6 Zusammenfassung

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Die anatomisch und physiologisch unterschiedlichen, aber im funktionellen Zusammenhang stehenden Membranen der beiden Sinnesorgane Auge (Kornea) und Nase (Mukosa) wurden hinsichtlich ihrer transzellulären In-vitro-Permeabilität vergleichend untersucht. Ein bereits etabliertes, modifiziertes Ussing-Kammer-Modell wurde hierzu in der Art weiter modifiziert, dass beide Membranen eingespannt werden konnten. Als Modell-Arzneistoff diente das lipophile Androstendion (AD) und partiell auch das Testosteron (TST). Beide Steroidhormone wurden weiterhin zu Penetrations- und Metabolisierungsstudien an Schweinekornea bzw. Rindernasenmukosa herangezogen. Zur Charakterisierung der parazellulären Permeabilität der Kornea gelangte der hydrophile Teststoff Fluorescein-Na (FSC) zum Einsatz. Um darüber hinaus membran-unabhängige Effekte, die durch Rezepturkomponenten der im Donator befindlichen Testlösungen verursacht werden, zu differenzieren, wurden für AD und FSC analoge Permeationsversuche an der synthetischen Zellulosemembran Nephrophan® durchgeführt.

Während im Fall von Nephrophan® sowohl für AD als auch für FSC aus Pufferlösung (EBS) nahezu gleiche Permeabilitätskoeffizienten (Peff) resultierten (~3•10-5 cm/s), und auch die Permeabilität von Nasenmukosa für AD mit einem Wert von ~2•10-5 cm/s in der gleichen Größenordnung lag, ergaben sich für die Kornea deutlich niedrigere Werte (0,73•10-5 cm/s für AD und 0,99•10-6 cm/s für FSC). Diese korneaspezifischen Unterschiede konnten auf die differenzierten Membranstrukturen (dreischichtiges, lipophil-hydrophiles Gewebe mit einer Dicke von ca. 400 µm) zurückgeführt werden und im Zusammenhang mit den Oktanol/ Puffer-Verteilungskoeffizienten (AD = 593, FSC = 0,2) sowie der Verteilung der beiden Substanzen zwischen Donatorlösung und Gewebe interpretiert werden.

Zur optimierten okularen und nasalen Applikation von AD in therapeutischen Konzentrationen wurden Mikroemulsionen (ME) als potentielle Arzneiträgersysteme auf Basis von Isopropylmyristat (IPM), Wasser und Cremophor® EL (CrEL) als Tensid entwickelt. Als Kotenside gelangten Propylenglykol (PG → ME-PG), Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin (HP-γ-CD → ME-CD) sowie das kationische Hydroxytrimethylammoniopropyl-β-Cyclodextrin (HTAP-β-CD → ME-ION) zur Anwendung. Der Einfluss dieser Rezepturkomponenten sowie der ME auf das Permeationsverhalten von AD und FSC wurde untersucht und die Peff bzw. Permeationsraten wurden bestimmt.

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Die mukosale Permeation von AD zeigte, mit Ausnahme von CrEL, keine signifikante Beeinflussung durch die unterschiedlichen Trägermedien. Die durch CrEL bedingte Absenkung des Peff ist dem mizellaren Einschluss des Arzneistoffs sowie einer Membranbelegung durch das Tensid zuzuschreiben. Im Gegensatz dazu resultierten für die Kornea sowohl durch die Einzelkomponenten als auch durch die ME bedingte signifikante Reduzierungen der AD-Permeabilitätskoeffizienten. Abweichend war das Versuchsergebnis allerdings bei Addition geringer Mengen von HP-γ-CD, die einen permeationsfördernden Effekt ausübten. Dieses Phänomen lässt sich mit einer Art Carrier-Funktion des CD durch hydrophile Bereiche, die der Epitheloberfläche anhaften, erklären.

Die hydrophile Testsubstanz FSC ergab in Anwesenheit der Hilfsstoffe bzw. ME (Ausnahme ME-ION) an beiden getesteten Barrieren (Kornea und Nephrophan®) gegenüber der Referenz (EBS) signifikant reduzierte Peff. Da sowohl die Nephrophan®- als auch die Korneapermeabilität des FSC durch die CD und CrEL reduziert war, sind Inklusion bzw. elektrochemische sowie mizellare Wechselwirkungen des FSC mit diesen Komponenten anzunehmen. Interessanterweise setzten HP-γ-CD und CrEL, besonders aber HTAP-β-CD, die Lag-time in den Kornea-Permeationen herab, was für eine temporäre Beeinflussung der Poren oder Tight-junctions spricht. Ein dauerhaft membranschädigender Effekt dieser Substanzen kann jedoch ausgeschlossen werden, da nach Vorinkubierung bestenfalls eine tendenzielle Veränderung von Peff und Lag-time gegenüber dem EBS-Wert gefunden wurde.

Zur okularen Anwendung könnte ME-ION ein geeignetes System darstellen, wenn vorzugsweise lokale Effekte erzielt werden sollen, wie im Fall des lipophilen AD zur Therapie der Keratoconjunctivitis sicca, was keinen Membrandurchtritt erfordert. Andererseits scheint dieses Trägersystem auch Eignung für zu absorbierende hydrophile Wirkstoffe aufzuweisen, wie aus den Versuchen mit FSC abzuleiten ist. Die anderen beiden ME können im Spezialfall ebenfalls potente Trägersysteme repräsentieren - ihre physiologische Verträglichkeit vorausgesetzt -, wobei sich für Nasalia unter Anwendung von CD für lipophile Wirkstoffe gute Lösungseigenschaften mit verzögerter Freisetzung vereinigen ließen.

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Als vorteilhaft sind die physikalisch-chemischen Eigenschaften der getesteten ME zu bewerten. Ihre relativ niedrige Viskosität gewährleistet die Tropf- und Sprühbarkeit. Tonizität und pH-Wert lassen auf allenfalls geringe Reizerscheinungen schließen (Ausnahme: Tonizität von ME-PG, vgl. 4.1.3.2), und die physiologischen Funktionen der Sinnesorgane Auge und Nase dürften durch die Verdünnbarkeit der Systeme mit Wasser sowie ihre Transparenz wenig beeinflusst werden. Hinsichtlich der Schleimhautkompatibilität liegt zumindest für eine Modifizierung des Systems ME-PG mit 5% PG statt der hier verwendeten 9% die im HET-CAM-Test erwiesene Klassifizierung „praktisch nicht irritierend“ vor [73].

Die mit AD und TST sowohl an homogenisiertem Schweinekornea-Epithel als auch an intakter Rindernasenmukosa durchgeführten Penetrations- und Metabolisierungsstudien erbrachten gewebespezifische Ergebnisse. Aus den Mukosa-Versuchen resultierten eine vollständige Wiederfindung des eingesetzten Arzneistoffs im Inkubationsmedium sowie ein enzymatischer Umsatz in gleicher Größenordnung (ca. 4%) für beide Substanzen. Aufgrund der hohen Durchlässigkeit der Mukosa für die lipophilen Arzneistoffe erfolgte offensichtlich ein schneller Konzentrationsausgleich zwischen Lösung und Membran.

Im Kornea-Epithelzellhomogenat wurde dagegen eine drastische Reduzierung der Wiederfindungsrate auf ca. 30% sowie eine deutlich höhere Metabolisierungsrate von TST zu AD erfasst, was mit der Zerstörung der Gewebestrukturen und damit einhergehender Adsorption von Arzneistoff an Zellbestandteile einerseits und mit Erhöhung der reaktiven Enzymkonzentration andererseits diskutiert wird.

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Am kornealen Epithel wurde weiterhin der Einfluss der ME und ihrer Bestandteile auf die Penetrations- und enzymatischen Umsatzraten geprüft. Im Ergebnis wurde generell eine verminderte Adsorption an Gewebekomponenten festgestellt, d.h. die Wiederfindungsraten im Zentrifugat lagen zwischen 60 und 100%. Das Kotensid PG zeigte auf die Verteilung des jeweiligen Substrats keinen Einfluss. Diese Resultate korrelieren mit den Permeationsdaten, indem sich verminderte Peff-Werte bereits auf eine reduzierte Penetration und Verteilung im Kornea-Epithel zurückführen lassen. Verantwortlich hierfür sind primär die bereits in der Formulierung vorliegenden Arzneistoff-Hilfsstoff-Assoziate.

In gleicher Weise kann der ermittelte Rückgang der jeweiligen Metabolisierungsrate durch Interaktionen der Rezepturkomponenten mit AD bzw. TST erklärt werden. Insbesondere war der Umsatz von TST zu AD durch Inklusion in die beiden CD bzw. durch Mizelleinschluss mittels CrEL, wodurch der Enzym/ Substrat-Kontakt vermutlich erschwert wird, effektiv reduziert.

Im Hinblick auf eine mögliche okulare und/oder nasale Anwendung des AD wurden der jeweiligen Intention entsprechende weiterführende Untersuchungen angestellt. Bei okularem Einsatz des AD bei der Indikation „Trockenes Auge“ wird eine lokale Wirkung auf die Tränen- oder Meibom’schen Drüsen präferiert. Insofern ist einem möglichen Einfluss der Trägerformulierung auf den Tränenfilm eine wesentliche Bedeutung beizumessen. Daher wurde versucht, im Langmuir-Trog durch biophysikalische Charakterisierung eines Oberflächenfilms aus dem Sekret der Meibom’schen Drüse (MGS), das auf eine Subphase entsprechender wässriger Lösungen der ME bzw. ihrer Bestandteile aufgespreitet wurde, Wechselwirkungen deutlich zu machen und Veränderungen des Films mittels Brewsterwinkel-Mikroskop (BAM) zu erfassen.

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Durch Zugabe der Kotenside HP-γ-CD bzw. HTAP-β-CD zur Subphase war im Gegensatz zu PG nur ein sehr geringer Effekt auf das gespreitete MGS zu konstatieren. Während einer Komprimierung von MGS auf wässrigen Lösungen der drei ME-Systeme waren hingegen keine differenzierten Effekte zu detektieren, und das Oberflächenverhalten wurde hauptsächlich auf den Einfluss des Tensids CrEL zurückgeführt.

Im Gegensatz zum Fertigarzneimittel liposic®, das zur Anwendung am Trockenen Auge zugelassen ist, ergab sich für CrEL und die ME ein zeitlich verzögerter Abbau- bzw. Lösungsvorgang der MGS-Oberflächenstrukturen, was bei einer Anwendung am Auge für den Erhalt der physiologischen Tränenfilmstruktur vorteilhaft sein könnte. Darüber hinaus können Wechselwirkungen zwischen den beiden CD bzw. CrEL, wie sie in den ME anzunehmen sind, zu einer Abmilderung physiologisch eventuell nachteiliger Effekte der Einzelkomponenten, wie sie allgemein für einige Tenside bzw. CD bekannt sind, führen und einen Lösungsvorgang des kornealen Lipidfilms weiter retardieren.

Um den nasalen Applikationsweg näher zu charakterisieren, wurden In-vivo-Versuche an Kaninchen durchgeführt, da die Permeationsstudien für eine systemische Resorption lediglich orientierenden Charakter haben können. Unter In-vivo-Bedingungen kommen Einflussfaktoren, wie die nasale Clearance, Substanzverlust durch enzymatischen Abbau und Abfließen über den Nasen-Rachenraum, Effekte der Zubereitung auf die lokale Durchblutung sowie eventuelle Reizerscheinungen zum Tragen. In dieser Arbeit konnten jedoch keine konkreten Aussagen zur Resorption von AD nach nasaler Gabe getroffen werden, da sich die Applikation einer ausreichend hohen Arzneistoff-Konzentration sowie die Aufarbeitung der gewonnenen Plasmaproben als problematisch herausstellten. Aufgrund des beobachteten Verhaltens der Tiere waren keine makroskopischen Beeinträchtigungen durch die ME feststellbar, was vorsichtig auf eine physiologische Verträglichkeit der Systeme schließen lässt.

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Im Hinblick auf die Untersuchungen an den ME-Systemen ergaben sich vielversprechende Vorteile für einen nasalen und/oder okularen Einsatz sowohl als Arzneistoffträgersysteme als auch als wirkstofffreie Formulierungen, wobei weitere Untersuchungen, vor allem hinsichtlich der physiologischen Verträglichkeit, sowie umfangreiche In-vivo-Studien für eine endgültige Beurteilung herangezogen werden müssen.


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08.11.2005