Royl, Georg: Neurovaskuläre Kopplung im somatosensorischen Kortex der Ratte: Untersuchungen zur zeitlichen Kinetik mittels optischer Verfahren und funktioneller Magnetresonanztomographie

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Kapitel 4. Diskussion und Schlußfolgerungen

Im folgenden werden die Ergebnisse dieser Arbeit betreffend der Frage einer frühen Deoxygenierung zusammengefaßt und mit anderen Arbeiten zu diesem Thema verglichen. In diesem Zusammenhang wird auch die Interpretation der frühen Antwort als Blutvolumensignal diskutiert. Anhand der optisch und magnetresonanztomographisch gemessenen Veränderungen von CBV und Oxygenierung wird dann der weitere Verlauf der Blutflußantwort betrachtet. Dabei werden schematisch vaskuläre Vorgänge skizziert, auf die sich die gemessene Signalkinetik in fMRT und Imaging Spectroscopy zurückführen lassen könnte.

4.1 Die frühe Deoxygenierung - ein Artefakt?

Wir konnten mittels Optical Imaging bei 600nm unter Stimulation eines Whiskerhaares eine frühe Abschwächungszunahme detektieren, die sich im Mikrozirkulationsgebiet abspielte und deren Ausdehnung einer kortikalen Kolumne entsprach. Diese Absorptionszunahme bildete sich unabhängig von der Stimulationsdauer nach 3s wieder zurück und ging in eine Absorptionsabnahme über.

Die spektralen Veränderungen in diesem Gebiet lassen sich nur unter Berücksichtigung der optischen Pfadlängenunterschiede gut beschreiben. Vernachlässigt man diese, so zeigt eine solche erste Annäherung abgesehen von der frühen Antwort qualitativ den gleichen Zeitverlauf. Auch mit der ungenügenden Anpassung an das Spektrum errechnet sich die stimulationsbegleitende Hyperoxygenierung und die Hypooxygenierung nach Stimulationsende. In der frühen Antwort zeigt die Analyse ohne Pfadlängenkorrektur aber einen Anstieg des Deoxy-Hb, der durch die differentielle Pfadlängenkorrektur nivelliert wird. Wir sind daher der Meinung, daß das errechnete frühe Deoxygenierungssignal im aktivierten Areal ein Fehlersignal ist, durch einen Algorithmus produziert, der den optischen Eigenschaften des streuenden biologischen Gewebes nicht gerecht wird. Es ist nicht verwunderlich, daß er die ihm gestellte Aufgabe nicht adäquat lösen kann und mit seiner besten Näherung Fehler produziert.

Mit spektroskopischen Messungen unter somatosensorische Stimulation haben bereits zwei Arbeitsgruppen eine frühe Deoxygenierung bei der Ratte messen können. Bei einer Arbeit ist über Mikrospektrophotometrie eine frühe Deoxygenierung gemessen worden, die der unseren


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ähnlich ist, aber in der Analyse unter dem Vorbehalt des konstanten Pfadlängenmodells steht .

Mayhew et al. haben mit der Imaging Spectroscopy eine initiale Deoxy-Hb-Zunahme auch unter Einschluß differentieller Pfadlängen beschrieben . Für die Abweichung seiner Ergebnisse scheinen zwei Erklärungen möglich:

  1. Das Modell ist nicht valide. Es wird nur eine lineare Anpassung eines gemessenen Spektrums gezeigt. Allerdings stammt dieses Beispiel nicht aus der errechneten frühen Deoxygenierung. Mayhew et al. setzten als initiale Blutkonzentration 100µmol/l im Meßvolumen voraus, wir haben uns hierbei auf 20µmol/l festgelegt. Wir erhielten diesen Wert aus einer direkten Analyse der Rohspektren, er wird aber auch durch die Ergebnisse aus autoradiographischen Hb-Messungen gestützt . Möglicherweise kann die verwendete Pfadlängenanalyse den Algorithmus in seiner Validität verbessern, jedoch nicht in ausreichendem Maße. Darauf weist auch die geringe Amplitude des errechneten Deoxy-Hb-Anstiegs hin.
  2. Der Unterschied könnte auch in den langsamen Blutflußoszillationen mit der Frequenz von 0.1Hz liegen, von denen berichtet wird. Diese führten zu periodischen Oxygenierungsveränderungen, die in ihrer Amplitude die Stimulationsantwort um das zehnfache überstiegen und daher mittels eines Algorithmus herausgefiltert werden mußten. Solche Oszillationen werden auch Vasomotionen genannt. Physiologischerweise sind sie von kleiner Amplitude, sie können jedoch unter Blutdruckabfall oder NO-Synthaseinhibition drastisch zunehmen . Es könnte sein, daß die starken Vasomotionen ein Zeichen gestörter neurovaskulärer Kopplung sind und als solche einen Sauerstoffverbrauch der Neurone demaskieren. Könnte man ein solches Phänomen reproduzieren und verstärken, so wäre dies ein vielversprechender Ansatz für die Messung des aeroben Metabolismus bei neuronaler Aktivierung.

Um von einer Deoxygenierung sprechen zu können, müßte nicht nur das Deoxy-Hb zunehmen, sondern zusätzlich auch das Oxy-Hb abfallen. Diese Entsättigung des Hämoglobins ist bisher nicht gezeigt worden. Sie würde eine mitochondriale Sauerstoffreserve voraussetzen. Eine Detektion durch Mehrverbrauch bedingter Hämoglobindeoxygenierung widerspricht daher dem Buxton-Frank-Modell vom diffusionslimitierten Sauerstofftransport ins Gewebe.


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Ob der von Malonek und Grinvald mit der gleichen Methode errechnete frühe Anstieg des Deoxy-Hb bei visueller Stimulation der Katze durch die Vernachlässigung der differentiellen Pfadlängenkorrektur entstanden ist, läßt sich nicht beurteilen. In dieser Arbeit werden keine Aussagen über die Validität des Algorithmus getroffen. Seine lineare Anpassung an die gemessenen Spektren wird nicht dargestellt. Eine Neuberechung der Daten mit differentieller Pfadlängenkorrektur wäre hier hilfreich .

Um die Ergebnisse durch eine unabhängige Methode zu überprüfen, wiederholte Grinvald das Experiment und ermittelte über die Methode des "Phosphorescence Quenching" einen initialen intravaskulären Sauerstoffabfall unter Stimulation . Im Rahmen einer weiteren Dissertation etablierte unsere Gruppe diese Methode, um die spektroskopischen Messungen zu überprüfen. Wir konnten auch mit dieser Methode keine initiale Deoxygenierung feststellen .

Eine sorgfältige Auswertung unserer spektroskopischen Daten ergab keinen initialen Deoxy-Hb-Anstieg bei somatosensorischer Stimulation in der Ratte. Unsere fMRT-BOLD-Messungen unter Vorderpfotenstimulation zeigten wie alle anderen fMRT-Studien an der Ratte keinen initialen BOLD-Signalabfall . Diese Übereinstimmung läßt uns daran zweifeln, daß es in der Ratte eine frühe Deoxygenierung bei somatosensorischer Stimulation gibt. Es zeigte sich aber auch eine gewisse Anfälligkeit des Lambert-Beer-Algorithmus unter der Voraussetzung verschiedener optischer Modelle. Für die Überprüfung unserer Schlußfolgerung wäre es sinnvoll, die spektroskopischen Daten der verschiedenen Gruppen einmal zusammenzufassen und über den Vergleich der Algorithmen die Ursache für die abweichenden Ergebnisse zu suchen.

4.2 Das frühe Blutvolumensignal

Das hochauflösende 600nm-Abschwächungssignal kommt unserer Meinung nach durch eine Blutvolumenzunahme zustande, die die initiale Ausdehnung des kapillär-venösen Ballons repräsentiert.

Unter Einschluß der Pfadlängenkorrektur ergibt sich im Hämoglobinzeitverlauf eine frühe Antwort, die sich von der späteren Hyperoxygenierung unterscheidet. Sowohl in der Whisker- als auch in der Vorderpfotenstimulation nimmt bei Stimulationsbeginn zunächst das oxygenierte Hämoglobin zu. Diese isolierte Oxy-Hb-Zunahme dauert etwa 1.5-2.5 Sekunden.


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Erst danach zeigt sich mit dem Beginn der großen Hyperoxygenierungsantwort eine Abnahme der Deoxy-Hb-Konzentration.

Die frühe Antwort einer isolierten Oxy-Hb-Zunahme unterscheidet sich von allen folgenden Hämoglobinverteilungen, in denen eine Oxy-Hb-Zunahme immer von einer Deoxy-Hb-Abnahme und umgekehrt begleitet ist. Der Einschluß der Pfadlängen zeigt sowohl Oxy-Hb-Zunahme als auch Deoxy-Hb-Abnahme in qualitativer Übereinstimmung mit der konstanten Pfadlängenanalyse. Die bessere Beschreibung der frühen spektralen Veränderung durch die differentielle Pfadlängenanalyse weist auf eine besondere optische Situation beim Einsetzen der Stimulationsantwort hin. Das hochauflösende 600nm-Signal zeigt die kapilläre Absorptionszunahme ebenfalls nur in den ersten zwei Sekunden. Wir glauben daher, daß sich in dieser Phase eine Druckwelle bemerkbar macht, die den kapillär-venösen Ballon dehnt, bevor die Blutflußfront das Deoxy-Hb herausspült ( Abbildung 27 ).

Abbildung 25: Schema der Veränderungen im Voxel: frühe Antwort

Für eine einfachere Darstellung wird die Oxygenierung über weiße (sauerstoffreiche) und schwarze (sauerstoffarme) Erythrozyten symbolisiert. Das kapillär-venöse System ist durch den Ruhefluß als elastisches Kompartiment vorgedehnt (links). Bei Stimulation dehnt sich aufgrund der abrupten Druckzunahme der kapillär-venöse Ballon (Mitte). Erst wenn das vorhandene Blut aus dem Voxel abgeflossen ist, ersetzt durch Blut, das mit erhöhter Geschwindigkeit durch die Kapillaren geflossen ist, steigt die Oxygenierung im Voxel deutlich (rechts).
Deltap: Druckgefälle (bestimmt v.a. durch arteriolären Widerstand)
Deltafin: Mehreinstrom von Blut in das Voxel
Deltafout: Mehrausstrom von Blut aus dem Voxel

Bei einer arteriolären Dilatation kommt es zu einem Druckanstieg im nachgeschalteten Kompartiment (Deltap>0). Mit Schallgeschwindigkeit (1.5 km/s im Wasser) wird dieser Druckanstieg auf alle nachfolgenden Gefäße weitergeleitet. Schon vor der Auswirkung der Flußzunahme auf die Oxygenierung dehnt sich so der kapillär-venöse Ballon und speichert


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Volumen, vermutlich unter Verdrängung extravasalen Volumens in den Liquorräumen. Da sich diese Erythrozyten noch langsam durch die Mikrozirkulation bewegt haben, ändert sich die Oxygenierung nur minimal: Oxy-Hb und das plasmatische Blutvolumen nehmen zu, Deoxy-Hb und BOLD bleiben unverändert.

Den Erythrozyten, die die Mikrozirkulation vom Anfang bis zum Ende mit erhöhter Geschwindigkeit durchflossen haben, ist aufgrund ihrer kürzeren Verweildauer weniger Sauerstoff entzogen. Ihr Eintreffen im Ballonkompartiment des Voxels leitet die anhaltende Hyperoxygenierung ein: Deoxy-Hb fällt ab und BOLD nimmt zu. Die initiale 600nm-Abschwächung reflektiert demnach einen isolierten Oxy-Hb-Anstieg ohne komplementären Deoxy-Hb-Abfall. Als frühe Antwort ist sie zeitlich eng an die Stimulation gebunden. Auch wir konnten feststellen, daß diese initiale Absorptionsveränderung räumlich hoch aufgelöste funktionelle Bilder erzeugt, die eine Differenzierung einzelner Kolumnen erlauben.

Wir erklären uns diesen Effekt mit einer Kompartimentbegrenzung auf den ersten Abschnitt der Mikrozirkulation. Die arterioläre und kapilläre Versorgung folgt im wesentlichen der Kolumnenstruktur, während die venösen Gefäße viel Raum einnehmen und eine eindeutige Zuordnung hier nicht zu treffen ist . Die Kapillarnetzdichte bildet kortikale Kolumnen regelrecht ab, und so ist es unserer Vermutung nach die initiale kapilläre Füllung, die sich im 600nm-Signal hervorhebt. Dies geschieht allerdings nur so lange, wie das Licht bis zu diesem Volumen auf unveränderte Verhältnisse stößt. Ist die Blutflußantwort in den Venen angekommen, so geht das kapilläre Signal offenbar in der Hyperoxygenierung der diffus verteilten Venulen und Venen unter.

Trifft dieses Modell der frühen Antwort zu, so könnte sich mittels einer Volumengewichtung auch mit der fMRT eine frühe, kapilläre Signalkomponente erfassen lassen. Tatsächlich konnte eine die CBV-gewichtete fMRT der Ratte bereits Vorder- und Hinterpfote auf dem gleichen Frontalschnitt voneinander abgrenzen .

4.3 Die Blutflußantwort während der Stimulation

Die vorliegende Arbeit bestätigt, daß sich die Blutflußantwort bei funktioneller Aktivierung in fMRT und Imaging Spectroscopy in einander entsprechenden Meßgrößen darstellt. So konnten wir zeigen, daß sich das BOLD-Signal wie erwartet mit der Deoxy-Hb-Konzentration verändert. Im Vergleich zu den CBV-Signalen korreliert es auch quantitativ stärker mit Deoxy-Hb. Dieser Zusammenhang bildet die Grundlage des BOLD-Modells und wurde


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bereits mittels der Nahinfrarotspektroskopie für globale und fokale Veränderungen untersucht .

Unserer Studie erlaubt dieser Zusammenhang aber gerade im Hinblick auf die Untersuchung des frühen Deoxygenierungssignals eine wichtige Aussage: aus der optischen Quantifizierung von Hämoglobinverteilungen ergeben sich wichtige Implikationen für die funktionelle Bildgebung durch die fMRT. Für die Untersuchung komplexer funktioneller Stimulationen oder Fragestellungen der Ischämieforschung könnten sich optische Tierstudien als wertvolle Zusatzinformation in der diagnostischen und therapeutischen Weiterentwicklung herausstellen.

4.4 Die Antwort auf das Stimulationsende

Wir konnten zeigen, daß sowohl die nach der initialen Antwort einsetzende Hyperoxygenierung als auch die nach Stimulationsende eintretende Hypooxygenierung in ihrer Größe mit der Stimulationsdauer in einem linearen Verhältnis stehen.

Ein Hypooxygenierungssignal nach Stimulationsende wird von vielen Spektroskopiegruppen als Hämoglobinverlust mit Deoxygenierung des Meßvolumens beschrieben , bei den meisten fMRT-Studien zeigte sich dieser als sogenannter BOLD "post-stimulus undershoot" (z.B. ). Dabei wurde bereits eine Abhängigkeit dieser Antwort von der Dauer der vorangegangenen Stimulation beschrieben . Andere Gruppen haben diese nur bei bestimmten Paradigmen der visuellen Stimulation gesehen, während das BOLD-Signal bei anderen Paradigmen auf Ausgangswerte fiel .

Wir konnten zeigen, daß die Größe der Antwort nach Stimulationsende mit der Stimulationsdauer zusammenhängt. Diese Tatsache weist auf ein vaskuläres Speicherphänomen hin. Wir vermuten den Mechanismus der Hypooxygenierung nach dem Stimulationsende in einem Mißverhältnis von Blutfluß und Blutvolumen, das sich aus der verzögerten Rückkehr des venösen Spannungszustandes zum Ruhewert ergibt.

Das korpuskuläre und das plasmatische Blutvolumensignal zeigten beide 10%ige Zunahmen auf Stimulation hin, wobei sie neben einem steilen Anstieg zum Stimulationsbeginn eine weitere allmähliche Veränderung unter prolongierter Stimulation aufwiesen. Diese bestand beim plasmatischen Volumen in einer Zunahme und beim korpuskulären Volumen in einer


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Abnahme. Zusammengerechnet ergab dies eine allmähliche Zunahme des gesamten Blutvolumens. Diese führen wir auf eine verzögerte Compliance des venösen Kompartiments zurück. Die Anpassung der glatten Muskelzellen an den neuen Füllungszustand geschieht demnach mit einer Entspannung der Venen und führt zu einer Mehrspeicherung von Volumen.

Die unterschiedliche Verteilung der Zellen und des Plasmas innerhalb dieser Volumenzunahme führen wir auf unterschiedliche Transitzeiten von Plasma und Zellen zurück. Im Laufe der Blutflußantwort kumuliert das Plasma randständig im kapillär-venösen Ballon und drängt die Zellen in den Axialstrom. Dieses Phänomen ist bekannt als Fahraeus-Lindquist-Effekt. Der kapillär-venöse Ballon "verliert" unter Stimulation Zellen. Die zu jedem Zeitpunkt gemessene Zellsäule wird durch die Plasmaakkumulation in Richtung schlechter oxygenierter Kompartimente bzw. durch ableitende Venen aus dem Meßvolumen heraus geschoben. Bei Stimulationsende fällt der Druck, und der Ballon kollabiert, zunächst aufgrund seiner Compliancezunahme zu einem gegenüber dem Ruhezustand erhöhten Volumen. Die ausgespülten Zellen machen sich bemerkbar als Hämoglobinverlust. Die jetzt wieder langsam einströmenden Zellen werden aufgrund des noch vorhandenen Plasmas schneller vorangespült, bis sich dieses durch die langsame Anpassung der Venen an die neuen Druckverhältnisse entleert hat. Dann ist der Ruhehämatokrit wiederhergestellt ( Abbildung 28 ).

Diese Darstellung ist eine Vermutung, die sich erst mit einer simultanen Messung von Volumen und Fluß genauer nachprüfen läßt. Das kapillär-venöse Kompartiment ist äußerst heterogen und mit einem einfachen Ballon nur annähernd beschrieben.


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Abbildung 26: Schema der Veränderungen im Voxel: Verlauf der Blutflußantwort

Für eine einfachere Darstellung wird die Oxygenierung über weiße (sauerstoffreiche) und schwarze (sauerstoffarme) Erythrozyten symbolisiert. Der passiven elastischen Volumenzunahme bei Stimulationsbeginn (1.) folgt unter prolongierter Stimulation eine langsame weitere Volumenzunahme, die wahrscheinlich durch eine venöse Streßrelaxation bedingt ist (2.). Plasma fließt langsamer als Zellen und akkumuliert vermehrt im Ballon was zu einem Netto-Zellverlust führt. Dieser macht sich am Stimulationsende bemerkbar, wenn der abrupte Druckabfall zu einer elastischen Retraktion des Ballons führt (3.). Das Blut strömt dann wieder wie unter Ruhebedingungen ein, wobei die Zellen durch den Plasmapool beschleunigt die Venulen und das Meßvolumen verlassen. Dem Voxel erhalten bleiben die schlechter oxygenierten Kompartimente (4.). Dieses Fließgleichgewicht kehrt allmählich zu seinem Ruhezustand zurück, indem die Venen sich wieder anspannen und der Plasmapool ausströmt (5.).
Deltap:Druckgefälle, (bestimmt v.a. durch arteriolären Widerstand); Deltafin:Mehreinstrom von Blut in das Voxel; Deltafout:Mehrausstrom von Blut aus dem Voxel


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4.5 Schlußfolgerungen

Die somatosensorische Stimulation bei der Ratte hat sich als geeignetes Modell zur Erforschung der Blutflußantwort herausgestellt. Die Whiskerstimulation konnte wegen ihrer strengen Somatotopie die hohe räumliche Auflösung der optischen Signale demonstrieren. Unter monochromatischem 600nm-Licht grenzte sich unter mechanischer Whiskerauslenkung ein Abschwächungsgebiet ab, dessen Ausdehnung einer kortikalen Kolumne gleichkommt. Offenbar handelt es sich um das jeweilige Whisker-Barrel des stimulierten Whiskerhaares.

Die spektroskopische Analyse dieser initialen optischen Abschwächung ermittelte als Ursache eine frühe Zunahme der Oxy-Hb-Konzentration. Eine vereinfachte Lambert-Beer-Analyse ohne differentielle Pfadlängenkorrektur konnte die gemessenen Spektren nicht linear anpassen. Sie errechnete in einem Näherungsversuch neben dem Anstieg des Oxy-Hb einen vermutlich artifiziellen Anstieg des Deoxy-Hb. Die BOLD-fMRT lieferte keine Hinweise auf eine frühe Deoxygenierung. Die Zunahme des CBV setzt in den optischen und magnetresonanztomographischen Messungen fast unmittelbar mit dem Stimulationsbeginn ein. Sie wird mit einer initialen passiven Dehnung des kapillär-venösen Kompartiments durch die Druckzunahme bei der arteriolären Dilatation erklärt. Die Oxygenierungsveränderung wird nach etwa einer kapillären Transitzeit im Deoxy-Hb-Abfall und in der BOLD-Zunahme deutlich. Dann ist das vorhandene Hämoglobin aus dem Meßvolumen gespült und der hyperoxygenierende Effekt der Blutflußantwort tritt ein.

In einer Meßreihe mit unterschiedlich langen Vorderpfotenstimulationen zeigte diese Hyperoxygenierungsantwort eine starke Korrelation mit der Stimulationsdauer, unabhängig von ihrer Erfassung mit dem pCBV, cCBV, Deoxy-Hb oder BOLD-Signal. Nach dem Ende der Stimulation kehrten sich die Signale von BOLD und Deoxy-Hb um, was einer Hypooxygenierung des Meßvolumens entspricht. Die verzögerte Rückbildung des pCBV und die Umkehr des cCBV-Signals nach Stimulationsende weisen auf eine vorübergehende Hämatokritreduktion hin.

Die allmähliche Blutvolumenzunahme unter prolongierter Stimulation legt eine viskoelastische Veränderung der Blutgefäße im Sinne einer Compliancezunahme nahe. Wir gehen zudem davon aus, daß sich die Mechanismen der Blutflußantwort auf Zellen und Plasma verschieden auswirken und somit zu Hämatokritverschiebungen führen.


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Die simultane Messung magnetresonanztomographischer und optischer Signale stellt den nächsten Schritt in Richtung eines besseren Verständnisses von den Grundlagen der funktionellen Bildgebung dar. Das Ziel dieser Grundlagenforschung besteht unter anderem darin, die Kinetik der neurovaskulären Kopplung quantitativ vorherzusagen. Dies könnte sich als Schlüssel auf dem Weg zu einer hochauflösenden Hirnkartierung erweisen, die bis zur Interaktion kortikaler Kolumnen vordringen kann.

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Fri Feb 7 15:12:27 2003