Rückert, René: Bakterielles Superantigen verstärkt die Atemwegsinflam mation und bronchiale Atemwegsreagibilität in einem Mausmodell der allergischen Sensibilisierung.

Aus dem Institut für Pathobiochemie/Laboratoriumsmedizin
der Medizinischen Fakultät Charité, Campus Virchow-Klinikum
der Humboldt-Universität zu Berlin


DISSERTATION
Bakterielles Superantigen verstärkt die Atemwegsinflam
mation und bronchiale Atemwegsreagibilität in einem
Mausmodell der allergischen Sensibilisierung.

zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

Vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt Universität zu Berlin


von René Rückert ,
aus Neubrandenburg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Gutachter:
1. Prof. Dr. Renz, Marburg
2. Prof. Dr. Kunkel, Berlin
3. Prof. Dr. Heeg, Marburg

Eingereicht:30. November 1999

Datum der Promotion: 26. Juni 2000 (summa cum laude)


5

Abstract Deutsch

Asthma Bronchiale (AB) ist eine chronisch- obstruktive, teilweise reversible Entzündung der Atemwege, deren klinisches Korellat die bronchiale Hyperreagibilität (BHR) ist. Es lassen sich aufgrund ethiologischer Faktoren extrinsiches und intrinsisches AB unterscheiden, wobei ersteres auf einer allergischen Sensibilisierung und letzteres auf irritativen oder infektbedingten entzündlichen Prozessen beruht. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß von bakteriellem Superantigen auf die Entzündungsreaktion und die bronchiale Hyperreagibilität untersucht. Stapylococcal enterotoxin B (SEB) wurde hierbei als Modellsubstanz in einem Mausmodell eingesetzt, da SEB produzierende Staphylokokken im Nasenrachenraum von Asthmatikern nachgewiesen werden konnten.
Nasale Applikation von SEB induzierte in C57BL/6 Mäusen eine Entzündungsreaktion mit Influx von Lymphozyen und eosinophilen Granulozyten sowie gesteigerte Produktion von IL-4, IL-5 und TNF-alpha in der Lunge, welches in der Histologie und Bronchiallavage nachgewiesen wurde. Desweiteren führt SEB allergenunabhängig zur Ausbildung von BHR.
SEB Applikation in einem Mausmodell der allergischen Sensibilisierung (gegen Ovalbumin in C57BL/6 Mäusen) verstärkt die allergische Entzündung in der Lunge und die BHR.
CD23 (Low-Affinity IgE Rezeptor) Knock out Tiere zeigen nach allergischer Sensibilisierung und SEB Behandlung keinen Anstieg der TNF-alpha Produktion und keine Hyperreagibilität.
Aus diesen Ergebnisse läßt sich schlußfolgern: I. Bakterielles Superantigen induziert das Vollbild des intrinsischen AB im Tiermodell. II. Bakterielles Superantigen kann das extrinsische, allergische AB verstärken. III. Der CD23 Rezeptor ist essentiell für die TNF-alpha Produktion und die Induktion von BHR.
Diese Resultate sollten in klinischen Studien am Patienten überprüft werden, da aufgrund der hier vorliegenden Daten zu erwarten ist, daß Antibiotikatherapie, und damit Elimination superantigenproduzierender Bakterien im Nasenrachenraum, die klinische Symptomatik des AB reduzieren kann.

Schlagwörter:
Asthma, Superantigen, CD23, Hyperreagibilität, OVA


6

Abstract english

Asthma bronchiale (AB) is an obstructive, partially reversible chronic inflammatatory disease of the small airways, which clinical correlate is represented by airway hyperreactivity. Based on etiological factors, AB can be divided in extrinsic and intrinsic AB, where the first depends on an allergic sensitization and the latter on airway irritation by environmental factors or airway inflammation due to viral or bacterial infection.
In this thesis, the role of bacterial superantigens in airway inflammation and -hyperreactivity is analyzed. Staphylococcal enterotoxin B (SEB) was used as a prototypic substance, since SEB producing Staphylococcal aureus can be found in the nose and pharynx of asthmatic patients.
Nasal application of SEB in C57BL/6 mice resulted in airway inflammation characterized by an influx of lymphocytes and eosinophil granulocytes and increased production of IL-4, IL-5, and TNF-alpha, which was analyzed by histology and bronchiolalveolar lavage. Furthermore, SEB induced independent of allergens airway hyperreactivity.
SEB application in a mouse-model of allergic sensitization (to ovalbumin in C57BL/6 mice) boosts the allergen-induced allergic inflammation and airway hyperreactivity.
CD23 (low-affinity IgE receptor) knock out mice showed no increased TNF-alpha production and no airway hyperreactivity after allergic sensitization and SEB treatment.
These results demonstrate: I. Bacterial superantigen can induce intrinsic AB in a mouse model. II. Bacterial superantigen can significantly boost the allergic, extrinsic AB. III. The CD23 receptor is essential for TNF-alpha production and for the induction of airway hyperreactivity.
Based on these findings, clinical surveys should be performed, since one could expect, that eradication of nasal bacterial carriage and therefore local superantigen sezernation should improve the AB- symptoms in affected patients.

Keywords:
Asthma, Superantigen, CD23, Hyperreactivity, OVA


Seiten: [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteBakterielles Superantigen verstärkt die Atemwegsinflam mation und bronchiale Atemwegsreagibilität in einem Mausmodell der allergischen Sensibilisierung.
1 Einleitung
1.1Asthma Bronchiale
1.2Morphologische Veränderungen bei AB
1.3Tiermodelle für die allergische Sensibilisierung
1.4Bakterielle Superantigene
1.5Immunologische Aspekte des extrinsischen AB
1.5.1Allergenpräsentation und allergische Sensibilisierung
1.5.2T-Helfer Zellen als Induktoren allergischer Sensibilisierung.
1.5.3Interleukin-5
1.5.4Eosinophile Granulozyten
1.6Funktion des CD23 Rezeptors bei allergischen Erkrankungen
1.7TNF-alpha
1.8Ziel der Arbeit
2 Material und Methoden
2.1Tiere und Behandlungsprotokolle
2.1.1Immunisierung
2.1.2Lokale Allergenchallenge mittels Aerosol
2.2Narkose und Nasalapplikation
2.2.1Narkose
2.2.2Nasale Applikation von Flüssigkeiten
2.3Behandlungsschema der Mäuse
2.3.1Allergische Sensibilisierung gegen Ovalbumin (OVA)
2.3.2Additive Behandlung der OVA sensibilisierten Tiere mit nasal appliziertem SEB
2.3.3Präparation der Tiere
2.3.4Histologie der Lunge
2.3.5Durchführung der bronchoalveolaren Lavage
2.3.6Zytozentrifugation der durch die BAL gewonnenen Zellen
2.4Quantitative Antikörperbestimmung mittels Enzyme-Linked Immuno Sorbant Assay (ELISA)
2.4.1Durchführung des ELISA zur Bestimmung des Gesamt-IgE
2.4.2ELISA zur Bestimmung von OVA-spezifischem IgE, IgG1 und IgG2a
2.4.3Protokolle der IL-4, IL-5 und IFN-gamma Zytokin - ELISA
2.5Messung der bronchialen Hyperreagibilität
2.6Statistische Auswertung der Ergebnisse
3 Ergebnisse
3.1Aspiration nasal applizierter Reagenzien in die Lungenperipherie
3.2SEB Titration: Modell des intrinsischen AB
3.2.1Dosisabhängiger Anstieg der Gesamtzellzahl in der BAL
3.2.2Zelldifferenzierung der BAL Zellen
3.2.3Dosisabhängige peribronchiale Inflammation
3.2.4Zytokinkonzentration in der BAL
3.2.5Dosisabhängiger Anstieg der TNF-alpha Konzentration in der BAL nach SEB Applikation
3.2.6Nasal appliziertes SEB induziert bronchiale Hyperreagibilität
3.3Einfluß von SEB auf OVA sensibilisierte C57BL/6 Mäuse.
3.3.1Anstieg der Immunglobulintiter nach OVA - Sensibilisierung
3.3.2Histologischer Nachweis der Inflammation in der Lunge von C57BL/6
3.3.3Zunahme der Absolutzellzahl in der BAL
3.3.4Anstieg der Eosinophilen und Lymphozyten in der BAL
3.3.5Zytokinkonzentration in der BAL von C57BL/6 Wt Mäusen
3.3.6Bronchiale Hyperreagibilität nach OVA Sensibilisierung und SEB Applikation
3.4Einfluß des CD23 Rezeptors
3.4.1Einfluß des CD23 Rezeptors auf die allergische Sensibilisierung
3.4.2CD23 -/- ist ein entscheidender Faktor für pulmonale Inflammation
3.4.3Anstieg der Zellzahl in der BAL von CD23 -/- Mäusen
3.4.4Signifikante Unterschiede der BAL - Zelldifferenzierung in C57BL/6 Wt versus CD23-/-
3.4.5Zytokinkonzentration in der BAL von CD23 -/- Mäusen
3.4.6CD23 -/- entwickeln keine BHR
3.5Rolle von TNF-alpha in der Induktion von BHR
3.6Zusammenfassung der Ergebnisse
4 Diskussion
4.1SEB induziert lokale Inflammation und BHR: Modell für intrinsisches AB
4.1.1C57BL/6 Mäuse entwickeln BHR nach SEB Applikation
4.2Lokale SEB Behandlung verstärkt allergische Inflammation und BHR in OVA - Sensibilisierten C57BL/6 Wt Mäusen
4.3Einfluß des CD23 Rezeptors auf die SEB Wirkung
4.4TNF-alpha
5 Zusammenfassung
Bibliographie Literatur
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
Lebenslauf
Anhang A Publikationsliste
A.1Paper:
A.2Abstracts:
Danksagung
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: TNF-alpha Konzentration in der BAL, Die Tiere wurden unbehandelt (Nil) oder nach dreimaliger Applikation von SEB in den angegebenen Konzentrationen analysiert. Signifikanzen wurden mit dem Student t Test bestimmt (p le 0,05; *; n = 5/Gruppe)
Tab. 2: Total IgE- und allergenspezifische Antikörpertiter im Serum von C57BL/6 Mäusen aus den folgenden Studiengruppen: PBS, nasale Applikation von PBS, OVA, intraperitoneale Sensibilisierung mit 10µg OVA, SEB, nasale Applikation von 50ng SEB/Applikation, OVA+SEB, nasale Applikation von SEB nach erfolgter Sensibilisierung. Die Immunglobuline wurden im ELISA wie im Methodenteil beschrieben aus Serumproben bestimmt, die am Tag 22 nach der ersten Sensibilisierung, entnommen wurden. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD aus unabhängigen Experimenten mit 6-14 Mäusen/Gruppe, Signifikanzen wurden mit Student t Test bestimmt (p le 0,05; *).
Tab. 3: Gesamtzellzahl in der BAL von C57BL/6 Wt und CD23-/- Mäusen nach Sensibilisierung mit OVA. Die i.p. Injektionen von OVA mit Adjuvans erfolgten am Tag 1, 7 und 14. Die i.n. Applikation von SEB wurde nach der Sensibilisierung am Tag 15, 17 und 20 durchgeführt. Am Tag 21 erfolgte die Allergenchallenge mit aerosolisierter OVA Lösung. Die BAL wurde am Tag 22 durchgeführt.
Tab. 4: Die Zytokinkonzentration in der BAL wurde in C57BL/6 Mäusen mit ELISA gemessen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD von einem repräsentativen Experiment (n=5) aus 2 - 4 unabhängigen Experimenten. Signifikanzen ( * p le 0,05 zur PBS Kontrolle) wurden mit dem Student t Test bestimmt.
Tab. 5: Total IgE- und allergenspezifische Antikörpertiter im Serum von C57BL/6 CD23 -/- Mäusen aus den folgenden Studiengruppen: PBS, nasale Applikation von PBS, OVA, intraperitoneale Sensibilisierung mit 10µg OVA, SEB, nasale Applikation von 50ng SEB/Applikation, OVA+SEB, nasale Applikation von SEB nach erfolgter Sensibilisierung. Die Immunglobuline wurden im ELISA wie im Methodenteil beschrieben aus Serumproben bestimmt, die am Tag 22 nach der ersten Sensibilisierung, entnommen wurden. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD aus unabhängigen Experimenten mit 6-14 Mäusen/Gruppe, Signifikanzen wurden mit Student t Test bestimmt (p le 0,05; *).
Tab. 6: Gesamtzellzahl in der BAL von C57BL/6 Wt und CD23-/- Mäusen nach Sensibilisierung mit OVA. Die i.p. Injektionen von OVA erfolgten am Tag 1, 7 und 14. Die i.n. Applikation von SEB wurde nach der Sensibilisierung am Tag 15, 17 und 20 durchgeführt. Am Tag 21 erfolgte zweimalige Allergenchallenge mit aerosolisierter OVA Lösung. Die BAL wurde am Tag 22 durchgeführt. (n.d. = wurde nicht bestimmt, * ple 0,05)
Tab. 7: Die Zytokinkonzentration in der BAL wurde in CD23-/- Mäusen mit ELISA gemessen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD von einem repräsentativen Experiment (n=5) aus 2 - 3 unabhängigen Ex
perimenten. Signifikanzen ( * p le 0,05 zur PBS Kontrolle) wurden mit dem Student t Test bestimmt.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Übersicht über die wichtigsten Effektoren (zellulär und lösliche Faktoren) bei allergischen Reaktionen und morphologischen Umbauvorgängen. (Details im Text).
Abb. 2: Schematische Darstellung der Bindung von SA an den variablen Teil der beta-Kette des T-Zell Rezeptors und an MHC II der APC.
Abb. 3: Schematische Darstellung der allergischen Sensibilisierung und der Effektorphase (Soforttypreaktion).
Abb. 4:
Abb. 5:
Abb. 6:
Abb. 7:
Abb. 8:
Abb. 9:
Abb. 10: Histologie der SEB - Titration
Abb. 11:
Abb. 12:
Abb. 13:
Abb. 14:
Abb. 15:
Abb. 16:
Abb. 17:
Abb. 18:
Abb. 19:
Abb. 20:
Abb. 21:
Abb. 22:

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Wed Oct 2 12:56:08 2002