CrEL ist in der Lage, Wirkstoffe sowie auch lipophile Gewebebestandteile in seine Mizellen aufzunehmen. In Übereinstimmung damit ließen sich bei Addition der Substrat- und Metabolitkonzentration nahezu 100% der eingesetzten Arzneistoffmenge nach Inkubation detektieren, wobei die Konzentration an jeweiligem Metaboliten näherungsweise in der Größenordnung der Referenz (EBS-Wert) lag. In diesem Fall muss, anders als bei den CD, von einer verminderten Umsatzrate ausgegangen werden, da sicher kein selektiver Mizelleinschluss der beiden Substanzen erwartet werden kann. Durch den mizellaren Einschluss des jeweiligen Substrats wird höchstwahrscheinlich der Enzym/Substrat-Kontakt erschwert [14] und somit der Umsatz zumindest zeitlich verzögert, was jedoch aufgrund der gleichbleibenden Inkubationszeit von 90 min nicht erfasst werden konnte. Für andere oberflächenaktive Substanzen, die als Permeations-Enhancer eingesetzt werden, wie beispielsweise Gallensäuresalze, wird vermutet, dass eine gefundene Steigerung der Permeationsrate zumindest teilweise auf einer Inhibierung bestimmter Enzyme beruht [14], wobei der genaue Mechanismus noch ungeklärt ist.

Die ME-Systeme verhinderten in beiden Versuchsreihen weitgehend eine Verteilung der Wirksubstanz ins Gewebe, so dass für ME-CD bzw. ME-PG in der Summe die eingesetzte Menge Arzneistoff, allerdings besonders bei TST mit einem hohen Fehler behaftet, nach der Inkubation wiedergefunden wurde. Für AD aus ME-ION lag die Wiederfindung mit 90% etwas niedriger. Dieser Befund korreliert gut mit den kornealen Permeationsergebnissen (vgl. Tabelle 12) und kann wiederum eine Erklärung für die verminderten Peff darstellen. Die Metabolisierungsrate war differenziert für die beiden Arzneistoffe sowie drei ME und folgt dem Verhältnis EBS : ME-ION : ME-PG : ME-CD für AD = 1:1:3:3 und für TST = 1:0,7:0,5:1. Der enzymatische Umsatz wird demnach nicht prinzipiell in den ME unterbunden, sondern von den jeweiligen Verteilungsverhältnissen und/oder inneren Strukturen der ME-Systeme determiniert und teilweise retardiert.

Kapitel-Zusammenfassung

↓86

Zusammenfassend kann zu den Penetrations- und Metabolisierungsstudien Folgendes gesagt werden:

Abschließend sollte einschränkend angemerkt werden, dass mit diesen Untersuchungen nicht entschieden werden kann, ob eine niedrige Wiederfindungsrate im Überstand tatsächlich auf eine Arzneistoff-Verteilung in das Gewebe zurückzuführen ist oder ob weitere Metabolite durch enzymatischen Abbau entstanden sind, die mit Hilfe der eingesetzten Analytik nicht detektierbar waren.

4.4 In-vivo-Studien

↓87

Im Gegensatz zur lokalen okularen Anwendung des AD als potentielles Tränenstimulans ist es das Ziel einer nasalen AD-Applikation, eine systemische Wirkung zu erreichen. Die drei ME-Systeme zeigten ein akzeptables Lösungsvermögen für AD (vgl. Kap. 4.1.4.2), das ein Erreichen der therapeutischen Dosis (ca. 7 mg [50]) nach nasaler Gabe zumindest im Fall von ME-CD ermöglichen könnte. Zudem wurden zumindest aus ME-CD und ME-PG in den In-vitro-Permeationsstudien (vgl. Kap. 4.2.3.1.3) im Vergleich zu EBS kaum reduzierte Durchtrittsraten für AD ermittelt. Um die ME hinsichtlich ihrer Eigenschaften als Trägerformulierungen zur nasalen Anwendung weitergehend zu prüfen, wurden In-vivo-Versuche an Kaninchen durchgeführt (vgl. Kap. 5.2.12). Da die Mukosa von Kaninchen eine dem Menschen ähnliche Struktur aufweist [48], können aus Kaninchenversuchen erste Vorhersagen zur Anwendbarkeit als humanes Arzneimittel getroffen werden.

Die Studien von Ko et al. [ 152], in denen Plasmaspiegel von Kaninchen nach nasaler Gabe TST enthaltender Emulsionen detektiert wurden, konnten zur Orientierung herangezogen werden: nach einer Gabe von 3,8 mg TST/Tier konnten absolute Bioverfügbarkeiten von ca. 40 - 50% ermittelt werden. Um diese Konzentrationsverhältnisse zu erreichen und damit eine Analytik mittels HPLC zu ermöglichen, müsste für die vorliegenden Studien bei einer Verteilung der Applikationsdosis auf maximal 5 Sprühstöße pro Tier (ein Sprühstoß ca. 50 µl) in der Ausgangslösung eine Konzentration von ca. 15 mg/ml vorliegen. Aufgrund der schlechten Löslichkeit des AD (vgl. Kap. 3.4.1) waren durch Lösen in den ME-Systemen sowie in einer 9%igen HP-γ-CD-Lösung AD-Konzentrationen im Bereich von 4 - 14 mg/ml (vgl. Kap. 4.1.4.2) zu erzielen. Der Vergleich mit einer Puffer-Referenzlösung konnte nicht durchgeführt werden, da EBS für AD lediglich eine Sättigungslöslichkeit von 66 µg/ml aufweist. Bei Verwendung von radioaktiv-markierten Substanzen können aufgrund einer sehr viel empfindlicheren Analytik deutlich geringere Mengen im Plasma detektiert werden. Diese Methode konnte jedoch wegen fehlender Voraussetzungen nicht zur Anwendung gelangen. Die ermittelten Plasmakonzentrationen sind in Abb. 14 über die Zeit aufgetragen. Ein Vergleich mit einer i.v.-Gabe des Arzneistoffs wurde nicht durchgeführt.

Abb. 14: Plasma-Zeit-Profile nach nasaler Applikation unterschiedlicher AD-Formulierungen an Kaninchen

↓88

Bei der Durchführung der Versuche stellte sich die Arzneistoffextraktion aus den Plasmaproben als äußerst problematisch dar. Die Wiederfindungsversuche (vgl. Kap. 5.2.12) konnten lediglich anhand von Schweineplasma durchgeführt werden und ergaben anfänglich im relevanten Konzentrationsbereich unrealistisch hohe Werte. Da vermutlich eine Assoziation von AD mit Plasma-Lipoproteinen [137] oder anderen Plasmabestandteilen die hohen Konzentrationen verursachte, wurde versucht, durch eine zwischengeschaltete Festphasen-Extraktion (solid phase extraction, SPE) den Wirkstoff zu trennen [ 153, 154]. Aufgrund der aufwändigeren Analytik, die mit einem größeren Arzneistoffverlust einherging, und der maximal erlangten AD-Konzentrationen in den applizierten Formulierungen von lediglich 3,6 mg/ml für ME-PG, 5,7 mg/ml für ME-CD, 6,8 mg/ml für HP-γ-CD und 8,1 mg/ml für ME-ION, lagen die ermittelten Plasmakonzentrationen alle unterhalb der Bestimmungsgrenze der HPLC-Methode (vgl. Kap. 5.2.1) und können daher lediglich zur Orientierung dienen. Möglicherweise wurde auch aus diesem Grund kein TST in den Proben gefunden; allerdings ist auch nicht unbedingt ein enzymatischer Umsatz der Substanz nach nasaler Gabe zu erwarten [153].

Die Zubereitungen ME-ION und ME-PG ergaben tendenziell höhere Plasmakonzentrationen als ME-CD und HP-γ-CD und wiesen ein Maximum nach ca. 20 min auf. Diese Ergebnisse korrelieren teilweise mit den oben erwähnten Messungen von Ko et al. [156], die Maxima nach 20 min sowie höhere Plasmaspiegel nach Verabreichung aus einer positiv oder negativ geladenen Submikronemulsion gegenüber einer nicht ionischen Formulierung fanden. Stuenkel et al. [155] ermittelten ebenfalls Maxima bei 20 min für humane Plasmaspiegelkurven von AD und TST nach Gabe von Sublingualtabletten.

Ein Vergleich mit den In-vitro-Permeationen aus Kap. 4.2.3.1 zeigt eine vorsichtige Übereinstimmung der Ergebnisse insofern, dass für Rindernasenmukosa aus ME-PG ein tendenziell höherer Peff gemessen wurde als aus HP-γ-CD. Das Resultat der ME-CD-Permeation war vergleichbar mit dem Wert aus ME-PG und ergibt somit keine Parallele zu den In-vivo-Studien. Die Zubereitung ME-ION wurde in vitro nicht getestet. Allerdings scheinen auch unter In-vivo-Bedingungen die einzelnen Trägersysteme möglicherweise individuelle Effekte auf die Arzneistoffresorption auszuüben, was sich bereits in den Permeations- sowie Penetrationsstudien (vgl. Kap. 4.2.3.1 und 4.3) in ähnlicher Weise abzeichnete. Einschränkend muss zu einem Vergleich der Permeations- und In-vivo-Studien angemerkt werden, dass die Plasmakonzentrationen nicht nur von der Arzneistoffabsorption, sondern ebenso von der Verteilung der Substanz im Organismus sowie deren Metabolisierung und Elimination abhängen.

↓89

In Gegenüberstellung zu der oben zitierten Arbeit von Ko et al. [156] fanden Hussain et al. [156] in ihren Studien eine 90 – 99%ige absolute Bioverfügbarkeit nach nasaler Gabe von radioaktiv markiertem TST in einer Tween 80/ Puffer-Lösung an Ratten. In einer weiteren Untersuchung ermittelte die gleiche Gruppe [4] nahezu identische AUC-Werte nach intra-venöser bzw. nasaler Gabe eines TST-Prodrug (Testosteron-17β-N,N-Dimethylglycinat• Hydrochlorid). Demnach ist auch für das lipophile AD eine relativ hohe Bioverfügbarkeit nach nasaler Applikation zu erwarten, sofern die Freigabe aus der Formulierung nicht der limitierende Faktor ist. Für HP-γ-CD und ME-CD ist aufgrund des Einschlusses in die CD-Kavität (vgl. Kap. 4.1.4.3) zumindest mit starker zeitlicher Verzögerung der Liberation zu rechnen, wofür auch die Daten in Abb. 14 sprechen, so dass möglicherweise der Abtransport der Formulierung vom Applikationsort schneller erfolgt als die Resorption des Arzneistoffs.

Zur Beurteilung der physiologischen Verträglichkeit der Formulierungen ist zu sagen, dass nach Applikation und am Versuchsende bei den Tieren keinerlei Reaktionen, wie Niesen, Ausfluss von Nasenschleim, erschwerte Atmung oder sonstige Verhaltensänderungen, die auf eine Beeinträchtigung der Nasenfunktion schließen lassen, zu beobachten waren. Es kann daher angenommen werden, dass die Zubereitungen gut verträglich sind, wobei weitere systematische Untersuchungen diese Annahme bestätigen müssen.

4.5 Biophysikalische Untersuchungen

Um die Kornea als Applikationsort und die neuen ME als Trägersysteme anwendungsbezogen zu charakterisieren, wurden weiterführende Versuche unternommen. Da AD am Auge als potentieller Wirkstoff beim Sicca-Syndrom diskutiert wird [10], ist die Wirkung der Trägerformulierung auf den Tränenfilm und vor allem auf die Lipidschicht des Tränenfilms von besonderem Interesse (vgl. Kap. 3.1.2). Darüber hinaus kann zur Behandlung der Symptome bei günstigen Effekten auch eine Anwendung der arzneistofffreien Formulierung indiziert sein. Um daher diese Wechselwirkungen näher zu untersuchen, erfolgten Messungen am Langmuir-Trog [91]. Hierbei können Oberflächenphänomene einer gespreiteten Substanz bzw. Interaktionen zwischen den Inhaltsstoffen der Subphase und dieser Substanz detektiert werden.

4.5.1  Theoretische Grundlagen

↓90

Wie bereits in Kap. 3.1.2 beschrieben, ist der Tränenfilm des gesunden Auges mehrschichtig aufgebaut. Direkt auf dem Epithel der Hornhaut über eine Glykokalix verankert liegt die gelartige und widerstandsfähige Muzinschicht [21, 22]. Darüber folgt eine hydratisierende wässrige Schicht, und auf deren Oberfläche schwimmt abschließend eine Lipidschicht, die normalerweise ein Verdunsten des Tränenfilms verhindert. Die Bestandteile dieses Lipidfilms werden in den Meibom’schen Drüsen gebildet, die am unteren und oberen Lidrand verteilt sind, jeweils am Übergang von der Haut des äußeren Augenlides zum Konjunktiva-Epithel (Abb. 15).

Das Meibom’sche Drüsensekret (MGS) wird in den elastischen Drüsengängen gesammelt, durch den Lidschlag herausgedrückt und über den Augapfel verteilt [I_Ref44840954">23, 157]. Dabei entsteht ein 8–10 nm dicker Film [158], der in der menschlichen Tränenflüssigkeit eine Konzentration von 131,2 µg/ml ausmacht [29].

Abb. 15: Schematischer Querschnitt durch eine Meibom’sche Drüse im oberen Augenlid sowie durch den vorderen Augenabschnitt; nach [159]

↓91

Ist das Meibom-Sekret in seiner Menge oder Zusammensetzung verändert, hat das direkten Einfluss auf den gesamten Tränenfilm. Ein Aufreißen oder Fehlen der Lipidschicht wird als die mögliche Hauptursache für das Syndrom des „Trockenen Auges“ diskutiert, da unter diesen Bedingungen kein ausreichender Verdunstungsschutz für die darunter liegende wässrige Schicht mehr gegeben ist [160, 161]. Aus der Literatur konnten einige physikalisch-chemische Parameter des MGS entnommen werden, die in Tabelle 22 aufgeführt sind.

Tabelle 22: Physikalisch-chemische Parameter des MGS (vgl. auch Tabelle 1)

Brechungsindex

 

Viskosität bei 35 °C

9,7 – 19,5 Pa•s [23]

Schmelzbereich

19,5 – 32,9 °C [23]

Oberflächenspannung der Tränen

43,6 – 46,6 mN/m [27]

Bei der Wertung dieser Daten ist allerdings zu berücksichtigen, dass für die entsprechenden Messungen jeweils nur sehr geringe Mengen an Sekret zur Verfügung stehen und die statistische Absicherung schwierig ist. Da die MGS-Schicht ein aus einer Vielzahl an Lipidkomponenten, hauptsächlich polare Wachse, Sterolester und Phospholipide [23], zusammengesetzter Monolayer [173] mit zum Teil oberflächenaktiven Eigenschaften ist [162, 163], lässt sie sich andererseits im Labormaßstab nicht zufriedenstellend synthetisieren. Gefragt sind also Messmethoden, die mit sehr geringen Mengen an Substanz reproduzierbare Ergebnisse liefern.

↓92

Bei Versuchen am Langmuir-Trog können partiell die physiologischen Bedingungen am Auge nachempfunden werden, indem MGS als sehr dünner Film (Monolayer) auf eine wässrige Subphase aufgetragen und dann mit Hilfe einer beweglichen Barriere komprimiert und wieder expandiert wird. Für die Applikation (Spreitung) dieses Films sind nur sehr geringe Substanzmengen (ca. 10 –100 µg) erforderlich. In Abb. 16 ist der Vorgang der Komprimierung amphiphiler Moleküle eines Oberflächenfilms skizzenhaft dargestellt.

Abb. 16: Skizze eines Langmuir-Trogs: Amphiphile Moleküle vor (links) und nach (rechts) beendeter Komprimierung durch eine bewegliche Barriere

Kawaguchi [164] spreitete in seinen Versuchen zunächst die Gesamt-Tränen auf einer isotonen Pufferlösung im Langmuir-Trog. Dabei konnte durch Bestäuben mit Talkum ein Oberflächenfilm nachgewiesen werden, der Eigenschaften eines Monolayers zeigte.

↓93

Jaeger et al. [ 165] untersuchten MGS an einem automatisierten Langmuir-Trog und zeichneten simultan Oberflächendruck und –potential auf. Diese Versuche wurden von Kaercher et al. [ 166 - 167, 168 169] weitergeführt und darüber hinaus optimiert, indem der Film während der Messung durch ein Brewsterwinkel-Mikroskop (Brewster angle microscope, BAM, vgl. Kap. 5.2.13) beobachtet wurde [ 170 - 171 172]. Im Rahmen dieser Studien wurden auch Versuche mit MGS von Patienten mit Keratoconjunctivitis sicca („Trockenes Auge“) bzw. Meibomitis durchgeführt [172, 177]. In beiden Fällen war eine Veränderung des Spreitverhaltens von MGS festzustellen.

Kritisch muss bei diesem Modell allerdings angemerkt werden, dass die physiologischen Mengenverhältnisse am Auge nicht simuliert werden und darüber hinaus der einzelne Lidschlag weitaus schneller erfolgt als die Kompression mittels der installierten Barriere. Jedoch können die Eigenschaften des MGS als Lipidfilm charakterisiert und Wechselwirkungen mit Formulierungsbestandteilen deutlich gemacht werden.

Weitere Anwendungsgebiete dieser Methode sind vor allem Strukturanalysen von Monolayern, bestehend beispielsweise aus Tensiden [173] oder Bestimmungen des Diffusionsverhaltens von Substanzen aus einer Subphase an die Oberfläche [174].

4.5.2 Ergebnisse

↓94

In diesem Abschnitt wurde der Einfluss der ME und ausgewählter Bestandteile auf das Meibom’sche Drüsensekret (MGS) untersucht, vor allem im Hinblick auf Anwendbarkeit dieser Trägersysteme am Auge. Dazu wurde MGS im Langmuir-Trog auf eine wässrige Subphase gespreitet, der jeweils die ME bzw. deren Einzelkomponenten (vgl. Tabelle 4) zugesetzt waren. Während der Messung wurden kontinuierlich Oberflächendruck (Schub, π[mN/m]) und –potential [mV] aufgezeichnet. Darüber hinaus wurde die Oberflächenbeschaffenheit durch ein Brewsterwinkel-Mikroskop (BAM) beobachtet und über eine Kamera fixiert. Der Versuchsaufbau ist detailliert in Kap. 5.2.13 abgebildet und beschrieben.

Im Folgenden werden in erster Linie die detektierten BAM-Bilder interpretiert, da die beiden Parameter Schub und Oberflächenpotential bei komplex aufgebauten bzw. inhomogenen Oberflächenfilmen, wie sie in diesen Messungen zu erwarten waren, schwer auszuwerten sind. Alle Bilder zeigen den gleichen Flächenausschnitt, jedoch bei unterschiedlichem Komprimierungsgrad der Gesamtfläche, der jeweils in der Abbildungsbeschriftung angegeben ist. Eine Komprimierung von 100% bedeutet hier eine Verkleinerung der Fläche auf 115 cm², die aufgrund des Versuchsaufbaus maximal zu erreichen war (vgl. Kap. 5.2.13), eine Expansion von 100% analog dazu eine Fläche von 353 cm², was der Troggesamtoberfläche entspricht.

4.5.2.1  Spreitung von MGS auf Wasser/Puffer

Wie bereits berichtet (vgl. Kap. 4.5.1), haben Kaercher et al. [170 - 177] schon früher umfangreiche Untersuchungen an MGS im Langmuir-Trog durchgeführt, so dass hinsichtlich Methodik und informativer Abbildungen auf diese verwiesen werden kann. Zur Interpretation der hier durchgeführten Messungen werden jedoch zwei BAM-Bilder, die MGS auf Wasser bzw. auf EBS gespreitet zeigen (Abb. 17 und Abb. 18), wiedergegeben.

↓95

Abb. 17: MGS (10 µg) auf Wasser bei 76% Komprimierung (A=173 cm²)5

Die Oberfläche der jeweiligen Subphase erschien in der Regel ohne gespreitetes Material in der BAM-Betrachtung gleichmäßig dunkel. Dies bedeutet jedoch nicht in jedem Fall, dass kein Oberflächenfilm vorhanden ist, sondern dass aufgrund der unzureichenden Filmdicke bzw. der Molekülanordnung keine ausreichende Reflexion des Laserlichts erfolgt. Erst bei einer Filmdicke über 2 nm wird das einfallende Laserlicht in ausreichender Intensität reflektiert.

In Abb. 17 ist eine MGS-Scholle zu sehen, die in lockeren oder etwas dichter gepackten Verbänden auf der dunkel erscheinenden Trogoberfläche schwamm. Selbst vollständige Komprimierung ergab in diesem Fall keinen gleichmäßig reflektierenden Film. Während der Komprimierung konnte zudem mittels BAM eine Drift der MGS-Schollen beobachtet werden, so dass angenommen werden muss, dass die dunklen Bereiche die unbelegte Subphasenoberfläche darstellen oder von einem sehr mobilen Film (gas-analog) belegt sind.

↓96

Abb. 18 dagegen zeigt einen sehr dichten, unbeweglichen MGS-Film, der nahezu den gesamten Bildausschnitt bedeckt und aufgrund seiner Dicke sehr hell erscheint. Die erhöhte Konzentration von 60 µg MGS führte also zur Bildung eines zusammenhängenden, homogenen Films. Diese Messung erfolgte auf EBS-Puffer als Subphase, um einen Elektrolyt-Einfluss auf die Filmeigenschaften festzustellen, der aber in diesem Fall und ebenso in weiteren Versuchen mit CrEL- und IPM-Filmen vernachlässigbar war, sowohl hinsichtlich der BAM-Bilder als auch der Daten von Schub und Oberflächenpotential.

Abb. 18: MGS (60 µg) auf EBS bei 98% Komprimierung (A=119 cm²)

Der Einsatz einer derart niedrigen Konzentration (hier 10 µg), bei der sich kein homogener Film bildet (vgl. Abb. 17), ist genau genommen bei dieser Messanordnung zur Charakterisierung eines Oberflächenfilms nicht sinnvoll. Für die weiteren Versuche mit Adjuvantien hatte sich jedoch eine Konzentration von 10 µg MGS als ausreichend erwiesen, da Wechselwirkungen zwischen MGS und den verschiedenen Zusätzen zur Subphase untersucht werden sollten, die zum Teil einen starken Schubanstieg, gleichbedeutend mit einer Oberflächenbelegung, bereits zu Beginn der Messungen zur Folge hatten.

4.5.2.2 Subphasen-Zusatz: Cremophor®EL

↓97

Abb. 19: MGS (10 µg) auf CrEL (0,1 % in Wasser) bei 29% Komprimierung (A=284 cm²)

Abb. 19 zeigt vermutlich einen MGS-Rest in einem dichten Film aus Lipiden des MGS und CrEL, das zu 0,1% im Wasser der Subphase gelöst wurde. Vor dem Applizieren des MGS erschien die Oberfläche der CrEL/Wasser-Subphase dunkel (s. oben!).

Um den Einfluss des CrEL auf den MGS-Film zu konkretisieren, wurden in einem anderen Versuch ohne BAM-Beobachtung 20 µg CrEL (15,3•10-6 mMol) auf Wasser aufgetragen und bei Komprimierung ein deutlicher Schubanstieg auf maximal 23 mN/m registriert (Daten nicht dargestellt). Dies lässt darauf schließen, dass bereits sehr geringe CrEL-Mengen unter den Versuchsbedingungen auf Wasser spreiten und einen Film auf der Subphase bilden. Dieses Ergebnis sowie die Oberflächenaktivität der Substanz (36,33 ± 0,02 mN/m für eine 20%ige wässrige CrEL-Lösung) führen zu der Annahme, dass sich CrEL auch nach Lösen in der Subphase zu einem Teil an der Oberfläche anordnete, dabei aber kein ausreichend dicker Film entstand, der mittels BAM sichtbar war. Bei Aufspreitung von MGS konnten die Tensid-Moleküle mit den MGS-Lipiden in Wechselwirkung treten, und es entstand sofort ein dichter, sichtbarer Film, der aufgrund unzureichender Durchmischung vereinzelt noch MGS-Inseln aufwies (Abb. 19).

↓98

Der Verlauf der beiden Isothermen (Abb. 20) kann diesen Zusammenhang verdeutlichen. Der Kurvenverlauf von rechts nach links entspricht der Kompression des Films und der Verlauf zurück bis zum Ausgangspunkt der Expansion. Das Zurückfahren der Barriere erfolgte mit einer wesentlich höheren Geschwindigkeit, so dass die resultierenden unterschiedlichen Kurvenverläufe darauf zurückzuführen sein dürften.

Abb. 20: Schub (blau) und Potential (orange) von MGS (10 µg) auf CrEL (0,1% in Wasser)

Bereits ohne Flächenänderung unmittelbar nach dem Einfüllen wurde ein Schub von 33 mN/m gemessen, der nahezu der Differenz aus den Oberflächenspannungen von Wasser (72,54 mN/m bei 21 °C) und CrEL (s. oben!6) entspricht, aber aufgrund der Messanordnung (vgl. Kap. 5.2.13) nicht als absoluter Wert betrachtet werden darf. Jedoch kann dieses Ergebnis die Annahme unterstützen, dass sich die gelösten CrEL-Moleküle im Gleichgewicht mit CrEL-Assoziaten innerhalb der Subphase und an deren Oberfläche befinden. Dieser detektierte Ausgangspunkt wurde gleich Null gesetzt, so dass die durch Flächenänderung erhaltene Schub-Kurve vom Messwert 33 mN/m zum Ausgangswert 0 mN/m parallel verschoben ist.

↓99

Sofort nach dem Spreiten von MGS stieg der Schub sprunghaft um ca. 1,5 mN/m an (Abb. 20), was vermutlich durch die angesprochenen Interaktionen zwischen CrEL und MGS an der Oberfläche verursacht wird [ 175]. Im weiteren Verlauf stieg die Kurve vergleichsweise kaum an (20 µg CrEL auf Wasser bewirkte einen Schubanstieg von 23 mN/m; Daten nicht dargestellt). Es ist denkbar, dass bei Komprimierung CrEL-Moleküle und in Tensid-Mizellen eingeschlossenes MGS von der Oberfläche in die Subphase abtauchen und somit die Anzahl der Moleküle pro Fläche mehr oder weniger konstant bleibt.

Das Oberflächenpotential von MGS auf CrEL/Wasser zeigt insgesamt nahezu keine Veränderung (Abb. 20). Wie eingangs bereits erwähnt, sind diese Daten für die untersuchten Filme schwer zu interpretieren oder mit Werten aus der Literatur zu vergleichen. Beispielsweise fanden Jäger et al. [171] und Kaercher et al. [173] einen plötzlichen Anstieg des Oberflächenpotentials für MGS auf Wasser von ca. 200 mV, was bei den eigenen Versuchen nicht erfolgte. Sehr allgemein gesprochen, kann eine Änderung des Oberflächenpotentials eine Umorientierung der Moleküle des Oberflächenfilms bedeuten [171].

Aus diesen Untersuchungen lässt sich für die physiologischen Bedingungen ableiten, dass CrEL möglicherweise in der Lage ist, auf dem Auge einen Oberflächenfilm zu bilden, der eine etwas niedrigere Oberflächenspannung (36,33 mN/m, bestimmt für eine 20%ige wässrige Lösung) aufweist als der Tränenfilm (43,6 - 46,6 mN/m [27]). Da für den Tränenfilm des „Trockenen Auges“ ein leicht erhöhter Wert gemessen wurde (49,6 mN/m [27]), könnte eine Applikation des Tensids vorteilhaft sein. Weiterhin besteht die Möglichkeit, dass das Tensid Lipide, die am Lidrand oder an den Öffnungen der Meibom-Drüsen haften, zu solubilisieren und auf der Augenoberfläche zu verteilen vermag.

4.5.2.3 Subphasen-Zusatz: Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin

↓100

Bei Vorliegen von 1% HP-γCD in der Subphase schien das darauf gespreitete MGS ebenfalls Wechselwirkungen einzugehen. Abb. 21 zeigt den Flächenausschnitt bei der gleichen Komprimierung wie in Abb. 19 für CrEL abgebildet.

Abb. 21: MGS (10 µg) auf HP-γ-CD (1% in Wasser) bei 29% Komprimierung (A=284 cm²)

Im Fall von CD hat sich jedoch kein homogener Film gebildet, und es sind in der BAM-Aufnahme mindestens drei verschiedene Helligkeitsabstufungen erkennbar, die auf unterschiedliche Beschaffenheit oder Dicke des Oberflächenfilms hindeuten. Im Vergleich zu Abb. 17, die MGS (10 µg) auf Wasser ohne Zusätze zeigt, erscheinen die Strukturen jedoch dunkler und lassen einen dünneren oder weniger dichten Film vermuten.

↓101

Im Verlauf der weiteren Komprimierung war jedoch zu beobachten, dass der Film mit seinen Inseln und Löchern in sich völlig unbeweglich war. Im Gegensatz zu den MGS-Schollen aus Abb. 17 haben sich die einzelnen Strukturen hier nicht weiter zusammengeschoben oder auf einander zu bewegt, während sie mit Hilfe der Barriere unter dem BAM vorbei geschoben wurden. Eine mögliche Erklärung könnte das Vorhandensein eines kaum reflektierenden, jedoch unbeweglichen, sehr dünnen Films sein, der die dunklen Bereiche ausfüllt. Kaercher et al. [I_Ref30581822">176] kommen bei ihren Untersuchungen mit MGS von Patienten mit Meibomitis auf ein ähnliches Ergebnis. Eine andere Erklärung wäre, dass die Schollen ineinander verzahnt und verkantet waren und sehr steife, unbewegliche Filmbruchstücke darstellten. In ihrer Gesamtheit bildeten sie daher ein patchwork-artiges, zusammenhängendes Gerüst, das als Einheit von der Barriere auf der Subphase verschoben wurde.

Als Wechselwirkung kann hier ein völliger oder teilweiser Einschluss von Lipidkomponenten des MGS in die lipophile Kavität des CDs in Betracht gezogen werden. Für HP-β-CD und die nativen CD wird in der Literatur [58, 176] die Fähigkeit beschrieben, Lipide aus Membranen, vornehmlich Cholesterol und Phospholipide, zu extrahieren. Sowohl Cholesterol als auch Phospholipide sind im MGS nachgewiesen worden [23]. Es wäre daher vorstellbar, dass auch HP-γ-CD in der Lage ist, mit diesen Lipiden Inklusionen zu bilden und dadurch Wechselwirkungen der MGS-Lipide untereinander zu stören bzw. zu unterbinden. Möglicherweise ging damit eine strukturelle Auflockerung einher, die eine größere Ausdehnung auf der Subphase ermöglichte, worauf auch die dunklere Färbung der Schollen hindeuten könnte. Beim Zurückfahren der Barriere lösten sich die ursprünglichen MGS-Strukturen offensichtlich weiter auf und zeigten ein großflächiges Netz mit vereinzelten dunklen Bereichen (Abb. 22).

Diese auffallende Netzstruktur war bei MGS auf CrEL/Wasser (vgl. Kap.  4.5.2.2) sowie unter Zugabe von Mischungen aus CrEL mit HP-γ-CD bzw. HTAP-β-CD (vgl. Kap. 4.5.2.8) zur Subphase zu beobachten und trat jeweils bei nahezu vollständiger Expansion, nach zuvor erfolgter Kompression, auf.

↓102

Abb. 22: MGS (10 µg) auf HP-γ-CD (1% in Wasser) bei 80% Expansion nach erfolgter Kompression (A=305 cm²)

Nach erfolgter Kompression von 60 µg MGS auf EBS (vgl. Abb. 18), also ohne weitere Formulierungskomponenten, war diese Netzstruktur ebenfalls zu beobachten, allerdings in weniger ausgeprägter Form. Es wäre daraus zu schlussfolgern, dass sich MGS-Komponenten lateral in bestimmter Art und Weise selbst assoziieren und die Ausbildung dieser netzartigen Struktur durch die Substanzen in der Subphase in gewisser Weise unterstützt, zumindest aber nicht behindert wird.

Bei Anwendung am Auge könnte die Ausbildung dieser „Netze“ für den Erhalt eines zusammenhängenden Lipidfilms vorteilhaft sein.

4.5.2.4 Subphasen-Zusatz: Hydroxytrimethylammoniopropyl-β-Cyclodextrin

↓103

Der Einsatz einer 1%igen HTAP-βCD Lösung als Subphase schien im visuellen Vergleich wenig Einfluss auf die MGS-Strukturen an der Oberfläche zu nehmen. Abb. 23 zeigt MGS-Schollen, die im Erscheinungsbild sehr denen aus Abb. 17 für MGS/Wasser ähneln. Auffällig sind lediglich die stärker ausgefransten Randstrukturen, die bei nahezu allen beobachteten MGS-Schollen auf HTAP-βCD auftraten und in diesem Bereich den netzartigen Strukturen aus Abb. 22 ähneln. Bei Kompression waren weder ein nennenswerter Anstieg von Schub oder Potential zu messen (Daten nicht dargestellt), noch traten bei Expansion die zuvor erwähnten, ausgeprägten Netzstrukturen auf. Es lässt sich schlussfolgern, dass sich wie bei MGS auf Wasser (vgl. Kap. 4.5.2.1) kein homogen reflektierender Film gebildet hat und in dieser Versuchsanordnung kaum Wechselwirkungen zwischen den MGS-Lipiden und dem HTAP-βCD in der Subphase auftraten.

Abb. 23: MGS (10 µg) auf HTAP-β-CD (1% in Wasser) bei 50% Komprimierung (A=233 cm²)

HTAP-βCD weist aufgrund der positiv geladenen Stickstoff-Gruppierungen in den nach außen gelegenen Seitenketten kationischen Charakter auf. Substituenten an den Seitenketten eines CD-Moleküls können in hohem Maße die Inklusion beeinflussen [ 177, 178]. Bei Seitenketten mit ionischem Charakter wurde in Abhängigkeit von ihrer Position zur Kavität eine Behinderung der Komplexbildung gefunden [60]. Sterische Hinderung und verminderte Inklusion in die β-Kavität können also für reduzierte Wechselwirkungen mit den MGS-Lipiden verantwortlich sein. Allerdings müssen ionische Wechselwirkungen mit der Außenseite des CD-Moleküls aufgrund der entgegengesetzten Ladungen, z.B. in Phospholipiden des MGS, angenommen, werden wie schon für FSC diskutiert (vgl. Kap. 4.2.3.3).

↓104

Darüber hinaus weist HTAP-βCD im Vergleich zu HP-γCD eine signifikant geringere Oberflächenaktivität (51,45 ± 0,42 mN/m für HTAP-βCD und 47,05 ± 0,09 mN/m für HP-γCD) auf, so dass sich in dieser Versuchsanordnung möglicherweise weniger HTAP-βCD Moleküle an der Oberfläche der Subphase anreichern und in Wechselwirkung mit dem gespreiteten MGS treten können. Müller und Brauns [182] fanden für HTAP-β-CD eine vernachlässigbar geringe Oberflächenaktivität.

4.5.2.5 Subphasen-Zusatz: Propylenglykol

Bei Zugabe von 1% PG zur Subphase zeigten sich keinerlei schollenartige Strukturen wie sie beim Aufspreiten von MGS auf Wasser (vgl. Kap. 4.5.2.1) oder auf HTAP-βCD/ Wasser (vgl. 4.5.2.4) zu sehen waren. Dagegen fielen sehr helle, stark reflektierende Punkte auf (Abb. 24), die mit dem Film unter dem Mikroskop vorbei geschoben wurden. Weiterhin waren sehr schwach - schattenhaft im Hintergrund - schaumartige Strukturen zu erkennen, die von einer nur schwach reflektierenden Substanz stammen müssen.

Abb. 24: MGS (10 µg) auf PG (1,0% in Wasser) bei 95% Komprimierung (A=127 cm²)
(Das regelmäßige Streifenmuster ist bedingt durch die Bildbearbeitung.)

↓105

Möglicherweise hat PG aufgrund seiner lösungsvermittelnden Eigenschaften einzelne MGS-Bestandteile solubilisiert und das komplex zusammengesetzte Sekret sozusagen in Fraktionen mit hoher und geringer Reflexion aufgetrennt. Es ist denkbar, dass PG hydrophile Wechselwirkungen mit polaren Bereichen der Lipide eingeht, sich dadurch zwischen die Moleküle lagert und so geordnete Strukturen aufbricht. Ein vergleichbares Verhalten wird auch als mögliche Funktion des Kotensids in einer ME diskutiert. Auf die MGS-Strukturen auf der Trogoberfläche hatte PG beim visuellen Vergleich der BAM-Bilder mit den CD einen sehr viel deutlicheren Einfluss.

4.5.2.6 Subphasen-Zusatz: Mikroemulsion ME-CD

Sehr interessante Strukturen ergaben sich bei der Zugabe der Formulierung ME-CD in 0,1%iger Konzentration zur Subphase. Von einer dicht gepackten, einheitlichen Filmschicht (Abb. 25) über zunehmend aufgelockerte Strukturen (Abb. 26 - Abb. 28) bis hin zu einem sich auflösenden „Schaumgebilde“ (Abb. 29) konnte über die gesamten Kompressions- bzw. Expansionszeit (45 min) hinweg eine Veränderung der Oberflächenstruktur beobachtet werden. Eine mögliche Ursache könnte eine zeitabhängige Strukturierung des Films, auch bereits ohne MGS-Spreitung, sein.

So untersuchten beispielsweise Glasgow et al. [179] im Langmuir-Trog die Änderung des Oberflächendrucks über mehrere Stunden hinweg, nachdem Tränen-Lipocaline7 in eine Puffersubphase injiziert wurden, und fanden einen Anstieg des Oberflächendrucks nach einer „Ruhephase“ von ca. 30 min bis zum Erreichen eines Plateaus nach ca. 180 min.

↓106

Abb. 25: MGS (10 µg) auf ME-CD (0,1% in Wasser) bei 18% Komprimierung (A=310 cm²)

Abb. 26: MGS (10 µg) auf ME-CD (0,1% in Wasser) bei 69% Komprimierung (A=189 cm²)

Abb. 27: MGS (10 µg) auf ME-CD (0,1% in Wasser) bei 75% Komprimierung (A=173,7 cm²)

↓107

Abb. 28: MGS (10 µg) auf ME-CD (0,1% in Wasser) bei 15% Expansion (A=149,7 cm²)

Abb. 29: MGS (10 µg) auf ME-CD (0,1% in Wasser) bei 71% Expansion (A=284 cm²)

Prinzipiell ist für jeden Zusatz oberflächenaktiver Substanzen zur Subphase eine Gleichgewichtseinstellung in Abhängigkeit von der Diffusionsgeschwindigkeit und der Oberflächenaktivität der entsprechenden Substanz hinsichtlich ihrer Konzentration im Inneren der Subphase und an deren Oberfläche zu erwarten. Dieser Aspekt, der bei den Mehrkomponentensystemen, wie den ME, potenziert zum Tragen kommen kann, wurde in den vorliegenden Studien jedoch nicht entsprechend berücksichtigt, und alle Versuchsreihen wurden nach einer kurzen Ausgleichszeit von nur 5 min gestartet.

↓108

Der einheitliche Film am Anfang (Abb. 25) ähnelt im Aussehen dem MGS/CrEL-Film (Abb. 19). Auch der Verlauf der Isothermen (Abb. 30) ist mit der CrEL-Messung vergleichbar.

Abb. 30: Schub (blau) und Potential (orange) von MGS (10 µg) auf ME-CD (0,1%)

Da vermutlich durch das Lösen der ME-CD in Wasser die typischen ME-Strukturen zumindest teilweise verändert werden, ist auch hier eine Orientierung der freien CrEL-Moleküle an der Oberfläche anzunehmen und würde die Ähnlichkeiten mit dem MGS/CrEL-Film zu Beginn des Versuchs erklären.

↓109

Weiterhin enthält die ME die Fettkomponente IPM, die in der wässrigen Umgebung entweder durch Mizellen oder CD-Einschlussverbindung in Lösung gehalten wird oder sich an der Subphasenoberfläche anreichert. Bei hier nicht weiter dokumentierten Vorversuchen wurde ermittelt, dass IPM auf Wasser spreitet und bei Kompression im Langmuir-Trog einen Film bildet, der bei einer gespreiteten Menge von 80 µg einen maximalen Schub von 18 mN/m ergab.

In den Bildausschnitten ab Abb. 26 fallen helle Bereiche an der Oberfläche auf. Anhand des Erscheinungsbildes, wie sie den Film durchziehen, muss angenommen werden, dass es sich um eine mobile Phase handelt, die durch Strömungen auf der Oberfläche mitgenommen und verteilt wird. IPM, das bei Raumtemperatur flüssig ist, könnte möglicherweise durch Wechselwirkungen mit MGS-Komponenten diese Phase darstellen.

Beim Auftragen der MGS-Chloroform-Lösung auf die ME-CD enthaltende Subphase fand hier keine Spreitung statt, sondern die Lösung blieb als Linse auf der Oberfläche so lange liegen, bis das Chloroform abgedampft war. Das bedeutet, dass der Spreitungskoeffizient SK 8, der in diesem Fall die Differenz aus Oberflächenspannung der Subphase und Grenz- und Oberflächenspannung der Chloroformphase darstellt, negativ war. Das MGS konnte sich beim Auftragen also nicht spontan über die gesamte Oberfläche verteilen, sondern blieb als Bolus liegen, von dem ein zeitabhängiges Vermischen der Komponenten ausging, wodurch die inhomogene Reflexion des Films verursacht sein könnte.

↓110

In Abb. 27 ist eine deutliche Strukturierung der Oberfläche in eine Art Tröpfchen zu erkennen, in denen sehr helle Punkte auffallen, die in ihrer Verteilung dem in Abb. 26 erkennbaren Strömungsmuster folgen. Im weiteren Versuchsverlauf (Abb. 28) nahmen die hellen Strukturen zu und gleichzeitig die flächenmäßige Ausdehnung des reflektierenden Gesamt-Filmes ab. Wie Abb. 29 zeigt, nehmen nachfolgend die Strukturen nur noch einen geringen Teil der Bildfläche ein, obwohl die Expansionsoberfläche zu diesem Zeitpunkt eine Ausdehnung hat, die ungefähr die Hälfte der komprimierten Flächen aus Abb. 25 und Abb. 26 beträgt. Es scheinen also große Teile des anfänglich erkennbaren Films in die Subphase abzutauchen oder ihre Struktur derart zu verändern, dass die Reflexion abnahm und nicht mehr zu detektieren war. Allerdings bleibt der relativ hohe Schub (Anfangswert: 39 mN/m) nahezu unverändert (Abb. 30), was für einen vorhandenen, nicht reflektierenden Oberflächenfilm spricht.

Vollhardt und Fainermann [180] haben die Penetration einer amphiphilen Substanz aus der Subphase in einen bestehenden Monolayer untersucht und berechnet. Dabei fanden sie einen sprunghaften Anstieg des Schubs bei der Ausbildung eines Mischfilms und daran anschließend einen eher flachen Kurvenverlauf der Isotherme. Für die hier ermittelte Isotherme (Abb. 30) war ein schwacher Anstieg im Verlauf der Messung ebenso zu registrieren. Allerdings nutzten Vollhardt und Fainermann [180] für ihre Experimente einen unterschiedlichen Versuchsaufbau, in dem ein gespreiteter Monolayer mit Hilfe zweier Barrieren über eine tensidhaltige Subphase geschoben wurde.

Die BAM-Aufnahmen von Vollhardt und Fainermann [180] zeigen Bildung, Anwachsen und Koaleszenz kondensierter Phasen aus Monolayer und amphiphiler Substanz aus der Subphase. Die hier in Abb. 28 und Abb. 29 gezeigten Bilder weisen große Ähnlichkeit mit diesen Aufnahmen auf. Unklar bleibt allerdings, welche Substanz mit großer Reflexion die sehr hell erscheinenden Reststrukturen bildet. Sofern ein Bestandteil der ME dafür verantwortlich ist, wäre bei Erhöhung der ME-Konzentration in der Subphase möglicherweise eine Zunahme der Reflexion oder des Anteils dieser hellen Flächen an der Gesamtfläche zu erwarten. Um dies näher zu beleuchten, wurden nachfolgend Messungen mit 1% ME-CD in der Subphase durchgeführt.

↓111

Abb. 31: MGS (10 µg) auf ME-CD (1,0% in Wasser) bei 66% Expansion (A=272 cm²)

Abb. 31 zeigt einen Oberflächenausschnitt bei einer Fläche von 272 cm² aus dem Versuch mit 1%iger ME-CD-Konzentration in der Subphase vergleichbar mit Abb. 29. Die hellen Strukturen scheinen hier tatsächlich dichter verteilt zu sein, wobei zu berücksichtigen ist, dass jeweils nur ein Flächenausschnitt gezeigt wird. Der spontane Schubanstieg nach Einfüllen der Subphase war hier etwas höher und erreichte einen Wert von 42 mN/m, im Gegensatz zu 39 mN/m bei 0,1%iger ME-CD. Der weitere Anstieg erfolgte bei der Kompression ebenfalls nur bis zum Maximum von 45 mN/m. Die dichter verteilten Strukturen ergaben also während der Kompression keinen größeren Schubanstieg.

Aufgrund der Ausbildung eines dynamischen Gleichgewichts zwischen Anordnung an der Oberfläche und Abtauchen in die Subphase, die zumindest für die amphiphilen Komponenten möglich ist, blieb vermutlich die Oberflächenbelegung bei beiden Konzentrationen nahezu gleich. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die dunklen Flächen bei diesen Messungen mit einem viel geringer reflektierenden Film belegt waren, der die Oberflächenspannung im Vergleich zur Oberflächenspannung von reinem Wasser deutlich reduzierte. Die beobachteten hellen Strukturen könnten von ME-Bestandteilen herrühren, die selbst keine Mizellen ausbilden und vielleicht erst zeitverzögert in Mizellen anderer Komponenten eingeschlossen wurden oder von besonders dichten und schlecht löslichen Assoziaten aus ME- und MGS-Komponenten.

4.5.2.7 Subphasen-Zusatz: Mikroemulsionen ME-PG bzw. ME-ION

↓112

Bei Zugabe von 0,1% ME-PG bzw. 0,1% ME-ION zur Subphase konnten keine so ausgeprägten Strukturen wie bei ME-CD beobachtet werden. In beiden Fällen zeigten sich aber Anfangsstrukturen wie für MGS auf ME-CD/Wasser in Abb. 25, die ohne die einzelnen für ME-CD abgebildeten Übergangsstufen (vgl. Abb. 25 - Abb. 29) nach der Expansion in sehr helle punktartige Reste übergingen. Abb. 32 veranschaulicht diese anfänglichen Oberflächenstrukturen am Beispiel von MGS auf 0,1% ME-ION in Wasser.

Ebenfalls für beide Zusätze vergleichbar ergab sich nach dem Spreiten des MGS ein leichter Schubanstieg von 2 mN/m und eine weitere Zunahme im Verlauf der Kompression um jeweils einen Betrag von 6 mN/m. Das Oberflächenpotential zeigte in beiden Fällen keine bemerkenswerte Veränderung während des Versuchs (Daten nicht dargestellt) und lässt damit wiederum keine Rückschlüsse auf mögliche Strukturänderungen der Oberflächenbelegung zu.

Abb. 32: MGS (10 µg) auf ME-ION (1,0% in Wasser) bei 33% Komprimierung (A=275 cm²)

↓113

Auch bei ME-PG und ME-ION wird für das im Langmuir-Trog beobachtete Verhalten hauptsächlich das Tensid CrEL als verantwortlich gesehen. Allerdings sollte das jeweilige Kotensid sowohl auf das CrEL als auch auf das gespreitete MGS ebenfalls einen Einfluss ausüben, wie in den vorangehenden Untersuchungen (vgl. 4.5.2.3 bis 4.5.2.5) ermittelt wurde. Für die drei ME konnten hier jedoch keine differenzierten Ergebnisse erzielt werden.

Darüber hinaus erfolgten Versuche mit einer Mischung aus CrEL und dem jeweiligen CD in gleicher prozentualer Zusammensetzung wie in ME-CD und ME-ION, die 1%ig der Subphase zugesetzt wurden, da insbesondere zwischen diesen Komponenten Interaktionen erwartet wurden. Hierbei waren mögliche Effekte der Fettkomponente IPM zu eliminieren.

4.5.2.8 Subphasen-Zusatz: Mischungen aus CrEL mit HP-γ-CD bzw. HTAP-β-CD

Bei der Spreitung von MGS auf einer 1%igen Lösung des Gemischs aus HP-γCD oder HTAP-βCD mit CrEL, korrespondierend mit der Konzentration in den ME mit jeweils 9% CD und 20% (ME-CD) bzw. 15% CrEL (ME-ION) (vgl. Tabelle 4), waren mit CD-freier CrEL-Subphase vergleichbare Bilder zu beobachten (vgl. Abb. 19). Hervortraten mehrere Bereiche von unterschiedlicher Helligkeit sowie eine ausgeprägte Netzstruktur nach Expansion.

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Da sich die beiden Subphasen weder im mikroskopischen Bild noch in ihren Isothermen deutlich unterschieden, muss auch hier das Tensid als dominierend hinsichtlich seiner Wirkung auf das MGS angenommen werden. Die CD begünstigen möglicherweise eine schnellere Auflockerung des Films oder eine Auftrennung der MGS-Komponenten, wie auch für PG diskutiert, wofür im Bild ggf. die unterschiedlich reflektierenden Bereiche sprechen könnten.

DeGrip et al. [179] haben in ihren Untersuchungen eine geringere Affinität verschiedener CD zu Phospholipiden als zu einer Reihe von strukturell unterschiedlichen Tensiden festgestellt und auf diese Weise Tensidreste aus Phospholipid-Liposomen extrahieren können. Alami et al. [I_Ref39841939">90] untersuchten Strukturen von Komplexen zwischen einem nicht-ionischen, zweikettigen Tensid und hydroxypropyliertem α-, β-, und γ-CD und fanden stabartige oder sphärische Komplexe sowie ein Aufbrechen der Mizellstrukturen bei CD-Zugabe.

Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass auch bei den hier durchgeführten Versuchen entsprechende Wechselwirkungen zwischen CrEL und dem jeweiligen CD auftraten. Da das CD vorzugsweise Teile der hydrophoben Ketten des Emulgators inkludieren wird, könnte damit der amphiphile Charakter des Tensids abgeschwächt und eine Anreicherung im Inneren der Subphase begünstigt werden. Für die Oberflächenspannung einer Lösung aus beiden Komponenten wäre folglich ein Anstieg zu erwarten, was beim Vermessen mit dem Tensiometer bestätigt werden konnte (vgl. Kap. 4.1.3.2, Tabelle 6).

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Eine weitere Folge der CD-Zugabe könnte ein Anstieg der CMC des Tensids sein, was von Topchieva und Karezin [180] für nicht-ionische Tenside und die nativen CD nachgewiesen wurde. Aufgrund des Überschusses an CrEL in den hier verwendeten Formulierungen und der sperrigen Struktur dieses dreikettigen Tensid-Moleküls (vgl. Kap. 3.5.1) ist allerdings anzunehmen, dass das Oberflächenverhalten im vorliegenden Fall durch die eventuell gebildeten „Komplexe“ nicht grundlegend beeinflusst wurde.

Unter physiologischen Bedingungen könnten diese Tensid/CD-Wechselwirkungen allerdings den Vorteil haben, eventuelle Tensid-Unverträglichkeiten abzumildern. Auch ist eine mögliche Membranschädigung des verwendeten CDs, bedingt durch Herauslösen von Lipidbestandteilen aufgrund der höheren Affinität des CDs zum Tensid, eher auszuschließen. Daran anknüpfend haben Jabbal Gill et al. [181] einen protektiven Effekt von CD gegen eine Membranschädigung durch andere Enhancer wie Laureth 9, Glykodeoxycholat oder L-α-Lysophosphatidylcholin festgestellt.

4.5.2.9  Subphasen-Zusatz: Fertigarzneimittel liposic®

Um die Ergebnisse der durchgeführten BAM-Untersuchungen für einen möglichen Einsatz der ME-Systeme am Auge besser werten zu können, wurde zum Vergleich eine Lösung des auf dem Markt befindlichen Augengels liposic® (Dr. Mann Pharma, Berlin) als Subphase verwendet. liposic® ist zugelassen zur Behandlung des Trockenen Auges und enthält auf wässriger Basis mittelkettige Triglyceride als Fettkomponente. Den arzneilich wirksamen Bestandteil stellt Carbomer in einer Konzentration von 0,2% dar. Das Arzneimittel wurde zu 0,1% in Wasser gelöst, um als Subphase zu dienen. Eine höhere Konzentration war nicht verwendbar, da dann keine klaren Lösungen mehr entstanden; die Verdünnungen erschienen trüb und kamen für eine BAM-Untersuchung nicht in Frage.

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Die BAM-Aufnahmen zeigten neue Strukturen (Abb. 33), die in den vorangegangenen Experimenten nicht beobachtet worden waren. An den Rändern fielen streifige Bereiche auf, die weder klar abgegrenzte Schollen darstellten noch einen geschlossenen Film bildeten. Es muss allerdings darauf hingewiesen werden, dass in diesem Fall bereits die Subphase allein eine deutliche Strukturierung auf dem Bildausschnitt erkennen ließ, was vermuten lässt, dass das liposic® auch in der eingesetzten Konzentration nicht einwandfrei gelöst war und somit bereits die Subphase allein das eintretende Laserlicht reflektierte.

Auch die in Abb. 33 auffallenden sehr hellen Punkte waren bereits auf der reinen Subphase zu erkennen. Aus der angegebenen Zusammensetzung des Handelspräparates geht nicht hervor, in welcher Weise die mittelkettigen Triglyceride in das wässrige Gel eingearbeitet wurden; ein Emulgator-Zusatz ist nicht aufgelistet. Insofern lassen sich auch die abgebildeten Strukturen nicht bestimmten Substanzen zuordnen.

Abb. 33: MGS (10 µl) auf liposic® (0,1% in Wasser) bei 75% Komprimierung (A=174 cm²)

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In Abb. 33 ist zu erkennen, dass der Bildausschnitt eine dreidimensionale Struktur zu haben scheint und die Strukturen verschwimmen. Auch anhand der Graustufen ist nicht sicher zuzuordnen, welche Bereiche aus dem MGS stammen und welche die liposic®-Komponenten darstellen. Die Aufzeichnung der Isothermen brachte ebenfalls keine klare Aussage, da kein strukturierter Film gebildet wurde, der die Oberflächenparameter Schub und Potential beeinflussen konnte.

Im Unterschied also zu den ME-Systemen wurde im Falle des liposic®-Gels kein Oberflächenfilm gebildet. Dem MGS waren nach der Spreitung und während der Kompression auf den BAM-Bildern keine eindeutigen Strukturen mehr zuzuweisen.

Kapitel-Zusammenfassung

In diesen Modell-Versuchen sollten Wechselwirkungen der ME-Formulierungen sowie einzelner Komponenten daraus mit den Tränenlipiden (MGS) hinsichtlich Unterstützung der Funktion oder Ersatz des Lipidfilms [182] untersucht werden. Die getesteten Mikroemulsionen, ME-CD, ME-ION und ME-PG, könnten Vorteile für die Therapie des Sicca-Syndroms aufweisen und als mögliche arzneistofffreie oder auch –haltige Systeme Anwendung finden. Aus den durchgeführten Experimenten kann resümiert werden:

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Fußnoten und Endnoten

1  Der Arzneistoffzusatz (25 µg/ml FSC) bewirkt rechnerisch einen Tonizitätsanstieg von 0,2 mosmol/kg und kann damit in diesem Fallvernachlässigt werden.

2  An dieser Stelle sei Frau Ingrid Zenke am Max-Planck-Institut für Kolloid- und Grenzflächenforschung, Potsdam, sehr herzlich für die Durchführung der Messungen und die Unterstützung bei der Auswertung der Daten gedankt.

3  Mukosa konnte hier leider aus den auf S. 56 beschriebenen Gründen nicht mehr mit einbezogen werden.

4  RAMEB = randomly methylated βcyclodextrin

5  Der weiße Balken repräsentiert in allen folgenden BAM-Aufnahmen eine Länge von 100 µm.

6  CMC für CrEL < 0,1% in Wasser (m/V)

7  Lipocaline sind Proteine, die in der Lage sind, kleine hydrophobe Substanzen zu binden und dadurch den Transport dieser Verbindungen im hydrophilen Milieu des Körpers zu ermöglichen. Diese Proteine kommen z.B. in der Tränendrüse oder der Nasenschleimhaut vor.

8 

γS: Oberflächenspannung der unteren Flüssigkeit; γL: Oberflächenspannung der spreitenden Flüssigkeit; γLS: Grenzflächenspannung zwischen den beiden Flüssigkeiten



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08.11.2005