Ergebnisse

Blattmuster mit unregelmäßiger makulater Musterung Araceae Mikroskopische Untersuchungen an Syngonium podophyllum ‘Variegata’

Untersuchungen an Blattquerschnitten von Syngonium podophyllum ‘Variegata’ zeigten eine einschichtige untere und obere Epidermis. An die untere Epidermis schließen sich 3 bis 5 Schwammparenchymschichten und eine Palisadenparenchymschicht an (Abbildung 11).

Abbildung 11: Querschnitt durch ein Blatt von Syngonium podophyllum. Im Mesophyll befinden sich Zellen mit grünen oder mutierten Plastiden.

Mischzellennachweise bei Syngonium podophyllum ‘Variegata’

Im Mesophyll der älteren Blätter sind nur Zellen mit normalen oder ohne Chloroplasten zu finden. Bei diesen Blättern ist der Nachweis von Mischzellen sehr schwierig zu erbringen, da die weißen Plastiden im Blatt keine korpuskuläre Struktur mehr besitzen und deshalb nicht zweifelsfrei gemeinsam mit grünen Plastiden in der gleichen Zelle gefunden werden können. Ausgehend von den vorhergehenden Beobachtungen wurden besonders feingescheckte, junge Blattbereiche untersucht, da an solchen Stellen die Wahrscheinlichkeit am größten ist, mutierte, nicht zerfallene Plastiden neben grünen Plastiden in einer Zelle zu finden. In diesen Blattbereichen konnten Mischzellen nachgewiesen werden (Abbildung 12). In der Regel sind die Zellen jedoch schon entmischt und man kann Zellen mit großen, normalen, grünen Chloroplasten oder mit kleineren, mutierten Chloroplasten finden.

Abbildung 12: Mischzellen im Gewebe von variegatem Syngonium podophyllum. links: In den Zellen des Palisadenparenchyms befinden sich mutierte und unmutierte Plastiden, rechts: Die Zelle des Palisadenparenchyms enthält zerfallene mutierte Plastiden und eine unmutierte Plastide.

Spontane Entmischung bei Syngonium podophyllum ‘Variegata’

Als Ausgangsmaterial für die spontanen Entmischungsversuche bei Syngonium podophyllum wurden Stecklinge von Pflanzen entnommen, die einen Blattbereich mit feinem Grün-Weiß-Mosaik besaßen. Jeder Steckling bestand aus einen Sprossteilstück mit einem Blatt und einer Achselknospe. Das Ausgangmaterial wurde zurückgeschnitten als die Pflanzen 8 Internodien hatten, um den Austrieb der Seitensprosse zu induzieren und gleichzeitig Material für die Vermehrung der Klone zu gewinnen (Tabelle 10).

Pflanzen gesamt

Internodien gesamt

Blätter gesamt

Internodien/ Pflanze

Blätter/ Pflanze

Ausgangsklone

9

78

80

8,7

8,9

Wachstum von
Seitensprossen an
Ausgangsklonen

14

224

222

16

15,9

Vermehrung der
Ausgangsklone

44

565

564

12,8

12,8

Gesamt

67

867

866

12,5

12,5

Tabelle 10: Ergebnisse der Vermehrung der Klone von Syngonium podophyllum ‘Variegata’

Es wurde keine Weißrand- bzw. Weißkernform von Syngonium podophyllum gefunden. Nach der Vermehrung der bunten Formen dieser Pflanze traten immer nur Formen mit entweder weißen oder grünen Blättern auf (Tabelle 11) oder der makulate Typ blieb erhalten. Blattquerschnitte zeigten, dass im Bereich des Mesophylls die einzig möglichen stabilen Erscheinungsformen grün oder weiß sind. Epidermisabzüge sowohl bei grünen Klonen als auch bei weißen Sprossen an den Entmischungspflanzen belegen, dass Chlorophyll in der Epidermis ausschließlich in den Stomataplastiden gebildet wird (Abbildung 13).

Ausgangsmuster

Endmuster

Anzahl der Pflanzen

Anfang der Entmischung
(Internodium/Blatt)

Variegat

Variegat

52

Keine

Variegat

Grün

7

Keine

Variegat

Grün

6

9 – 20

Variegat

Weiß

2

7 – 21

Gesamt

67

Tabelle 11: Entwicklung des Blattmusters während des Pflanzenwachstums von Syngonium podophyllum ‘Variegata’.

Auf Grund der bisherigen Ergebnisse ist für die makulaten Sprosse der Scheitelaufbau L1 grün, L2 makulat (GM) und für Sprosse mit Sektormuster der meriklinalchimärische Aufbau L1 grün und L2 entweder grün, weiß oder makulat (GG/W/M) anzunehmen. Phänotypisch weiße Sprosse sind entsprechend Periklinalchimären mit der Scheitelschichtung L1 grün und L2 weiß (GW). Bei den homohistisch grünen Sprossen sind L1 und L2 grün.

Abbildung 13: Syngonium podophyllum, oben: Epidermisabzug. Schließzellen enthalten normale, grüne Plastiden. unten: Querschnitt durch Blätter,links: homohistisch grüne Pflanze, rechts: Chimäre der Konstitution GW.

Beteiligung der Epidermis bei der Mesophyllbildung

An der Spreitenbasis und an den Nebenblättern bei entmischten weißen Sprossen sind kleine grüne Randbereiche zu beobachten. Diese Blätter zeigen normal grüne Schließzellen in der Epidermis. Die Befunde deuten darauf hin, dass eine grüne L1 eine weiße L2 überzieht (Abbildung 14). Da kein Weißrandblatt beobachtet werden konnte, ist darauf zu schließen, dass L2 fast ausschließlich (bis auf eine geringe L1-Beteiligung) das Mesophyll des Blattes bildet.

Abbildung 14: Syngonium podophyllum: Querschnitt durch einen grünen Randbereich

Stabilität nach Plastidenentmischung

Zur Überprüfung der Stabilität nach Plastidenentmischung wurden Klone von sechs unabhängig voneinander entstandenen grünen Sprossen angelegt und davon vier weiter vermehrt. Alle Ausgangsklone und alle daraus hervorgegangenen Klone sind grün geblieben. Die neu ausgetriebenen Seitensprosse der Ausgangsklone waren ebenfalls grün (Tabelle 12).

Pflanzen
gesamt

Internodien
gesamt

Blätter
gesamt

Indernodien/
Pflanze
oder Trieb

Blätter/
Pflanze
oder Trieb

Ausgangsklone

6

80

79

13,3

13,1

Wachstum von
Seitensprossen an
Ausgangsklonen

12

177

170

14,75

14,16

Vermehrung der
Ausgangsklone

36

284

284

7,9

7,9

Gesamt

54

541

533

10,0

9,9

Tabelle 12: Ergebnisübersicht der Überprüfung der Stabilität von Syngonium podophyllum mit einheitlich grünen Blättern.

Auf Grund der Tatsache, dass es bei Syngonium überhaupt keine Blüte gab, war es nicht möglich, die Selbstungsmethode von variegaten Pflanzen anzuwenden, um zu einem indirekten Beweis für die Existenz von Mischzellen zu kommen.

In-vitro-Kultur von Syngonium podophyllum ‘Variegata’

Eine In-vitro-Kallusbildung aus Blättern konnte bei Syngonium podophyllum nicht erreicht werden, doch ließen sich Sprossspitzen über einen gewissen Zeitraum kultivieren. Bessere Ergebnisse wurden mit Internodienstücken erreicht, obwohl die Kallus- und Sprossbildung aus Parenchymzellen bei Monokotylen besonders schwierig zu induzieren ist. In der Tabelle 13 wurden die Ergebnisse der Induktionsversuche der verschiedenen Explantate zusammengefasst, um die Wirkung von TDZ und AgNO₃bei der Adventivsprossbildung ablesen zu können (Abbildung 15).

Phytohormone

Sprossanzahl

TDZ (mg/l)

AgNO₃ (mg/l₎

0

0

0

0

1,7

0

0

3,4

0

1

0

0

1

1,7

1

1

3,4

0

2

0

2

2

1,7

0

2

3,4

0

5

0

4

5

1,7

2

5

3,4

3

Insgesamt

11

Tabelle 13: Ergebnisse der Sprossinduktion bei Syngonium podophyllum ‘Variegata’

Aufgrund der geringen Anzahl von Adventivsprossen aus Internodienstücken bei Syngonium podophyllum ist es nicht möglich, eine eindeutige Schlussfolgerung der Wirkung von TDZ und AgNO₃ zur Adventivsprossinduktion zu ziehen. Die Tendenz zeigt jedoch, dass bei einer Konzentration von 5 mg/l TDZ in weiteren Versuchen eine größere Anzahl von Adventivsprossen zu erwarten wäre.

Abbildung 15: Syngonium podophyllum: links: Kallusinduktion, rechts: Adventivsprossinduktion.

Insgesamt waren von den 11 neuen Adventivsprossen 6 grün und 5 weiß. Es wurde eine deutliche Beziehung zwischen dem Explantattyp und der Konstitution der neuen Adventivsprosse gefunden. Bei den grünen Explantaten entwickelten sich drei völlig grüne Adventivsprosse, dagegen wurde bei den weißen Explantaten keine Regeneration erzielt. Aus dem Pflanzenmaterial, das 50% Variegation aufwies, entwickelten sich von drei unabhängigen Explantaten drei grüne und fünf weiße Adventivsprosse (Tabelle 14, Abbildung 16).

Mit diesen Ergebnissen konnte das Vorhandensein von Mischzellen in den Ursprungs-pflanzen nicht bestätigt werden, aber dieser Befund kann als Beweis für eine Entmischung der Chimäre zum Homohistonten gelten.

Phänotyp der Explantate

Sprosse
gesamt

Grüne
Sprosse

Variegate
Sprosse

Weiße
Sprosse

50 % variegat

8

3

0

5

Grün

3

3

0

0

Weiß

0

0

0

0

Insgesamt

11

6

0

5

Tabelle 14: Vergleich der Musterung von Explantat und Regenerat nach Sprossinduktion bei Syngonium podophyllum ‘Variegata’

Abbildung 16: Adventivsprosse nach Internodienkultur beiSyngonium podophyllum.
links: weißer, entwickelter Adventivspross aus einem Explantat mit 50 % Variegation, rechts: grüner, entwickelter Adventivspross aus einem Explantat mit 50 % Variegation.

Mikroskopische Untersuchungen an Monstera deliciosa ‘Variegata’

Untersuchungen an Blattquerschnitten von Monstera deliciosa ‘Variegata’ zeigten einschichtige untere und obere Epidermen. An die untere Epidermis schließen sich 7 bis 9 Schwammparenchymschichten und eine Palisadenparenchymschicht an (Abbildung 17).

Abbildung 17: Querschnitt durch ein Blatt von Monstera deliciosa. Im Mesophyll befinden sich Zellen mit grünen oder mutierten Plastiden

Mischzellennachweise bei Monstera deliciosa ‘Variegata’

Auch bei Monstera deliciosa ‘Variegata’ wurde davon ausgegangen, dass sich Mischzellen in fein gestreiften jungen Blattbereichen befinden. Dort konnten Mischzellen nachgewiesen werden. In der Regel sind die Zellen jedoch schon entmischt und man kann Zellen entweder mit großen, normalen grünen Chloroplasten oder mit kleineren, mutierten weißen Chloroplasten finden (Abbildung 18).

Abbildung 18: Mischzellen im Gewebe von variegaten Monstera deliciosa : In den Zellen des Schwammparenchyms befinden sich mutierte und unmutierte Plastiden

Spontane Entmischung bei Monstera deliciosa ‘Variegata’

Monstera deliciosa ‘Variegata’ weist ein Entmischungsverhalten auf, wie es bei Syngonium podophyllum vorgefunden wurde. Die Pflanzen wachsen langsamer als Syngonium und möglicherweise geht deshalb auch die Entmischung sehr langsam vor sich. In den untersuchten Pflanzen traten phänotypisch weiße Sprosse auf. Die Schließzellen enthalten in jedem Fall Chloroplasten. Diese phänotypisch weißen Sprosse stellen die eigentlichen Periklinalchimären der Konstitution GW dar. Bei Monstera deliciosa wurde ebenfalls keine Weißrand- bzw. Weißkernform gefunden (Tabelle 15 und Tabelle 16). Das bedeutet, dass das Mesophyll fast ausschließlich von L2 gebildet wird.

Pflanzen
gesamt

Internodien
gesamt

Blätter
gesamt

Internodien/
Pflanze

Blätter/
Pflanze

Gesamt

9

168

167

18,7

18,6

Tabelle 15: Ergebnisse der Entwicklung variegater Klonen von Monstera deliciosa

Ausgangsmusterung

Endmusterung

Anzahl der
Pflanzen

Anfang der
Entmischung
(Internodium/Blatt)

variegat

variegat

5

keine

sektorial

sektorial

3

keine

variegat

weiß

1

14

variegat

grün

0

keine

gesamt

9

Tabelle 16: Entwicklung des Blattmusters während des Wachstums der Pflanzen von Monstera deliciosa

Untersuchungen von Sprossscheiteln und Achselknospen an Syngonium podophyllum und Monstera deliciosa

Die Musteranalysen auf morphologischer und anatomischer Ebene an variegaten Pflanzen von Syngonium podophyllum und Monstera deliciosa haben gezeigt, dass im Sprossscheitel und in Achselknospen zwei Schichten unabhängig voneinander existieren und in das Blatt eingehen.

Bei histologischen Untersuchungen (Tabelle 17) waren von 13 Längsschnittserien durch 7 Sprossscheitel und 6 Achselknospen von Syngonium podophyllum und durch 3 Sprossscheitel von Monstera deliciosa der mediane Längsschnitt durch den Scheitel eindeutig identifizier- und auswertbar. In den Randbereichen der Sprossscheitel ist die antikline Struktur der L2 nicht mehr aufzufinden, weshalb sie an dieser Stelle zum Korpus gerechnet werden und zwangsläufig von einem zweischichtigen Scheitelaufbau ausgegangen werden muss (Abbildung 19).

Sprossscheitel
Anzahl

Achselknospen
Anzahl

Schichten
Anzahl

Syngonium podophyllum
‘Variegata’

7

6

2

Monstera deliciosa
‘Variegata’

3

0

2

Tabelle 17: Scheiteluntersuchungen zum Nachweis der Anzahl der Scheitelschichten bei Syngonium podophyllum und Monstera deliciosa

Abbildung 19: Längsschnitt durch Sprossscheitel von Syngonium podophyllum (links) und eine Achselknospe von Monstera deliciosa (rechts). Kunststoff-Dauerpräparate, Hämatoxylin-Färbung nach Delafield.

Asteraceae Mikroskopische Untersuchungen an Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’

Untersuchungen an Blattquerschnitten von ‘Pirol’ zeigten folgenden Aufbau: Eine einschichtige untere und obere Epidermis. An die untere Epidermis schließen sich 3 bis 4 Schwammparenchymschichten und eine Palisadenparenchymschicht an.

In den verschiedenen Serien von Längsschnitten an variegaten Blättern von Chrysanthemen konnte man eine ungleichmäßige Verteilung der verschiedenen Zellgruppen beobachten, die im Mesophyll Chlorophyll bilden oder auch nicht (Abbildung 20). Um festzustellen, ob dieses Muster das Ergebnis eines Prozesses der Entmischung von Mischzellen war, wurde eine weitere Analyse an einer Vielzahl von Frischschnitten nötig.

Abbildung 20: Querschnitt durch ein Blatt von Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’ . Im Mesophyll befinden sich Zellen mit grünen und mutierten Plastiden.

Mischzellennachweise bei Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’

Bei jungen makulaten Blättern konnten in feingescheckten Bereichen Mischzellen nachgewiesen werden. Unterschiedliche Plastiden-Typen ließen sich in jungen Blättern gut voneinander unterscheiden. Die normalen grünen Chloroplasten waren groß, die mutierten Chloroplasten dagegen kleiner und heller (Abbildung 21). Noch im dritten entwickelten Blatt war es möglich, mutierte Chloroplasten zu erkennen. Jedoch in älteren Blättern wurden nur Zellen mit grünen Plastiden bzw. mit Plastiden ohne Chlorophyll beobachtet und keine Mischzellen gefunden.

Abbildung 21: Mischzellen bei Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’. Große, unmutierte Chloroplasten und kleinere, mutierte Chloroplasten sind im Mesophyll zu erkennen.

Anordnung der Zelltypen in genetisch heterogenen Trieben Selbstungen bei Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’

Obschon eine Identifikation von Mischzellen gelang, traten diese Zellen nicht mit großer Häufigkeit auf. Für eine genauere Bestimmung war die Nutzung von Selbstungen von Pflanzen nötig, die verschiedene Grade von Variegationen im Blattwerk aufwiesen. Anhand dieser Methode ließ sich auf indirekte Weise die Konstitution der zweiten Schicht der Sprossscheitel bestimmen.

Auf Grund der Schwierigkeit, Selbstungen an Einzelblüten (Röhrenblüten) bei Chrysanthemen vorzunehmen, erwies es sich als günstig, alle Köpfchen der Doldenrispe jener Zweige einzutüten, die Panaschierungen im Blattwerk aufwiesen. Obwohl eine große Anzahl der Doldenrispen sich selbst bestäubte, kam es nur zu einem geringen Samenansatz (Tabelle 18).

Anzahl der
geselbsteten
Doldenrispen

Köpfchen

Köpfchen
mit Samen

Röhrenblüten
mit Samen

Gekeimte
Samen

Sämlinge
gesamt

94

467

79

164

150

129

Tabelle 18: Ergebnisse der Selbstungen von Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’

Die Nachkommen der variegaten geselbsteten Sprosse wiesen Mischzellen auf. Insgesamt besaßen 57,36% der Sämlinge irgendeine Art von Variegation im Blatt, 34,11% waren völlig grün und 8,53% gänzlich Albinos (Tabelle 19). Die Albinopflanzen konnten im Unterschied zu den panaschierten und den grünen Pflanzen nur die Keimblätter ausbilden und starben danach ab (Abbildung 22).

Phänotyp der Sämlingen

Anzahl der Sämlinge

Gesamt

Variegat

Grün

Weiß

Absolut

129

74

44

11

Prozentual

100%

57,36%

34,11%

8,53%

Tabelle 19: Übersicht der Musterungen von Sämlingen aus Selbstungen an makulaten Pflanzen von Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’.

Abbildung 22: Sämlinge nach Selbstungen von Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’. links: eine Albinopflanze, die nur die Keimblätter ausbildet, rechts: panaschierte und grüne Sämlinge.

Es wurde ein bestimmter Zusammenhang zwischen dem Ausmaß der Variegation in den Blättern der geselbsteten Triebe und dem Typ der erlangten Nachkommenschaft beobachtet. Pflanzen mit einem hohen Prozentsatz an weißem Gewebe ergaben Nachkommen mit einem sehr hohen Weißanteil im Blattmuster oder auch vollständige Albinos. Mutterpflanzen mit einem geringen Anteil von weißem Gewebe im Mesophyll führten zu Sämlingen mit ebenfalls geringem Weißanteil (Tabelle 20).

Klon

Weißanteil der
letzten Blätter vor
der Doldenrispe (%)

Pflanzen
insgesamt

Phänotyp der
Nachkommen *

42-B1

9

1

G

10-A1-A2

10

10

15, 20, 25, 50, 50, 70, 80, 95, 2 G

43-B1

10

2

G

04-A1

20

2

75, G

07-A1-A2-A3

20

9

30, 80, 7 G

14-B1-B2-B3-B4-B5

20

7

20, 4 G, 2 W

08-B1

29

2

40, W

26-B1

30

2

70, 85

05-A1

33

1

W

15-A2-A3-A4

33

5

10, 20, 60, 80, G

06-B2

35

1

95

18-B1

35

4

80, 95, W, G

09-A1-A2-A3

37

7

20, 25, 40, 4 G

01-A1

38

6

20, 70, 70, 80, 2 G

09-B1

43

2

G, W

03-A2

50

3

50, 70, G

41-B1

50

3

50, G, W

28-B1

85

1

W

Tabelle 20: Variegationsvergleich von Mutter- und Nachkommenschaftspflanzen von Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’

* Phänotyp der Nachkommen: G = grün, W = Weiß, Zahl = Weißanteil der Blätter in %

Im gleichen Versuch gab es jedoch auch andere Teilergebnisse. Nachkommen des Klons 10-A1-A2 (mit 15, 20, 25, 50, 50, 70, 80, 95% Variegation und Grün) zeigten ein Muster, das nicht in Verbindung mit dem Prozentsatz der Panaschierung der Mutterpflanzen stand. Diese Resultate werden mit dem Vorhandensein von Mischzellen in L2-bürtigem Gewebe und damit in den Gameten erklärt.

Um die Selbstungen vergleichen und überprüfen zu können, wurden Doldenrispen von völlig grünen Sprossen (GG), von periklinalen Chimären (GW) und Sprossen, die zu 90% Weiß im Blattwerk aufwiesen (GM), verwendet. (Tabelle 21).

Blattmuster der
Mutterpflanze

Anzahl der
Doldenrispen

Köpfchen

Köpfchen
mit Samen

Röhrenblüten
mit Samen

Gekeimte
Samen

Sämlinge
gesamt

Blattmuster
der Keimlinge

Weiß

14

35

5

26

26

0

Weiß

Grün

31

200

17

114

112

111

Grün

90% Weiß

1

3

1

12

12

0

Weiß

Tabelle 21: Ergebnisse der Selbstungen variegater, weißer und grüner Triebe von Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’.

Bei keinem der Keimlinge, die aus der Selbstung von Trieben der nach den Musteranalysen als GG, GW oder GM charakterisierten Formen stammten, wurde irgendein Typ von Panaschierung beobachtet, der auf das Vorhandensein von Mischzellen hinwiese. Alle Keimlinge waren in Übereinstimmung mit der Konstitution der L2-bürtigen Gewebe grün bzw. vollständige Albinos (Tabelle 21).

Im weiteren Verlauf der Pflanzenentwicklung wurde beobachtet, dass die Sämlinge GG grün blieben. Jedoch die Nachkommen der Triebe GW oder GM verhielten sich wie die weißen Sämlinge, die von panaschierten Zweigen abstammten. Sie keimten, bildeten Keimblätter aus und starben ab.

Konkurrenz während des Wachstums der Sämlinge

Während des Wachstums der Sämlinge gab es eine Veränderung hinsichtlich der Position der apikalen Zellen im Sprossscheitel. Von den 74 Sämlingen, die Panaschierungen aufwiesen, zeigten 51 auch weiterhin eine Panaschierung, ohne zu einer Stabilisierung der zweiten Schicht des Sprossscheitels zu gelangen. 12 der 74 Sämlinge stabilisierten sich in den frühen Entwicklungsetappen zu GG-Homohistonten. Nur bei vier von allen wurde in der zweiten Sprossscheitelschicht eine Stabilisierung zum Albino beobachtet, aber im Unterschied zum grünen Homohistoten erfolgte die andauernde Stabilisierung erst in späten Entwicklungsetappen der Pflanze (ab dem sechsten Blatt).

An 5 Pflanzen, die als Homohistonten GG charakterisiert wurden, traten nach einem normalen Wachstum der Pflanzen panaschierte Blätter auf. Danach wuchsen vier dieser Pflanzen normal weiter, ohne dem Muster der Panaschierung zu folgen. Bei allen analysierten Pflanzen stabilisierte sich die Epidermis zur Konstitution grün mit chlorophyllhaltigen Zellen (Tabelle 22).

* momentan
Ausgangsmusterung

Endmusterung

Anzahl der
Pflanzen

Anfang der
Entmischung
(Laubblattstadium)

Variegat

Variegat

51

Keine

Variegat

Grün

12

2 – 8

Variegat

Weiß

4

6 – 8

Variegat

Variegat

1

(3 W) zu weiß *

Variegat

Variegat

1

(4 G) zu grün *

Grün

Grün

4

Keine

Grün

Variegat

1

11

Tabelle 22: Entwicklung des Blattmusters während des Pflanzenwachstums der Sämlinge von Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’

In-vitro-Entmischung von Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’ Ursprung von Adventivsprossen

Bei der Mehrzahl der Kombinationen von Wachstumsregulatoren und AgNO₃ kam es zur Bildung von Adventivsprossen aus Internodienstücken mit 50% Variegationen, aber auch ohne den Zusatz von AgNO₃wurde eine gute Adventivsprossbildung erreicht. Beste Ergebnisse sowohl bei der Anzahl von induzierten Explantaten als auch bei der Anzahl der Adventivsprosse pro Explantat resultieren aus der Variante 0,2 mg/l NAA, 1 mg/l BAP ohne AgNO₃ und der Variante 0,2 mg/l NAA, 1 mg/ BAP, 3,4 mg/l AgNO_3.

* 14 Wiederholungen/Behandlung
Phytohormone (mg/l)

Explantate mit
Adventivspross–
induktion (%) *

Durchschnittliche
Anzahl der
Adventivsprosse
pro Explantat

NAA

BAP

AgNO₃

0,2

0,5

0

42,86

6,00

0,2

1

0

42,86

8,83

0,2

2

0

7,14

10,00

0,2

0,5

1,7

35,71

4,80

0,2

1

1,7

14,29

3,00

0,2

2

1,7

35,71

4,80

0,2

0,5

3,4

14,29

2,00

0,2

1

3,4

35,71

8,00

0,2

2

3,4

14,29

5,00

Tabelle 23: Ergebnisse der Adventivsprossinduktion bei Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’

Es wurde beobachtet, dass die Sprosse sich am inneren Teil der Schnittfläche der Internodien und nicht an den Rändern bildeten. Deshalb wird die Möglichkeit, dass die Epidermis an der Ausbildung von neuen Sprossen beteiligt sein könnte, ausgeschlossen. Insgesamt waren von den 207 neuen Adventivsprossen 19,8 % variegat, 68,1 % grün und 12,1 % weiß (Tabelle 23).

Phänotyp der Regenerate

grün

variegat

weiß

Gesamt

Gesamt

141

41

25

207

Prozentual (%)

68,1

19,8

12,1

100

Tabelle 24: Charakterisierung des Phänotypes der Laubblätter von Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’ nach Adventivsprossinduktion aus Internodienstücken mit 50% Variegation

Um die Konstitution der Adventivsprosse zu bestimmen, wurden von 20 grünen, 20 variegaten und allen 25 weißen Regeneraten der Epidermis untersucht. In all den analysierten Fällen wurde das Vorhandensein von Chlorophyll in der Epidermis beobachtet. Anhand dieser Ergebnisse kann man die Konstitution der Sprosse als GM (Abbildung 23), GG beziehungsweise GW bestimmen. Es wurden keine Pflanzen mit weißen oder grünen Rändern erzielt.

Abbildung 23: Variegater Adventivspross nach Internodienkultur beiDendranthema grandiflorum ‘Pirol’ auf MS Medium mit 0,2 mg/l NAA, 0,5 mg/l BAP und 1,7 mg/l AgNO₃.

Zusammenhang Sprossursprung und Mutterpflanzentyp

Es wurde keine direkte Beziehung zwischen dem Explantattyp und der Konstitution der neuen Adventivsprosse gefunden (Tabelle 25). Sowohl bei dem Pflanzenmaterial, das 50% Variegation aufwies, als auch bei den fast vollständigen Albinopflanzen (zu 95% weiß) entwickelten sich variegate, völlig grüne oder weiße Adventivsprosse (Abbildung 24).

Phänotyp der
Explantate

Explantate
mit Kallus

Sprosse
gesamt

Grüne
Sprosse

Variegate
Sprosse

Weiße
Sprosse

Epidermis

50 % variegat

52

57

37

13

7

56 grün, 1 gemischt

95 % weiß

11

20

9

9

2

20 grün

Tabelle 25: Vergleich der Musterung von Explantat und Regenerat nach Adventivsprossinduktion bei Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’

Die Entwicklung der variegaten Pflanzen bestätigt das Vorhandensein von Mischzellen in den Ursprungspflanzen. Genau wie im ersten Experiment entwickelten sich die Adventivsprosse im mittleren Teil der Internodien, so dass die Epidermis sich an ihrer Bildung nicht beteiligt.

Konkurrenz bei der Ausbildung von Sprossen

56 der 57 entwickelten Adventivsprosse besaßen eine Epidermis, deren Schließzellen grüne Plastiden enthielten (Tabelle 25). Der Unterschied zwischen den Sprossen wurde bezüglich der Konstitution der zweiten Schicht des Sprossscheitels beobachtet. Nur bei einer von den 57 Pflanzen fand sich eine Epidermis, die Schließzellen mit chlorophyllintakten oder chlorophylldefekten Plastiden besaß und bei der außerdem das Mesophyll variegat war (Abbildung 24).

Abbildung 24: Adventivspross nach Internodienkultur beiDendranthema grandiflorum ‘Pirol’. links: weißer entwickelter Adventivspross und grüne Adventivsprossprimordia aus einem Explantat mit 50 % Variegation

Neben der Zellkonkurrenz bei der Ausbildung von Sprossscheiteln wurde eine Konkurrenz im Entwicklungsverlauf der Pflanze beobachtet. Diese Tendenz trat sowohl bei den von den Internodien mit 50% Variegation als auch bei den von Albinos abstammenden Sprossen auf. 7 der 13 variegaten Sprosse, die von Pflanzen mit 50% Variegation regenerierten, entwickelten sich zu grünen Sprossen bzw. Pflanzen. Alle 9 variegaten Regenerate, die von Explantaten mit 95% Weißanteil abstammten, entmischten zu Grün. In Übereinstimmung mit diesen Resultaten kann man die Konstitution der regenerierten Sprosse als GM, GG beziehungsweise GW bestimmen. Auch in diesem Fall wurden keine Pflanzen mit weißen oder grünen Laubblatträndern gefunden (Abbildung 25).

Abbildung 25: Konkurrenz bei der Ausbildung von Sprossen bei Dendranthema grandiflorum ‘Pirol’. Die Pfeile markieren die Sprosse, die sich zu grün entmischten.

Mikroskopische Untersuchungen und Selbstungen an Dendranthema grandiflorum ‘Luyona’

Dendranthema grandiflorum ‘Luyona’ besitzt ebenso wie ‘Pirol’ ein makulates Blattmuster. Blattquerschnitte durch diese Blätter zeigten eine ähnliche Schichtung wie bei ‘Pirol’: An die untere Epidermis, deren Schließzellen grüne Plastiden enthalten, schließen sich 3-4 Schwammparenchymschichten, eine Palisadenparenchymschicht sowie die obere Epidermis an.

Mischzellennachweis bei Dendranthema grandiflorum ‘Luyona’

Von jungen makulaten Blättern konnten in feingescheckten Bereichen Mischzellen nachgewiesen werden (Abbildung 26). Blattquerschnitte an ‘Luyona’ zeigten, dass Mischzellen im Mesophyll zu finden sind. In hellen älteren Geweben, sowohl im Palisaden- als auch im Schwammparenchym wurden nur plastidenfreie Zellen beobachtet. Bei Übergängen vom grünen zum weißen oder im makulaten Bereich fallen Zellen mit wenigen normalen, grünen Chloroplasten auf. In jungen Blättern, wie bei ‘Pirol’, sind die unterschiedlichen Plastiden-Typen besser voneinander zu unterscheiden. Im ersten Laubblatt lassen sich Mischzellen im Mesophyll nachweisen. Darüber hinaus sind aber schon entmischte Zellen mit entweder mutierte, kleinen, hellen oder normalen, grünen Plastiden zu erkennen.

Abbildung 26: Beide Abbildungen zeigen Mischzellen von Dendranthema grandiflorum ‘Luyona’.

Aufgrund des geringen Versuchsumfangs der Selbstungen von variegaten Pflanzen ergab sich für diesen Klon kein eindeutiges Aufspaltungsverhältnis. Von 60 geselbsteten Köpfchen hatten nur 13 auch Samen angesetzt und 30 Samen keimten. Man kann, obwohl die Ergebnisse nicht umfangreich waren, die Anwesenheit von Mischzellen in der L2 erkennen. Innerhalb der Nachkommenschaft zeigte sich eine Aufspaltung in weiße, grüne und variegate Sämlinge (Abbildung 27). Eine Wiederholung der Selbstungen mit einer größeren Anzahl von Pflanzen ist zu empfehlen.

Phänotyp der Sämlinge

Anzahl der Sämlinge

Gesamt

Variegat

Grün

Weiß

Absolut

30

1

28

1

Prozentual

100%

3,33%

93,33%

3,33%

Tabelle 26: Übersicht der Musterungen von Sämlingen aus Selbstungen an makulaten Pflanzen von Dendranthema grandiflorum ‘Luyona’

Abbildung 27: Sämlinge nach Selbstungen von Dendranthema grandiflorum ‘Luyona’. links : Der Pfeil markiert eine Albinopflanze, die nur die Keimblätter ausbildete und abstirbt, rechts: grüne Sämlinge.

Sprossscheiteluntersuchungen an den Sorten ’Pirol’ und ‘Luyona’ von Dendranthema grandiflorum

Die Musteranalysen auf morphologischer und anatomischer Ebene an chimärischen Pflanzen von Dendranthema grandiflorum ‘Luyona’ und ‘Pirol’ zeigten, dass im Sprossscheitel nur zwei voneinander unabhängige Schichten existieren und in das Laubblatt eingehen. Normalerweise stammt von L1 nur die Epidermis und L2 bildet in den Blättern das gesamte Mesophyll. In Längsschnitten durch Sprossscheitel und Achselknospen wurde der entsprechende Aufbau der Apikalmeristeme überprüft.

In allen untersuchten 35 Sprossscheiteln sowie 4 Achselknospen von ‘Pirol’ wurden nur zwei Schichten gefunden (Tabelle 27). Bei ‘Luyona’ wurden 16 Längschnittserien durch Sprossscheitel untersucht, bei denen ebenfalls nur zwei Schichten nachgewiesen wurden (Abbildung 28).

Sorten

Scheitel
Anzahl

Sprossscheitel
Anzahl

Achselknospen
Anzahl

Scheitel-
schichten

‘Pirol’

39

35

4

2

‘Luyona’

16

16

0

2

Tabelle 27: Sprossscheiteluntersuchungen zum Nachweis unabhängiger Scheitelschichten bei den Sorten ‘Pirol’ und ‘Luyona’ von Dendranthema grandiflorum

Abbildung 28: Längsschnitte durch Sprossscheitel von Dendranthema grandiflorum. links: ‘Pirol’, rechts: ‘Luyona’. Beide Sorten enthalten nur zwei Schichten im Sprossscheitel.

Untersuchungen zur Problematik ‘Immerspaltende Periklinalchimären’ Spiraea bumalda‘Goldflame’

In Übereinstimmung mit den Ergebnissen, die durch anatomische Analysen und die Beobachtung der regelmäßig auftretenden grünen Sprosssektoren bei den Austrieben von Spiraea bumalda‘Goldflame’ erlangt wurden, ist es nötig nachzuweisen, ob diese Pflanze eine periklinale Chimäre der Konstitution GA ist und ob dieses Phänomen einer periklinen Aufspaltung im Sprossscheitel ist oder der Entwicklungsphase des Blattes geschuldet.

Mikroskopische Untersuchungen an Spiraea bumalda ‘Goldflame’
Beobachtungen an Spiraea bumalda‘Goldflame’ zeigten regelmäßig entstehende, grüne Sprosssektoren. Bei anatomischen Untersuchungen der Blätter ließen sich grüne, normale Plastiden in den Schließzellen nachweisen. Aber an den Stellen, wo hellgrünes und grünes Mesophyll aneinander grenzte, hatten die grünen Gewebe immer direkten Kontakt zur Epidermis (Abbildung 29). In den Aurea-Bereichen waren hellgrüne Plastiden im Mesophyll zu finden.

Abbildung 29: Querschnitt durch ein Blatt von Spiraea bumalda ‘Goldflame’: Die Abbildung zeigt einen Übergang vom Aurea- zum grünen Mesophyll.
Musteranalyse
Die Regelmäßigkeit der grünen Sprosssektoren, die über mehrere Internodien hinweg zu verfolgen sind, ist ein Hinweis, dass bei entwicklungsgeschichtlicher Bedingtheit dieser Panaschüre die entscheidenden periklinen Teilungen in der L1 des Sprossscheitels gesucht werden müssen (Abbildung 30). Manchmal sind Erweiterungen des Sektors bis zum rein grünen Sprossumfang, aber auch Verkleinerungen des Sektors bis zum rein hellgrün erscheinenden Spross zu beobachten.

Um mögliche perikline Teilungsmuster oder –häufigkeiten in L1 bei Spiraea bumalda‘Goldflame’ zu finden, wurden 393 Austriebe untersucht. Davon begannen 61 mit einem grünen Sektor, keiner war rein grün und die restlichen 332 waren phänotypisch Aurea. Im Einzelfalle wurden als Minimum 3, als Maximum 37 Blätter gezählt. Aus diesen Ergebnissen wurde festgestellt, dass 'Goldflame' eine Phyllotaxy 2/5 zeigt. Die Blätter, die im Bereich eines grünen Sektors ansetzten, besaßen mehr oder weniger viel grünes Mesophyll, je nachdem, ob sich der Blattansatz ganz oder nur teilweise im grünen Sektorbereich befand.

Abbildung 30: Spiraea bumalda ‘Goldflame’. Die Scheckungsmuster von Blatt 0, 5 und 10 eines Achselsprosses: Diese Blätter liegen übereinander im Bereich eines schmalen, grünen Sektors.
Wurzelaustriebe bei Spiraea bumalda ‘Goldflame’
Wurzelaustriebe an ‘Goldflame’ konnten von Wurzelstücken nicht induziert werden. Nach ein paar Wochen vertrockneten die Wurzeln und starben ab. Bessere Ergebnisse wurden mit dem modifizierten Wurzelfreilegungsversuch erreicht (Abbildung 31). Obwohl die Wurzeln nicht größer und dicker als bei der ersten Methode waren, blieb das Wurzelsystem unbeschädigt und neue Triebe ließen sich induzieren. Bei dieser Methode wuchsen 77 Triebe von 203 unabhängigen freigelegten Wurzeln erzielt.

Abbildung 31: Wurzelaustriebe bei Spiraea bumalda ‘Goldflame’.

Alle im Jahr 1999 erfolgten Austriebe hatten ausnahmslos nur hellgrüne Blätter. Um die Stabilität der Entmischung zur Innenkomponente zu überprüfen, wurden im Jahr 2000 acht Pflanzen weiter beobachtet. Im Laufe des Jahres zeigten die Kontrollpflanzen regelmäßig grüne Sprosssektoren, dagegen zeigten sich an keinem der acht Büsche aus Wurzelaustrieben Grünsports, sondern nur hellgrüne Blätter (Tabelle 28). Dieser Befund kann als Beweis für eine Entmischung der Chimäre zum Homohistonten gelten.

Phänotyp der Pflanze

Pflanzentyp

Pflanze gesamt

Aurea

Grüne Sektoren

Pflanze aus Wurzelaustrieb

8

8

0

Kontrolle

15

15

15

Tabelle 28: Charakterisierung des Phänotypes der Laubblätter von Spiraea bumalda ‘Goldflame’ nach Austriebinduktion aus Wurzeln.

In-vitro-Kultur von Spiraea bumalda ‘Goldflame’
Genau wie die Induktion von Wurzelaustrieben wurde die Regeneration von Pflanzen mit Gewebekultur-Techniken angewandt, um die chimärische Konstitution einer Pflanze durch Segregation in ihre verschiedenen Komponenten zu untersuchen. Ausgehend von den Ergebnissen der In-vitro-Kultur bei Spiraea bumalda ‘Shirobana’ (vgl. mit 3.2.1.6.4) gelang es, eine erfolgreiche Sprossregeneration durch In-vitro-Kalluskultur mit anschließender Adventivsprossbildung bei ‘Goldflame’ durchzuführen.
Kallus-Kultur
Eine Kallus-Bildung erfolgte auf MS Nährmedium mit verschiedenen Kombinationen von 2,4-D und BAP nach 4 Wochen. Je nach Kombination bildeten 55% bis 90% der Explantate Kallus. Mit der Kombination von 0,5 mg/l BAP und 3 mg/l 2,4-D wurde der höchste Prozentsatz an Explantaten mit Kallus erreicht. Eine positive Tendenz der Kallusinduktion wurde mit der Zunahme von 2,4-D in Kombination mit BAP beobachtet (Tabelle 29).

* 20 Wiederholungen/Behandlung
MS + Phytohormone (mg/l)

Explantate mit Kallus (%) *

BAP

2,4-D

0,5

1

50

0,5

2

80

0,5

3

90

0,5

4

75

0,5

5

80

1

1

35

1

2

70

1

3

70

1

4

80

1

5

55

Tabelle 29: Ergebnisse der Kallusinduktion bei Spiraea bumalda ‘Goldflame’

Sprossbildung
Ausgehend davon, dass man aus Blattexplantaten Kallus und keine direkte Induktion von Adventivsprossen erlangte, war es notwendig, verschiedene Kombinationen von Wachstumsregulatoren zu testen, um irgendeinen Typ von Organogenese zu befördern (Abbildung 32). Für die Sprossbildung aus Kallus wurden Medien mit verschiedenen Konzentrationen von TDZ und NAA getestet. Ohne Phytohormone und mit NAA-Zusatz in verschiedenen Konzentrationen blieb die Sprossbildung aus. (Tabelle 30).

Auf Medien mit TDZ oder TDZ und NAA konnten 1237 Sprosse aus Kallus induziert werden. Die beste Sprossinduktion erfolgte bei 1 mg/l TDZ, aber nur 17,65 % der Explantate wurden induziert. Bessere Ergebnisse wurden mit der Kombination von 0,1 mg/l NAA und 1 bzw. 3 mg/l TDZ (Abbildung 32) erreicht. Höhere Konzentrationen von TDZ (5 mg/l ohne NAA) förderten die Induktion von Adventivsprossen (35 Explantate), aber bei der Kombination von TDZ mit verschiedenen NAA-Konzentrationen wurde mit geringeren TDZ-Konzentrationen eine bessere Sprossinduktion erreicht (Tabelle 30).

* 17 Wiederholungen/Behandlung
MS + Phytohormone (mg/l)

Explantate mit
Adventivspross–
induktion (%)*

Durchschnittliche
Anzahl der
Adventivsprosse
pro Explantat

TDZ

NAA

0

0

0

0

0

0,1

0

0

0

0,3

0

0

1

0

17,65

57,33

1

0,1

41,18

36,00

1

0,3

35,29

15,5

2

0

17,65

24,00

2

0,1

47,06

17,38

2

0,3

47,06

25,00

3

0

5,88

14,00

3

0,1

41,18

28,43

3

0,3

47,06

5,50

5

0

5,88

35,00

5

0,1

17,65

2,33

5

0,3

23,53

2,50

Tabelle 30: Übersicht der Ergebnisse der Adventivsprossinduktion aus Kalli von Spiraea bumalda ‘Goldflame’ bei verschiedenen Phytohormonkonzentrationen und -kombinationen

Vereinzelte Sprosse wurden auf MS-Medium mit halber Konzentration der Makrosalze ohne Phytohormonzusatz gebracht, um Wurzeln zu induzieren. Bewurzelte Jungpflanzen kamen zur Weiterkultur in Erdsubstrat. Nicht alle Pflanzen überlebten die neuen Wachstumsbedingungen.

Abbildung 32: Adventivsprossinduktion aus Kallus bei Spiraea bumalda‘Goldflame’auf MS Nährmedium. links: 0,1 mg/l NAA und 1 mg/l TDZ, rechts: 0,3 mg/l NAA und 3 mg/l TDZ.

Von den 1237 aus Kallus gebildeten Sprossen repräsentierten 1233 den Phänotyp Aurea von ‘Goldflame’ und nur 4 Pflanzen den grünen Phänotyp, der für die L1 der Pflanzen GA charakteristisch ist. Zwei dieser Pflanzen entstammten dem gleichen Kallus und im Verlaufe ihrer Entwicklung waren sie in ihrem Habitus identisch mit den chimärischen Pflanzen von ‘Goldflame’, unterschieden sich aber in der Blattfarbe. Die anderen zwei Klone stammten aus verschiedenem Kallus. Sie besaßen einen von ‘Goldflame’ verschiedenen Phänotyp (Habitus, Blattform und Blattfarbe).

Um die Stabilität der Entmischung zur Innenkomponente zu überprüfen, wurden im Jahr 2000 die überlebenden Pflanzen ins Freiland gebracht und weiter beobachtet. 29 Büsche zeigten keinen Grünsport sondern nur hellgrüne Blätter, dagegen bildeten zwei der Kontrollpflanzen regelmäßig grüne Sprosssektoren (Tabelle 31). Der Wuchstyp, die Form und Farbe des Blattes der zwei überlebenden grünen, im Phänotyp von Spiraea bumalda ‘Goldflame’ völlig verschiedenen, blieben stabil. Dieser Befund kann als Beweis für eine Entmischung der Chimäre zum Homohistonten gelten.

Phänotyp der Pflanze

Pflanzentyp

Pflanze gesamt

Aurea

Grün

Aurea mit
grünen Sektoren

Adventivsprosse

31

29

2

0

Kontrolle

3

1

0

2

Tabelle 31: Charakterisierung des Phänotypes der Laubblätter von Spiraea bumalda ‘Goldflame’ und ihrer Regenerate nach der Entmischung durch In-vitro-Kultur.

Abstammung der Adventivsprosse
Auf Grund der Ergebnisse stellte sich die Frage, ob diese Veränderungen auf die somaklonale Variabilität bei der Vervielfältigung von Pflanzen durch die Gewebekultur zurückzuführen waren oder ob diese Pflanzen aus Kalli stammten, die sich aus der Epidermis entwickelt hatten.

Resultate aus chronologisch histologischen Untersuchungen an Laubblättern, bei denen Kallus induziert wurde, verdeutlichten, dass der Kallus aus Mesophyllzellen abstammt und die Epidermis sich nicht an der Kallusinduktion und später in der Regeneration von Pflanzen beteiligte (Abbildung 33).

Abbildung 33: Histologische Untersuchungen an Laubblättern von Spiraea bumalda ‘Goldflame’. von links nach rechts: 0, 6 und 12 Tage nach Kallusinduktion auf MS Medium mit 0,5 mg/l BAP und 5 mg/l 2,4-D. Es wird deutlich, dass der Kallus von Mesophyllzellen abstammt.
Sprossscheiteluntersuchungen an Spiraea bumalda‘Goldflame’
Die Musteranalysen auf morphologischer und anatomischer Ebene an variegaten Periklinalchimären von Spiraea bumalda‘Goldflame’ zeigten, dass im Sprossscheitel nur zwei voneinander unabhängige Schichten existieren und in das Blatt eingehen. Es formiert sich im mittleren Teil eines Sprossscheitels bzw. einer Achselknospe ein scheinbar dreischichtiger Aufbau. Wie bei den Araceae ist in den Randbereichen des Scheitels die antikline Struktur der L2 nicht mehr aufzufinden, weshalb sie an dieser Stelle zum Korpus gerechnet werden muss. Normalerweise stammt von L1 nur die Epidermis ab und L2 bildet in den Blättern das gesamte Mesophyll. In Längsschnitten durch Sprossscheitel und Achselknospen wurde der entsprechende Aufbau der Apikalmeristeme überprüft.

Bei 7 Längsschnittserien von 26 untersuchten Sprossscheiteln sowie 9 untersuchten Achselknospen wurden in der ersten Schicht perikline Aufspaltungen nachgewiesen.(Tabelle 32, Abbildung 34).

Scheitel
Anzahl

Schicht mit periklinen Aufspaltungen

L1

L2

L1+L2

Ohne

Sprossscheitel

26

2

7

3

14

Achselknospen

9

0

1

2

6

Tabelle 32: Sprossscheiteluntersuchungen zum Vorliegen perikliner Teilungen in den Scheitelschichten bei Spiraea bumalda‘Goldflame’

Abbildung 34: Längsschnitte durch Sprossscheitel von Spiraea bumalda‘Goldflame’ im Kunststoff-Dauerpräparat, Färbung mit Hämatoxylin nach Delafield; Die Pfeile markieren die Stellen, wo perikline Teilungen stattfinden, links: perikline Teilungen in der L1, rechts: perikline Teilungen nur in L2.
Spiraea bumalda‘Shirobana’ Blattanatomie
Der Blattquerschnitt von Spiraea bumalda ‘Shirobana’ zeigt folgenden Blattaufbau: An eine untere Epidermis schließen sich 3 bis 5 Schwammparemchymschichten an, 2 bis 3 Schichten Palisadenzellen folgen und dann die obere Epidermis. Grüne, normale Plastiden wurden in den Mesophyllzellen und in den Schließzellen der unteren Epidermis beobachtet. Demzufolge ist ‘Shirobana’ homohistisch im Bezug auf die grüne Blattfarbe. Darüber hinaus bildete sich häufig Anthocyan in der unteren und oberen Epidermis, hauptsächlich an Pflanzen im Freiland.
Mikroskopische Untersuchungen des Blütenblattes
An dem Pflanzenmaterial wurden im Untersuchungszeitraum völlig rote, weiße, rosafarbene Blüten sowie Blüten mit roten und weißen Petalen beobachtet. Anhand von Blütenblattquerschnitt-Frischpräparaten und Epidermisabzügen wurde die Farbstoffbildung aller vorhandenen Blüten-Typen von ‘Shirobana’ geprüft. Vergleichende Untersuchungen an Querschnitt- und Epidermis-Frischpräparaten von weißen Petalen mit roten Sektoren zeigten, dass Blütenfarbstoff in den roten Sektoren in beiden Epidermen aber nicht im Mesophyll gebildet wird. Es wurde keine Farbstoffbildung in den weißen Sektoren beobachtet.

Rote Blüten zeigten in der oberen und unteren Epidermis eine dunkelrote Zellfärbung und ein farbloses Mesophyll. Bei rosafarbene Blüten war der Anthocyaninhalt und die Farbstoffintensität in den Epidermiszellen geringer als bei den roten Blüten. Im Mesophyll wurde kein Anthocyan gebildet. Blütenblattquerschnitte der weißen Blüten zeigten eine farblose obere und untere Epidermis sowie Mesophyllzellen ohne Anthocyan (Abbildung 35).

Abbildung 35:links: Blüte völlig rot, rosa bzw. weiß bei Spiraea bumalda ‘Shirobana’ rechts: Entsprechende Blütenblattquerschnitte. Die Blüten, die eine rote Blütenfarbe haben, zeigten, dass Blütenfarbstoff bei ‘Shirobana’ nur in beiden Epidermen gebildet werden kann
Wurzelaustriebe bei Spiraea bumalda ‘Shirobana’
Von Spiraea ‘Shirobana’ ließen sich keine Austriebe an Wurzelstücken induzieren. Um eine erfolgreiche Wurzelaustriebinduktion zu bekommen, wurde die modifizierte Wurzelfreilegungsmethode benutzt. Bei dieser Methode wuchsen 177 Triebe von 283 unabhängigen Wurzeln (Abbildung 36).

Abbildung 36: Wurzelaustriebe bei Spiraea bumalda 'Shirobana'

17 von den 177 Wurzelaustrieben wurden in den Jahren 1999 und 2000 weiter beobachtet. Die Blütenbonituren der regenerierten Pflanzen von Spiraea bumalda 'Shirobana' zeigten, dass 88,24 % der Pflanzen Blüten mit roten und weißen Petalen besaßen und 5,88 % völlig rot bzw. weiß blühten. Diese Verhältnisse wurden auch in den Kontrollpflanzen beobachtet (Tabelle 33). Es konnte keine chimärische Konstitution in der Petalenmusterung gefunden und nachgewiesen werden. Offenbar sind die Farbunterschiede bei 'Shirobana' genetisch bedingt.

Insgesamt

weißblühend

rotblühend

weißblühend mit rot

Wurzelaustriebe

17

1

1

15

Prozentual (%)

5,88

5,88

88,24

Kontrolle

7

1

2

4

Prozentual (%)

14,29

28,57

57,14

Tabelle 33: Ergebnisse der Blütenbonituren an 'Shirobana'-Pflanzen von Wurzelaustrieben. 2000.

In-vitro-Kultur von Spiraea bumalda ‘Shirobana’
Um das Entmischungs- und Regenerationsverhalten bei Spiraea bumalda ‘Shirobana’ zu untersuchen und die Individualisierung der verschiedenen Komponenten periklinaler Chimären zu erreichen, wurde ‘Shirobana’ in eine Kalluskultur überführt. Wegen der geringen Informationen über Spiraea in der In-vitro-Kultur war es notwendig, eigene Methoden zu entwickeln. Um pilzliche und bakterielle Kontaminationen zu vermeiden und aseptische Spiraea-Pflanzen zu erhalten, wurden die Sprosse zuerst mit einer 5%igen Hypochloritlösung und drei Tropfen Tween 80 für 15 min desinfiziert, danach dreimal mit autoklavierten Aqua destillata gespült, und als Sprosse mit 3 Achselknospen auf ein Vermehrungsmedium (MS mit 0,5 mg/l BAP) gesetzt (Norton, 1986 a).
Kalluskultur
Um Kallus bei Spiraea bumalda ´Shirobana` zu induzieren, wurden als Explantate aseptischen Blättern benutzt. Ergebnisse für den ersten Kalluskulturversuch, sind in Tabelle 34 aufgeführt. In den Varianten ohne Phytohormone oder nur mit BAP war die Kallusinduktion nicht erfolgreich. Kallusregeneration erfolgte (nach 4 Wochen) unter normalen Bedingungen in den Varianten mit 2,4–D und in bei verschiedenen Kombinationen mit 2,4-D und BAP. Eine hohe Kallusinduktion wurde mit verschiedenen Kombinationen von 2,4-D und BAP erreicht (Tabelle 34).

MS + Phytohormone (mg/l)

Explantate
mit Kallus (%) *

BAP

2,4-D

0

0

0

0

1

17

0

2

67

0

5

67

0,5

0

0

0,5

1

100

0,5

2

100

0,5

5

83

1

0

0

1

1

100

1

2

100

1

5

100

2

0

0

2

1

100

2

2

100

2

5

100

* 6 Wiederholungen/Behandlung

Tabelle 34: Ergebnisse der ersten Kallusinduktion bei Spiraea bumalda ‘Shirobana’

Aufgrund positiver Ergebnisse wurden weitere Kallusinduktionsversuche bei Spiraea bumalda‘Shirobana’ mit BAP (0,5 und 1,0 mg/l) und 2,4-D (1 bis 5 mg/l)durchgeführt. In den verschiedenen Kombinationen von BAP und 2,4-D hatten nach 4 Wochen 70% bis 100% der Explantate Kallus gebildet (Tabelle 35, Abbildung 37).

Tabelle 35: Ergebnisse der zweiten Kallusinduktion bei Spiraea bumalda ‘Shirobana’

MS + Phytohormone (mg/l)

Explantate
mit Kallus (%) *

BAP

2,4-D

0,5

1

90

0,5

2

90

0,5

3

100

0,5

4

70

0,5

5

80

1

1

80

1

2

80

1

3

80

1

4

90

1

5

90

* 10 Wiederholungen/Behandlung

Abbildung 37: Kallusinduktion bei Spiraea bumalda 'Shirobana' auf MS Nährmedium. links: 1 mg/l 2,4-D und 2 mg/l BAP, rechts: 5 mg/l 2,4-D und 1 mg/l BAP.
Adventivsprossbildung
Adventivsprossinduktion aus Kallus war in den Varianten mit nur IES oder BAP und in den entsprechenden Kombinationen nicht möglich, ebenso bei der Kultur ohne Phytohormone oder nur mit NAA. Jedoch erfolgte in den Varianten mit nur TDZ und in Kombination mit NAA eine Sprossinduktion. Bei der Kombination von 5 mg/l TDZ und 0,3 mg/l NAA wurde die beste Sprossinduktion (12,5 Sprosse/Explantat) erreicht und 54,55 % der Explantate induzierten (Tabelle 36, Abbildung 38).

* 22 Wiederholungen/Behandlung
MS + Phytohormone (mg/l)

Explantate mit
Adventivsprossbildung (%) *

Durchschnittliche Anzahl der
Adventivsprosse pro Explantat

TDZ

NAA

0

0

0

0

0

0,1

0

0

0

0,3

0

0

1

0

18,18

8

1

0,1

4,55

3

1

0,3

4,55

2

2

0

9,09

14,5

2

0,1

0

0

2

0,3

9,09

0,5

3

0

4,55

12

3

0,1

4,55

27

3

0,3

31,82

7,43

5

0

9,09

1,5

5

0,1

13,64

10

5

0,3

54,55

12,58

Tabelle 36: Regeneration von Adventivsprossen aus Kalli bei Spiraea bumalda ‘Shirobana’

Um Wurzeln zu induzieren, wurden vereinzelte Sprosse auf MS-Medium mit der halben Konzentration der Makrosalze ohne Phytohormonzusatz gebracht. Bewurzelte Jungpflanzen wurden zur Weiterkultur in Erdsubstrat überführt. An allen in Erde überführten Pflanzen erfolgte eine Bonitur der Blütenfarbe.

Abbildung 38: Adventivsprossinduktion aus Kallus bei Spiraea bumalda ‘Shirobana’auf MS Nährmedium mit 1 mg/l TDZ.

Die Ergebnisse von den im Jahr 2000 blühenden Pflanzen zeigten ohne Ausnahme die nicht chimärische Konstitution von ‘Shirobana’. Regenerierte Pflanzen (2) von Ausgangspflanzen mit weißen Petalen mit roten Sektoren zeigten das gleiche Muster und eine blühte weiß. Ein Regenerat, das von einer völlig weiß blühenden Pflanzen abstammte, blühte weiß mit rot. Die vier blühenden Kontrollpflanzen zeigten ohne Ausnahme weiße Petalen mit roten Sektoren. In der Tabelle 37 sind die Ergebnisse der Blütenbonitur von ‘Shirobana’ zusammengefasst.

Herkunft der Explantate

insgesamt

blühend

weißblühend

weißblühend mit rot

weißblühend

7

1

-

1

weißblühend mit rot

9

3

1

2

Kontrolle (weiß–blühend mit rot)

9

4

-

4

Tabelle 37: Ergebnisse der Blütenbonituren von ‘Shirobana’-Pflanzen nach In-vitro-Kultur und den Kontrollpflanzen. 2000.

Aufgrund der geringen Anzahl von Versuchspflanzen wären weitere Experimente im größeren Umfang sinnvoll.
Untersuchungen des Sprossscheitels an Spiraea bumalda ‘Shirobana’
In Längsschnitten durch Sprossscheitel war der entsprechende Aufbau der Apikalmeristeme zu überprüfen. Bei 6 Längsschnittserien von 21 untersuchten Sprossscheiteln sowie 2 untersuchten Achselknospen wurden in der ersten Schicht perikline Aufspaltungen nachgewiesen. Bei allen anderen untersuchten Fällen teilte sich nur die zweite Schicht periklin (Tabelle 38, Abbildung 39). Anhand dieser Ergebnisse wird davon ausgegangen, dass bei Spiraea bumalda ‘Shirobana’ nur 2 Sprossscheitelschichten in das Laubblatt eingehen.

Scheitel
Anzahl

Schicht mit periklinen Aufspaltungen

Nur L1

Nur L2

L1+L2

Ohne

Sprossscheitel

21

0

11

6

4

Achselknospen

16

1

9

1

5

Tabelle 38: Sprossscheiteluntersuchungen zum Vorliegen perikliner Teilungen in den Scheitelschichten bei Spiraea bumalda ‘Shirobana’

Abbildung 39: Längsschnitte durch einen Sprossscheitel von Spiraea bumalda ‘Shirobana’ im Kunststoff-Dauerpräparat, Färbung mit Hämatoxylin nach Delafield.

Hypoderm und Beeinflussung der Musterbildung Mikroskopische Untersuchungen an Ctenanthe lubbersiana ‘Variegata’
Ctenanthe lubbersiana ‘Variegata’ zeigte bei Blattquerschnitten in der Regel einen 9 bis 10-schichtigen Blattaufbau. Im gesamten Blatt im grünen Randbereich und in der weißen Mittelzone befindet sich im Anschluss an die Epidermen ein Hypoderm. Blattoberseits besitzt das Hypoderm große Zellen, blattunterseits kleine Zellen. Die gesamte Gewebeschicht ist phänotypisch weiß (Abbildung 41). In den Stomata und Nebenzellen der untersuchten Blätter waren über sowohl grünen als auch über weißen Blattbereichen grüne Plastiden vorhanden (Abbildung 40). Die übrigen Epidermiszellen phänotypisch weiß.

Abbildung 40: Epidermisabzug von Ctenanthe lubbersiana ‘Variegata’, Die Schließ- und Nebenzellen besitzen grüne Plastiden.

Abbildung 41: Querschnitt durch ein Blatt von Ctenanthe lubbersiana ‘Variegata’, Im gesamten Blatt sowohl an Blattober- als auch Blattunterseite ist ein Hypoderm.

Im Bereich des weißen Binnenfeldes schließt sich das chlorophylldefekte Mesophyll sofort an das Hypoderm an. Dadurch ist das Binnenfeld unmaskiert, da im Bereich des Binnenfeldes weder die von der grünen L1 abstammende Epidermis noch das L2-bürtige Hypoderm Grünfärbung zeigen.

Bei jüngeren Blättern ist das Binnenfeld hellgrün, so als ob das weiße Gewebe von einer grünen Zellschicht maskiert wäre. Vergleichende Untersuchungen an Frischpräparaten von Blattquerschnitten jüngerer Blättern, die ein hellgrünes Binnenfeld hatten, zeigten, dass zwischen Epidermis und Mesophyll keine grüne Zellschicht vorhanden ist. Vielmehr handelt es sich um Zellen mit mutierten Chloroplasten, die zunächst hellgrün erscheinen, sich aber in älteren Blättern zu weißen Plastiden entwickeln. Im hellgrünen Übergang des Blattes gibt es meistens eine grüne Schwammparenchymzellschicht im weißen Binnenfeld (Abbildung 42).

Abbildung 42: Blattquerschnitte durch das Binnenfeld von Ctenanthe lubbersiana ‘Variegata’, links: bei jüngeren Blättern ist das Binnenfeld hellgrün; rechts: bei älteren Blättern ist das Binnenfeld weiß.
Mikroskopische Untersuchungen an Ctenanthe oppenheimiana Aufbau des Blattes von Ctenanthe oppenheimiana
Das Blatt von Ctenanthe oppenheimiana ist in der Regel neunschichtig. Folgender Aufbau ist bei dieser Pflanze charakteristisch: eine einschichtige obere und untere Epidermis und ein einschichtiges oberes und unteres Hypoderm umschließen zwei Palisadenparenchym- und meist zwei Schwammparenchymschichten.

Die oberen Hypodermzellen sind größer als die unteren Hypodermzellen, haben eine annähernd quadratische (oben) bzw. ovale Form (unten) und enthalten keine Plastiden. Normalerweise besitzen die Palisadenparenchymzellen längliche, die Schwammparenchymzellen dagegen eine runde Form.

Blattquerschnitte (Frisch- und Dauerpräparate) von graugrünen Sektoren zeigten Lufträume zwischen den Palisadenparenchymzellen. Die Zellen haben eine längliche bis ovale Form. Im Gegensatz dazu sind in normalen grünen Bereichen längliche rechteckige Palisadenparenchymzellen beobachtet worden und sehr kleine Zellzwischenräume (Abbildung 43).

Abbildung 43: Blattquerschnitte von Ctenanthe oppenheimiana’ im Kunststoff-Dauerpräparat, Färbung mit Toluidinblau; links: Der Schnitt durch den graugrünen Sektor zeigt Lufträume zwischen den Palisadenparenchymzellen, rechts: Schnitt durch einen grünen Bereich mit sehr kleinen Interzellularräume im Palisadenbereich.

Die Anwesenheit solcher Lufträume bewirkt, dass sich das einfallende Licht in den Lufträumen streut, bevor es die Chloroplasten erreicht. Das hat zur Folge, dass ein Teil des auftretenden Lichtes durch das Hypoderm bzw. die Epidermis reflektiert wird und die graugrüne Variegation an der Oberseite des Blattes entsteht (Fooschee und Henny, 1990).
Anatomische Struktur eines chlorophylldefekten Blattes von Ctenanthe oppenheimiana ‘Tricolor’.
Blattquerschnitte von Ctenanthe oppenheimiana ‘Tricolor’ zeigten eine bis auf die Schließ- und Nebenzellen chloroplastenfreie Epidermis. Eine Anthocyanausbildung, die für die rote Farbe auf der Unterseite verantwortlich ist, wurde ausschließlich in der unteren Epidermis beobachtet (Abbildung 44).

Abbildung 44: Abzug der unteren Epidermis von Ctenanthe oppenheimiana ‘Tricolor’: Die Schließ- und Nebenzellen enthalten grüne Plastiden.

Kleine grüne Randbereiche des Blattes enthalten grüne Mesophyllzellen, die wegen des chloroplastenfreien, durchgehenden Hypoderms keinen Kontakt zur Epidermis haben (Abbildung 45).

Abbildung 45: Querschnitt durch den weißen Blattrand von Ctenanthe oppenheimiana ‘Tricolor’, grüne Zellen befinden sich subhypodermal im weißen Randmesophyll. Ein Hypoderm ist blattober- und blattunterseits ausgebildet.

Im weißen Randbereich werden alle Schichten des Mesophylls von chlorophylldefekten Zellen aufgebaut. Im Bereich des grünen Binnenfeldes schließt sich sofort grünes Mesophyll an das Hypoderm an (Abbildung 46, rechts).

Abbildung 46: Blattquerschnitte von Ctenanthe oppenheimiana ‘Tricolor’, links: Übergang vom grünen Binnenfeld zum weißen Blattrand, rechts: Schnitt durch das grüne Binnenfeld.
Mikroskopische Untersuchungen an der Rhododendron-Hybride ‘Goldflimmer’
Anhand anatomischer Untersuchungen an Blattquerschnitten im hellen Binnenfeld der Rhododendron-Hybride ‘Goldflimmer’ lässt sich folgender Blattaufbau feststellen: Auf die untere Epidermis, in deren Schließzellen grüne Plastiden nachweisbar sind, folgen eine oder manchmal eine zweite grüne Schicht von Schwammparenchymzellen, 5 bis 6 chlorophylldefekte Schwammparenchymschichten, 4 bis 6 weiße Palisadenschichten, eine Hypodermschicht und die obere Epidermis. Da im Bereich der Blattunterseite kein Hypoderm ausgebildet wird, ist hier die Färbung von L2-bürtigem Gewebe durchgehend ablesbar (Abbildung 47).

Abbildung 47: Blattquerschnitt der Rhododendron-Hybride ‘Goldflimmer’, links: Im Bereich der Blattoberseite eines unmaskierten Binnenfeldes ist ein Hypoderm ausgebildet; rechts: Im Bereich der Blattunterseite ist die grüne Färbung von L2-bürtigem Gewebe ablesbar.

Im Übergang vom hellen Binnenfeld zum grünen Randbereich wurden an der Blattoberseite eine oder mehrere grüne Palisadenparenchymschichten beobachtet. Homohistisch grüne Triebe der Rhododendron-Hybride ‘Goldflimmer’ zeigten ebenfalls eine Hypodermschicht unter der oberen Epidermis (Abbildung 48 und Abbildung 49).

Abbildung 48: Rhododendron-Hybride ‘Goldflimmer’, links: Schließzellen mit Chloroplasten, rechts: Der Blattquerschnitt durch den Blattrand zeigt das grüne L2-bürtige Mesophyll.

Abbildung 49: Querschnitt durch ein Blatt eines homohistisch grünen Triebes der Rhododendron-Hybride ‘Goldflimmer’, links: Blattquerschnitt im Bereich einer Blattmitte; rechts: Blattquerschnitt am Blattrand. Das gesamte Mesophyll im Blatt enthält grüne Plastiden und ein Hypoderm ist nur an der Blattoberseite zu erkennen.
Rhododendron simsii ‘Andenken an Vater Hedusch’
Blattquerschnitte durch das grüne Binnenfeld zeigten folgenden Blattaufbau: An die untere kleinzellige grüne Epidermis schließt sich eine weiße Schicht Schwammparenchym an. Die übrigen Mesophyllschichten (drei bis vier Schwammparenchym- und eine oder zwei Palisadenschichten) sind grün bis auf mindestens eine weiße Schicht unter der oberen großzelligen Epidermis (Abbildung 50).

Abbildung 50: Rhododendron simsii ‘Andenken an Vater Hedusch’ links: Schließzellen mit Chloroplasten; rechts: Querschnitt durch das grüne Binnenfeld, eine weiße Mesophyllschicht ist blattober- und blattunterseits ausgebildet.

Durchbrüche der grünen Innenkomponente durch die weiße Schicht wurden beobachtet. An solchen Stellen erscheint das Blatt grüner. Bei dieser Sorte liegen in Schließzellen grüne Plastiden vor (Abbildung 51).

Abbildung 51: Rhododendron simsii ‘Andenken an Vater Hedusch’, links: Blattquerschnitt im Bereich eines Überganges vom graugrünen Sektor zum grünen Binnenfeld; rechts: Blattquerschnitt im Bereich eines Überganges von einem graugrünen Sektor zum weißen Blattrand

Grüne Sektoren am weißen Rand haben direkten Kontakt mit der Epidermis, sind aber durch weißes Gewebe vom grünen Binnenfeld isoliert (Abbildung 52).

Abbildung 52: Rhododendron simsii ‘Andenken an Vater Hedusch’. Blattquerschnitt (rechts) im Bereich des weißen Randes des links dargestellten Blattes. Das grüne Gewebe ist L1-bürtig.
Untersuchungen von Sprossscheiteln
Die Musteranalysen auf morphologischer und anatomischer Ebene an variegaten, periklinalchimärischen Klonen der Rhododendron-Hybride ‘Goldflimmer’, Ctenanthe oppenheimiana ‘Tricolor’ und Ctenanthe lubbersiana ‘Variegata’ haben gezeigt, dass im Sprossscheitel mindestens drei unabhängige Schichten vorliegen (Tabelle 39, Abbildung 53).

Sprossscheitel
Anzahl

Achselknospen
Anzahl

Schichten
Anzahl

Ctenanthe lubbersiana
‘Variegata’

29

-

3

Ctenanthe oppenheimiana
‘Tricolor’

11

-

3

Rhododendron
-Hybride ‘Goldflimmer’

15

-

3

Rhododendron simsii
‘Andenken an Vater Hedusch’

4

6

3

Tabelle 39: Sprossscheiteluntersuchungen

Abbildung 53: Mediane Längsschnitte durch Sprossscheitel, a: Ctenanthe oppenheimiana ‘Tricolor’, b: Ctenanthe lubbersiana ‘Variegata’, c: Rhododendron simsii ‘Andenken an Vater Hedusch’ und d: Rhododendron-Hybride ‘Goldflimmer’