Royl, Georg: Neurovaskuläre Kopplung im somatosensorischen Kortex der Ratte: Untersuchungen zur zeitlichen Kinetik mittels optischer Verfahren und funktioneller Magnetresonanztomographie

29

Kapitel 2. Modelle und Methoden

Diese Studie basiert auf optischen und magnetresonanztomographischen Methoden, die örtlich getrennt durchgeführt wurden<1>. Dieses Kapitel erläutert zunächst die durchgeführten Experimente und die verwendeten Auswertetechniken. Im Kapitel 3 werden dann die Ergebnisse dargestellt. Die anschließende Diskussion im Kapitel 4 bewertet die Ergebnisse, stellt sie in Bezug zu den aufgestellten Hypothesen und zieht daraus Schlußfolgerungen.

Im Mittelpunkt der Untersuchungen stand die funktionelle Aktivierung des zerebralen Kortex. Diese wurde am Tiermodell Ratte durch somatosensorische Stimulation hervorgerufen, wobei zum einen die Whiskerstimulation, d.h. die Auslenkung von Barthaaren, zum anderen die elektrische Vorderpfotenstimulation zum Einsatz kamen. Die Whiskerstimulation wurde mit Optical Imaging und Imaging Spectroscopy untersucht. Dabei stand die Fragestellung nach der räumlichen Auflösung von Oxygenierungssignalen im Vordergrund. Die Vorderpfotenstimulation wurde in separaten Experimenten optisch und magnetresonanztomographisch untersucht, um die Kongruenz der beiden Methoden zu prüfen. Über die Kontrolle der physiologischen Parameter, der Anästhesie und der Stimulationsparadigmen wurde die Vergleichbarkeit optimiert. Die Stimulationsdauer wurde variiert, um die optischen und magnetresonanztomographischen Signale in ihrer Kinetik einander gegenüberzustellen und dabei systematische Fehlertrends zu vermeiden.

2.1 Das somatosensorische System der Ratte

Die Ratte ist Versuchsmodell für verschiedene Modalitäten der funktionellen Stimulation. Hierbei kommen für anästhesierte Tiere nur sensorische Stimulationen in Betracht. Die visuelle und die akustische Stimulation werden vereinzelt für Studien angewendet. Allerdings ist das visuelle System bei der Ratte nicht sehr differenziert, was sich auch in seiner geringen Repräsentation auf dem Kortex zeigt. Das akustische System ist sensitiver, bereitet aber aufgrund seiner kortikalen Lage und der Tatsache, daß man den äußeren Gehörgang meist zur Fixierung des Kopfes benötigt, Schwierigkeiten bei der Anwendung. In der lärmintensiven


30

fMRT läßt sich eine akustische Begleitaktivierung kaum vermeiden. Offenbar verstärkt diese akustische Stimulation aber die Antwort auf somatosensorische Stimulation . Als Modell zur Darstellung der Tonotopie ist die akustische Stimulation auch schon mit Optical Imaging untersucht worden . Die olfaktorische Stimulation ist aufwendig im Aufbau und schwer zu steuern . Für die funktionelle Bildgebung der Ratte ist daher von allen Stimulationsformen die somatosensorische Stimulation am besten geeignet.

Ein Tiermodell bei Methoden zur Messung und räumlichen Charakterisierung der Blutflußantwort auf funktionelle Stimulation sollte folgende Anforderungen erfüllen:

Aufgrund der Somatotopie, d.h. der Eigenschaft, die stimulierte Körperregion in ihrer neuronalen Repräsentation auf dem Kortex abzubilden, ist das somatosensorische System der Ratte besonders geeignet, Studien über die Kapazität intrinsischer Signale zur Gehirnkartierung durchzuführen. Eine Umrißzeichnung, bei der auf einem Bild des Kortex die jeweiligen Körperteile auf das Gebiet skizziert werden, das bei Stimulation erhöhte extrazelluläre Potentiale aufweist, ergibt ein verzerrtes Abbild der Ratte. Analog dem "Homunculus" auf dem menschlichen Gyrus postcentralis wurde es „Ratunculus“ genannt ( Abbildung 3 ). Mit der Größe, die eine Körperregion in ihrer Projektion auf den Kortex einnimmt, läßt sich die Sensitivität der dort empfundenen Sinneswahrnehmungen abschätzen. So sind beispielsweise beim Menschen die Areale für Gesicht und Hand besonders groß. Wie auf der Abbildung zu sehen, nimmt die Repräsentation der Whisker-Haare fast ein Fünftel des gesamten somatosensorischen Kortex der Ratte ein.


31

Abbildung 3: Neuronale Somatotopie im Kortex der Ratte

Ein histologischer Schnitt durch den primär somatosensorischen Kortex der Ratte: der "Ratunculus" ist eingezeichnet auf der Grundlage der zytoarchitektonisch abgegrenzten Subareale. Das Posteromedial Barrel Subfield (PMBF) enthält die 1:1 Zuordnung von Whisker-Haar und kortikalen Kolumnen, die hier "Barrels" (Fässer) genannt werden. FP, Vorderpfotenareal
aus .

2.1.1 Die Whiskerstimulation

Die Ratte ist bei ihrer Orientierung in der Umwelt auf die taktile Wahrnehmung durch ihre Whisker-Haare angewiesen, weshalb dieses System äußerst sensitiv ist. Es wurden Zeichen der Aktivierung bei minimalen Haarauslenkungen von 0.04° gemessen . Für Studien der funktionellen Neuroanatomie ist das Whisker-System vor allem wegen seiner gut abgrenzbaren kortikalen Organisation geeignet. Jedem Whisker-Haar ist im somatosensorischen Areal eine kortikale Kolumne zugeordnet ( Abbildung 4 A), die sich in der Schicht IV bauchförmig ausweitet und daher "Whisker-Barrel" (Whiskerfaß) genannt wird. Die Tatsache, daß die Gefäßarchitektur in ihrer arteriolären Versorgung und kapillären Dichteverteilung dieser Barrel-Architektur folgt, verleiht dem Whisker-System für die Erforschung der neurovaskulären Kopplung große Bedeutung ( Abbildung 4 B).

Abbildung 4: Vaskuläre Somatotopie im Kortex der Ratte

Die somatotopische Anordnung von Whisker-Haaren zu Whisker-Barrelstrukturen (A) läßt sich nicht nur zytoarchitektonisch und elektrophysiologisch reproduzieren. Auch die Gefäßarchitektur (hier ein Ausgußpräparat) folgt dieser Barrel-Anordnung (B), wobei von der Arteria cerebri media ausgehend je eine penetrierende Arteriole einem Whisker-Barrel zugeordnet ist und das versorgende Kapillarnetz füllt
aus .


32

2.1.2 Die Vorderpfotenstimulation

Aufgrund ihrer leichten Kontrollierbarkeit wird die elektrische Vorderpfotenstimulation in der funktionellen Bildgebung des somatosensorischen Kortex häufig eingesetzt. Auch das Vorderpfotenareal zeigt eine Kolumnenorganisation, allerdings ist die somatotopische Zuordnung nicht so differenziert möglich wie beim Whisker-System. Das Vorderpfotenareal ist kleiner als das Whisker-Areal. Anhand der typischen Lokalisation läßt sich die funktionelle Kartierung dieser Stimulation beurteilen. Ein wichtiger Vorteil, den diese elektrische Stimulation gegenüber der mechanischen besitzt, ist die Möglichkeit, sehr kurze Stimulationsdauern im Bereich von Millisekunden zu applizieren. Dies wird unter anderem für die zeitliche Charakterisierung des BOLD-Signals und Studien zu dessen Linearität ausgenützt .

2.2 Die Präparation

2.2.1 Die Präparation für Optical Imaging und Imaging Spectroscopy

Die Ergebnisse von Optical Imaging und Imaging Spectroscopy stammen von Experimenten an 10 männlichen Wistar Ratten, bei denen die Verfärbung des somatosensorischen Kortex unter mechanischer Whiskerauslenkung (n=4) bzw. elektrischer Vorderpfotenstimulation (n=6) gemessen wurde.

Zu Beginn der Präparation wurden die Ratten (Körpergewicht 250 - 350g ) mit 3% Isofluran in einem Trägergas aus 70% N2O und 30% O2 anästhesiert. Nach einer raschen Tracheotomie wurden die Tiere mit einem Nagetier-Respirator (Effenberger, Paffing/Attel, Deutschland) künstlich beatmet und das Isofluran auf 0.8-1.5% reduziert. Die Körpertemperatur wurde mit einer rektalen Sonde kontrolliert und mit einer Heizplatte konstant gehalten (38 ± 0.5°C). Vor jedem Hautschnitt wurde subkutan mit Lidocain anästhesiert.

Die linke Arteria und Vena femoralis wurden freipräpariert und mit PE50-Schläuchen kannüliert. Die Katheter wurden mit 0.9%iger NaCl-Infusion freigehalten (1ml/h). Die Körpertemperatur, der arterielle Blutdruck (RFT, Biomonitor, Zwönitz, Germany) und die endexspiratorische CO2-Spannung (CO2 Monitor Artema MM 200, Heyer, Bad Ems, Deutschland) wurden kontinuierlich angezeigt und im physiologischen Bereich gehalten. Zudem wurden die arteriellen Blutgase periodisch nach Probenentnahme gemessen (Compact 2, AVL, Bad Homburg, Deutschland).


33

Für die weitere Präparation wurden die Tiere in einem stereotaktischen Rahmen fixiert. Dann folgte die Implantation eines geschlossenen kraniellen Fensters von ca. 4x5mm Größe über dem rechten somatosensorischen Kortex. Dabei lag das Zentrum des Fensters für die Whiskerstimulation etwa 7mm lateral und 3mm kaudal zum Bregma. Für die Vorderpfotenstimulation lag das Zentrum etwa 5mm lateral und 1mm kaudal zum Bregma.

Bei der Präparation des Fensters wurde zunächst mit einem Bohrer unter NaCl-Kühlung der parietale Knochen ausgedünnt. Dann wurde der ausgedünnte Knochendeckel mit einem Haken vorsichtig abgehoben. Die Dura mater wurde intakt gelassen und kleinere epidurale Blutungen mit Hilfe eines vorsichtigen Mikrokautergebrauchs gestoppt. Um das Fenster wurde ein Wachswall geformt. In das Innere dieses Wachswalls wurde auf die meningeale Oberfläche physiologische NaCl-Lösung gegeben. Das Fenster wurde dann mit einem Deckglas verschlossen, wobei die wirkenden Kapillarkräfte als Versiegelung genügten. Auf diese Weise konnte die Gehirnoberfläche durch die Meningen gleichmäßig beleuchtet und eingesehen werden.

Nach der chirurgischen Präparation wurde die Anästhesie auf eine Injektionsnarkose mit alpha-Chloralose/Urethan umgestellt. Dabei wurde eine initiale Bolusinjektion mit einem Ausschleichen aus der Inhalationsnarkose kombiniert, so daß innerhalb von 15min sowohl Isofluran als auch N2O abgestellt waren. Die Dosis der initialen i.v.-Bolusinjektion betrug 40mg alpha-Chloralose und 400mg Urethan pro kg Körpergewicht, die gleiche Dosis wurde anschließend stündlich in kontinuierlicher Infusion gegeben. Aufgelöst wurde sie in 1ml NaCl 0.9%. Vor dem Beginn der Messungen wurde 30-45min gewartet, um die Narkoseumstellung zu stabilisieren.

2.2.2 Die Präparation für die fMRT

Die fMRT-Ergebnisse stammen von 8 männlichen Sprague-Dawley-Ratten (250-350g Körpergewicht). Die Narkose wurde mit 3%igem Halothan im Trägergas O2 eingeleitet, nach der Tracheotomie wurde das Tier künstlich beatmet (Small Animal Ventilator Model 683, Harvard Apparatus, Holliston/MA, USA) und die Halothankonzentration auf 1-1.5% reduziert. Die Körpertemperatur wurde mit einer rektalen Sonde überwacht und mit einer Heizdecke zwischen 37.5 und 38.5 °C eingestellt. Vor jedem Hautschnitt wurde Lidocain appliziert. Die linke Arteria und Vena femoralis wurden im Bereich des Leistenbandes freipräpariert und mit PE50-Schläuchen kanülliert. Für die spätere Kontrastmittelapplikation wurde auf gleiche Weise ein Zugang zur rechten Vena femoralis gelegt.


34

Nach der chirurgischen Präparation wurde das Tier in einem stereotaktischen Rahmen aus Plastik fixiert (Selbstbau). Dann erfolgte eine graduelle Umstellung auf eine Injektionsnarkose mit alpha-Chloralose. Die Dosis betrug im initialen i.v.-Bolus 50mg alpha-Chloralose/kg KG gelöst in 1ml NaCl 0.9%, dann folgte eine kontinuierliche Gabe mit einer stündlichen i.v.-Dosis von 40mg/kg gelöst in 1ml NaCl 0.9%. Zusätzlich wurde der Chloralose das Muskelrelaxans Pancuronium mit einer resultierenden initialen Dosis von 2mg/kg und einer kontinuierlichen Dosis von 2mg/kg/h beigemischt. Die Beatmung wurde auf 20% O2 und 80% medizinische Luft umgestellt. Der arterielle Blutdruck wurde per Monitor überwacht und aus der Arterie wurden periodisch Proben zur Blutgasanalyse entnommen. Den Körper der Ratte ummantelten zwei Heizdecken (Gaymar, Orchard Park/NY, USA), in denen warmes Wasser zirkulierte, um die Körpertemperatur bei 37.5-38.5°C zu halten.

Zwischen der Narkoseumstellung und dem Beginn der Messungen vergingen etwa 45 min, in denen das Tier in der Röhre positioniert und der Magnetresonanztomograph kalibriert wurde.

2.3 Der experimentelle Aufbau

2.3.1 Stimulationsparadigmen

Optical Imaging und Imaging Spectroscopy wurden an zwei Stimulationssystemen angewandt, der mechanischen Whiskerstimulation und der elektrischen Vorderpfotenstimulation. Für die Whiskerstimulation wurden zunächst alle Tasthaare der linken Gesichtshälfte auf 1 cm Länge getrimmt. Dann wurde ein einzelnes Whisker-Haar ausgewählt, dessen Somatotopie kaudal im Winkel der Äste der A. cerebri media liegt (B1 oder B2, siehe Abbildung 4 ). Diesem Whisker-Haar wurde eine abgestumpfte Kanüle, die an einen selbstgebauten mechanischen Stimulator befestigt war, so weit angenähert, daß sich das Whisker-Haar in das Lumen der Kanüle einführen ließ ohne dabei aus seiner ursprünglichen Lage gebogen zu werden. Eine triggerbare Stromquelle steuerte ein Relais, an dessen Schalter die Kanüle fixiert war. Dies führte bei jedem Stromimpuls zu einer kurzen Auslenkung des Haares in rostral-kaudaler Orientientierung von etwa 5°. Die Dauer einer Whiskerstimulation betrug 2s bei einer Frequenz von 4Hz. Zwischen aufeinanderfolgenden Stimulationen wurde ein zeitlicher Abstand von mindestens 30s eingehalten.


35

Die Vorderpfotenstimulation wurde elektrisch über einen stromkontrollierenden Stimulator (DS7A, Digitimer, Hertfordshire, England) durchgeführt. Dabei wurden beide Seiten des Karpalgelenks mit zwei 20G-Stimulationsnadeln im Abstand von ca. 3mm punktiert. Die Nadeln wurden fixiert und an den Stimulator angeschlossen. Die Stimulationsparameter betrugen: Rechteckpuls von 0.5ms, 1.5mA Stromstärke, unipolar. Die Strompulse wurden mit einer Frequenz von 3Hz gesendet. Anders als bei der Whiskerstimulation wurde bei der Vorderpfotenstimulation die Dauer variiert, um Aussagen über Reproduzierbarkeit und Linearität treffen zu können. Dabei wurden Stimulationsdauern von 1, 2, 4, 8, 16 und 32s eingestellt. Die Triggerung des Stimulators erfolgte durch einen Master-8 (A.M.P.I., Jerusalem, Israel). Dieser wurde während des Experiments zwischen den Stimulationen von einem PC über die RS232-Schnittstelle umprogrammiert. Dabei wurde die Reihenfolge der 1, 2, 4, 8, 16 und 32s-Stimulationen bei der Hälfte der Tiere mit zunehmender, bei der anderen Hälfte mit abnehmender Stimulationsdauer gewählt. Synchronisiert wurde die Stimulation PC-gesteuert von VDAQ ("Video Data Acquisition"), dem Programm des Optical Imaging Systems. Sie sendete zum Datenaufnahmebeginn einen Triggerimpuls an den Master 8.

Bei den fMRT-Experimenten wurden auf gleiche Weise beide Pfoten abwechselnd stimuliert. Ein Master-8 steuerte einen ebenfalls stromkontrollierten Stimulator (A 385, World Precision Instruments, Sarasota, Florida) unter Verwendung der gleichen Parameter (Rechteckpuls, 0.5ms, 1.5mA, unipolar, 3Hz). Die Stimulationsdauer wurde manuell zwischen den Stimulationen umprogrammiert. Die Paradigmen wurden in zwei Gruppen eingeteilt: In einer Meßreihe wurden Stimulationsdauern von 1, 2, 4 und 8s nacheinander appliziert, in einer weiteren Meßreihe Stimulationsdauern von 8, 16, und 32s. Dabei wurden die Stimulationen in gegenläufiger Reihenfolge - zunehmende Dauer für die eine Pfote, abnehmende Dauer für die andere - angeordnet.

2.3.2 Der experimentelle Aufbau: Optical Imaging und Imaging Spectroscopy

Um spektroskopische Signale vom Ort der Aktivierung zu erhalten, wurde jedem Experiment der Imaging Spectroscopy ein Optical Imaging - Experiment vorangestellt. Hierbei wurden monochromatische intrinsische optische Signale mittels eines verstärkenden Videosystems (Imager 2001, Optical Imaging, Germantown, USA) aufgenommen.

Die Gehirnoberfläche wurde mit einer stabilisierten Lampe (Oriel, Darmstadt, Deutschland) ausgeleuchtet. Das weiße Licht dieser Lampe wurde mit einem Filter auf seinen 600nm-Anteil begrenzt. Ein Makroskop, bestehend aus zwei End-an-End aneinandergekoppelten


36

50mm-Objektiven, projizierte das so orange angestrahlte kranielle Fenster auf den Chip einer CCD-Kamera ( Abbildung 5 A). Der Imager 2001 digitalisierte das Bild mit einer Frequenz von 25Hz und summierte aufeinanderfolgende Bilder zu einer resultierenden Frequenz von 1.7Hz. Während eines Aufnahmeblocks wurden mit dieser Frequenz 12 Bilder nacheinander im RAM gespeichert und am Ende als Serie auf die Festplatte geschrieben. Danach folgte jeweils eine Pause von mindestens 15s Dauer.

Abbildung 5: Optischer Aufbau

Strahlengang und Abbildungsebenen der kortikalen Oberfläche im kraniellen Fenster bei der Projektion auf den CCD-Chip der Videokamera (CCD). Für Optical Imaging (A) und Imaging Spectroscopy (B) wurden unterschiedliche Elemente in den Strahlengang eingefügt (siehe Text).

Stimulationsblock (mit 2s dauernder 4Hz Whiskerstimulation einsetzend nach 0.5s Verzögerung) und Ruheblock (keine Stimulation) wurden abgewechselt. Unter Kontrolle der am Bildschirm dargestellten Aktivierungskarte, die die relative Veränderung der Pixelintensität bei Stimulation darstellte, wurden 5-10 solcher Stimulationsblock-Ruheblock-Sequenzen durchgeführt. Das Ziel dieser Aufnahmen bestand in der Auffindung des funktionell aktivierten Areals, als dem Areal, das unter der 600nm-Beleuchtung eine frühe lokalisierte Absorptionszunahme zeigte und einen minimalen Beitrag von oberflächlichen pialen Gefäßen aufwies (siehe Kapitel 2.4.1 ).

Für die nun folgende Imaging Spectroscopy wurde das Zentrum der Optik auf dieses Areal gerichtet. Das Gesichtsfeld wurde in der Projektionsebene des ersten Makroskops durch einen engen Schlitz mit einer Breite von 200µm eingeengt. Der resultierende Streifen, in dem die vertikale Ausdehnung erhalten blieb, wurde durch ein weiteres 50mm-Objektiv auf ein optisches Gitter projiziert, dessen Einkerbungen parallel zur Achse des Schlitzes standen ( Abbildung 5 B).


37

Das an diesem Gitter reflektierte Abbild des Schlitzes unterliegt dem optischen Phänomen der Beugung. Bei entsprechender Einstellung des Winkels, den das Gitter mit dem Strahlengang bildet, läßt sich das Maximum erster Ordnung durch das Objektiv in die Kamera lenken. Das Abbild des Schlitzes ist an dieser Stelle gebeugt und damit entsprechend der Wellenlänge des verwendeten Lichtes deplaziert. Entfernt man nun den Filter aus der Lampe, so wird die Gehirnoberfläche weiß beleuchtet. Das Abbild des Schlitzes ergibt im Maximum erster Ordnung ein zweidimensionales Bild, in dem das weiße Licht, das von der kortikalen Oberfläche reflektiert wird, in seine spektralen Anteile zerlegt ist. Durch die räumliche Anordnung des Gitters zu dem Schlitz-Abbild verteilt sich das Licht entsprechend seiner Wellenlängen orthogonal zum Schlitz-Abbild. Multiple Kopien des eindimensionalen Streifens werden so wellenlängenabhängig gebeugt und horizontal nebeneinander abgebildet. Es entsteht ein räumlich-spektrales Bild, in dem die räumliche Dimension erhalten bleibt (in der vertikalen Achse) und eine spektrale Dimension hinzugefügt wird (in der horizontalen Achse). Jede vertikale Linie des Bildes stellt die Pixel gleicher Wellenlänge dar, die ein Abbild des Schlitzes ergeben. Jede horizontale Linie stellt das Spektrum einer bestimmten Höhe entlang des Schlitzes dar.

Das weiße Schlitzbild wird auf diese Weise spektral aufgeweitet und bleibt dennoch in einer Achse räumlich aufgelöst, weshalb der Name Imaging Spectroscopy ("bildgebende Spektroskopie") für diese Methode gewählt wurde. Kalibriert wurde das räumlich-spektrale Bild über zwei Filter, die das weiße Licht und damit das abgebildete Spektrum auf seinen 532nm-Anteil ( Abbildung 6 A) bzw. sein 600nm-Anteil ( Abbildung 6 B) einengten. Jedes Experiment begann mit der Aufnahme solcher Kalibrationsbilder. In der späteren Analyse wurden die Wellenlängenpunkte der spektralen Achse zwischen den Intensitätsmaxima dieser Bilder interpoliert ( Abbildung 6 C).

Abbildung 6: Kalibrierung des räumlich-spektralen Bildes mit gefilterten Wellenlängen


38

Die Aufnahme der räumlich-spektralen Bilder wurde ebenfalls durch den Imager 2001 vorgenommen, bei der Whiskerstimulation in Blöcken von 30 Bildern mit einer zeitlichen Auflösung von 1.8 Bildern pro Sekunde. Beim Ruheblock wurde die Spontanaktivität auf dem Kortex gemessen. Zu Beginn des Stimulationsblocks triggerte der PC den Master-8, der mit einer Verzögerung von 2s den mechanischen Whisker-Stimulator aktivierte (Stimulationsdauer 2s, Frequenz 4Hz). Beiden Blöcken folgte eine Pause von 15s. Ruheblöcke und Stimulationsblöcke wurden in randomisierter Reihenfolge aufgenommen und die Mittelwerte der jeweiligen Pixelintensitäten gebildet. Bei der Whiskerstimulation wurden pro Experiment mindestens 48 Ruhe- und Stimulationsblöcke durchgeführt.

Um längere Stimulationen zu verfolgen, wurde die Datenaufnahme bei der Vorderpfotenstimulation auf 120 Bilder pro Block ausgeweitet, was eine Blockdauer von 68s ergab. Es wurden Sequenzen von acht verschiedenen Blöcken durchlaufen, von denen sechs Stimulationsantworten aufzeichneten (mit 1, 2, 4, 8, 16, 32s Stimulationslänge) und zwei die Spontanaktivität. Die Reihenfolge wurde bei drei Tieren mit aufsteigender und bei den anderen drei Tieren mit absteigender Stimulationsdauer festgelegt, um systematische Fehler zu vermeiden. Auf den 16s- und den 32s-Stimulationsblock folgte jeweils ein Ruheblock. Die nötige Umprogrammierung des Master-8 erfolgte PC-gesteuert. Pro Experiment wurden 24-36 Stimulationen jedes Paradigmas durchlaufen.

2.3.3 Der experimentelle Aufbau bei der fMRT

Die fMRT-Experimente wurden an einem Magnetresonanztomographen der Feldstärke 2T (SISCO spectrometer, Varian Spectroscopic Instruments, Palo Alto/CA, USA) durchgeführt. Die Datenaufnahme und die Exzitation vermittelte eine Sende-und Empfangs Radiofrequenzspule, die unmittelbar auf dem Schädel der Ratte fixiert wurde. Als Pulssequenz wurde das gradient echoplanar imaging (EPI) an einem Frontalschnitt von 1mm Breite durchgeführt. Die Zeitauflösung war 370ms, die TE (Echo Time) typischerweise 25ms bei einem Exzitationswinkel von 30°. Die resultierende räumliche Auflösung betrug etwa 0.3mm3 pro Voxel.

Es wurden zwei verschiedene fMRT-Methoden angewandt: die BOLD-fMRT und die MION-fMRT. Die BOLD-fMRT beruht auf der paramagnetischen Wirkung des Deoxy-Hb und bedarf keiner Kontrastmittelinjektion. Die MION-fMRT mißt die regionale Blutvolumenveränderung. Um ein plasmatisches und damit oxygenierungsunabhängiges


39

Volumensignal zu erhalten, wird intravenös das paramagnetische Kontrastmittel MION (Monocrystalline Iron Oxide Nanocolloid) injiziert. Die verwendete Eisendosis betrug 13mg/kg Körpergewicht.

MION besteht aus monokristallinen Eisenoxidkernen, die mit 512B Dextran (11kD) ummantelt sind. Dies vermindert die Opsonierung durch Plasmaproteine und erschwert somit die Entfernung der Partikel durch das retikuloendotheliale System. Es handelt sich hierbei um ein Kontrastmittel, das extrem paramagnetisch ist und sich im gesamten Blutplasma verteilt . Wenn MION mit einer Eisendosis von 10mg/kg injiziert wird, zeigt die transverse Relaxationsrate im Gehirn nach dem Äquilibrium über drei Stunden keine spontane Veränderung . Dieses Kontrastmittel erlaubt daher stabile Messungen sowie die Berechnung relativer Veränderungen im plasmatischen zerebralen Blutvolumen, pCBV.

Anders als die invasiven optischen Verfahren erlaubt die fMRT, beide Hemisphären gleichzeitig zu untersuchen. Daher wurden bei jedem Tier beide Vorderpfoten stimuliert. Im ersten Teil des Experiments wurden Stimulationsdauern von 1, 2, 4 und 8s Dauer nacheinander ausgeführt. Dabei wurde alle 30s abwechselnd die rechte und die linke Vorderpfote stimuliert. Die Stimulationen wurden bei der einen Pfote mit zunehmender, bei der anderen mit abnehmender Stimulationsdauer angeordnet. Damit resultierte für eine Vorderpfote eine Ruhezeit von 52-59s zwischen aufeinanderfolgenden Stimulationen. Der zweite Teil des Experiments bestand aus einem entsprechenden Protokoll mit Stimulationsdauern von 8, 16 und 32s. Die Zeit zwischen den Stimulationen wurde verlängert auf 60s, so daß pro Vorderpfote eine Ruhezeit von 88-112s eingehalten wurde. Die Zeitauflösung betrug 370ms.

Acht Ratten wurden auf ihre Vorderpfotenstimulationsantwort hin untersucht. Dabei wurden bei sechs Tieren innerhalb des gleichen Experiments erst BOLD und nach MION-Injektion pCBV gemessen. Bei je einem Tier wurde nur BOLD- bzw. nur MION-fMRT durchgeführt.

2.4 Die Datenanalyse

2.4.1 Die Datenanalyse des Optical Imaging

Ziel des Optical Imaging war die Lokalisierung des jeweiligen somatosensorisch aktivierten Kortexareals. Über das aktivierte Gebiet der resultierenden funktionellen Karte wurde später


40

der Schlitz für die Imaging Spectroscopy positioniert. Eine stimulationsbedingte Absorptionszunahme bildete die Grundlage dieser optischen Bildgebung. Sie läßt sich aus den Rohdaten auf verschiedene Weise ermitteln.

Zum einen bietet das Aufnahmeprogramm VDAQ die Möglichkeit, noch während des Experiments zwischen den Messungen eine vorläufige funktionelle Kartierung durchzuführen. Dabei werden alle Bilder des Stimulationsblocks und alle Bilder des Ruheblocks zu je einem durchschnittlichen Bild gemittelt. Dann wird eine sogenannte "globale Karte" erstellt, indem das Stimulationsbild durch das Ruhebild geteilt wird. Jedes Pixel dieser Karte enthält als Wert die relative Veränderung seiner Intensität unter Stimulationsbedingung gegenüber der unter Ruhebedingung. Bei vermehrter Absorption nimmt der absolute und der relative Wert des Pixels ab. Viele solcher Pixel ergeben dann ein Areal, das durch seine relativ erniedrigten Intensitätswerte mit der Umgebung kontrastiert.

Ob diese Absorption mit der Stimulation im zeitlichen Zusammenhang steht, läßt sich anhand des Zeitverlaufs prüfen. Hierzu bietet VDAQ ein sogenanntes "Superpixel", einen quadratischen Bezirk innerhalb des Bildes, dessen mittlere Pixelintensität bestimmt wird. Der Intensitätszeitverlauf während des Stimulationsblocks wird nach jeder Messung graphisch dargestellt. Steht die zunehmende Absorption mit der Stimulation im zeitlichen Zusammenhang, so müssen sich Verzögerung und Dauer der Stimulation in diesem Zeitverlauf wiedererkennen lassen.

Diese vorläufige Hirnkartierung durch das Aufnahmeprogramm VDAQ wurde durch digitale Nachbearbeitung validiert. Um die Stimulationsantwort zu prüfen, wurde Zeitpunkt für Zeitpunkt die Veränderung des aufgenommenen Bildes gegenüber dem Ruhebild verglichen. Dies ergab den Zeitverlauf der globalen Aktivierungskarte. Aus Gründen der Quantifizierung und Vergleichbarkeit wurde die relative Veränderung jedes Pixels logarithmiert und mit -1 multipliziert ( Gleichung 2 ).

Gleichung 2

I0 enthält die mittlere Intensität des Pixels mit den Koordinaten xy vor der Stimulation. Der Wert A wird als Abschwächung (engl. Attenuation) bezeichnet und hat die dimensionslose Einheit Optische Dichte (engl. Optical Density, [OD]).


41

Anhand einer solchen Abschwächungs-Bildserie läßt sich beobachten, ob die vermehrte Absorption des kartierten Areals in zeitlichem Zusammenhang mit der Stimulation steht. Um diese Veränderung auch statistisch zu prüfen, muß die Varianz jedes Pixels mit einbezogen werden. Eine solche Varianzanalyse bietet der gepoolte t-Test: Der Mittelwert eines Pixels unter Ruhebedingungen wird von seinem Mittelwert unter Stimulation abgezogen. Die resultierende Differenz wird duch die gemeinsame Varianz des Pixelwertes unter Ruhe- und Stimulationsbedingungen geteilt. Die Berechnung des t-Wertes für einen Pixel zeigt Gleichung 3 .

Gleichung 3

µStim, VarStim: Mittelwert bzw. Varianz des Pixels unter Stimuluskonditionen
µRuhe., VarRuhe: Mittelwert bzw. Varianz des Pixels unter Ruhekonditionen
nStim, nRuhe: Anzahl der Stimulations- bzw. Ruhebilder.

Aus dem t-Wert läßt sich mit der Anzahl der Freiheitsgrade (nStim + nRuhe -2) das statistische Signifikanzniveau ermitteln. Der resultierende p-Wert gibt an, mit welcher Wahrscheinlichkeit die Veränderung eines Pixelwertes unter Stimulation zufällig zustandegekommen ist. Die spontanen Absorptionsschwankungen werden auf diese Weise berücksichtigt. Es hat sich gezeigt, daß ein solcher statistischer Test Veränderungen in den gefäßarmen Regionen hervorhebt, weil diese anders als die pialen Gefäße Licht aussenden, das ein größeres und damit homogeneres Meßvolumen durchleuchtet hat.

Die neuronalen Entladungen und die an sie gekoppelten vaskulären Signale finden überwiegend in der IV. Schicht des somatosensorischen Kortex statt, etwa 500µm unterhalb der pialen Oberfläche. Es ist daher von Bedeutung, den Schlitz bei der Imaging Spectroscopy so zu positionieren, daß das aufgenommene Areal minimale Beiträge oberflächlicher Gefäße und maximale stimulationskorrelierte optische Veränderungen aufweist. Die funktionellen Karten, die das monochromatische Optical Imaging bei 600nm Wellenlänge erstellt, dienten dieser Positionierung. Das Gebiet mit stimulationsbedingter Absorptionszunahme wurde dann mit der Imaging Spectroscopy spektral analysiert, um die beteiligten Chromophoren zu identifizieren und ihren Konzentrationsverlauf zu quantifizieren.


42

2.4.2 Die Datenanalyse der Imaging Spectroscopy

Der Aufbau der Imaging Spectroscopy erlaubt es, weißes Licht von der Gehirnoberfläche in die Videokamera zu lenken und spektral zu ordnen. Im folgenden soll gezeigt werden, wie die Daten in dem aufgenommenen Bild organisiert sind, wie sich aus ihnen spektrale Information gewinnen läßt und wie diese Spektren in Hämoglobinkonzentrationen umgerechnet werden können. Um den Ablauf der kontrollierten Spektrenanalyse nachvollziehbar zu machen, soll auch das Programm vorgestellt werden, das für die Auswertung der Imaging Spectroscopy entwickelt wurde.

2.4.2.1 Das räumlich-spektrale Bild

Die Imaging Spectroscopy liefert einen Zeitverlauf von räumlich-spektralen Bildern. Ein solches Bild besitzt eine räumliche Dimension, die sich entlang eines Schlitzes in der vertikalen Achse erstreckt. Unter Beleuchtung mit weißem Licht liegen alle spektralen Anteile übereinander und ergeben ein weißes Schlitzbild. Die Beugung, die dieses Bild am optischen Gitter erfährt, ist in ihrem Projektionswinkel wellenlängenabhängig. Sie spreizt das weiße Licht auf und produziert ein geometrisch geordnetes Spektrum. Das weiße Schlitzbild wird in monochromatische Kopien zerlegt, die nebeneinander angeordnet die horizontale, spektrale Dimension des Bildes ausfüllen.

Entnimmt man einem solchen räumlich-spektralen Bild eine Spalte, so erhält man die Absorption, die das Licht einer bestimmten Wellenlänge an den verschiedenen vertikalen Positionen erfährt. Umgekehrt läßt sich aus der Entnahme einer Zeile bzw. der Mittelung mehrerer aufeinanderfolgenden Zeilen ein Spektrum gewinnen. Dieses enthält die spektrale Absorption einer vertikalen Position ( Abbildung 7 ).


43

Abbildung 7: Räumlich-spektrales Bild

Dieses Bild wurde am Ende einer 2s dauernden periodischen Whiskerstimulation aufgenommen und zeigt die relative Veränderung der Gehirnoberfläche in der Abschwächungseinheit Optische Dichte (OD). Durch die Beugung des weißen Schlitzbildes am optischen Gitter kann man das Bild in zwei Richtungen eingrenzen. In der Vertikalen läßt sich die Absorptionszunahme bei einer bestimmten Wellenlänge aus dem Bild herauslesen (unten). Sie enthält die räumliche Verteilung der Absorptionsveränderungen entlang des Schlitzes. In der Horizontalen läßt sich unter Auswahl einer Region of Interest das dort gemessene Absorptionsspektrum ermitteln (rechts). Mit dem Lambert-Beer-Algorithmus kann ein solches Spektrum in Chromophorkonzentrationen umgerechnet werden.

Mit kleinen Abweichungen durch die Einstellung des Gitterwinkels umfaßte das aufgenommene Spektrum meist einen Wellenlängenbereich von etwa 490-680nm. Analog dem Optical Imaging wurde bei der Bildanalyse über alle Wellenlängen die Abschwächung gegenüber den Ruhewerten (log10(I0/I)) bestimmt. Wie am dargestellten Spektrum ersichtlich, fand die größte Abschwächung unterhalb von 600nm statt.

2.4.2.2 Die Anwendung des Lambert-Beer-Gesetzes

Das Verhältnis einer Abschwächungsänderung (DeltaA = log10 (I0/I)) ist mit der Konzentrationsveränderung eines Farbstoffes (Deltac) durch eine Variation des Lambert-Beer-Gesetzes beschrieben ( Gleichung 4 ):

Gleichung 4


44

DeltaA(lambda): Abschwächung, epsiloni(lambda): Extinktionskoeffizient des Chromophors i bei der Wellenlänge ?,
ci(lambda): Konzentrationsveränderung des Chromophors i, Da(lambda): Differentielle Pfadlänge im Medium bei der Wellenlänge lambda

Der Ausdruck Da(lambda) ist definiert als

Gleichung 5

und heißt differentielle Pfadlänge (engl. differential pathlength, ). Da(lambda) verändert sich mit der mittleren optischen Pfadlänge, die die Photonen im Gewebe zurücklegen. Sie hängt ab von den optischen Eigenschaften des Gewebes (die Absorptions- und Transport-Streuungs-Koeffizienten µa bzw. µ's) und ist wellenlängenabhängig. Vernachlässigt man diese Wellenlängenabhängigkeit, so hat das den Effekt, als rechne man mit falschen Extinktionsspektren. Die differentielle Pfadlänge wurde anhand von Monte-Carlo-Simulationen und Messungen von Photonenflugzeiten im Gehirn für verschiedene Modelle ermittelt .

Das Chromophor, das die Abschwächung des verwendeten Lichtes auf neuronale Stimulation hin wesentlich hervorruft, ist der rote Blutfarbstoff Hämoglobin. Er verändert sein Absorptionsspektrum, je nachdem, ob ihm Sauerstoff angelagert ist (Oxy-Hb) oder ob er keinen Sauerstoff mit sich trägt (Deoxy-Hb). Die in der Biochemie verwendeten Extinktionskoeffizienten beziehen sich auf Messungen im Spektrophotometer, bei transmittiertem Licht und gleicher Pfadlänge Da ( Abbildung 8 ).

Abbildung 8: Extinktionsspektren von Oxy-Hb und Deoxy-Hb

Unter den optisch inerten Bedingungen einer Glasküvette ergeben sich für die beiden Farbstoffe die abgebildeten Extinktionsspektren. Sie sind Grundlage der Konzentrationsbestimmung im Spektrophotometer.

Die Anwendung des Lambert-Beer-Gesetzes geschieht in einem linearen Gleichungssystem, welches für jeden Wellenlängenpunkt eine Lösung für Gleichung 4 sucht. Anders ausgedrückt


45

versucht der Algorithmus, die gemessene Abschwächung mit vorgegebenen Extinktionsspektren nachzuzeichnen. Man spricht von einem "fit", einer linearen Anpassung, deren errechnetes Spektrum dem gemessenen Spektrum möglichst nahekommen soll.

Das Gleichungssystem aus Gleichung 6

Gleichung 6

wird für multiple Wellenlängenpunkte

nach den Konzentrationen für Oxy-Hb und Deoxy-Hb aufgelöst. Dies liefert die Werte der Konzentrationen c(Oxy-Hb) und c(Deoxy-Hb), die im Produkt mit den jeweiligen Extinktionskoeffizienten dem gemessenen Spektrum am nächsten kommen.

Weil die gezeigten Hb-Extinktionsspektren im optisch inerten Medium einer Küvette gelten, müssen sie mit der differentiellen Pfadlängenskalierung an die optischen Verhältnisse im Gehirn angepaßt werden. Diese Pfadlängenkorrektur verlangt Annahmen über die Schichtdicke des Volumens, in dem die Absorptionsveränderungen stattfinden, über die Hämoglobinkonzentration des Meßvolumens und über dessen Sauerstoffsättigung.

Die von uns verwendete Pfadlängenskalierung setzte voraus, daß die Konzentrationsveränderungen des Hämoglobins in einer oberen Schicht von 500µm stattfinden. Eine grobe Abschätzung des Verhältnisses zerebrales Blutvolumen zu zerebralem Gesamtvolumen liegt bei 5%. Das ergibt bei einem Molekulargewicht des Hb von 64.500 Dalton und einer intravaskulären Hb-Konzentration von 14g/dl eine Hb-Konzentration von etwa 100µmol/l. Allerdings ist von einer inhomogenen Verteilung innerhalb des Gehirns auszugehen, bei der der Wert für die Mikrozirkulation kleiner und für die Makrozirkulation größer ist.

Die verwendete Analyse nahm eine Hb-Konzentration von 20µmol/l als Ausgangswert an. Er stützt sich einerseits auf eine direkte Analyse der gemessenen Rohspektren . Andererseits gibt es Studien mit autoradiographischen Messungen durch 55Fe - markierte Erythrozyten, die im somatosensorischen Kortex Erythrozytenkonzentrationen von


46

2.3-3.3µl/g ermittelt haben. Dies entspricht einer Hb-Konzentration von 10-30µmol/l. .

Die Berechnung von Da(lambda) mit den Daten der Monte Carlo-Simulation ergab mit diesen Parametern die folgende Verteilung ( Abbildung 9 , ):

Abbildung 9: Differentielle Pfadlänge Da(lambda)

Die Werte für Da(lambda) wurden ermittelt aus Monte-Carlo-Simulationen, unter der Annahme einer Veränderung in den oberen 500µm bei einer Hb-Gesamtkonzentration von 20µmol/l und einer Sauerstoffsättigung von 60% im Meßvolumen. Unter Annahme optisch inerter Bedingungen ist Da=1 als konstante Pfadlänge wellenlängenunabhängig.

Mit der quantifizierbaren differentiellen Pfadlängenanalyse konnte auch die Veränderung im korpuskulären zerebralen Blutvolumen ermittelt werden. Hierfür wurden Oxy-Hb und Deoxy-Hb-Konzentrationsveränderungen addiert und damit die Voxelkonzentration des totalen Hämoglobins (HbT) in ihrer zeitlichen Veränderung errechnet. Geteilt durch die Ruhekonzentration des Hämoglobins lieferte dies die relative Veränderung des korpuskulären Blutvolumens, cCBV.

Zu Vergleichszwecken wurde bei der Analyse neben diesem Schichtmodell mit differentieller Pfadlänge ein Modell mit konstanter Pfadlänge (Da(lambda)=1) angenommen, bei dem für alle Photonen die gleiche Wegstrecke durch das Gehirn angenommen und dieses somit vereinfacht als Glasküvette modelliert wird.

Aufgrund der verschiedenen Algorithmen, die bei der Auswertung der Daten zur Anwendung kommen, sowie der zweidimensionalen Organisation der Daten mit ihrer Möglichkeit zur räumlichen und spektralen Eingrenzung spielte bei der Imaging Spectroscopy die PC-gestützte Auswertung eine zentrale Rolle. Daher soll im folgenden das hierfür geschriebene Programm vorgestellt werden.


47

2.4.2.3 Digitale Auswertung der Daten

Mit Hilfe der objektorientierten Programmiersprache Matlab wurde das Programm "Fitimaging" entwickelt, das verschiedene Zugriffe auf die Rohdaten der Imaging Spectroscopy ermöglicht. Gesteuert über eine graphische Benutzeroberfläche kann es die Daten in verschiedene Formate konvertieren, die verwendeten Referenzspektren auf den gemessenen Wellenlängenbereich hin kalibrieren, den Datenbereich räumlich und spektral eingrenzen und den verwendeten Algorithmus modifizieren ( Abbildung 10 A). Mit dem ausgewählten Algorithmus läßt sich dann für den eingestellten räumlich-spektralen Bereich Bild für Bild die jeweilige Konzentrationsveränderung von Oxy-Hb (rot) und Deoxy-Hb (blau) nach dem Lambert-Beer-Gesetz errechnen. In einem neu erstellten Fenster werden diese Veränderungen im Zeitverlauf dargestellt ( Abbildung 10 B). Als Kontrolle des verwendeten Algorithmus sind in diesem Fenster auch die Residuen dargestellt, d.h. die quantifizierte Abweichung des jeweils gemessenen Spektrums vom linear angepaßten Spektrum, mit dem der Algorithmus die optischen Veränderungen nachzuzeichnen versucht. Eine dritte Ebene, die aus diesem Fenster heraus aufrufbar ist, legt diese Spektren übereinander und erlaubt somit, Zeitpunkt für Zeitpunkt den Algorithmus auf seine Gültigkeit hin zu prüfen ( Abbildung 10 C).


48

Abbildung 10: Konsolen des Analyseprogramms FITIMAGING

(Erläuterungen im Kapitel 2.4.2.4 )

2.4.2.4 Ausführliche Beschreibung des Analyseprogramms

Die Imaging Spectroscopy liefert ihre Daten mit einer Bildstruktur, deren differenzierter Informationsgehalt bei jedem Experiment eine umfangreiche Neuanpassung der Analyse verlangt. Das Programm "Fitimaging" erlaubt die gleichzeitige Kontrolle der verschiedenen Parameter sowie Überblicksanalysen der jeweiligen Daten. Im folgenden sollen Aufbau und


49

Kontrollfelder des Programms dargestellt und damit die praktische Auswertung der Daten nachvollziehbar gemacht werden<2>.

Um das Programm "Fitimaging" verwenden zu können, ist eine installierte Version von Matlab 5.0 (oder neuer) erforderlich<3>. Beim Starten von Matlab erscheint zunächst die Befehlsoberfläche. Hier muß das aktuelle Verzeichnis auf den Ordner "fitimaging" eingestellt werden. Mit der Befehlszeile "fitimaging" startet das Programm. Unter Ladung eines Beispielexperiments wird dann ein Fenster mit der Hauptkonsole erstellt. Von dieser Konsole aus werden über die graphische Benutzeroberfläche Unterroutinen aufgerufen, die zum Teil in die Hauptroutine integriert sind, zum Teil zusätzliche "*.m" Dateien bilden.Die objektorientierte Programmiersprache Matlab ist mit der graphischen Darstellung in Form von Fenstern ("Figure") und Koordinatensystemen ("axes") sowie den dort erfolgenden Befehlen zur Darstellung von Daten (Graphen, Bilder, Text) verbunden. "gco" steht hierbei für den Griff ("handle") des Objektes, das oben auf der Anzeige liegt (also als letztes von der Maus angesprochen wurde). Jedes Objekt hat vordefinierte Eigenschaften. Diese sind zum einen graphische Einstellungen wie Position, Größe, Farbe, Schriftart und anderes. Zum anderen gibt es Einstellungen, die das Objekt mit einem anderen verbinden, was hierarchisch geschieht. Unter "parent" und "children" werden die jeweiligen Griffe des verbundenen Objektes abgespeichert. So ist zum Beispiel ein Graph ("plot") seinem Koordinatensystem ("axes") als "Children" untergeordnet und läßt sich als solches aus dem Griff des Koordinatensystems heraus ansprechen (plot=get([Griff des Koordinatenystems], 'Children')). Unter 'UserData' lassen sich Variablen in das Objekt einspeichern und von dort wieder herausladen, was für die Struktur dieses Programms eine bedeutende Rolle spielt. Auf diese Weise lassen sich die Daten eines errechneten Zeitverlaufs in einem separaten Fenster ablegen. Sie geraten daher nicht in Konflikt mit einem weiteren Zeitverlaufsfenster, das mit anderen Parametern erstellt wurde.

Die Konsole besitzt mehrere Knöpfe ("buttons"), Schieber ("slides"), Untermenüs und Eingabefelder, die sich bedienen bzw. verändern lassen. Für ein solches "graphical user


50

interface", GUI, gibt es wie für jedes graphische Objekt in Matlab Eigenschaften ("properties"), die sich über einen Griff anzeigen (get(gco)) und verändern (set(gco, 'Name der Eigenschaft', gewünschter Wert der Eigenschaft)) lassen. Eine wichtige Eigenschaft ist hierbei 'CallBack'. Sie beinhaltet eine Befehlszeile oder den Namen einer Funktion, die bei Bedienung (Veränderung oder Aktivierung durch Mausklick) aufgerufen wird. Auf diese Weise wird durch jede Aktion des Benutzers eine Unterroutine aufgerufen, wodurch das Programm "Fitimaging" keinem linearen Ablauf mit Anfang und Ende folgt, sondern ein Fenster erstellt, das in Interaktion mit dem Benutzer immer wieder neue Routinen aufruft.

2.4.2.4.1 A: Hauptkonsole

File

Unter dem Menü "File" lassen sich "*.mat"-Dateien in den Speicher laden sowie Dateien verschiedener Versuchsanordnungen aus dem Rohformat, den vom Programm VDAQ erstellten "*.dc"-Dateien, konvertieren. Neben der eigentlichen Bildserie aus dem Experiment benötigt das Programm hierfür je ein digitales Foto des kraniellen Fensters mit und ohne Schlitz im Strahlengang und die Kalibrierungsdateien des 532nm- und 600nm-Filters. Diese Aufnahmen können unter VDAQ mit dem Befehl "ROI Image" im sogenannten "*.iv" - Format abgespeichert werden und müssen vor jedem Experiment angefertigt werden. Sie werden benötigt, um die vaskuläre Architektur mit den Daten zu vergleichen bzw. den Spektralbereich anzupassen.

Analysis

In diesem Menü läßt sich eine Streukomponente als Pseudochromophor in den Algorithmus einschalten. Diese Streukomponente versteht man in der Lambert-Beer-Analyse als eine alle Wellenlängen gleich betreffende Abschwächung des Lichtes, der kein Farbstoff zugrundeliegt. Der Beitrag der Streuung zu den intrinsischen optischen Signalen dieses Wellenlängenbereichs ist umstritten und hat sich in unserer Analyse als nicht bedeutsam gezeigt.

Kontrolle über die vaskuläre Architektur

Mit diesen beiden Fenstern ist es möglich, die vaskuläre Architektur des Schlitzbereiches zu beurteilen. Dabei wird im oberen Koordinatensystem ein Foto des kraniellen Fensters eingestellt, in dem der Schlitzbereich aufgehellt ist. Um eine möglichst enge Registrierung mit dem räumlich-spektralen Bild zu erreichen, wurde dieses Foto unter Reflektion des Lichtes am optischen Gitter aufgenommen. Allerdings wurde der Winkel des Gitters so


51

eingestellt, daß es nicht das Maximum 1.Ordnung sondern das ungebeugte Maximum 0.Ordnung in die Kamera projizierte. Dann wurde der Kortex mit 600nm-Licht beleuchtet, um einen Gefäßkontrast zu erzeugen. Dem so angefertigten Übersichtsbild wurde ein Bild des Schlitzbereiches aufgelagert und die überschneidenden Pixel in dieser Darstellung aufgehellt.

Da sich bei der Umstellung des Gitterwinkels auf das Maximum 1.Ordnung geringe vertikale Verschiebungen des Bildes ergeben, wurde zusätzlich eine Ermittlung der vaskulären Architektur aus den Rohdaten vorgenommen. Hierbei wurden die Ruhebilder (ohne Stimulation) gemittelt und die Konzentration der Chromophoren über die räumliche Dimension näherungsweise errechnet. Statt verschiedene Zeitpunkte miteinander ins Verhältnis zu setzen, wurden hierbei die Spektren entlang der räumlichen Dimension verglichen. Nach willkürlicher Festlegung eines Referenzpunktes (in diesem Fall bei y=48, wo Oxy-Hb=Deoxy-Hb=0) wurde das entsprechende Spektrum als Zeile aus dem räumlich-spektralen Bild herausgelesen. Dann wurden die Spektren Zeile für Zeile herausgelesen und durch dieses Referenzspektrum geteilt, also die Abschwächung relativ zu diesem Punkt errechnet. Die erhaltenen Abschwächungsspektren geben mittels einer Lambert-Beer-Analyse eine Annäherung der Konzentrationsveränderungen von Oxy-Hb und Deoxy-Hb entlang des Schlitzbereiches. Der Fehler ist hier aufgrund der Beleuchtungsunterschiede sehr groß, weshalb auch die Angaben dimensionslos sind. Trägt man nun die Konzentrationsverteilung über die räumliche Dimension auf, so lassen sich Gipfel von Oxy-Hb und Deoxy-Hb ausmachen, die durch die hohe Blutkonzentration in den Gefäßen entstehen ('approximation of spatial distribution'). Das Fensterfoto läßt sich nun in der Horizontalebene verschieben, um eine Übereinstimmung der auf ihm sichtbaren Gefäße mit den Erhebungen der untenangestellten Konzentrationsverteilung herzustellen. In der Kombination dieser beiden vaskulären Bilder läßt sich die aufgenommene Gehirnoberfläche gut überblicken. Dies ist wichtig, um bei der Analyse Regionen mit minimalem Beitrag oberflächlicher pialer Gefäße auszuwählen.

Räumliche und spektrale Eingrenzung.

Die beiden Felder unter der Bezeichung "Spatial Range" beinhalten die untere und obere Begrenzung der Schlitzregion, die der Analyse zugeführt werden soll. In den beiden Feldern darüber läßt sich der in die Analyse einbezogene Wellenlängenbereich eingrenzen (Wavelength Range). Die Spektren werden unter- und oberhalb der gesetzten Punkte trunkiert. Über die eingegrenzten Zeilen in den räumlich-spektralen Bildern werden die Rohdaten gemittelt und dann die Abschwächung zur Ruhekondition im Zeitverlauf errechnet.


52

Berechnung von Da(lambda)

Beim Aktivieren der Checkbox neben "Include DPF" läßt sich die differentielle Pfadlängenanalyse ausschalten (Da(lambda)=1) oder hinzufügen. Die beiden Eingabefelder darunter enthalten die geschätzte Konzentration von Oxy-Hb und Deoxy-Hb unter Ruhebedingungen. Für die Mikrozirkulation wurde hierbei eine Hb-Konzentration von 20µmol/l mit 60% Sättigung angenommen, dies entspricht einer Oxy-Hb- und Deoxy-Hb-Konzentration von 12 bzw. 8µmol/l.

Unterhalb dieser Eingabefelder befindet sich das Menü "Layer Model". Hier läßt sich das geometrische Modell auswählen, mit dem die Monte-Carlo-Simulation erstellt wurde. Es geht dabei um die Frage, in welcher Tiefe des Kortex die berechneten Absorptionsveränderungen stattfinden. Dieses Programm bietet den Zugriff auf Daten aus drei Modellen: Ergebnisse aus Simulationen in einer Schicht von 200µm und 500µm Tiefe sowie in einer homogenen Schicht, d.h. unter der Annahme, daß die Absorptionsveränderungen in jeder Tiefe stattfinden. Die von uns verwendete Analyse der Mikrozirkulation geht von dem Schichtmodell 500µm aus, weil sich in dieser Tiefe die Schicht IV des somatosensorischen Kortex befindet und das Kapillarnetz der kortikalen Kolumnen dort eine bauchförmige Ausweitung zeigt .

Visueller Spektrenvergleich

In dem Fenster links unten werden Da(lambda) und epsilonOxy-Hb(lambda) bzw. Da(lambda) und epsilonDeoxy-Hb(lambda) zu je einem Spektrum zusammengefaßt. Diese beiden Spektren sind Grundlage des Algorithmus. Mit ihnen versucht er, die gemessenen Spektren im Sinne einer linearen Anpassung nachzuzeichnen. Ein Beispiel hierfür ist in dem Fenster rechts daneben zu sehen. Das gemessene Abschwächungsspektrum (schwarz) zu einem bestimmten Zeitpunkt (hier bei 5.6s) wird über die vom Algorithmus errechnete lineare Anpassung (rosa) dargestellt. Die Residuen, d.h. die Differenz zwischen Messung und Anpassung, ist blau aufgetragen. Zwei senkrechte schwarze Striche markieren in beiden Graphen den Wellenlängenbereich, der in die Analyse einbezogen wurde. In einem kleinen Fenster oberhalb dieses Graphen ist ein kleines Histogramm aufgetragen, das die Häufigkeitsverteilung der Residuen aufträgt.

2.4.2.4.2 B: Zeitverlauf

Bei Aktivierung des Knopfes "Time Course" wird der Zeitverlauf der Konzentrationsveränderungen von Oxy-Hb und Deoxy-Hb errechnet. Die Werte dieses Zeitverlaufs, die zugehörigen Spektren sowie alle gerade eingestellten Parameter werden als


53

Variablen in einem separaten Fenster abgelegt. Der oberste Graph dieses Fensters zeigt den Konzentrationsverlauf von Oxy-Hb und Deoxy-Hb sowie die Stimulationsperiode (hellblaue Striche). Um die Qualität der Anpassung abzuschätzen, wurde für jeden Zeitpunkt das Residuum berechnet als die Summe der Differenzbeträge zwischen Anpassung und Messung über die Wellenlängenpunkte. Der mittlere Plot zeigt die Residuen des eingegrenzten Spektralbereichs, der untere Plot zeigt die Residuen im gesamten Spektrum, d.h. des Bereiches inner- und außerhalb der beiden senkrechten Striche im visuellen Spektrenvergleich. Inwieweit die lineare Anpassung auch über den analysierten Bereich hinaus Übereinstimmung mit der Messung zeigt, ist ein weiteres Validitätskriterium des Algorithmus.

2.4.2.4.3 C: Spektrenvergleich

Die Auswahl des Menüs "Fitting Spectra" führt zur Erstellung eines weiteren Fensters. In dieses werden die der aktuellen Berechnung zugrundeliegenden gemessenen und angepaßten Spektren abgelegt. Sie können mit dem "Previous" und dem "Next"-Knopf durchgegangen und auf Übereinstimmung zwischen Anpassung und Messung hin geprüft werden.

2.4.3 Die Datenanalyse der fMRT

Die wesentlichen Analyseschritte der fMRT-Auswertung bestanden im Bildaufbau aus den Rohdaten, in der Konvertierung der Voxelwerte in das entsprechende BOLD- bzw. CBV-Signal und in der Lokalisierung des aktivierten Gehirnareals, dessen Stimulationsantwort in die Gesamtanalyse über alle Tiere einbezogen wurde.

2.4.3.1 Bildaufbau aus den fMRT-Rohdaten

Das Empfangssignal der fMRT ist der FID ("free induction decay"). Er beginnt nach der Exzitation der ausgerichteten Protonen durch den Radiofrequenzpuls und beruht auf der Rückbewegung der Protonen in die Ebene des externen Magnetfeldes. Es handelt sich um einen magnetisch induzierten Strom, der mit abnehmender Amplitude oszilliert. Die Spule empfängt ein Mischsignal aller Protonen im Meßvolumen. Damit dieses Mischsignal zu einem Bildsignal wird, das die Signalherkunft räumlich zuordnet, werden beim Echo Planar Imaging verschiedene Kodierungen vorgenommen.


54

Die Larmor-Frequenz eines Kerns ist von seinem gyromagnetischen Ratio und von der Stärke des externen Magnetfeldes abhängig. Mit Hilfe eines magnetischen Gradienten entlang der x-Dimension werden die Protonen durch ihre jeweilige Larmor-Frequenz kodiert ( Gleichung 7 ):

Gleichung 7

omegax1...xend: Larmor-Resonanzfrequenz entlang der x-Achse (Positionen x1 bis xend), gamma: gyromagnetischer Ratio des Kerns (bei Wasserstoff gamma=42.6MHz/Tesla), omegax1...xend: Magnetfeldstärke entlang der x-Achse (Positionen x1 bis xend)

Das aufgenommene Signal zeigt dann ein Frequenzgemisch. Eine Fourier-Transformation löst dieses Gemisch in seine einzelnen Frequenzkomponenten auf. Jede Frequenz entspricht dann einer Position entlang der x-Dimension und erlaubt die räumliche Zuordnung der entsprechenden Amplitude. Die y-Position des Signals wird über die Phase kodiert. Dabei wird die Magnetfeldstärke auf einer Höhe der y-Achse verstärkt, was zu einer höheren Frequenz aller Spins dieser Ebene führt. Dieser Vorgang wird Zeile für Zeile wiederholt und führt damit zu einer Phasenverschiebung entlang der y-Achse. Die oben genannten Kodierungsvorgänge werden räumlich lokalisiert in einem kurzen Abschnitt des Magneten, dem aktivierten Schnitt, vorgenommen und betreffen somit die diesem Schnitt am nächsten liegenden Protonen am stärksten. Auf diese Weise wird die z-Achse entlang der MRT-Röhre räumlich aufgelöst.

Zur Auffindung des somatosensorischen Vorderpfotenareals wurden zu Beginn des Experiments mehrere solcher Schnitte unter Stimulation aufgenommen und das aktivierte Areal lokalisiert. Die zeitlich hoch aufgelöste Datenaufnahme zur Untersuchung der Stimulationsantwort wurde dann in einem 1mm breiten Schnitt vorgenommen, der das Vorderpfotenareal beinhaltete.

2.4.3.2 Signalkonvertierung in BOLD und CBV

Es hat sich gezeigt, daß die transverse Relaxationsrate R2* linear von der Deoxy-Hb-Konzentration in einem Voxel abhängt . Diese Studie verwendet als BOLD-Signal die Veränderung der transversen Relaxationsrate, ?R2*. Sie ergibt sich aus der Teilung der gemessenen Signalveränderung durch die Echo Time, TE, die Zeitverzögerung zwischen Exzitationspuls und Signalempfang ( Gleichung 8 ).

Gleichung 8


55

S(t): Signal zum Zeitpunkt t, S0: Signal während Ruhekondition, TE: Echo Time

Die funktionelle MRT, die das zerebrale Blutvolumen mit dem paramagnetischen Kontrastmittel MION bei Blutkonzentration im Äquilibrium mißt, ist eine Erweiterung der Bolustechnik, der ersten Technik, mit der durch Magnetresonanz funktionelle Karten erstellt wurden . Dabei wird grundätzlich angenommen, daß die Veränderung in der transversen Relaxationsrate (DeltaR2 für Spin Echo, DeltaR2* für Gradient Echo Sequenzen) relativ zum Prä-Injektionswert proportional zum Produkt aus dem lokalen zerebralen Blutvolumen (Cerebral Blood Volume, CBV) und einer Funktion (f) der Plasmakonzentration des paramagnetischen Kontrastmittels ([P]) ist ( Gleichung 9 ):

Gleichung 9

Erreicht das paramagnetische Kontrastmittel ein Äquilibrium im Blutplasma, so vereinfacht sich diese Gleichung zu einer linearen Beziehung:

Gleichung 10

wobei die Konstante K jetzt die Blutkonzentration des Kontrastmittels enthält und daher von der Dosis abhängt.

Das plasmatische paramagnetische Kontrastmittel MION reichert sich bei lokaler CBV-Zunahme im gemessenen Voxel an. Die Konzentration des Deoxy-Hb hingegen, des intrinsischen paramagnetischen Kontrastmittels, nimmt bei einer lokalen CBV-Zunahme aufgrund der resultierenden Hyperoxygenierung ab. Prinzipiell handelt es sich hierbei also um antagonisierende Wirkungen. Das MION wird daher so dosiert, daß sein paramagnetischer Effekt den des Deoxy-Hb um ein Vielfaches übertrifft . Unter der Annahme eines monoexponentiellen Signalabfalls und eines vernachlässigbaren entgegengesetzten BOLD-Effekts kann die relative CBV-Veränderung, rCBV(t) nach Gleichung 11 berechnet werden.


56

Gleichung 11

S(t): Signal zum Zeitpunkt t, S(0): Signal nach Injektion des Kontrastmittels MION und Äquilibrium, SPRE: Signal vor Injektion des Kontrastmittels MION

Im Methodenvergleich wird dieses Signal als relative Veränderung des plasmatischen CBV dem spektroskopisch ermittelten korpuskulären CBV gegenübergestellt und mit pCBV bezeichnet.

2.4.3.3 Auswahl der aktivierten Voxel

Bei den nativen BOLD und bei den nach Injektion von MION erhaltenen CBV-Bildserien wurden die aktivierten Voxel des somatosensorischen Kortex auf gleiche Weise ausgewählt. Dabei unterzieht die C-Routine "t-grinder" die Werte vor und während der Stimulation einem gepoolten t-Test, analog dem, der bei der Optical Imaging Analyse angewandt wurde ( Gleichung 3 ). Der Vorteil gegenüber dem Optical Imaging besteht darin, daß die funktionelle Kartierung mit dem Datensatz vorgenommen wird, der auch den errechneten Zeitverläufen zugrundeliegt. Dies war in der optischen Bildgebung nicht möglich, weil die Imaging Spectroscopy nur eine räumliche Dimension mißt und die funktionelle Kartierung daher mit einem separaten, kürzeren Experiment durchgeführt wurde. Die p-Werte bei den funktionell aktivierten Arealen unter Optical Imaging fallen daher grundsätzlich größer aus.

"t-grinder" erstellt in Verbindung mit dem Visualisierungsprogramm "xds" eine funktionelle Karte, die farbkodiert über das Rohbild gelegt wird. Sowohl der t-grinder als auch xds sind UNIX-Programme, die am Massachusetts General Hospital entwickelt wurden. Anhand der funktionellen Karte wurden 15 aneinandergrenzende Voxel (ein Volumen von etwa 5mm3) aus dem Zentrum der Aktivierung ausgewählt und so eine Auswahlmaske erstellt. Mit dieser Maske wurde der Zeitverlauf der entsprechenden Voxel aus dem Datensatz herausgelesen und gemittelt<4>. Dabei wurden die Antworten über alle stimulierten Vorderpfoten zusammengefaßt.


Fußnoten:

<1>

Die optischen Methoden Optical Imaging und Imaging Spectroscopy wurden unter Leitung von Prof. Dr. U. Dirnagl in der Abteilung für Experimentelle Neurologie der Charité Berlin etabliert und angewandt. Die magnetresonanztomographischen Messungen wurden in Zusammenarbeit mit Dr. J. Mandeville im Rahmen eines Aufenthaltes am Massachusetts General Hospital in Charlestown, USA durchgeführt.

<2>

In einem anderen Rahmen fände dieses Kapitel seinen geeigneten Platz in einem Anhang. Ein solcher ist in der Promotionsordnung nicht erwünscht. Daher wird an dieser Stelle die detaillierte Beschreibung des Programms "Fitimaging" eingefügt. Das darauffolgende Kapitel 2.4.3 (Seite 53) wendet sich der Datenanalyse bei der funktionellen Magnetresonanztomographie zu.

<3>

Die Software "Fitmaging" ist auf der Homepage der Abteilung für Experimentelle Neurologie (http://expneuro.de) der Charité unter der Rubrik "labstuff" zugänglich.

<4>

Der verwendete C-Routinensatz "roi" ist beschrieben unter http://www.nmr.mgh.harvard.edu/people_mandeville.htm.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Fri Feb 7 15:12:27 2003