5 Experimenteller Teil

5.1 Substanzen

↓118

Arzneistoffe

 

  • Androstendion
  • Testosteron
  • Fluorescein-Na

Schering AG, Berlin

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen

Merck, Darmstadt

Cyclodextrine

 

  • Hydroxypropyl-γ-CD
  • Hydroxytrimethylammoniopropyl-β-CD

Wacker Chemie, München9

Wacker Chemie, München

Hilfsstoffe für die Mikroemulsionen

 

  • Cremophor® EL
  • Isopropylmyristat
  • Propylenglykol
  • Methylenblau (Löffler’s)
  • Oil Red O

Caesar & Loretz, Hilden

Caesar & Loretz, Hilden

Wasserfuhr, Bonn

E. Merck, Darmstadt

Serva Entwicklungslabor, Heidelberg

HPLC-Fließmittel

 

  • Acetonitril (HPLC grade)
  • Methanol (LiChrosolv®)
  • Wasser

J.T. Baker, Deventer, Holland

E. Merck, Darmstadt

Reinstwasser (RS 90-4 UF, SG Wasseraufbereitung und Regenerierstation GmbH, Hamburg-Barsbüttel)

Substanzen für die In-vivo-Studien

 

  • Ursotamin®
    Rompun® 2%

Wirkstoff: Ketamin-HCl
Serumwerk Bernburg AG

Wirkstoff: Xylazin-HCl
Bayer Vital GmbH, Leverkusen

  • Liquemin® N 25000
  • Na-EDTA
  • Isoton. NaCl-Lösung
  • Methyl-tert. Butylether (MTBE)

Wirkstoff: Heparin-Na, 5.000 I.E./ml
Roche

Isocomerz, Herzberg

Delta Pharma, Pfullingen

J.T. Baker, Deventer, Holland

Pufferlösung und weitere Chemikalien

↓119

Zusammensetzung Earl’s Balanced Salts pH 7,4 (EBS)

CaCl2•2H2O

MgSO4 (wasserfrei)

KCl

NaCl

Na2HPO4•2H2O

D-Glucose

NaHCO3

0,265 g/l

0,0977 g/l

0,4 g/l

6,8 g/l

0,122 g/l

1,0 g/l

2,2 g/l

Verwendete Elektrolyte:

↓120

  • Calciumchlorid
  • Magnesiumsulfat
  • Kaliumchlorid
  • Natriumchlorid
  • Natriummonohydrogenphosphat
  • D-Glucose
  • Natriumbicarbonat
  • Salzsäure (0,1 N)
  • Natriumhydroxid (0,1 N)

E. Merck, Darmstadt

E. Merck, Darmstadt

Ferak Laborat, Berlin

Wasserfuhr, Bonn

Laborchemie, Apolda

E. Merck, Darmstadt

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen

E. Merck, Darmstadt

Chemapol, Prag

  • Chloroform
  • Carbogen (CO2/O2 5:95)
  • n-Octanol
  • Trichloressigsäure

J.T. Baker, Deventer, Holland

Air Liquide GmbH, Düsseldorf

J.T. Baker, Deventer, Holland

E. Merck, Darmstadt

5.2 Methoden

5.2.1  Gehaltsbestimmungen

5.2.1.1  Androstendion und Testosteron

Es wurde eine HPLC-Methode [74] genutzt, die eine parallele Bestimmung beider Substanzen, AD und TST, erlaubt. In nachfolgender Tabelle 23 sind die Methoden- und Geräteparameter aufgelistet.

↓121

Tabelle 23: Parameter der HPLC-Analytik für AD und TST

Pumpe

Intelligent Pump L-6200, Merck-Hitachi, Darmstadt

Detektion

L-4000 UV Detector, Merck-Hitachi, Darmstadt
bei 240 nm

Injektion

Rheodyne, Cotati, CA, USA
20 µl Injektionsvolumen

Autosampler

Merck-Hitachi, Darmstadt

Säule
Vorsäule

LiChrospher® 100 RP-18 (5 µm) 125-4, Merck, Darmstadt
LiChrospher® 100 RP-18 (5 µm) 4-4, Merck, Darmstadt

Mobile Phase

60% Acetonitril, 40% Wasser

Fließgeschwindigkeit

1,0 ml/min

Die Nachweisgrenze für die beiden Substanzen lag < 40 ng/ml und die Bestimmungsgrenze betrug 0,5 µg/ml.

5.2.1.2 Fluorescein

FSC wurde am Fluorimeter (RF 5001 PC, Shimadzu, Japan) nachgewiesen. Die Messungen erfolgten bei einer Extinktion von 492 nm, wobei sich eine Emissionswellenlänge von 511 nm ergab. Die Bestimmungsgrenze dieser Methode lag bei 0,095 ng/ml.

5.2.2 Herstellung der Mikroemulsionen

↓122

Alle untersuchten Systeme (Zusammensetzung s. Tabelle 4) wurden auf die gleiche Weise hergestellt. IPM und CrEL wurden zusammen unter Rühren und Erwärmen auf 75 °C (Magnetrührer, RCT B, IKA Labortechnik Staufen, Janke&Kunkel GmbH&CoKG, Staufen) gemischt. Unter identischen Bedingungen wurde eine Lösung des jeweiligen Kotensids (HP-γ-CD, HTAP-β-CD bzw. PG) in Wasser hergestellt, die daraufhin unter fortgesetztem Rühren und Temperieren (75 °C) in die Lipid/Tensid-Mischung gegeben wurde. Alle Systeme zeigten direkt nach dem Vermischen eine leichte Trübung, die bei Erreichen von RT verschwand. Eine Einarbeitung von Arzneistoff erfolgte durch Lösen in der wässrigen Kotensid-Lösung vor der Zugabe zur Lipid/Tensid-Mischung.

5.2.3 Färbemethode

Auf einem Uhrglas wurden jeweils drei Tropfen der zu prüfenden ME aufgebracht. An den Rand wurden daraufhin nacheinander zwei Tropfen der jeweiligen Farbstofflösung gegeben und vorsichtig mit einem Glasstab mit der ME vermischt. Für die Mikroskopischen Untersuchungen wurde die zu untersuchende ME auf einen Objektträger getropft und mit einem Deckgläschen abgedeckt. Die jeweilige Farbstofflösung wurde seitlich mit Zellstoff eingezogen und das Mischverhalten unter dem Mikroskop (Olympus CH2, Olympus Optical, Co Ltd., Japan, Vergrößerung 10fach bzw. 40fach) beobachtet. Zur Betrachtung der Mischung wurde das Deckgläschen vorsichtig abgehoben und die Zubereitung homogen mit dem Farbstoff vermischt. Es wurden für beide Methoden Löfflers Methylenblaulösung für die Mikroskopie sowie eine 1%ige Lösung von Oil Red O in IPM verwendet.

5.2.4 Polarisationsmikroskopie

Die Bestimmung der optischen Isometrie der ME-Systeme erfolgte an einem Polarisationsmikroskop (Laborlux 12 Pol S, Leica Mikroskopie Systeme GmbH, Wetzlar). Die Proben wurden auf einen Objektträger aufgetropft, mit einem Deckgläschen abgedeckt und im polarisierten Licht betrachtet.

5.2.5 Physikalisch-chemische Untersuchungen

5.2.5.1 Viskosität

↓123

Die Viskositätsbestimmungen wurden am Ubbelohde-Viskosimeter (Schott-Geräte, 6238 Hofheim) im Automatikbetrieb durchgeführt. Nach dem Temperieren der Probe im Wasserbad bei 25 °C ± 0,1 (Thermostat CT 1450 und AVS 350, Schott, Hofheim) wurde mindestens fünfmal die Durchflusszeit durch eine geeignete Kapillare bestimmt und unter Einbeziehung der Gerätekonstante die kinematische Viskosität ν erhalten. Mittels der Dichte ρ (s. Kap. 5.2.5.2) ließ sich aus diesem Wert die dynamische Viskosität η berechnen.

5.2.5.2 Dichte

Für die Bestimmung der Dichte wurde das Density meter DMA 38 der Firma Anton Paar KG, Graz, Österreich, verwendet. Die Proben wurden vor der Messung durch das Gerät auf 25 °C temperiert. Jede Probe wurde dreimal vermessen.

5.2.5.3 pH-Wert

Die Messung des pH-Werts erfolgte am pH-Meter 766 Calimatic (Knick Elektronische Messgeräte GmbH&Co, Berlin) bei RT.

5.2.5.4 Brechungsindex

↓124

Der Brechungsindex wurde an einem Abbé-Refraktometer (Carl-Zeiss-Jena, Jena) gemessen. Die Bestimmung erfolgte dreifach bei RT.

5.2.5.5 Tonizität

Die Messungen des osmotischen Drucks [mOsmol/kg] wurden mit einem automatischen Halbmikro-Osmometer (Knauer GmbH, Berlin) durchgeführt. Jede Probe wurde dreifach vermessen. Das Gerät wurde regelmäßig mit destilliertem Wasser (0 mOsmol/kg) und einer 1,2687%igen NaCl-Lösung (400 mOsmol/kg) kalibriert.

5.2.5.6 Oberflächenspannung

Für die Bestimmung der statischen Oberflächenspannungen [mN/m] wurde ein Ring-Tensiometer (TE 1C, Lauda, Lauda-Königshofen) verwendet. Alle Messungen (n = 5) erfolgten mittels eines Platin-Iridium-Rings bei RT.

5.2.5.7 Dielektrizitätskonstante

↓125

Die Bestimmung der Dielektrizitätskonstanten wurde am DK-Meter Typ GK 68 (MLW-Prüfgeräte, Karl-Marx-Stadt) durchgeführt. Die Kalibrierung des Geräts erfolgte mit folgenden Kalibrier-Flüssigkeiten (Laborchemie, Apolda): Cyclohexan, Chlorbenzol, Acetophenon, Methanol, Aceton, 1,2-Dichlorethan, 1,4-Dioxan/Wasser 3:7 bzw. 2:8 und gereinigtem Wasser. Die Messungen wurden durchgeführt bei einer Temperatur von 20 °C ± 0,5.

5.2.6 Kalorimetrische Messungen

Die kalorimetrischen Messungen wurden an einem Wärmestrom-Differenz-Kalorimeter (SETARAM C80D, Caluire Cedax, Frankreich) durchgeführt.

Für die Untersuchungen an ME-CD wurde mit einer Umkehrmischzelle gearbeitet, in deren inneren Zylinder 0,3 g einer Mischung aus 20% CrEL und 5% IPM gefüllt wurde und deren äußerer Zylinder 0,9 g einer wässrigen Lösung von 7, 9 bzw. 11% HP-γCD, ggf. unter Zusatz von 0,0025% AD, enthielt. Zur besseren Durchmischung wurden beiden Zellen Glaskugeln zugefügt. Nach Erreichen der Versuchstemperatur von 40 °C ± 0,5 wurde die Schwenkvorrichtung aktiviert und der Mischungsvorgang begonnen. Nach erneutem Erreichen der Basislinie konnte die Messung beendet werden. Die Vergleichszelle enthielt Luft. Die Auswertung erfolgte durch Integration der Fläche unter der Wärmestromkurve mittels gerätezugehöriger Software.

↓126

Die Untersuchungen zur Komplexierung von AD durch HTAP-β-CD wurden im Scanning-Betrieb mit einer Heizrate von 2,5 K/min über eine Temperaturspanne von 30-300 °C durchgeführt unter Verwendung der Normalzelle mit Glaseinsatz. Folgende Zubereitungen wurden vermessen:

Die Einzelsubstanzen wurden zuvor getrocknet (RT, Exsikkator). Die physikalische Mischung wurde in einem Porzellanmörser unter ständigem Verreiben und Abschaben hergestellt. Um eine Inklusion des AD zu erreichen, wurde eine Lösung aus AD und HTAP-β-CD in Wasser hergestellt (s.o.!) und bei -35 °C und 27 mbar gefriergetrocknet (Gefriertrocknungsanlage Alpha 1-4, Christ Medizinischer Apparatebau, Osterode/Harz). Jede Probe wurde so bemessen, dass in jedem Fall 5 mg AD enthalten waren. Die Auswertung der Peaks erfolgte mittels gerätezugehöriger Software.

5.2.7 Röntgenkleinwinkelstreuung

↓127

Die Röntgenkleinwinkelmessungen wurden mit einer Kratky-Kamera (A-8054, Anton Paar, Österreich) durchgeführt. Die Streumuster wurden auf Fotoplatten (BAS III, Fuji) erhalten und mit einem Scanner (MAC Science Dip-Scanner IPR-420) eingelesen.

5.2.8 Verteilungskoeffizient

Hier wurden die Verteilungskoeffizienten für AD und FSC zwischen Oktanol bzw. IPM und EBS sowie der Einfluss der zugefügten Kotenside bestimmt. Nach vorheriger Absättigung des Oktanols bzw. IPM mit EBS wurden jeweils 2 ml der lipophilen Testphase mit dem gleichen Volumen an wässriger Substanzlösung (25 µg/ml) zusammengegeben und bei RT mind. 2 h auf einem Schütteltisch (Thys 2, VEB MLW Labortechnik, Ilmenau) geschüttelt.

Für die Bestimmung der VK der Wirkstoffe in EBS musste die Versuchsdurchführung modifiziert werden, da bei einem Konzentrationsverhältnis der lipophilen zur hydrophilen Phase von 1:1 (jeweils 2 ml, s.o.!) ein vollständiges Auflösen in einer der beiden Phasen, je nach Substanzcharakter, erfolgte. Es wurden 1 ml lipophile Phase mit 5 ml wässriger Phase für die AD-Bestimmung und umgekehrt 5 ml Ölphase mit 1 ml wässriger Lösung im Falle des FSC bei gleichbleibender Substanz-Konzentration kombiniert.

↓128

Nach Beenden des Schüttelvorgangs wurden die Ansätze 10 min bei 2.500 min-1 zentrifugiert (Labor-Zentrifuge, Z230, B. Hermle AG, 7209 Gosheim) und der wässrigen Phase 500 µl Probe entnommen. Der Substanz entsprechend wurde der Gehalt vor und nach der Verteilung an der HPLC (AD) bzw. am Fluorimeter (FSC), wenn nötig nach vorangehender Verdünnung, bestimmt (vgl. Kap. 5.2.1). Die Berechnung des VK erfolgte nach folgender Gleichung:

V W : Volumen der wässrigen Phase; V L : Volumen der öligen Phase; c w 0 : Ausgangskonzen tration der Substanz in der wässrigen Phase; c w 1 : Endkonzentration der Substanz in der wässrigen Phase

5.2.9 Sättigungslöslichkeit

↓129

Der Arzneistoff wurde der jeweiligen zu untersuchenden Lösung im Überschuss zugegeben und in einem Bioinkubator (3032 GFL, Gesellsch. f. Labortechnik mbH, Burgwedel) bei 25 °C über 48 h geschüttelt. Die ungelöste Substanz wurde durch Filtration (Cellulosenitrat-Filter, Porengröße 0,2 µm, Sartorius GmbH, Göttingen) abgetrennt und das Filtrat mit Acetonitril in den Messbereich verdünnt. Um das Erreichen der Sättigungskonzentration zu überprüfen, wurden jeweilige Parallelansätze unter gleichen Bedingungen weitere 24 h geschüttelt und in gleicher Weise aufgearbeitet. Der Arzneistoffgehalt wurde mittels HPLC bestimmt (vgl. Kap. 5.2.1.1). Die Sättigungskonzentration war bei allen Proben bereits nach 48 h erreicht, da die Konzentrationen nach 72 h in keinem Fall signifikant höher lagen. Jeder Ansatz umfasste 4 Proben.

Die Erstellung der Löslichkeitsisothermen (Abb. 12) mit den CD erfolgte wie oben beschrieben bei CD-Konzentrationen von jeweils 0,1; 1; 2; 5; und 10%.

5.2.10 In-vitro-Permeationsstudien

Zur experimentellen Ermittlung der Membranpermeation stehen zahlreiche Permeationsmodelle zur Verfügung. Viele davon sind dem Versuchaufbau entsprechend modifiziert, basieren aber auf etablierten Systemen, wie zum Beispiel der Ussing-Kammer [53, 111, 127, 183], den Side-Bi-Side-Zellen [117] oder der Franz-Zelle, wobei letztere hauptsächlich für transdermale Permeationsstudien genutzt wird [184 -185 186]. Allen Modellen gemeinsam ist die Möglichkeit zur Temperierung der Kammern, ggf. zur Durchmischung der Kompartimente sowie zur Probenentnahme aus der Akzeptorkammer.

↓130

In dieser Arbeit fand das Modell einer Ussing-Kammer aus Acrylglas (Grünberg Kunststoffe, Rödermark), die zuvor in der Arbeitsgruppe entwickelt wurde [128], Anwendung. Um das Einspannen sowohl der gewölbten und dicken Kornea als auch der planen und dünnen Mukosa möglich zu machen, wurde die Kammer weiter modifiziert. Abb. 34 zeigt den Aufbau der in dieser Arbeit entwickelten In-vitro-Permeationsmodelle für Kornea bzw. für Mukosa.

Abb. 34: Skizze der Permeationszellen: Querschnitt durch den Mittelpunkt, nicht maßstabs-getreu

Für die Kornea-Studien befindet sich an der Öffnung der Akzeptor-Kammer ein ringförmiger Wulst, der in eine Vertiefung auf der Donator-Seite greift (Abb. 34, oben rechts und links) und die physiologische Wölbung der Kornea aufrecht erhält. Im Falle der Mukosa-Versuche ist der Wulst ersetzt durch einen Dichtungsring aus Gummi und die Vertiefung um die Donator-Öffnung egalisiert (Abb. 34, unten rechts und links), so dass beim Zusammensetzen der beiden Kammern der Gummiring schonenden Druck auf die Membran ausübt und das System abdichtet. Beide Kammer-Modelle sind baugleich mit einem Donator- bzw. Akzeptorvolumen von jeweils 1,0 ml und einer Permeationsfläche von 0,5 cm².

↓131

Die Studien wurden durchgeführt in einem Bioinkubator (3032, GFL, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel), in dem die Kammern bei 33 °C ± 0,5 temperiert und durch horizontale Rotation mit 100 min-1 bewegt werden konnten. In regelmäßigen Zeitabständen gemäß Tabelle 24 wurden der jeweiligen Akzeptorkammer 400 µl Probe entnommen und sofort mit frischer, temperierter Puffer-Lösung (EBS) ersetzt. Eine Vorinkubation der Gewebe wurde mit der entsprechenden Substanz/EBS-Lösung auf der Donatorseite und EBS auf der Akzeptorseite über 30 min unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Nach Beendigung wurden beide Kammern entleert, mind. fünfmal mit EBS gespült und wie beschrieben für die nachfolgende Permetion befüllt. Eine Equilibrierung entfiel für diese Versuche.

Um eine für die Permeationsstudien essentielle Agitation der Kompartimente zu garantieren, wurden Vorversuche bei unterschiedlichen Rotationsgeschwindigkeiten durchgeführt, sowie durch Farbstoffzugabe in die Kammern das Erreichen einer gleichmäßigen Verteilung optisch bewertet.

Tabelle 24: Entnahmezeiten für die Proben in den Permeationsstudien

 

Entnahmezeiten [min]

Mukosa

15, 30, 45, 60, 75, 90

Kornea

30, 60, 120, 180, 240, 300

↓132

Wenn die Durchmischung der Kompartimente nicht ausreicht, hat das zur Folge, dass sich vor und hinter der Permeationsbarriere eine ruhende Schicht aufbaut, die die Permeabilität maßgeblich beeinflusst, indem die Dicke der zu durchdringenden Barriere erhöht wird. Da die Lag-time proportional ist zum Quadrat der Barrierendicke, könnte ein Vergleich der Lag-time bei unterschiedlichen Umdrehungsgeschwindigkeiten Auskunft über die Qualität der Durchmischung geben.

Tabelle 25: Ermittelte Lag-time [min] für AD-Permeationen durch Mukosa bei unterschiedlichen Rotationsgeschwindigkeiten [min-1]

 

min -1

 

40

60

100

Lag-time [min]

9,2 ± 5,5

12,4 ± 11,6

6,9 ± 7,1

n ≥ 5

In Tabelle 25 sind die ermittelten Verzögerungszeiten für die Permeation von AD aus EBS durch Rindernasenmukosa bei unterschiedlichen Umdrehungen aufgeführt. Die Mukosa wurde ausgewählt, da sie die bei Agitation empfindlichste Membran darstellt und eine ausreichende aber schonende Rotationsgeschwindigkeit ermittelt werden sollte.

↓133

Die berechneten Verzögerungszeiten unterscheiden sich nicht signifikant voneinander, dennoch ist ein Trend zu erkennen zu längerer Lag-time bei geringerer Rotation. Darüber hinaus konnte sowohl bei 40 min-1 als auch bei 60 min -1 eine verstärkte Tendenz zur Umwandlung des AD in TST festgestellt werden, die eventuell durch eine längere Kontaktzeit der Substanz mit der Membran und den darin enthaltenen Enzymen erklärt werden kann und in Kap. 4.3 näher untersucht wurde.

Mit Hilfe einer verdünnten Methylenblau-Lösung wurde die Durchmischung der Kammern bei 100 min-1 visuell überprüft. Der jeweils mit EBS gefüllten Donator- und Akzeptorkammer wurden 400 µl Puffer entnommen und durch 400 µl Farbstofflösung ergänzt. Innerhalb einer maximalen Zeit von 2 min waren die Kammern optisch homogen durchmischt.

5.2.10.1  Präparieren des Gewebes

Um die Membranen für die Permeationsstudien zu gewinnen, wurden beim nächstgelegenen Schlachthof Schweineaugen (LVAT Ruhlsdorf-Großkreutz e.V.11, Ruhlsdorf-Teltow) und Rindernasenstücke (Eberswalder Fleischwaren, Eberswalde-Britz und Fleischwerke Lausitz, Kasel-Golzig) bezogen. Alle Gewebeproben wurden gekühlt transportiert - die Nasenstücke in EBS-Puffer-Lösung, die Augen in einem Gefäß mit feuchter Atmosphäre - und spätestens zwei Stunden nach Schlachtung der Tiere weiter verarbeitet.

↓134

Zur Gewinnung der Kornea wurde die Sklera rings um die Kornea in einem Abstand von 1 - 2 mm vorsichtig mit einem Skalpell eingeschnitten. Daraufhin wurde das Präparat mit einer Pinzette vom Augapfel abgehoben und der anhaftende Iris-Ziliar-Körper abgezogen. Nach kurzem Spülen mit Puffer-Lösung wurde die Kornea mit der Epithelseite dem Donator zugewandt in die Ussing-Kammer eingespannt, wobei darauf geachtet wurde, dass das Präparat zentral und faltenfrei zwischen den Kammern lag.

Die Nasenstücke wurden unmittelbar nach Schlachtung der Rinder aus dem enthäuteten Kopf ausgeschnitten, so dass keilförmige Stücke des vorderen Teils der Nasenmuschel (conchae nasales dorsales) erhalten wurden. Im Labor wurde die Nasenschleimhaut mit einem Skalpell leicht eingeschnitten und darauf mit einer Klemme sehr vorsichtig vom anhaftenden Bindegewebe abgezogen, so dass rechteckige Stücke mit Seitenlängen von ca. 1 auf 2 cm erhalten wurden. Diese wurden mit der serosalen Seite auf die Akzeptorkammer gelegt und glatt gezogen, und daraufhin die Ussing-Kammer mit der Donatorhälfte verschlossen.

Bei allen Geweben wurde darauf geachtet, dass nur unversehrtes Material für die Versuche zur Anwendung kam. Die Kammern wurden nach Einspannen der Membranen zunächst auf der Akzeptor- und sofort danach auf der Donator-Seite mit temperiertem EBS befüllt und die Gewebe unter den beschriebenen Bedingungen (33 °C ± 0,5, 100 min-1 , vgl. Kap.  5.2.10 ) equilibriert. Nach 30 min wurden beide Kammern entleert und wiederum in gleicher Reihenfolge umgehend mit frischem Puffer bzw. der Testlösung befüllt.

↓135

Die Vitalität der biologischen Membranen wurde wiederholt in der Arbeitsgruppe geprüft und kann für die Nasenschleimhaut über 10 h bei Lagerung in eisgekühlter Pufferlösung garantiert werden [74, 127] sowie für die Kornea über die Versuchsdauer von 5 h [187]. Während der Studien wurde durch Sättigung der verwendeten Pufferlösung mit Carbogen-Gas (O2/CO2) die Aufrechterhaltung der Vitalität unterstützt.

5.2.10.2 Synthetische Membran

Als künstliche Membran gelangte Nephrophan® (Filmfabrik, Wolfen) zum Einsatz. Nephrophan® besteht aus regenerierter Cellulose mit einem Porendurchmesser von 2,4 nm und einer Gesamtdicke von 14 – 15 µm. Das Material ist mit Sorbitol und Glycerol als Weichmacher imprägniert. Um diese zu entfernen, wurde die Membran vor dem Versuch 1 h unter fließendem Wasser gespült, darauf in ausreichender Größe ausgeschnitten und in die jeweilige Ussing-Kammer gespannt. Die Permeationsstudien wurden unter gleichen Bedingungen wie für die biologischen Gewebe durchgeführt, wobei jedoch auf eine Equilibrierung mit EBS verzichtet wurde.

5.2.11 Penetrations- und Metabolisierungs-Studien

5.2.11.1  Rindernasenschleimhaut

Die Gewebeproben wurden, wie unter Kap. 5.2.10.1 beschrieben, gewonnen und präpariert. Sofort nach dem Ablösen der Schleimhaut wurde das Präparat gründlich mit EBS-Pufferlösung abgespült, in ein Eppendorf-Gefäß überführt und gewogen. Vor der weiteren Verarbeitung und zwischen den einzelnen Arbeitsschritten wurden die Proben auf Eis gelagert. Nachdem alle Proben für eine Versuchsreihe vorbereitet waren, wurden die Gefäße mit 1,0 ml EBS-Lösung, die jeweils 25 µg/ml Testsubstanz enthielt, aufgefüllt und sofort in einen Bioinkubator (3032, GFL, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel) platziert. Die Inkubation erfolgte über 90 min bei 33 °C und 100 min-1.

↓136

Nach Ablauf der Versuchszeit wurde die Reaktion mit 100 µl TCA (Trichloressigsäure, 34,4% in Wasser) abgebrochen und die Proben für 10 min auf Eis gesetzt. Nach Zentrifugation (Eppendorf-Zentrifuge, 5 min, 3.500 min-1) wurden vom Überstand 500 µl entnommen und mittels HPLC (vgl. Kap.  5.2.1.1) analysiert.

In der Versuchsreihe, in der die Gewebestücke extrahiert werden sollten (vgl. Kap. 4.3.2), wurde nach Ende der Inkubation das Mukosa-Stück entnommen, gründlich mit EBS-Lösung abgespült und im Exsikkator bei RT getrocknet. Zur Extraktion wurde jedes einzelne Mukosa-Stück in kleine Stücke geschnitten, in ein Zentrifugenglas überführt und mit 5,0 ml eines Gemischs aus Methanol und Wasser (7:3 (V/V)) versetzt. Nach 30minütiger Quellung erfolgte mit einem Ultra-Turrax (Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen i.Br.) eine 2minütige Homogenisierung und anschließend die Zentrifugation (3.500 min-1, 5 min; Laborzentrifuge Z 230, B.Hermle AG, Gosheim). Vom klaren Überstand wurden 500 µl Probe entnommen und mittels HPLC (vgl. Kap.  5.2.1.1) analysiert.

5.2.11.2 Schweinekornea

Für die Versuche mit Schweinekornea wurde lediglich das Epithel verwendet und nach Abspülen des Augapfels mit EBS-Puffer vorsichtig mit einem Skalpell abgekratzt. Das Epithel von jeweils vier Augen wurde gepoolt, um annähernd das gleiche Gewebefeuchtgewicht zu erreichen wie bei den Mukosa-Versuchen. Im Weiteren wurde analog zu der für Rindermukosa beschriebenen Vorgehensweise verfahren. Die EBS-Lösung wurde für die entsprechenden Versuchsreihen durch Lösungen der jeweiligen Zusatzsubstanz in arzneistoffhaltiger EBS-Lösung oder eine arzneistoffhaltige ME-Zubereitung ersetzt. Unmittelbar vor der Inkubation wurden die Proben im Eisbad für 2 min ins Ultraschallbad (RK 255 H, Bandelin electronic, Berlin) gestellt. Um die AD- und TST-Konzentrationen in der CrEL-Lösung sowie den ME-Systemen HPLC-analytisch bestimmen zu können, war es erforderlich, diese Proben vor der Detektion 1:1 mit Acetonitril zu verdünnen und die Fließmittelzusammensetzung in 54% Acetonitril und 46% Wasser (vgl. Kap. 5.2.1.1) zu ändern.

↓137

Sowohl für die Versuchsreihen mit Mukosa als auch Kornea-Epithel wurde eine gewebefreie Probe mitgeführt und die jeweilige nach Versuchsende bestimmte Konzentration als Ausgangskonzentration gewertet. Für keine der Zubereitungen wurde in den gewebefreien Proben ein Umsatz des jeweiligen Ausgangsarzneistoffs festgestellt. Weiterhin wurden für beide Gewebe arzneistofffreie Ansätze analysiert, in denen das entsprechend präparierte Gewebe in reiner EBS-Pufferlösung inkubiert wurde. Es konnte in keinem Fall über die verwendeten HPLC-Methoden ein Signal detektiert werden.

5.2.12 In-vivo-Studien

Die Tierversuche (Kaninchen) wurden ordnungsgemäß bei der zuständigen Landesbehörde beantragt und durch diese genehmigt. Die Tierhaltung genügte den Anforderungen des Deutschen Tierschutzgesetzes und beinhaltete unter anderem freien Zugang der Tiere zu Wasser und Futter sowie einen 12stündigen Tag-Nacht-Rhythmus der Beleuchtung.

Die Studien wurden mit vier männlichen New Zealand White-Kaninchen (Gewicht 3,5 –4,5 kg; Charles River, Kißlegg, Deutschland) durchgeführt. Für die Dauer der Versuche wurden die Tiere mit einer Kombination aus Xylazin und Ketamin (0,4 mg/kg Xylazin, 40 mg/kg Ketamin, intramuskulär) sediert. Nach Applikation (fünfmal 45 µl) der Zubereitung über ein Dosiersprühsystem (Fa. Pfeiffer, Radolfzell) wurden innerhalb eines Zeitraums von 5 – 45 min in regelmäßigen Abständen jeweils sechsmal 500 µl Blut entnommen und zur Vermeidung der Blutgerinnung mit 5%iger Na-EDTA (1 mg/ml Blut) versetzt. Zur Bestimmung der physiologischen Plasmakonzentration an TST und AD wurde jeweils vor Versuchsbeginn eine Blutprobe als Leerwert entnommen, wobei in keinem Fall ein Vorliegen von AD bzw. TST detektiert wurde.

↓138

Zur weiteren Aufarbeitung wurden die Blutproben 15 min bei 4000 min-1 zentrifugiert (Z 230, B. Hermle AG, Gosheim) und das gewonnene Plasma abpipettiert. Die Plasmaproben wurden daraufhin mit 500 µl Methyl-tert. Butylether (MTBE) überschichtet und 10 min auf dem Schütteltisch (Thys 2, VEB MLW Labortechnik, Ilmenau) geschüttelt. Nach Abnahme des Etherüberstands wurde dieser Schritt wiederholt und beide Etherphasen wurden vereinigt. Nach Abdampfen des Ethers (RT, ca. 12 h) wurden die Proben zur späteren Aufarbeitung im Kühlschrank (2 - 8 °C) gelagert.

Zur Isolierung des Arzneistoffs aus dem Ether-Extrakt wurde eine Festphasenextraktion (solid phase extraction, SPE) durchgeführt [157]. Die SPE-Säulen (Mallinckrodt Baker, Deventer, Holland) wurden vor Gebrauch nach Vorschrift zuerst mit 1000 µl Methanol und darauf mit 1000 µl Wasser konditioniert. Die eingetrockneten Proben wurden in 500 µl EBS aufgenommen und nach 2 min Ultraschallbehandlung (RK 255 H, Bandelin electronic, Berlin) auf die vorbereiteten Säulen gezogen. Die Vorratsgefäße wurden mit weiteren 500 µl EBS ausgespült und die Spülflüssigkeit ebenfalls auf die entsprechenden Säulen gegeben. Die beladenen Säulen wurden zweimal mit jeweils 200 µl Methanol extrahiert. Die vereinigten Methanol-Eluate wurden abgedampft und zur nachfolgenden HPLC-Analyse (s. Kap. 5.2.1.1) in 100 µl Acetonitril, das 1,0 µg/ml AD als internen Standard enthielt, aufgenommen.

Tabelle 26: Wiederfindungsraten für AD [%] mittels der unterschiedlichen Methoden in Abhängigkeit von der Ausgangskonzentration

Ausgangs-
konzentration [µg/ml]

Wiederfindungsraten [%]

 

Schweineplasma

SPE aus Pufferlösung

SPE aus Schweineplasma

25,0

85,1 ± 9,0

  

1,0

118,1 ± 14,8

  

0,5

90,4 ± 10,7

111,0 ± 2,5

74,0 ± 8,0

0,2

 

102,2 ± 12,1

 

0,1

 

61,0 ±14,9

 

n = 5 – 18

↓139

Zur Bestimmung der Wiederfindungsraten für AD wurden Extraktionen aus Schweineplasma (LVAT Ruhlsdorf-Großkreutz e.V., Ruhlsdorf-Teltow) in analoger Vorgehensweise sowie ohne nachfolgende SPE durchgeführt. Darüber hinaus wurden Wiederfindungsraten für die SPE als Einzelschritt bestimmt, indem AD/EBS-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen extrahiert wurden. Tabelle 26 zeigt die erhaltenen Ergebnisse.

Für die SPE lagen die Wiederfindungsraten für den Arzneistoff jeweils um 100%, abgesehen von der niedrigsten Ausgangskonzentration mit 0,1 µg/ml AD. Die Wiederfindungsrate nach Ether-Extraktion und anschließender SPE ergab niedrigere Werte als ohne nachfolgende SPE aufgrund der Verlustraten in den zusätzlichen Arbeitsschritten.

5.2.13 Biophysikalische Untersuchungen

Üblicherweise werden am Langmuir-Trog Filme an einer Flüssigkeit/Luft-Grenzfläche charakterisiert, indem eine Barriere kontinuierlich die Trog-Oberfläche verkleinert und dabei Oberflächendruck und Oberflächenpotential aufgezeichnet werden. Dabei wird der Film von einer in der Flüssigkeit (Subphase) unlöslichen Substanz bzw. einem Substanzgemisch gebildet, die sich in bestimmter Weise an der Oberfläche anordnet. Meist besteht die Subphase aus Wasser oder einer wässrigen Lösung. In Abb. 35 ist der in dieser Arbeit verwendete Versuchsaufbau abgebildet.

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Abb. 35: Abbildung des Versuchsaufbaus12: Langmuir-Trog mit Schwingkondensator (A), Wilhelmy-Waage (B) und beweglicher Barriere (C) a) ohne BAM, b) mit BAM (D)

Der Oberflächendruck oder Schub (π) stellt die Differenz aus der Oberflächenspannung der unbedeckten Wasseroberfläche σ0 und der Oberflächenspannung der mit einem Film bedeckten Wasseroberfläche σ dar.

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Die Messung erfolgt mittels einer Wilhelmy-Waage (Abb. 35, B). Dabei wird die Kraft bestimmt, die an einem Filterpapierstreifen wirkt, der ein Stück weit senkrecht in die Wasseroberfläche eintaucht. Wenn der Oberflächendruck hoch ist, bewegt sich das Filterpapier nach oben, bei niedrigem Druck nach unten.

Das Oberflächenpotential wird mit der Schwingkondensatormethode (Abb. 35, A) bestimmt. Dabei befindet sich eine Platinplatte in der Subphase, die mit einer schwingenden Gegenplatte verbunden ist, welche ca. 2 mm über der Wasseroberfläche angebracht ist. Durch die Schwingungen ändert sich die Kapazität des Kondensators periodisch und induziert einen Wechselstrom. Die Gegenspannung, die erforderlich ist, um den Strom zu kompensieren, entspricht dem Voltapotential des Kondensators. Gemessen wird das Oberflächenpotential als Differenz aus der Potentialdifferenz zwischen der Platinelektrode und der filmbedeckten Wasseroberfläche und der Potentialdifferenz zwischen der Platinelektrode und der freien Wasseroberfläche.

Weiterhin ist es bei dieser Messanordnung möglich, die Struktur der Oberfläche über ein Brewsterwinkel-Mikroskop (BAM) zu betrachten [175]. Trifft p-polarisiertes Licht unter dem Brewsterwinkel auf eine ideale Grenzfläche zweier nicht-absorbierender Medien, so wird kein Licht reflektiert. Aus den Fresnel’schen Betrachtungen ergibt sich für den Brewsterwinkel folgende Beziehung:

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Dabei beschreiben n1 und n2 die Brechungsindices der beiden Medien an der Grenzfläche. Für die beiden Medien Luft und Wasser mit den jeweiligen Brechungsindices n1 = 1 für Luft und n2 = 1,333 für Wasser, bezogen auf Laserdioden-Licht mit einer Wellenlänge von 660 nm, beträgt der Brewsterwinkel 53,1°. Befindet sich ein gespreiteter Film auf der Wasseroberfläche, sind die Bedingungen für den Brewsterwinkel nicht länger erfüllt, so dass Licht reflektiert wird und über ein Mikroskop mittels einer Kamera im Brewsterwinkel beobachtet werden kann. Die Intensität des reflektierten Lichts ist abhängig von der Dichte der Moleküle auf der Oberfläche und von deren Anordnung bzw. Struktur.

Für die hier durchgeführten Messungen (Tabelle 27) wurde ein Teflon-Trog mit einer Spreitfläche von 353 cm² (Länge = 32 cm, Breite = 11 cm, Tiefe = 0,8 cm) verwendet, die durch eine bewegliche Barriere (Abb. 35, C) mit einer Geschwindigkeit von 16,2 cm²/min auf maximal 115 cm² verkleinert werden konnte, da an dieser Stelle das BAM installiert war (Abb. 35, D). Mittels BAM wurde ein fixer Flächenausschnitt der Trogoberfläche beobachtet, durch den der Film von der Barriere bewegt wurde.

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Tabelle 27: Übersicht über die durchgeführten Messungen am Langmuir-Trog

gespreitete Substanzen
(jeweils aus Chloroform)

Subphase
(jeweils wässrige Lösungen)

60 µg MGS
20 µg CrEL
80 µg IPM

  • Wasser

10 µg MGS

  • Wasser
  • HP-γ-CD (1%)
  • HTAP-β-CD (1%)
  • CrEL (0,1%)
  • ME-CD (0,1% und 1%)
  • ME-PG (0,1%)
  • ME-ION (0,1%)
  • PG (1%)
  • HP-γ-CD (9%) + CrEL (20%)
    davon 1% in Wasser
  • HTAP-β-CD (9%) + CrEL (20%)
    davon 1% in Wasser
  • liposic® (0,1%)

Als Subphase dienten wässrige Lösungen der zu testenden Zubereitungen (Tabelle 27) oder destilliertes Wasser (Milli-Q-System, Millipore). Die zu spreitende Substanz wurde in Chloroform (J.T. Baker, Deventer, Holland) gelöst und mit einer Mikroliterspritze langsam auf die Subphase gegeben. Das Chloroform verdampfte innerhalb kurzer Zeit, und die wasserunlöslichen bzw. amphiphilen Moleküle verblieben an der Oberfläche. Alle Versuche wurden gerätetechnisch begründet bei Raumtemperatur durchgeführt.

5.2.14 Statistik

Die Signifikanzermittlung erfolgte mittels ANOVA. Zuvor wurden die beiden vorausgesetzten Kriterien, Normalverteilung und Gleichheit der Varianzen, getestet. Als Post-Test zur Ermittlung der Signifikanzen wurde der Student-Newman-Keul’s Test durchgeführt. In einzelnen, gekennzeichneten Fällen kam der Student’s t-Test zur Anwendung. Alle Tests wurden mit der Statistiksoftware SigmaStat 2.0 durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant erachtet für p < 0,05.


Fußnoten und Endnoten

9  Der Firma Wacker Chemie, München sei an dieser Stelle für die kostenlose Überlassung der CD-Muster gedankt.

11  Für die freundliche Unterstützung bei Beschaffung der Augen möchte ich mich sehr herzlich bei Frau Uwarow bedanken.

12  Für die Überlassung der Fotografien möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Möbius herzlich bedanken.



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08.11.2005