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2.  Material und Methoden

2.1 Patienten und Gewebe

Die Untersuchung umfasst das Material von 20 Patienten. In allen Fällen handelt es sich um klinisch diagnostizierte Arthrosen (Sulzbacher 2000, Hoaglund & Steinbach 2001). Von 19 der 20 Patienten lag das Material als kryopräserviertes Gewebe vor, bei einem Patienten wurde in Paraffin eingebettetes Material verwendet. Das Gewebe stammte in 18 Fällen aus dem Knie, in weiteren 2 Fällen handelte es sich um Synovialgewebe aus der Hüfte. (Tabelle 2.2.1)

2.2 Aufarbeitung des Gewebes

2.2.1 Aufarbeitung des Gewebes für Kryostatschnitte (Immunhistochemie)

Das Gewebe wurde sofort nach der Entnahme in 1x1x2,5cm große Kunststoffgefäßen mit Tissue TekR (Miles, Eckhart, USA) bedeckt und in flüssigem Stickstoff bei -180°C schockgefroren. Für immunhistochemische Färbungen wurden von den schockgefrorenen Gewebsstückchen 7 µm dicke Seriengefrierschnitte an dem Kryostaten 2800 Frigocut N (Reichert-Jung, Nussloch) angefertigt, auf mit Silan beschichteten Objektträgern aufgebracht und zwölf Stunden lang luftgetrocknet. Diese wurden anschließend bei -70°C aufbewahrt.

2.2.2 Aufarbeitung des Gewebes für Paraffinschnitte (Immunhistochemie)

Die unmittelbar nach Gewebsentnahme in 4%igem, gepuffertem Formalin fixierten Gewebsblöcke (etwa 1x1x2cm) wurden in Paraffin eingebettet und mittels eines Mikrotoms 4 µm dicke Schnitte angefertigt, analog den Kryostatschnitten auf mit Silan beschichtete Objektträger verbracht und bei 37°C für 2 Stunden getrocknet. Anschließend wurden die Schnitte entweder bei Raumtemperatur aufbewahrt oder es erfolgte die Entparaffinisierung in der absteigenden Alkoholreihe. Nach der Entparaffinisierung wurden die Schnitte für 15 Minuten in 30%iger Zitronensäure gekocht. Nach einem dreifachen Waschgang mit PBS waren die Paraffinschnitte für die anschließende Färbung vorbereitet.


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2.3  Immunhistochemie

2.3.1 Indirekte Immunperoxidase Technik (iIP)

Die indirekte Immunoperoxidase Technik (iIP) wurde zum Nachweis der Plasmazell Antigene IgG, IgA, IgM, Kappa und Lambda, der B-Zell Antigene CD 20, CD 27 und CD 40, der T-Zell Antigene CD3, CD 4, CD 8, sowie den FDC-Antigenen Ki-M4 und CD 23, CD 68 (KiM6 = Makrophagenantigen) und Ki-67 (Proliferationsantigen) an Kryostatschnitten angewendet.

IgG, IgA, IgM, Kappa und Lambda sowie CD 20 und CD 23 wurden zusätzlich nochmals an Paraffinschnitten untersucht.

Der primäre Antikörper wurden 1:20 bis zu 1: 800 verdünnt (siehe Tabelle 2.2). Der sekundäre, peroxidase-konjugierte Kaninchen anti-Maus-Antikörper (DAKO Diagnostica, Hamburg) sowie der tertiäre, ebenfalls peroxidase-konjugierte Ziege anti-Kaninchen-Antikörper (Medac, Hamburg) wurde im Verhältnis 1:50 mit einem Gemisch aus 70% PBS-Puffer (pH 7,4) und 30% AB Rh-positivem Humanserum verdünnt. Für die Farbreaktion wurde hier 3,3 Diaminobenzidin (Sigma Chemie, Deisenhofen) in 10 ml PBS-Puffer (pH 7,4) gelöst; unmittelbar vor Auftragen auf die Schnitte wurde 5 µl 30%iges H202 (Merck, Darmstadt) zugesetzt, um die endogene Peroxidase-Aktivität zu unterdrücken.

Die indirekte Immunperoxidasetechnik umfaßt folgende Schritte: Nach einer 15-minütigen Acetonfixierung mit anschließender dreifacher PBS- Spülung wurden die Gefrierschnitte mit dem primären, sekundären und tertiären Antikörper je 30 min lang in einer feuchten Kammer inkubiert und anschließend in Tris-NaCl-Puffer (pH 7,4) gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Zur Entwicklung wurden die Schnitte 10 min mit dem DAB-Substratkomplex inkubiert und im Anschluß an die Substratentwicklung mit Tris-NaCl-Puffer (pH 7,4) gewaschen, um nicht verbrauchtes Diaminobenzidin zu entfernen. Die Schnitte wurden mit Hämalaun-Lösung 5 min gegengefärbt und nach einer 10 minütigen Spülung unter laufendem Wasser, wurden die Präparate mit Kaisers® Glyceringelantine eingedeckt. Die nachzuweisenden Antigene stellten sich auf diese Weise als braune Präzipitate dar.

Um unspezifische Reaktionen sowohl des sekundären als auch des tertiären Antikörpers an den Schnittpräperaten beurteilen zu können, wurde als Kontrolle in allen Fällen der primäre monoklonale Antikörper durch AB Rh-positives Humanserum ersetzt. Durch diese Kontrolle konnte auch gleichzeitig eine mögliche, trotz der H202-Behandlung vorhandene, endogene Peroxidasereaktion beurteilt werden.

2.3.2 Indirekte Immunperoxidase Technik zum Cytokin Nachweis

Im Unterschied zum Nachweis zytomembranöser Antigene wie z. B. CD 20 wurden die Schnitte, die für den Cytokinnachweis bestimmt waren, im Anschluss an die Fixierung mit Aceton für weitere dreißig Minuten Sapronin-PBS inkubiert, um eine Permeabilität der Zellstrukturen für den Antikörper zu gewährleisten. Die Inkubationszeit mit dem primären Antikörper wurde auf eine Stunde verlängert. Im weiteren entsprach die Behandlung dem in 2.3.1. beschriebenen Procedere.

2.3.3 Indirekte Immunofluoreszenz (iIFL)

Mithilfe der indirekten Immunfluoreszenz wurden die Plasmazell-Antigene IgG, IgA und IgM, sowie die leichten Ketten Kappa und Lambda in Paraffinschnitten nachgewiesen. Nach einstündiger Inkubation mit den Primärantikörpern folgte dreimaliges Waschen der Schnittpräparate mit PBS sowie eine 60 minütige Inkubation mit dem, für den primären Antikörper jeweils spezifischen sekundären, Fluoreszein gekoppelten Antikörper FITC-konjugierter Rabbit-anti-Mouse für CD 20, FITC-konjugierter Goat-anti-Rabbit für IgG, IgA und IgM sowie Kappa und Lambda. Die im Anschluß einmal mit PBS gespülten Schnitte wurden erneut mit PBS zweimal gespült und dann mit der Einbettlösung für Immunfluoreszenz eingebettet. Die Auswertung erfolgte unmittelbar danach am Fluoreszenzmikroskop (Firma Leitz) bei einer Wellenlänge von 490 nm.


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Um unspezifische Reaktionen sowohl des sekundären als auch des tertiären Antikörpers an den Schnittpräparaten beurteilen zu können, wurde als Kontrolle in allen Fällen der primäre monoklonale Antikörper durch AB Rh-positives Humanserum ersetzt. Durch diese Kontrolle konnte auch gleichzeitig eine Autofluoreszenz beurteilt werden.


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2.4  Auswertung der Übersichtspräparate

Die mit Hämalaun gefärbten Präparate dienten zum einen als negative Kontrollen, zum anderen wurde an ihnen das Ausmaß des Entzündungsgrades festgehalten gemäß der Klassifikation nach Krenn 1999.

2.5 Auswertung der Immunhistochemischen Färbungen

Die Intensität der zytoplasmatischen immunhistochemischen Reaktivität wurde semiquantitativ erfaßt und in einer Skala von -, o und + graduiert. (- = negative Reaktion, o= vereinzelte bis mäßige Reaktion, + = starke Reaktion), weiterhin wurde die Lokalisation der Zellen erfaßt und nach folgenden Regionen unterteilt: Lokalisation mit direkt räumlichem Bezug zur Deckzellschicht, perivaskuläre Lokalisation oder diffuse Lokalisation im Präparat.

In den immunhistochemisch auf IL-2 und IL-10 untersuchten Präparaten wurde noch eine zytomorphologische Differenzierung der Zellen in Rundzellen, Makrophagen oder Epithelzellen vorgenommen, um eine Aussage zu erhalten, ob die Zytokine von Lymphozyten, Makrophagen oder Epithelien produziert werden.

2.6 Statistische Analyse

Aufgrund der Datenlage (semiquantitative Beschreibung von räumlicher Verteilung und Ausprägungsgrad des entzündlichen Infiltrates) ist lediglich eine Beschreibung der Häufigkeitsverteilung möglich.

2.7 Fotodokumentation

Die Fotodokumentation der immunhistochemischen Präparate erfolgte auf AGFAâ RSX 50 für die iIP, auf Scotch âCHROME 640-T für die iIFL. Die Bilder wurden unter normierten Bedingungen mit einem Zeiss Axiophot erstellt.


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2.8  Reagenzien

Reagenz

Hersteller

Anti Human CD Antikörper

PharMingen, Heidelberg

Peroxidase- konjugierte Kaninchen anti- Maus-Antikörper

DAKO, Dänemark

Peroxidase- konjugierte Ziege anti- Kaninchen-Antikörper

Medac, Hamburg

Kaisers® Glyceringelantine

Sigma Chemie, Deisenhofen

3,3 Diaminobenzidin

Sigma Chemie, Deisenhofen

2.9 Apparate

Produkt

Hersteller

Inkubationskammer

 

Zentrifuge Biofuge 15 R

Heraeus Sepatech, Osterode

Kryostat 2800 Frigocut GNA 100

Pharmacia, Freiburg

Rotationsschüttler

Vortex-Genie 2, N. Y. USA

Fluoreszenzmikroskop

(Firma Leitz)


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2.10  Tabellen

Tabelle 2.2.1 Patienten und Gewebe

Patient Nr.

Fall Nr.

IFS

Alter

Geschlecht

Lokalisation

1

174

1

65

W

Knie

2

182

2

71

M

Knie

3

183

1

61

M

Knie

4

184

1

69

W

Knie

5

186

1

79

W

Knie

6

188

1

75

W

Knie

7

190

1

70

M

Knie

8

191

1

80

W

Knie

9

202

1

58

M

Knie

10

207

2

77

W

Knie

11

208

1

76

W

Knie

12

209

1

72

W

Knie

13

233

1

76

M

Knie

14

234

1

71

W

Knie

15

237

1

77

W

Knie

16

238

1

61

W

Hüfte

17

242

1

57

M

Hüfte

18

243

1

58

W

Knie

19

20553

1

78

W

Knie

20

22830

2

75

W

Knie

IFS = inflammatory score (nach Krenn 1999a) [Seite 15↓]

Tabelle 2.2.2 Liste der monoklonalen Antikörper

Antigen

Spezies

Verdünnung

Quelle

IgG

Maus/ Kaninchen

1:8000

Dianova, Hamburg, D.

IgA

Maus/ Kaninchen

1:4000

Pharmingen, USA

IgM

Maus/ Kaninchen

1:2

Kreipe et al. Würzburg / Hannover

Kappa

Maus/ Kaninchen

1:200

Dianova, Hamburg, D.

Lambda

Maus / Kaninchen

1:400

Dianova, Hamburg, D.

CD 20

Maus

1:4000

DAKO, Dänemark

CD 23

Maus

1:20

AG Kiel

CD 40

Maus

1:20

DAKO, Dänemark

CD 27

Maus

1:500

DAKO, Dänemark

CD3

Maus

1:100

Immunotech, Frankreich

CD 4

Maus

1:100

Dianova, Hamburg, D.

CD 8

Maus

1:200

Dianova, Hamburg, D.

IL-2

Maus

1:5

R&D SYSTEMS, Wiesbaden

IL-10

Maus

1:50

R&D SYSTEMS, Wiesbaden

Ki-M4

Maus

1:4000

Dianova, Hamburg, D

CD 68

Maus

1:8000

DAKO, Dänemark

Ki-67

Maus

1:10

Dianova, Hamburg, D

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18.11.2003