Role of Undecaprenyl Phosphokinase in mycobacteria: impact on biofilm formation, growth properties, persistence, and virulence

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) im Fach Biologie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dipl.-Biol. Lars Röse
(geb. 27.08.1974, Geesthacht)

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Erwin Schneider
2. Prof. Dr. Stefan Kaufmann
3. PD Dr. Ulrich Schaible

Tag der Einreichung: 03.03.04

Tag der mündlichen Prüfung: 09.06.04


[page 2↓]

Zusammenfassung

Die Familie der Mykobakterien setzt sich aus pathogenen und apathogenen Vertretern zusammen. In dieser Arbeit wurden 3 Mitglieder dieser Familie für Untersuchungen herangezogen: ihr prominentester pathogener Vertreter Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose, das als Impfstoff eingesetzte Mycobacterium bovis BCG, das durch Attenuierung aus dem Rindertuberkulose-Erreger Mycobacterium bovis hervorging und das apathogene Bodenbakterium Mycobacterium smegmatis.
Ein Schlüssel zum Verständnis der Mykobakterien und speziell ihrer Widerstandsfähigkeit ist die Kenntnis ihrer komplexen Zellwand. Peptidoglycan als deren Bestandteil und insbesondere der mittels Undecaprenyl-Monophosphat bewerkstelligte Transport von Peptidoglycan-Vorläufern aus dem Cytoplasma an die Zelloberfläche steht dabei im Zentrum der Zellwandbildung. In M. tuberculosis, M. bovis BCG und M. smegmatis wurden Deletionsmutanten für die Undecaprenyl-Phosphokinase (Upk) hergestellt.
Für M. smegmatis wurde gezeigt, daß die Δupk Deletionsmutante, in Übereinstimmung mit Deletionsmutanten homologer Gene in anderen Bakterien, eine erhöhte Sensitivität gegenüber dem die Zellwandsynthese hemmenden Antibiotikum Bacitracin aufwies. Überraschenderweise zeigte M. tuberculosis Δupk diesen Phänotyp nicht. Weiterhin ließ sich für M. smegmatisΔupk im Vergleich zum M. smegmatis Wildtyp Peptidoglycan an der Zelloberfläche in geringerem Maße nachweisen. Eindrucksvoll zeigte sich die Bedeutung der Undecaprenyl Phosphokinase in der gestörten Entwicklung von Biofilmen im Falle der M. smegmatis Δupk Mutante. Dies galt sowohl für in vitro Bedingungen als auch für ein, im Rahmen dieser Arbeit, neu entwickeltes in vivo Modell.
Vergleiche von M. tuberculosis Wildtyp und M. tuberculosis Mutante auf der Ebene von Proteom- und Transkriptom-Analysen führten zur Identifikation eines zum mykobakteriellen Fettsäure-Synthese II (FASII) System gehörenden Operons, das im Falle der upk-Deletion verstärkt exprimiert wurde und damit möglicherweise einen Kompensationsmechanismus für die fehlende Phosphokinase darstellt.
Eine reduzierte Persistenz von M. smegmatisΔupk in infizierten Makrophagen legte nahe, daß Upk bei mykobakteriellen Infektionen eine entscheidende Rolle für das Überleben der Bakterien und ihre Virulenz spielt. Dies konnte erstmals für M. tuberculosis im Rahmen von Maus-Infektionsversuchen gezeigt werden. M. tuberculosisΔupk ließ sich als neues Mitglied in eine Reihe von als growth in vivo (giv) klassifizierten Mutanten einreihen.
Die Herstellung von Deletionsmutanten wird als Möglichkeit betrachtet, verbesserte Impfstoffe herzustellen. Die physiologische Konsequenz der Deletion sollte bestenfalls neben einer Attenuierung des Ausgangsbakteriums (gilt besonders für M. tuberculosis) eine Überexpression protektionsrelevanter Antigene zur Folge haben. Im Vergleich zum bestehenden Impfstoff M. bovis BCG führte die Impfung von Mäusen mit M. bovis BCG Δupk sowohl zu geringerer bakterieller im Anschluß an die Vakzinierung als auch zu einer verbesserten Langzeit-Protektion gegen Tuberkulose.

Eigene Schlagworte: Biofilm, Persistenz, Virulenz, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium bovis BCG, Undecaprenyl-Phosphokinase


[page 3↓]

Summary

The family of mycobacteria is composed of pathogenic and apathogenic bacteria. This study was performed with 3 members of this family, the most prominent pathogenic member, Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, the vaccine strain Mycobacterium bovis BCG which was developed by attenuation of the bovine tuberculosis agent Mycobacterium bovis, and Mycobacterium smegmatis which is apathogenic and widely distributed in soil.
A key to understanding mycobacteria and, especially, their resistance is to understand the complexity of their cell wall. Peptidoglycan is a major component of the cell wall and the transport of peptidoglycan precursors out of the cytoplasm to the bacterial surface by undecaprenyl monophosphate is central to cell wall synthesis. Therefore, deletion mutants of the undecaprenyl phosphokinase gene (upk) were generated in M. tuberculosis, M. bovis BCG, and M. smegmatis.
In the case of M. smegmatis it was shown that a Δupk deletion mutant, as with deletion mutants of homologous genes in other bacteria, exhibited an increased sensitivity to the antibiotic bacitracin, indicating that cell wall synthesis was hampered. Surprisingly, M. tuberculosisΔupk did not exhibit this phenotype. Furthermore, a lower level of peptidoglycan was detected on the cell surface ofan M. smegmatis Δupk mutant compared to M. smegmatis wildtype. Relevance of the undecaprenyl phosphokinase was demonstrated by impaired biofilm development in the case of the M. smegmatisΔupk mutant. This was observed in vitro as well as in vivo using an animal model which was newly developed in this thesis.
A fatty acid synthase II (FASII) system related operon revealed by comparative proteome- and transcriptome-analyses comparing M. tuberculosis wildtype and M. tuberculosisΔupk mutant, and may reflect a compensatory mechanism for the loss of upk.
Reduced persistence of M. smegmatis in infected macrophages suggested a decisive role of Upk in mycobacterial infection concerning survival and virulence of bacteria. This was later demonstrated to be true for M. tuberculosis in a mouse model. M. tuberculosisΔupk was, therefore, classified as a new member of the group of growth in vivo (giv) mutants.
Construction of deletion mutants is a strategy to identify improved vaccines. Ideally, the physiologic consequences of a gene deletion would result in attenuation of the modified bacterium (especially in the case of M. tuberculosis) and overexpression of antigens relevant for protection. Compared to the existing vaccine M. bovis BCG, vaccination of mice with M. bovis BCG Δupk exhibited a lower bacterial load upon vaccination as well as an improved long-lasting protection against M. tuberculosis infection.

Keywords: biofilm, persistence, virulence, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium bovis BCG, undecaprenyl phosphokinase

Table of contents

Tables

Images



© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML generated:
15.07.2004