2.  Material und Methoden

Die Untersuchung umfasst das Material von 20 Patienten. In allen Fällen handelt es sich um klinisch diagnostizierte Arthrosen (Sulzbacher 2000, Hoaglund & Steinbach 2001). Von 19 der 20 Patienten lag das Material als kryopräserviertes Gewebe vor, bei einem Patienten wurde in Paraffin eingebettetes Material verwendet. Das Gewebe stammte in 18 Fällen aus dem Knie, in weiteren 2 Fällen handelte es sich um Synovialgewebe aus der Hüfte. (Tabelle 2.2.1)

Das Gewebe wurde sofort nach der Entnahme in 1x1x2,5cm große Kunststoffgefäßen mit Tissue Tek^R (Miles, Eckhart, USA) bedeckt und in flüssigem Stickstoff bei -180°C schockgefroren. Für immunhistochemische Färbungen wurden von den schockgefrorenen Gewebsstückchen 7 µm dicke Seriengefrierschnitte an dem Kryostaten 2800 Frigocut N (Reichert-Jung, Nussloch) angefertigt, auf mit Silan beschichteten Objektträgern aufgebracht und zwölf Stunden lang luftgetrocknet. Diese wurden anschließend bei -70°C aufbewahrt.

Die unmittelbar nach Gewebsentnahme in 4%igem, gepuffertem Formalin fixierten Gewebsblöcke (etwa 1x1x2cm) wurden in Paraffin eingebettet und mittels eines Mikrotoms 4 µm dicke Schnitte angefertigt, analog den Kryostatschnitten auf mit Silan beschichtete Objektträger verbracht und bei 37°C für 2 Stunden getrocknet. Anschließend wurden die Schnitte entweder bei Raumtemperatur aufbewahrt oder es erfolgte die Entparaffinisierung in der absteigenden Alkoholreihe. Nach der Entparaffinisierung wurden die Schnitte für 15 Minuten in 30%iger Zitronensäure gekocht. Nach einem dreifachen Waschgang mit PBS waren die Paraffinschnitte für die anschließende Färbung vorbereitet.

Die indirekte Immunoperoxidase Technik (iIP) wurde zum Nachweis der Plasmazell Antigene IgG, IgA, IgM, Kappa und Lambda, der B-Zell Antigene CD 20, CD 27 und CD 40, der T-Zell Antigene CD3, CD 4, CD 8, sowie den FDC-Antigenen Ki-M4 und CD 23, CD 68 (KiM6 = Makrophagenantigen) und Ki-67 (Proliferationsantigen) an Kryostatschnitten angewendet.

IgG, IgA, IgM, Kappa und Lambda sowie CD 20 und CD 23 wurden zusätzlich nochmals an Paraffinschnitten untersucht.

Der primäre Antikörper wurden 1:20 bis zu 1: 800 verdünnt (siehe Tabelle 2.2). Der sekundäre, peroxidase-konjugierte Kaninchen anti-Maus-Antikörper (DAKO Diagnostica, Hamburg) sowie der tertiäre, ebenfalls peroxidase-konjugierte Ziege anti-Kaninchen-Antikörper (Medac, Hamburg) wurde im Verhältnis 1:50 mit einem Gemisch aus 70% PBS-Puffer (pH 7,4) und 30% AB Rh-positivem Humanserum verdünnt. Für die Farbreaktion wurde hier 3,3 Diaminobenzidin (Sigma Chemie, Deisenhofen) in 10 ml PBS-Puffer (pH 7,4) gelöst; unmittelbar vor Auftragen auf die Schnitte wurde 5 µl 30%iges H₂0₂ (Merck, Darmstadt) zugesetzt, um die endogene Peroxidase-Aktivität zu unterdrücken.

Die indirekte Immunperoxidasetechnik umfaßt folgende Schritte: Nach einer 15-minütigen Acetonfixierung mit anschließender dreifacher PBS- Spülung wurden die Gefrierschnitte mit dem primären, sekundären und tertiären Antikörper je 30 min lang in einer feuchten Kammer inkubiert und anschließend in Tris-NaCl-Puffer (pH 7,4) gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Zur Entwicklung wurden die Schnitte 10 min mit dem DAB-Substratkomplex inkubiert und im Anschluß an die Substratentwicklung mit Tris-NaCl-Puffer (pH 7,4) gewaschen, um nicht verbrauchtes Diaminobenzidin zu entfernen. Die Schnitte wurden mit Hämalaun-Lösung 5 min gegengefärbt und nach einer 10 minütigen Spülung unter laufendem Wasser, wurden die Präparate mit Kaisers® Glyceringelantine eingedeckt. Die nachzuweisenden Antigene stellten sich auf diese Weise als braune Präzipitate dar.

Um unspezifische Reaktionen sowohl des sekundären als auch des tertiären Antikörpers an den Schnittpräperaten beurteilen zu können, wurde als Kontrolle in allen Fällen der primäre monoklonale Antikörper durch AB Rh-positives Humanserum ersetzt. Durch diese Kontrolle konnte auch gleichzeitig eine mögliche, trotz der H₂0₂-Behandlung vorhandene, endogene Peroxidasereaktion beurteilt werden.

Im Unterschied zum Nachweis zytomembranöser Antigene wie z. B. CD 20 wurden die Schnitte, die für den Cytokinnachweis bestimmt waren, im Anschluss an die Fixierung mit Aceton für weitere dreißig Minuten Sapronin-PBS inkubiert, um eine Permeabilität der Zellstrukturen für den Antikörper zu gewährleisten. Die Inkubationszeit mit dem primären Antikörper wurde auf eine Stunde verlängert. Im weiteren entsprach die Behandlung dem in 2.3.1. beschriebenen Procedere.

Mithilfe der indirekten Immunfluoreszenz wurden die Plasmazell-Antigene IgG, IgA und IgM, sowie die leichten Ketten Kappa und Lambda in Paraffinschnitten nachgewiesen. Nach einstündiger Inkubation mit den Primärantikörpern folgte dreimaliges Waschen der Schnittpräparate mit PBS sowie eine 60 minütige Inkubation mit dem, für den primären Antikörper jeweils spezifischen sekundären, Fluoreszein gekoppelten Antikörper FITC-konjugierter Rabbit-anti-Mouse für CD 20, FITC-konjugierter Goat-anti-Rabbit für IgG, IgA und IgM sowie Kappa und Lambda. Die im Anschluß einmal mit PBS gespülten Schnitte wurden erneut mit PBS zweimal gespült und dann mit der Einbettlösung für Immunfluoreszenz eingebettet. Die Auswertung erfolgte unmittelbar danach am Fluoreszenzmikroskop (Firma Leitz) bei einer Wellenlänge von 490 nm.

Um unspezifische Reaktionen sowohl des sekundären als auch des tertiären Antikörpers an den Schnittpräparaten beurteilen zu können, wurde als Kontrolle in allen Fällen der primäre monoklonale Antikörper durch AB Rh-positives Humanserum ersetzt. Durch diese Kontrolle konnte auch gleichzeitig eine Autofluoreszenz beurteilt werden.

Die mit Hämalaun gefärbten Präparate dienten zum einen als negative Kontrollen, zum anderen wurde an ihnen das Ausmaß des Entzündungsgrades festgehalten gemäß der Klassifikation nach Krenn 1999.

Die Intensität der zytoplasmatischen immunhistochemischen Reaktivität wurde semiquantitativ erfaßt und in einer Skala von -, o und + graduiert. (- = negative Reaktion, o= vereinzelte bis mäßige Reaktion, + = starke Reaktion), weiterhin wurde die Lokalisation der Zellen erfaßt und nach folgenden Regionen unterteilt: Lokalisation mit direkt räumlichem Bezug zur Deckzellschicht, perivaskuläre Lokalisation oder diffuse Lokalisation im Präparat.

In den immunhistochemisch auf IL-2 und IL-10 untersuchten Präparaten wurde noch eine zytomorphologische Differenzierung der Zellen in Rundzellen, Makrophagen oder Epithelzellen vorgenommen, um eine Aussage zu erhalten, ob die Zytokine von Lymphozyten, Makrophagen oder Epithelien produziert werden.

Aufgrund der Datenlage (semiquantitative Beschreibung von räumlicher Verteilung und Ausprägungsgrad des entzündlichen Infiltrates) ist lediglich eine Beschreibung der Häufigkeitsverteilung möglich.

Die Fotodokumentation der immunhistochemischen Präparate erfolgte auf AGFAâ RSX 50 für die iIP, auf Scotch âCHROME 640-T für die iIFL. Die Bilder wurden unter normierten Bedingungen mit einem Zeiss Axiophot erstellt.

Tabelle 2.2.1 Patienten und Gewebe

IFS = inflammatory score (nach Krenn 1999a) [Seite 15↓]

Tabelle 2.2.2 Liste der monoklonalen Antikörper

[Seite 16↓]