Rickmeyer, Christiane : Penetrationseigenschaften von beschichtetem mikrofeinem Titandioxid

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Kapitel 3. ERGEBNISSE

3.1 Erster Teil der Versuche: Penetration

3.1.1 Vorversuch: Überprüfung des Abrissverfahrens

Ziel des Vorversuches war es zu prüfen, ob es mit Hilfe des Abrissverfahrens möglich ist, die Hornschicht komplett zu entfernen.

Während und nach der Durchführung der Abrissserie konnten folgende Beobachtungen gemacht werden.

Abbildung 10: Unterarm nach dem Abrissverfahren und den beiden Biopsien.


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Die Biopsie der unbehandelten Haut zeigte in der HE-Färbung ein typisches Gewebe der Epidermis und Dermis des Unterarms. Die Furchung der Epidermis ist deutlich zu erkennen (Abbildung 11).

Abbildung 11: Biopsie der Haut des Unterarms außerhalb des Abrissareals.

Ein Vergleich mit der Biopsie, welche nach dem Abrissverfahren entnommen wurde, zeigt eine deutliche Schwellung der Haut an der Entnahmestelle. Die Falten und Furchen der Epidermis sind nicht mehr zu erkennen und das Gewebe ist deutlich heller, als Zeichen für ein Ödem. Es sind keine Hornschuppen über der Epidermis zu sehen (Abbildung 12).

Abbildung 12: Biopsie der Haut des Unterarms nach der Entnahme von 92 Abrissen.


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3.1.2 Versuch: Langzeitpenetration verschiedener Titandioxid-Partikel

1. Versuchsreihe: UV-Titan-Penetration (Proband 2, rechter Arm)

Zur Überprüfung des Penetrationsverhaltens von Titandioxid ins Stratum corneum wurde der rechte Arm des Probanden 2 mit der Emulsion behandelt, die die Partikel UV-Titan enthält. Anschließend wurde das Abrissverfahren durchgeführt und die Tesafilmstreifen untersucht.

In Abbildung 13 sind die dazugehörigen Penetrationsprofile zu sehen. Das Hornschichtprofil ist unauffällig und entspricht der Norm.

Bedingt durch die hohen Kosten der extern durchgeführten Röntgen-Fluoreszenz-Messungen wurden nur ausgewählte Abrisse untersucht (Tabelle 8).

Ein Großteil der Substanz ist im Profil nach einer Stunde im obersten Viertel lokalisiert. Die Substanzmenge pro Abriss nimmt zwischen dem zweiten und 10. Abriss rasch ab (entspricht ca. den obersten 25% der Hornschicht) und danach langsamer.

Der letzte Abriss, bei dem die Menge an Substanz untersucht wurde, war der 70. Auch hier konnte Titandioxid nachgewiesen werden, allerdings in minimalen Mengen nahe der Nachweisgrenze.

Im Profil nach 24 Stunden ist die Substanzmenge in den oberen Hornschichtlagen stark reduziert, auch in den unteren Schichten ist eine leichte Verminderung sichtbar.

Nach 96 Stunden erkennt man in allen Schichten nur noch minimale Substanzmengen, allerdings in den oberen Schichten immer noch mehr als in den unteren. Auch im 70. Abriss sind noch Spuren von Titandioxid zu finden.

2. Versuchsreihe: Tioveil-AQ-N-Penetration (Proband 2, linker Arm)

Um zu untersuchen, welchen Einfluss die Beschichtung der Partikel auf das Penetrationsverhalten von Titandioxid hat, wurde zum Vergleich simultan der linke Arm des Probanden mit einer anderen Substanz behandelt.

Das Penetrationsprofil vom linken Arm des Probanden 2 (Abbildung 14) zeigt ein ähnliches Bild wie das Profil des rechten Armes. Die Konzentration der Substanz in den oberen Schichten ist im Profil nach einer Stunde ein wenig geringer.

Der größte Unterschied wird im Penetrationsprofil nach 24 Stunden deutlich. Die Substanzmenge der obersten Schichten ist signifikant größer. In der Tiefe sind die Werte denen des rechten Armes relativ ähnlich.


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Nach 96 Stunden sind nur noch sehr geringe Mengen vorhanden. Auch hier sind die Werte etwas höher.

3. Versuchsreihe: Probandeneinfluss (Proband 3, linker Arm, Tioveil AQ-N)

Dieser Teil der Untersuchungen diente der Analyse des Probandeneinflusses auf das Penetrationsverhalten von Titandioxid. Dazu wurde eine weitere Abrissserie bei einem anderen Probanden durchgeführt.

Das Hornschichtprofil ist ebenfalls unauffällig und unterscheidet sich nur unwesentlich von dem des Probanden 2. Prinzipiell ist ein sehr ähnliches Penetrationsverhalten zu erkennen. Die geringfügigen Unterschiede drücken sich in den Abbildungen durch ein leicht verändertes Muster der Substanzverteilung aus (Abbildung 15).

Das Penetrationsprofil von Proband 3 zeigt nach einer Stunde etwas mehr Titandioxid in den oberen Hornschichten als im Fall von Proband 2.

Im Profil nach 24 Stunden befindet sich in den meisten Schichten weniger Titandioxid im Vergleich zu Proband 2.

Der Probandenvergleich nach 96 Stunden wiederum ergibt in den ersten Schichten der Hornhaut deutlich mehr Substanz bei Proband 3.

Bei allen 3 Versuchsreihen zeigt sich eine rasche Abnahme der Konzentration der Partikel, je tiefer man in die Hornschicht vordringt. Die hauptsächliche Menge befindet sich in den obersten 25 %. Auch in der Tiefe der Hornschicht (70. Abrisse) lässt sich Titandioxid in geringer Menge nachweisen. Schon nach 24 Stunden ist die Gesamtmenge in der Hornschicht erheblich vermindert, insbesondere die Werte der obersten Abrisse sind wesentlich kleiner. Auch nach 96 Stunden sind minimale Mengen in der Tiefe nachweisbar.


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Tabelle 8: Konzentrationen von Titandioxid auf den Abrissen [µg/cm2].

Abriss-nummer

1. Versuchsreihe

2. Versuchsreihe

3. Versuchsreihe

1 h

24 h

96 h

1 h

24 h

96 h

1 h

24 h

96 h

1

19,12

 

 

15,34

 

 

31,19

 

 

2

18,28

0,65

0,09

16,50

4,00

0,26

11,14

2,81

0,95

3

12,33

 

 

10,59

 

 

8,70

 

 

5

5,55

0,33

0,05

5,74

1,10

0,17

8,52

1,55

0,43

10

1,73

0,26

0,05

1,75

0,32

0,05

2,47

0,26

0,25

15

0,59

 

 

0,84

 

 

1,61

0,15

0,10

20

0,01

0,21

0,01

0,34

0,22

0,03

0,38

0,04

0,05

30

0,21

 

 

0,49

 

 

0,94

 

 

40

0,06

0,21

< 0,01

0,23

0,12

0,03

0,41

0

0,01

50

0,03

 

 

0,04

 

 

0,08

 

 

60

 

 

 

 

 

 

 

0

0,02

70

0

0,06

0,01

0,01

0,20

0,03

0

0

< 0,01


40

1. Versuchsreihe

Abbildung 13: Penetrationsprofile Proband 2, UV-Titan, rechter Arm.


41

2. Versuchsreihe

Abbildung 14: Penetrationsprofile Proband 2, Tioveil, linker Arm.


42

3. Versuchsreihe

Abbildung 15: Penetrationsprofile Proband 3, Tioveil, linker Arm.


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3.2 Zweiter Teil der Versuche: Penetrationswege

3.2.1 Erster Vorversuch: Detektion der Follikelöffnungen auf den Abrissen

Bei den Untersuchungen mit der Abrissmethode in Zusammenhang mit Titandioxid wurden folgende Beobachtungen gemacht:

Durch den hohen Titangehalt der Emulsion war die Haut nach der Applikation leicht weiß gefärbt. Im Laufe des Abrissverfahrens begann sie sich zu röten, die flächige weißliche Färbung verschwand. Gleichzeitig blieben auf der Haut einige kleine weiße Punkte sichtbar, für die ein Bezug zu den Follikelöffnungen anzunehmen war.

Abbildung 16: Rötung der behandelten Haut nach 40 Abrissen. Man erkennt einige weiße Punkte in dem geröteten Areal.

Um diese Vermutung zu bestätigen, wurden die Abrisse nach dem beschriebenen Verfahren mit Osmiumtetroxid gefärbt, um so die Follikelöffnungen zu markieren. In der folgenden Abbildung ist ein 25. Abriss nach der Färbung dargestellt.

Abbildung 17: Abriss (25.) nach Titandioxid-Applikation mit Osmiumtetroxid gefärbt.


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Es sind deutlich einzelne kleine Punkte zu erkennen. Die gefärbten Strukturen sind relativ gleichmäßig über die Abrissfläche verteilt.

3.2.2 Zweiter Vorversuch: Detektion der Partikel mit Laser-Scan-Mikroskopie

Der Vergleich der Reflexions- und Fluoreszenzaufnahmen der Titandioxidproben, welche mit Hilfe der Laser-Scan-Mikroskopie erhalten wurden, zeigt ein identisches Verteilungsmuster der Partikelreflexion und der Fluoreszenz der Beschichtung.

Abbildung 18: Titandioxidpartikel, Reflexionsmessungen.


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Abbildung 19: Titandioxidpartikel, Fluoreszenzmessungen (gleicher Ausschnitt).

3.2.3 Versuch: Ortsaufgelöster Nachweis der Partikel auf den Abrissen

Bei der Untersuchung der Tesafilm-Abrisse unter dem Laser-Scan-Mikroskop stellte sich heraus, dass die Fluoreszenz der Beschichtung der Partikel auf den Abrissen nicht homogen verteilt, sondern an verschiedene Strukturen gebunden ist. Außerdem unterscheidet sich die Verteilung auf den Abrissen, welche aus verschiedenen Schichten des Stratum corneum entnommen wurden, stark.

Abriss aus dem obersten Teil der Hornschicht

Die folgende Abbildung zeigt einen typischen Abriss vom obersten Teil der Hornschicht unter dem Laser-Scan-Mikroskop, aufgenommen als Überlagerung der Transmissions- und Fluoreszenzaufnahme. Die Transmission ist grün dargestellt. Sie zeigt den leeren Tesafilmstreifen und die Korneozytenaggregate. Die Fluoreszenz ist rot dargestellt.


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Abbildung 20: Typische Verteilung der Partikel (rot) auf dem 2. Abriss, der stellvertretend für einen Abriss der obersten Schicht der Hornschicht entnommen wurde (Aufnahme mit dem Laser-Scan-Mikroskop, Überlagerung von Transmission und Fluoreszenz).

Auf Abbildung 20 ist die charakteristische Fluoreszenz der Titandioxidprobe zu sehen, die in den Konturen der Hornschuppen auftritt. Die Partikel sind also an die Hornschuppen angelagert. Zusätzlich kann man erkennen, dass um die Hornschuppen herum Emulsionsbestandteile vorhanden sind. Auch dort erkennt man fluoreszierende Partikel.

In den mit Osmiumtetroxid angefärbten Follikelöffnungen konnten kleine Mengen Titandioxid nachgewiesen werden. Aufgrund der starken Fluoreszenzsignale aus den Bereichen der Hornschuppen wurden diese Signale teilweise überlagert. Dadurch wurde das Erkennen der schwächeren Signale aus den Follikelöffnungen in den zugehörigen Bildern wesentlich erschwert.


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25. Abriss

Diese Situation verändert sich, wenn Abrisse aus tieferen Schichten des Stratum corneum entnommen werden. Stellvertretend für die tieferen Schichten ist hier ein angefärbter Follikelabdruck des 25. Abrisses (Abbildung 21) dargestellt. Er zeigt signifikante Unterschiede im Vergleich zum 2. Abriss.

Abbildung 21: Follikelöffnung auf dem 25. Abriss unter dem Laser-Scan-Mikroskop.

Bei der Betrachtung des gefärbten Tesafilmstreifens unter dem Laser-Scan-Mikroskop sieht man über den Hornschuppen keine Fluoreszenz, hier befinden sich also keine Partikel. Die den Follikelöffnungen entsprechenden schwarzen Punkte sind dagegen gut zu erkennen. In einigen von ihnen kann man Fluoreszenzsignale identifizieren, die denen der Beschichtung der Partikel entsprechen. Diese Signale finden sich jedoch nur in etwa jeder achten Follikelöffnung. Außerhalb der Follikelöffnungen ist keine Fluoreszenz nachweisbar, weder auf den


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Korneozyten noch innerhalb der Tesafilmbereiche.

Während die Beschichtung der Partikel durch die Fluoreszenzmessungen sehr genau nachgewiesen werden konnte, war eine Reflexionsmessung zum Nachweis des Titandioxids in diesem Fall nicht möglich, weil das Signal in den Bereichen der Follikelöffnungen durch die Osmiumtetroxid-Färbung gestört wurde.

Um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz auch wirklich mit den beschichteten Partikeln korreliert, wurden die Abrisse zusätzlich mit Hilfe von Ramanspektroskopie analysiert.

Abbildung 22 zeigt das Spektrum der titandioxidhaltigen Emulsion (Eichspektrum).

Abbildung 22: Das Raman-Spektrum der titandioxidhaltigen Emulsion (UV-Titan).

In Abbildung 23 ist ein Spektrum dargestellt (schwarz), das im Abdruck einer Follikelöffnung gemessen wurde, in dem zuvor Fluoreszenzsignale gefunden wurden. Trotz starker Rauschsignale erkennt man deutlich die Übereinstimmung mit dem überlagerten Eichspektrum (blau).


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Abbildung 23: Spektrum der Messung innerhalb der Follikelöffnung (schwarz) im Vergleich mit dem Eichspektrum der titandioxidhaltigen Emulsion.

In Abbildung 24 werden die auf dem Abriss innerhalb (grün) und außerhalb (blau & schwarz) der Follikelöffnung gemessenen Spektren verglichen.

Abbildung 24: Spektrum der Messung innerhalb der Follikelöffnung (grün) im Vergleich mit den Spektren der Messungen außerhalb der Follikelöffnung (schwarz & blau).

Die Spektren zeigen, dass außerhalb der Follikelöffnungen kein Titandioxid nachgewiesen werden konnte.

Die Untersuchung mit Ramanspektroskopie bestätigt die Messung mit dem Laser-Scan-Mikroskop: Auf den Abrissen mit hoher Abrissnummer, die aus tieferen Schichten des Stratum corneum stammen, konnten die Mikropartikel nur in den Bereichen einiger Follikelöffnungen nachgewiesen werden.


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3.2.4 Versuch: Nachweis der Follikelpenetration durch eine Biopsie

Ausgehend von den beschriebenen Untersuchungen und den nachgewiesenen geringen Konzentrationen von beschichtetem Titandioxid in den tieferen Schichten des Stratum corneum wurde im weiteren versucht zu klären, wie tief diese Substanz in die Follikel eindringt. Da mit der Abrissmethode nur das Stratum corneum erfasst wird, wurden gezielte Biopsien entnommen und untersucht.

1. HE-Färbung

Der mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte histologische Schnitt einer Biopsie verdeutlicht die Strukturen innerhalb der Epidermis und Dermis. In Abbildung 25 erkennt man einen vollständigen Follikel und rechts daneben eine Talgdrüse. Auf anderen Schnitten dieser Biopsie ist noch ein zweiter Follikel zu sehen. Die Biopsie weist keine Abnormitäten auf.

Abbildung 25: HE-Färbung eines Follikels der Biopsie


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2. Fluoreszenzmessungen

Die Struktur des ungefärbten Gewebes konnte mit dem Laser-Scan-Mikroskop sichtbar gemacht werden (Abbildung 26). Auf der Abbildung erkennt man gut das Vorhandensein zweier Follikelkanäle. Die Bezeichnungen "rechter" und "linker Follikelkanal" im Folgenden beziehen sich auf diese Abbildung. Der Durchmesser des Messspots betrug 50 µm.

Es stellte sich heraus, dass die in den Follikeln natürlich vorhandene Substanz in einem ähnlichen Wellenlängenbereich fluoresziert wie die Beschichtung der Partikel. Diese Tatsache führte zu einer Überlagerung beider Fluoreszenzsignale, die den Nachweis der Partikel erschwerte.

Daher wurden die weiteren Untersuchungen mit Röntgenfluoreszenzmessungen durchgeführt.

Abbildung 26: Struktur des ungefärbten Gewebes, Laser-Scan-Mikroskopie. Die blauen Punkte markieren charakteristische Messpunkte.


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3. Röntgenfluoreszenzanalyse

Durch die elektronenmikroskopische Untersuchung der Proben unter Anwendung der Röntgenfluoreszenzanalyse war es möglich, das Vorhandensein von Titan im Gewebe direkt zu untersuchen. Es stellte sich heraus, dass sich bezüglich der gemessenen Titankonzentration die Schnitte grob in drei verschiedene Bereiche einteilen ließen.

Erster Bereich: Epidermis

In allen Schnitten konnten im Bereich der Epidermis Spuren von Titan festgestellt werden. Abbildung 27 zeigt ein Röntgenfluoreszenzspektrum innerhalb der Epidermis mit einem gut sichtbaren titanspezifischen Peak bei 4,5 keV. Dieses Ergebnis korrespondiert mit den Abrissuntersuchungen, die gezeigt haben, dass auch nach dem 10. Abriss eine Restkonzentration von Titandioxid auf der Haut gefunden werden konnte.

Zweiter Bereich: Rechter Follikelkanal

Innerhalb des rechten Follikelkanals konnte Titan in geringer Konzentration nachgewiesen werden. Die Konzentration verringerte sich innerhalb des Kanals von der Öffnung zur Wurzel hin stark. In allen Schnitten, die Teile dieses Follikels enthielten, wurden Titanspuren innerhalb des Follikelkanals gefunden. Im benachbarten Follikelkanal (linker Follikelkanal in Abbildung 26) dagegen wurde in keinem Schnitt Titan gefunden.

Dritter Bereich: Alle anderen Gebiete der Biopsie

Außerhalb der beiden ersten Bereiche, also im Gebiet von lebenden Zellen, konnten keine Spuren von Titan nachgewiesen werden, auch nicht seitlich des Follikelkanals. Alle untersuchten Schnitte der Biopsie bestätigen dieses Ergebnis.

Titan wurde ausschließlich in den oberen Schichten des Stratum corneum und in einem der beiden Follikelkanäle gefunden.


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Tabelle 9: Relative Röntgen-Fluoreszenzintensität von Titan in den Bereichen der Biopsie.

Gemessenes Gebiet der Biopsie

Relative Röntgen-Fluoreszenzintensität von Ti (Mittelwert ± Standardabweichung)

Stratum corneum

6,8 ± 2,6

Rechter Follikelkanal

1,5 ± 1,0

Andere Gebiete der Biopsie

0

Abbildung 27: Nachweis des Titan-Peaks im Röntgenfluoreszenzspektrum in der Hornschicht der Biopsie.


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