Rickmeyer, Christiane : Penetrationseigenschaften von beschichtetem mikrofeinem Titandioxid

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Kapitel 2. MATERIAL UND METHODIK

2.1 Material

2.1.1 Emulsion

Die Emulsion für die Versuche wurde freundlicherweise von der Firma L‘Oréal (Paris) zur Verfügung gestellt. Es handelt sich um eine Öl in Wasser Emulsion, welche in kommerziellen Produkten Anwendung findet. In diese Emulsion wurden jeweils zwei unterschiedliche Formen von Titandioxid-Mikropartikeln eingebracht. Die Emulsion ohne die Partikel soll im weiteren Basis-Emulsion genannt werden.

2.1.2 Titandioxid-Mikropartikel

Die Partikel unterscheiden sich in der Form der Titandioxidkristalle und durch die Art ihrer Beschichtung. Die Konzentration der Partikel in der Emulsion beträgt jeweils 5%. Kommerzielle Sonnenschutzmittel enthalten im Allgemeinen etwa 3%, teilweise jedoch bis zu 10%.

UV-Titan M 160

Dem Produktdatenblatt der Firma Kemira (Finnland) zufolge handelt es sich bei diesen Partikeln um beschichtete, rutile Titandioxidkristalle. Eine kontrollierte Partikelgrößen-verteilung führt zu einer ausgezeichneten Dispergierbarkeit. Das spezifische Gewicht der Partikel beträgt ca. 4, der TiO2-Gehalt mindestens 77%. Die Beschichtung setzt sich aus Stearinsäure (7,1%), Aluminiumoxid (6,3%) und Siliziumoxid (0,2%) zusammen.

Nach Auskunft der Firma Kemira sind die Partikel hydrophob. Die Partikelgröße beträgt ca. 200 nm und der Durchmesser der Beschichtung ca. 0,2 nm.

In vorausgehenden Untersuchungen wurde festgestellt, dass diese Partikel nach Anregung fluoreszieren und bei 255 nm eine deutliche Absorptionsbande besitzen. Da Titandioxid nicht fluoresziert, muss einer der weiteren Bestandteile dafür verantwortlich sein.


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Abbildung 2: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der primären rutilen Kristalle.

Abbildung 3: Untersuchung der Titandioxid-Mikropartikel (in Emulsion) unter dem Rasterelektronenmikroskop.

Tioveil AQ-N

Die Grundlage der anderen Titandioxid-Partikel der Firma Tioxide Specialities LTD (England) sind ebenfalls rutile Kristalle. Die Firma L‘Oréal beschreibt diese Partikel wie folgt: Die Größe der Partikel schwankt zwischen 10 und 150 nm, der Anteil an Titandioxid beträgt 74%. Die Beschichtung besteht aus Silizium, Aluminium und Natriumpolyacrylat.


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2.1.3 Tesafilm

Der beim Abrissverfahren verwendete Klebefilm TESA Film No. 5529 wird von der Firma Beiersdorf (Hamburg, Deutschland) in der Breite 19 mm hergestellt. Er wurde unter mehreren Klebefilmen ausgewählt, da er eine hohe UV-Transparenz und eine sehr homogene Belegung der Klebeschicht aufweist. Weiterhin enthält dieser Klebefilm keine störenden absorbierenden Inhaltsstoffe im UVA- und UVB-Bereich.

2.1.4 Osmiumtetroxid

Die Färbemethode mit Osmiumtetroxid wird neben der Färbung mit Sudanfarbstoffen eingesetzt zum Nachweis apolarer Lipide [23] und sollte darum geeignet sein, Follikelausgänge zu markieren. Sie ist von Adams 1959 beschrieben worden [1].

Lipide werden durch Einwirken von Osmiumtetroxidlösungen auf das Gewebe geschwärzt, was auf Anlagerung an die Doppelbindungen der ungesättigten Fettsäuren zurückzuführen ist [9].

Verwendet wurde Osmium(VIII)-oxid (0,1g) der Firma Merck in 0,1%iger wässriger Lösung.

2.2 Probanden

Die Probanden wurden unter dem Gesichtspunkt ausgewählt, dass die Haut auf dem Unterarm weitgehend unbehaart war und keine Narben aufwies.

Die Untersuchungen wurden an insgesamt 4 Probanden durchgeführt, welche in Tabelle 3 charakterisiert sind.

Tabelle 3: Übersicht über die Probanden

 

Zuordnung zu den Versuchen

Alter

Geschlecht

Hauttyp

Proband 1

Biopsie ohne Titandioxid

23

m

II-III

Proband 2

Abrissserien an beiden Armen

24

m

III

Proband 3

Abrissserie & TiO2-Biopsie

19

m

III

Proband 4

Färbung mit Osmiumtetroxid

26

w

II-III

2.3 Abrissmethode

Die Penetrationsuntersuchungen erfolgten mit Hilfe der Abrissmethode in Kombination mit


22

spektroskopischen Messungen zur Bestimmung der Korneozytenmenge auf den einzelnen Abrissen. Diese Methode soll hier ausführlich beschrieben werden.

Grundsätzlich gliedert sich der Arbeitsablauf der Penetrationsuntersuchung mit Hilfe der Abrissmethode in folgende Abschnitte:

Voraussetzung für reproduzierbare Ergebnisse sind standardisierte Messprotokolle. Im Folgenden werden solche Standards beschrieben, die in den Versuchen der Arbeit angewendet wurden. Auf eine Abwandlung wird explizit hingewiesen.

2.3.1 Ermitteln der Emulsionsmenge

Die Emulsion wurde dem COLIPA-Protokoll (US-Standard) entsprechend in der Konzentration 2 mg/cm² aufgetragen. Die Applikation der Emulsion erfolgte mit Hilfe einer Standardspritze, um ein einfaches Abmessen und eine möglichst gleichmäßige Verteilung zu erreichen. Dazu musste die Masse der Emulsion pro Volumeneinheit ermittelt werden. Es wurde eine Präzisionswaage (BP 211D-OCE; Sartorius, Deutschland) verwendet.

2.3.2 Applikation der Emulsion

Die Emulsion wurde nach dem folgendem Schema aufgetragen.


23

Tabelle 4: Applikationsprotokoll

1.

Abmessen und Anzeichnen der Applikationsfläche.

2.

Ermittlung der benötigten Emulsionsmenge.

3.

Applikation der Emulsion.

4.

Verreiben der aufgetragenen Menge mit einem gesättigten Gummifingerling.

  1. Auf dem Unterarm des Probanden wurde eine möglichst große Fläche ausgewählt (ca. 100 cm²) und mit einem Derma-Marker angezeichnet. Er wurde vorher untersucht und dabei gesichert, dass der enthaltene Farbstoff im betrachteten Bereich nicht absorbiert. Je größer die Fläche für die Applikation der Emulsion gewählt wird, desto größer ist die aufzutragende Menge. Dadurch kann die Haut homogener eingecremt und auch der Fehler beim Aufziehen der Emulsion in die Spritze verringert werden.
  2. Die benötigte Menge Emulsion wurde wie oben beschrieben ermittelt und auf eine Einmalspritze aufgezogen.
  3. Die Emulsion wurde mit der Spritze möglichst gleichmäßig auf die abgemessene Fläche getupft (Abbildung 4).
  4. Anschließend wurde die Emulsion mit einem ungepuderten Fingerling gleichmäßig verrieben.

Der Proband wurde angewiesen, die Emulsion eine Stunde lang einwirken zu lassen. Das bedeutete, dass er die Applikationsstelle in dieser Zeit nicht mit Textilien bedecken durfte, jede Berührung dieser Stelle mit anderen Dingen vermeiden und sich möglichst wenig bewegen sollte, auch um Transpiration zu vermeiden.


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Abbildung 4: Applikation der Emulsion.

2.3.3 Entnahme der Abrisse

Im folgenden werden die einzelnen Schritte des Abrissverfahrens im Detail beschrieben.

Tabelle 5: Protokoll des Abrissverfahrens

1.

Tesafilm aufkleben

2.

Abdecken mit Papier

3.

Andrücken (Abbildung 5)

4.

Abreißen des Tesafilmstreifens (Abbildung 6)

5.

Lagern des Abrisses

 

Wiederholen von Schritt 1-5, bis die Transmission nahezu 100% beträgt

6.

Kontrolle mit dem Spektrometer und unter dem Mikroskop

  1. Der Unterarm wurde mit der Streckseite auf eine stabile Unterlage gelegt. Ein Tesafilmstreifen wurde vorsichtig quer über das markierte Feld auf die Haut der Unterarmbeugeseite aufgeklebt. Die Position wurde beim ersten Mal vorsichtig durch Farbpunkte außerhalb des angezeichneten Feldes markiert. Die folgenden Streifen wurden auf exakt diese Fläche geklebt und dadurch auch ihre Länge definiert.
  2. Ein sauberer Papierstreifen wurde so über den Tesafilmstreifen gelegt, dass er vollständig abgedeckt war. Dadurch sollte die Kontamination und Verschmutzung der

    25

    Rückseite des Abrisses beim Rollen vermieden werden. Für jeden Abriss wurde ein neuer Papierstreifen verwendet.
  3. Der Untersucher fuhr mit einer Rolle (Abbildung 5) mit starkem, gleichbleibendem Druck längs in beide Richtungen je 5x über den abgedeckten Tesafilmstreifen. Danach wurde der Papierstreifen entfernt.
  4. Der Tesafilmstreifen wurde anschließend vorsichtig an einem Ende gefasst und mit einer schnellen Bewegung von der Haut abgerissen.
  5. Der Klebestreifen wurde auf einem Metallring mittig aufgeklebt und die Abrissnummer mit einem Marker auf den Ring geschrieben.

Diese Schritte wurden wiederholt, bis in simultan zur Abrissserie durchgeführten spektrometrischen Probemessungen die Transmission nahezu 100% war. Das wurde unter dem Mikroskop kontrolliert, um sicherzustellen, dass praktisch keine Hornschuppen mehr entfernt wurden.

Abbildung 5: Anpressen des Tesafilmstreifens durch gleichmäßiges Überfahren mit einer Rolle über Papier.


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Abbildung 6: Abreißen des Tesafilmstreifens.

Abbildung 7: Entnahmestelle nach dem Abrissverfahren.

2.3.4 Spektroskopische Messung der Extinktion der Hornschuppen auf den Abrissen

Zur Ermittlung des Hornschichtprofils wurden die Abrisse bei 430 nm im Zweistrahlphotometer gegen einen Leerstreifen vermessen. Dafür wurde ein modifiziertes Lambda 20 UV/VIS Spektrometer von Perkin Elmer (Überlingen) verwendet. Die Fläche des Messspots betrug 1 cm².

Das Signal wird durch Streuung, Reflexion und Absorption der Korneozyten hervorgerufen. Im Bereich ab 400 nm kann der Einfluss der Emulsion auf die Extinktion vernachlässigt werden.

Prinzipiell könnte aber auch bei jeder Wellenlänge gemessen werden, bei der das Signal nicht durch die Absorption der Emulsion gestört wird. Für organische Sonnenschutzmittel konnte gezeigt werden, dass dieses außerhalb der UV-Absorptionsbande der Filtersubstanzen (z. B. sichtbarer Spektralbereich) möglich ist [2].


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Die Titandioxid-Mikropartikel reflektieren auch im sichtbaren Bereich, so dass das gemessene Signal eine Überlagerung der Streuung der Korneozyten und der Titandioxid-Mikropartikel darstellt. Daher war es nicht möglich, das Hornschichtprofil aus Proben zu bestimmen, die von mit Titandioxid behandelten Haut stammten. Deshalb musste das Hornschichtprofil für dieselbe Emulsion ohne Titandioxid an einem analogen Hautareal bestimmt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Wahl der Größe und der Lage des Hautareals am Unterarm keinen Einfluss auf das Hornschichtprofil hat [2].

2.3.5 Berechnen des Hornschichtprofils

Das Hornschichtprofil soll abgerissene Hornschicht möglichst realitätsnah darstellen.

Es wird ein Koordinatensystem mit zwei Ordinaten erstellt. Auf der linken werden die aufsummierten Extinktionen der Korneozyten in Prozent aufgetragen (bei 430 nm), der oberste Wert ist 0% und der Schnittpunkt mit der Abszisse sind 100%.

Die Funktion

bestimmt die aufsummierte Extinktion bis zur Abrissnummer k in Prozent. Hierbei ist Ex die Extinktion des Abrisses x, und n die Anzahl aller Abrisse.

Diese Prozentwerte werden als horizontale Linien in das Koordinatensystem eingetragen. Das Hornschichtprofil wird durch eine waagerechte Linie beim Wert 0 nach oben abgeschlossen. Diese Linie entspricht optisch der Hautoberfläche.

Die entstehenden Balken stellen die Dicke der Korneozytenschicht auf dem entsprechenden Abriss dar. Sie werden auf der rechten Abszisse bei 1 beginnend von oben durchnummeriert, was den Abrissnummern entspricht. Ein Beispiel ist in Abbildung 8 dargestellt.


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Abbildung 8: Beispiel für ein Hornschichtprofil.

2.3.6 Messung der Konzentration der Substanz auf den Abrissen

Die Röntgenfluoreszenzanalyse ist die Standardmethode zur Bestimmung kleinster Konzentrationen von metallischen Elementen und daher auch gut geeignet, um geringste Mengen Titandioxid nachzuweisen. Die Messungen wurden in der IUT GmbH (Berlin) unter Verwendung eines EX 1,000 Röntgen-Spektrometers durchgeführt.

Aus der Mitte der Abrisse wurde 1 cm2 des korneozytenbesetzten Tesafilmstreifens mit einem Skalpell entnommen. Die Ränder wurden großzügig ausgespart. Diese Ausschnitte wurden in Chlornitratsäure unter Mikrowellenbestrahlung aufgelöst und Iridium als interner Standard hinzugefügt. Zwei Milliliter der Lösung wurden auf eine Quarzplatte getropft, dann mit quantitativen Röntgenfluoreszenzmessungen untersucht und die Titankonzentration der Abrisse bestimmt.

2.3.7 Erstellen des Penetrationsprofils

Die Titankonzentrationen der untersuchten Abrisse werden als waagerechte Balken in das Hornschichtprofil eingetragen. Dadurch entsteht das Penetrationsprofil (Abbildung 9).

Zur besseren Veranschaulichung werden die Balken zentriert, der Wert 0 liegt in der Mitte der X-Achse. Die Skala ist nur in eine Richtung abzulesen, bezieht sich aber auf die ganze Länge des Balkens.


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Abbildung 9: Beispiel für ein Penetrationsprofil

2.4 Erster Teil der Versuche: Penetration

2.4.1 Vorversuch: Überprüfung des Abrissverfahrens

Damit die Abrissmethode zur Erstellung des Penetrationsprofils eingesetzt werden konnte, musste gezeigt werden, dass die Hornschicht vollständig entfernt wird. Nur so konnten Hornschicht- und Penetrationsprofil als Grundlage für weitere Betrachtungen dienen.

Für diese Untersuchungen wurden einem Probanden zwei Biopsien entnommen, um die vollständige Entfernung des Stratum corneum mit Hilfe der Abrissmethode nachzuweisen.

An der rechten Unterarmbeugeseite des Probanden wurde die Basis-Emulsion wie beschrieben aufgetragen. Nach einer Einwirkzeit von einer Stunde wurde das Abrissverfahren durchgeführt, bis der Tesafilmstreifen keine Korneozytenaggregate mehr enthielt. Gleich im Anschluss wurden die Biopsien entnommen, eine in dem Hautareal, in dem die Abrisse entfernt wurden und eine weitere relativ dicht daneben, in dem mit Emulsion behandelten Gebiet. Dazu wurden 3 mm Stanzen verwendet.

Die Biopsien wurden in Paraffin fixiert, in der Histopathologie der Hautklinik der Charité mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und histologische Schnitte (5 µm) erstellt.


30

2.4.2 Versuch: Langzeitpenetration verschiedener Titandioxid-Partikel

Die Untersuchungen zur Langzeitpenetration von Titandioxid wurden nach dem beschriebenen Verfahren mit Hilfe der Abrissmethode, spektroskopischen Messmethoden und Röntgenfluoreszenzmessungen durchgeführt. Sie sollten zunächst Aufschluss darüber geben, ob nach mehrfacher Applikation von titandioxidhaltiger Emulsion, ähnlich den realen Bedingungen während des Urlaubs am Meer, im unteren Teil der Hornschicht Titandioxid nachweisbar ist. Zugleich wurden die Veränderungen dieser Konzentrationen über mehrere Tage nach der letzten Applikation beobachtet. Die Versuche wurden mit zwei verschiedenen Titandioxidpartikeln an zwei Probanden durchgeführt. Bei einem Probanden wurden beide Titandioxid-Emulsionen an je einem Arm aufgetragen. So konnten orientierende Aussagen über den Einfluss der Partikelbeschaffenheit und über interindividuelle Unterschiede gemacht werden.

Die Applikation der Emulsion und die Entnahme der Abrisse erfolgte nach dem Protokoll der Tabelle 6. Die Probanden durften die Applikationsstelle über die ganze Zeit (Applikation und Abrissserien) nicht waschen. Die Stelle konnte aber tagsüber nach einer Einwirkphase von einer Stunde mit Textilien abgedeckt werden, ebenso nachts.

Die Abrisse wurden nach dem standardisierten Verfahren entnommen, jede Abrissserie von nebeneinanderliegenden Stellen der mit Emulsion behandelten Fläche. Es wurde darauf geachtet, die später zu untersuchenden Areale nicht zu berühren, auch nicht mit den aufgelegten Papierstreifen.

Tabelle 6: Applikationsschema und Zeitpunkte der Abrissserien.

 

8 Uhr

11 Uhr

14 Uhr

17 Uhr

20 Uhr

1. Tag

x

x

x

x

x

2. Tag

x

x

x

x

x

3. Tag

x

x

x

x

x

4. Tag

x

9 Uhr: Beginn der 1. Abrissserie

5. Tag

8 Uhr: 2. Abrissserie

6. Tag

-

7. Tag

-

8. Tag

8 Uhr: 3. Abrissserie

x = Applikation der Emulsion


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Zur Erstellung des Hornschichtprofils konnten die Abrisse mit Titandioxidpartikeln nicht verwendet werden, da die Extinktion der Korneozyten durch die Streuung der Partikel verfälscht wurde.

Daher wurde eine Woche vorher nach dem gleichen Applikationsschema die Basis-Emulsion auf eine separate Stelle aufgetragen und nach dem oben beschriebenen Plan auch die erste Abrissserie durchgeführt.

2.5 Zweiter Teil der Versuche: Penetrationswege

Zusätzlich zur qualitativen Untersuchung des Penetrationsverhaltens von Titandioxid war zu klären, welche Wege dafür eine Rolle spielen. Insbesondere den Einfluss der Haarfollikel war zu untersuchen. Dazu wurden einerseits die Positionen der Follikelöffnungen auf den Abrissen und andererseits der komplette Follikelkanal in einer Biopsie betrachtet.

2.5.1 Erster Vorversuch: Detektion der Follikelöffnungen auf den Abrissen

Um die Positionen der Follikelöffnungen auf den Abrissen zu untersuchen, musste eine Methode gefunden werden, diese Areale sichtbar zu machen.

Die Färbung mit Osmiumtetroxid ist neben der Fettfärbung mit Sudanfarbstoffen eine Methode für den Lipid-Nachweis. Osmiumtetroxid ist fettlöslich und bildet schwarze Reaktionsprodukte durch Anlagerung an Kohlenstoffdoppelbindungen.

Neben dem Haar befindet sich im Follikelkanal vor allem Talg, der von den assoziierten Talgdrüsen produziert wird. Talg besteht zu einem großen Teil aus Lipiden. Es sollte also versucht werden, die Follikelöffnungen auf den Abrissen mit Osmiumtetroxid zu markieren.

Drei Stunden vor dem Beginn der Abrissserie wurde nach der standardisierten Methode auf ein definiertes Areal eines Unterarms titandioxidhaltige Emulsion (UV-Titan) aufgetragen. In der Zwischenzeit hatte der Proband den Arm nicht abgedeckt und sich so wenig wie möglich bewegt, um ein gleichmäßiges Einwirken zu ermöglichen und ein Verwischen zu vermeiden.

Die Abrissmethode wurde variiert, indem die Tesafilmstreifen, die angefärbt werden sollten, vor dem Abreißen 10 Minuten auf der Haut belassen wurden. Damit sollte erreicht werden, dass die typischen Substanzen aus den Follikelöffnungen in die Klebeschicht des Tesafilmstreifens diffundieren und so eine intensive Färbung initiieren.

Die Versuche mussten mit größter Vorsicht unter dem Abzug ausgeführt werden. Es wurden Handschuhe getragen, um eine Kontamination mit dem giftigen Osmiumtetroxid zu vermeiden.


32

Tabelle 7: Färbemethode mit Osmiumtetroxidlösung.

1.

Lagern des Tesafilmstreifens in einer Petrischale.

2.

Auftropfen von Osmiumtetroxidlösung mit einer Pipette.

3.

Verteilen der Osmiumtetroxidlösung durch Bewegung der Petrischale. Sollte damit keine ausreichende Verteilung erzielt werden, wird ein Spatel verwendet, ohne den Streifen selbst zu berühren.

4.

Reicht die Menge der Osmiumtetroxidlösung nicht, um den Streifen völlig zu bedecken, muss zusätzlich Lösung aufgetropft und verteilt werden.

5.

Trocknen der Tesafilmstreifen unter dem Abzug.

6.

Eine Stunde warten.

7.

Zweimaliges Spülen der Tesafilmstreifen mit destilliertem Wasser.

8.

Erneut trocknen lassen.

2.5.2 Zweiter Vorversuch: Detektion der Partikel mit Laser-Scan-Mikroskopie

Orientierende Untersuchungen mit einem Fluoreszenzspektometer hatten ergeben, dass die Titandioxidpartikel (UV-Titan) im Bereich 600-680 nm fluoreszieren. Damit war die prinzipielle Möglichkeit gegeben, die Partikel unter dem Laser-Scan-Mikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm (Argonlaser) nachzuweisen. Da das Titandioxid keine Fluoreszenz im sichtbaren Spektralbereich besitzt, war anzunehmen, dass eine Substanz der Beschichtung für das beobachtete Signal verantwortlich ist.

Erste LSM-Untersuchungen wurden durchgeführt, um die getroffene Zuordnung der beobachteten Fluoreszenz zu den Titandioxid-Partikeln zu bestätigen.

Für die Messungen wurde ein Argonlaser der Firma Lambda Physik GmbH (Göttingen, Deutschland) und ein Laser-Scan-Mikroskop von der Firma Zeiss (Jena, Deutschland) vom Typ LSM 2000 verwendet.

Eine kleine Menge der Titandioxidpartikel wurde auf einen Probenträger aufgebracht und am Laser-Scan-Mikroskop untersucht. Da Titandioxid reflektiert, sind die Partikel durch die Messung der Reflexion darstellbar. In einem ausgewählten Bereich wurden zum Vergleich Reflexions- und laserinduzierte Fluoreszenzmessungen durchgeführt und die Ergebnisse verglichen.


33

2.5.3 Versuch: Ortsaufgelöster Nachweis der Partikel auf den Abrissen

Die Verteilung der Titandioxidpartikel sollte auf den mit Osmiumtetroxid gefärbten Abrissen durch Messungen am LSM untersucht werden. Dazu wurden verschiedene Abschnitte mehrerer Abrisse unter dem Laser-Scan-Mikroskop betrachtet. Besonderes Augenmerk richtete sich dabei auf die mit Osmiumtetroxid gefärbten Follikelöffnungen.

Das jeweilige Gebiet wurde mit dem Argonlaser (488 nm) bestrahlt und sowohl die Fluoreszenz als auch die Transmission in Überlagerung aufgenommen.

Die Ergebnisse sollten mit Hilfe der ortsaufgelösten Raman-Spektroskopie, welche den direkten Titandioxidnachweis ermöglicht, verglichen werden. Dazu wurde ein Raman-Spektrometer 2000 R der Firma Perkin Elmer verwendet. Der Messstrahl hatte einen Durchmesser von 0,5 nm. Nach Anregung mit dem Laserstrahl wurde das Ramanfluoreszenzspektrum in der Spektralregion von 3500 cm-1 bis 100 cm-1 gemessen.

2.5.4 Versuch: Nachweis der Follikelpenetration durch eine Biopsie

Zur weiteren Untersuchung der Follikelpenetration von Titandioxid sollte eine Biopsie entnommen werden, in der ein vollständiger Follikel enthalten ist, um den Titangehalt bis in die Tiefe zu verfolgen.

Die Emulsion (UV-Titan) wurde entsprechend dem Protokoll der Langzeitapplikation der quantitativen Penetrationsuntersuchungen aufgetragen. Eine Stunde nach der letzten Applikation wurden 10 Abrisse entfernt. Gleich im Anschluss wurde eine 3mm-Stanz-Biopsie entnommen, fixiert und in der Pathohistologie der Hautklinik der Charité aufbereitet. Die Probe wurde in 10 Mikrometer dünne Kryo-Schnitte geteilt. Dabei wurde darauf geachtet, von der Tiefe zur Hautoberfläche zu schneiden, um keine Partikel in die Tiefe zu verschleppen. Schon während der Prozedur des Schneidens wurden die einzelnen Schnitte untersucht, ob sie einen Follikelkanal enthalten. Ab dem Beginn des Follikels wurden die Schnitte sukzessive in 3 Kategorien eingeteilt, die mit unterschiedlichen Verfahren aufbereitet wurden:

1.Serie: Der jeweils erste Schnitt wurde auf einen Probenträger aus Glas fixiert und mit Hämatoxilin und Eosin gefärbt, um die Gewebestrukturen und die Position des Follikels lichtmikroskopisch deutlich sichtbar zu machen.


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2.Serie: Der jeweils zweite Schnitt wurde nicht gefärbt und war für Fluoreszenzmessungen unter dem Laser-Scan-Mikroskop vorgesehen.

3.Serie: Der jeweils dritte Schnitt wurde mit Gold bedampft und elektronenmikroskopisch mit Röntgenfluoreszenzmessungen untersucht, um die Verteilung des Titandioxid in der Probe zu ermitteln.

Diese Methode ist wesentlich empfindlicher als die Fluoreszenzmessungen unter dem Laser-Scan-Mikroskop.


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Thu Jul 10 16:59:45 2003