Ryseck, Ilona: Modulation von Proliferation und Migration boviner kornealer Endothelzellen in Kultur durch humanes Kammerwasser, Transforming Growth Factor-Beta 2 und Ascorbinsäure

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Die Hornhaut

1.1.1 Struktur

Die verschiedenen Schichten der Hornhaut haben ihren embryologischen Ursprung im Ektoderm, Mesoderm und Neuroektoderm der Neuralleiste.

Die Vorderseite der Hornhaut bildet ein mehrschichtiges nicht verhornendes Plattenepithel, dessen Basalzellen fest auf der verdickten Bowman - Membran verankert sind. Es schließt sich das Stroma an, welches aus Kollagenfibrillen besteht. Transparent sind sie durch ihre kristalline Gitteranordnung innerhalb der Stromalamellen (Maurice 1957) und ihren niedrigen Wassergehalt (70%). Das Stroma wird vorderkammerwärts durch die Descemet - Membran begrenzt. Auf dieser Membran sitzt das einschichtige Hornhautendothel, die Abgrenzung der Hornhaut vom Kammerwasser.

Die Hornhaut hat beim Erwachsenen einen Durchmesser von 11,5 mm. Ihre Dicke beträgt im Zentrum 0,50 mm, in der Peripherie 0,65 mm.

Die ausgeprägte sensible Innervation der Hornhaut erfolgt durch Nervenfasern des ersten Trigeminusastes (Ramus ophthalmicus).

Da die Hornhaut keine Gefäße besitzt, wird sie hauptsächlich durch das Kammerwasser aber auch durch den Tränenfilm und das Randschlingennetz ernährt.

1.1.2 Funktion

Die Hornhaut ist ein wichtiger Teil des optischen Systems des Auges und ihre Transparenz ist für das Sehen von größter Bedeutung. Sie dient dem Schutz des Augeninneren vor schädigenden Einflüssen. Aufgrund ihrer Transparenz und Brechkraft wird eine scharfe Abbildung auf der Netzhaut ermöglicht. Durch den Übergang in ein anderes Medium (Luft - Tränenfilm - Hornhaut) und die Wölbung der Hornhaut werden die Lichtstrahlen gebrochen. Die Hornhaut besitzt mit 40 - 45 dpt die stärkste Brechkraft des Auges. Jede Unregelmäßigkeit oder eine Hornhauttrübung


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beeinträchtigen die Sehfähigkeit erheblich. Hornhauttrübungen sind die häufigste Erblindungsursache (Taylor 1986).

Die Transparenz der Hornhaut wird an der Vorderseite durch den Tränenfilm und an der Hinterseite durch ein intaktes Hornhautendothel aufrechterhalten.

1.2 Das Hornhautendothel

1.2.1 Struktur und Funktion

Das Hornhautendothel besteht aus einer 5 - 6 µm dicken, einlagigen Zellschicht von 300.000 - 500.000 Zellen (bei Geburt), die kammerwärts der Descemetschen Membran aufsitzen. Die Zellen haben eine polygonale, meist hepta - oder hexagonale Form. Sie sind ungleichmäßig über die Hornhautrückfläche verteilt und haben in der Hornhautperipherie eine höhere Zelldichte als im Zentrum (Schimmelpfennig 1982). In den ersten Lebensjahren nimmt die Dichte der Zellen stark ab, da die Hornhautrückfläche noch wächst, die Endothelzellzahl aber gleich bleibt. Die Zelldichte beträgt beim Neugeborenen 3500 - 4000 Zellen / mm², beim Erwachsenen nur noch 1400 - 2500 Zellen / mm². Mit zunehmendem Lebensalter nimmt die Zellzahl des menschlichen Endothels kontinuierlich ab (Waring et al. 1982, Lopez et al. 1989). Dies ist einer mangelnden Proliferationskapazität zuzuschreiben (Capella 1972). Die durchschnittliche Verminderung der Zelldichte beträgt ca. 0,56 % / Jahr (Murphy et al. 1984). Zusätzlich können Hornhautdystrophien, Traumen und intraokulare Chirurgie zu einem Endothelzellverlust führen.

Das Hornhautendothel hat zwei Hauptfunktionen. Es ernährt die Hornhaut durch Diffusion von Kammerwasserbestandteilen und sichert die Transparenz der Hornhaut durch zwei Mechanismen. Zum einen verhindern die Kontakte der Zellen untereinander (Zonulae occludentes) einen Einstrom von Kammerwasser. Sie bilden eine passive Barriere (Waring 1992). Zum anderen bedient sich das Endothel einer ATP - abhängigen, enzymkatalysierten Ionenpumpe, welche durch aktiven Transport von Natrium, Kalium und Hydrogenkarbonat - Ionen einen passiven Austritt von Wasser aus dem Stroma in die Vorderkammer bewirkt (Waring 1982, Kaufmann 1988).

Wenn die Barriere - und Pumpfunktion des Endothels alteriert ist, kommt es durch verstärkten Einstrom von Wasser in das Stroma zu einem Hornhautödem und einer Trübung der Hornhaut (Waring 1992).


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1.2.2 Wundheilung in vivo

Die Wundheilung des menschlichen Hornhautendothels erfolgt hauptsächlich durch Migration. Dabei kommt es nach Vergrößerung und Abflachung der Zellen zum Einwandern derselben in die Wunde. Nach abgelaufener Migration kann es durch Einwanderung benachbarter Zellen über einen Defekt zu einer radiären Anordnung der Zellen (Rosettenformation) kommen (Geroski et al. 1989). Die Art der Wundheilung ist auch vom Ausmaß und der Ursache des Zellverlustes abhängig. Geschädigte Endothelzellen werden in die Vorderkammer abgestoßen (Treffers 1982).

Während der Wundheilung des humanen Hornhautendothels wurden mitotische und amitotische Zellteilungen beobachtet (Zagorski et al. 1980, Hartmann et al. 1986). Man nimmt an, daß mit zunehmendem Lebensalter amitotische Zellteilungen mit Zellvergrößerung vorherrschend sind (Faure et al. 1971).

Zwischen den einzelnen Tierspezies bestehen Unterschiede in der Wundheilung. Die Regenerationsfähigkeit des Endothels von Tieren ist mit zunehmendem phylogenetischen Abstand stärker ausgeprägt als die humaner Endothelzellen. So erfolgt beim Menschen die Wundheilung hauptsächlich durch die Migration und Vergrößerung der Zellen, die Proliferationskapazität ist sehr begrenzt. Dahingegen nimmt die Proliferation den wichtigsten Platz im Wundheilungsprozeß des Endothels von Kaninchen, Ratte, Huhn und Rind ein (Geroski et al. 1989).

Welche endogenen und exogenen Faktoren im Wundheilungsprozeß eine Rolle spielen, ist weitestgehend unbekannt.

1.3 Die Kultivierung von Hornhautendothelzellen

Die Geschichte der Zellkultur begann Anfang unseres Jahrhunderts. Matsui gelang 1928 zum ersten Mal die Kultivierung von Hornhautendothelzellen.

Für die Isolierung von Endothelzellen kommen heute hauptsächlich zwei Methoden zur Anwendung. Wir haben uns der Methode bedient, bei der die Zellen mechanisch in Verbindung mit der Descemet - Membran von der Hornhaut gelöst werden. Nach Erreichen einer konfluenten Primärkultur werden die Zellen mit Hilfe von Enzymlösungen (z.B. Trypsin - Lösung) vom Kulturschalenboden gelöst und erneut


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ausgesät (Gospodarowicz et al. 1976). Bei der zweiten Methode werden die Zellen mit Enzymlösungen von der Hornhaut abgelöst und kultiviert (Slick et al. 1965).

Für die Kultivierung stehen spezielle Medien zur Verfügung, denen u.a. Antibiotika und anorganische Puffer sowie tierische oder menschliche Seren zugesetzt werden.

Zellkulturen werden in vielen medizinisch - wissenschaftlichen Bereichen zur Analysierung von Strukturen, Funktionen und Verhaltensweisen der Zellen genutzt. Die Induktion und Modulation von Proliferations - und Migrationsvorgängen bei der Wundheilung des Hornhautendothels läßt sich sehr gut an Zellen in Kultur untersuchen.

1.4 Wundheilung des Hornhautendothels in vitro

Bei der Untersuchung der Wundheilung des Hornhauthautendothels in vitro bestätigten sich die oben beschriebenen Speziesunterschiede. Der Auswahl der Spezies für die Zellkultur kommt daher große Bedeutung zu.

Der exogene Einfluß, z.B. von sog. Wachstumsfaktoren und anderer exogener Faktoren, läßt sich an Zellkulturen optimal studieren. Bei einer Reihe von Wachstumsfaktoren, z.B. EGF und bFGF, ist ein stimulierender Einfluß auf die Wundheilung bereits gezeigt worden (Gospodarowicz et al. 1977, Rieck et al. 1992, Watanabe et al. 1987).

Viele Faktoren, die physiologisch auf die Endothelzellen einwirken, sind in ihrer Wirkung noch nicht untersucht. So ist nach wie vor unklar, welchen genauen Einfluß TGF-ß2 und L-Ascorbinsäure, beides Faktoren, die in hoher Konzentration im Kammerwasser vorliegen, auf Proliferation und Migration des Hornhautendothels haben.

1.5 Kammerwasser

1.5.1 Bildung und Funktion

Das Kammerwasser wird im Processus ciliaris des Ziliarkörpers, und zwar vom nicht - pigmentierten Epithel, produziert. Es wird durch aktive Zelltätigkeit (Sekretion) und Ultrafiltration gebildet, wobei aktive Ionentransportvorgänge sowie Karboanhydrase eine Rolle spielen. Die Bildungsrate beträgt 2 mm³/min und sein Gesamtvolumen in Vorder -


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und Hinterkammer 0,15 - 0,35 ml. Das Kammerwasser fließt aus der Hinterkammer, an Linse und Iris vorbei, in die Vorderkammer. Es verläßt die Vorderkammer über das Trabekelwerk in den Schlemm - Kanal. Über 20 - 30 Abflußkanäle des Schlemm - Kanals, die mit dem intra- und episkleralen Venenplexus verbunden sind, gelangt das Kammerwasser in die Blutbahn. Die treibende Kraft für die Fließrichtung des Kammerwassers bildet das hydrostatische Druckgefälle. Ein kleiner Teil des Kammerwassers gelangt aus der Vorderkammer zur Uvea und verläßt das Auge über die Sklera (Grehn und Leydhecker 1995).

Eine Funktion des Kammerwassers besteht zum einen in der Aufrechterhaltung des gegenüber der Umgebung erhöhten Augeninnendrucks (15 - 22 mmHg) und damit der Formerhaltung des Bulbus. Zum anderen dient es der Ernährung der gefäßlosen Strukturen des Auges, Kornea, Linse und Glaskörper. Das Kammerwasser ist mit einem Brechungsindex von 1,334 an der Gesamtrefraktion des Auges beteiligt.

1.5.2 Zusammensetzung

Das Kammerwasser ist eine wasserklare Flüssigkeit. Es beinhaltet wenig Proteine und zahlreiche Bestandteile des Blutplasmas. Die im Kammerwasser gelösten Bestandteile machen nur ein Zehntel derer des Serums aus. So ist der Glukosegehalt des Kammerwassers geringer, aber der Ascorbinsäuregehalt wesentlich höher. Einige wichtige organische und anorganische Inhaltsstoffe des Kammerwassers sind in Tabelle1 dargestellt.

Tabelle 1: einige ausgewählte Konzentrationen von Inhaltsstoffen des Kammerwassers (modifiziert aus Caprioli 1992)

Anorganische Substanzen

Organische Substanzen

Bikarbonat

20,2 µmol/ml

Ascorbinsäure

1,06 µmol/ml

Chlorid

131,6 µmol/ml

Glukose

2,80 µmol/ml

Kalium

3,9 µmol/ml

Laktat

4,50 µmol/ml

Natrium

152,0 µmol/ml

Protein

13,50 mg/100m

Phosphat

0,6 µmol/ml

Citrat

0,12 µmol/ml

H+-Ionen (pH)

ca. 7,5

Kreatinin

ca. 0,04 µmol/m


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1.6 Wachstumsfaktoren (WF)

Wachstumsfaktoren sind körpereigene Polypeptide, die in der Art und Weise, wie sie auf ihre Zielzellen einwirken, den Polypeptid - Hormonen gleichen. Dies beinhaltet das Vorhandensein von Oberflächenrezeptoren auf den Zellen, die Art der Erzeugung des transmembranären Signals und die Wirkung auf die Genexpression. Im Gegensatz zu Hormonen werden die WF in einer Vielzahl von Zellen synthetisiert und haben ein größeres Spektrum an Zielzellen (Bradshaw und Cavanaugh 1990).

Wachstumsfaktoren fördern oft das Zellwachstum, können es aber auch hemmen. Darüber hinaus beeinflussen sie viele andere Zellfunktionen, wie z.B. die Differenzierung ihrer Zielzellen, Wundheilung, Seneszenz ect.. Zellen benutzen Wachstumsfaktoren als Signalmoleküle für die Kommunikation untereinander (Sporn und Roberts 1990).

Seit Anfang der 70er Jahre konnten durch verbesserte biochemische Techniken immer mehr Wachstumsfaktoren isoliert und ihre Struktur charakterisiert werden. Die Produktion großer Mengen jedes isolierten Faktors ist durch Kenntnis der für ihn codierenden Gene und unter Zuhilfenahme von Expressionssystemen möglich geworden (Bradshaw und Cavanaugh 1990).

Zu den bisher isolierten WF gehören u.a. der Epidermal Growth Factor (Epidermaler Wachstumsfaktor), die Familie der Fibroblast Growth Factors (Fibroblasten Wachstumsfaktoren) und die Familie der Transforming Growth Factors beta (Transformierender Wachstumsfaktor Beta).

1.6.1 Der Epidermal Growth Factor (EGF)

Der Epidermal Growth Factor (Epidermaler Wachstumsfaktor) wurde1962 erstmals aus der submaxillären Drüse der Maus isoliert (Cohen 1962). Der humane EGF hat eine Sequenz von 53 Aminosäuren (Gregory 1975) und ein Molekulargewicht von 6045 Dalton. Die Konzentration von EGF im Kammerwasser beträgt bei Männern ca. 10,3 ng/ml, bei Frauen ca. 4,9 ng/ml (Shinoda et al. 1988). Die endogene Präsenz dieses WF konnte in vielen okulären Zellen nachgewiesen werden (Wilson et al. 1994).

Der EGF - Rezeptor ist ein intrinsisches Membranglycoprotein mit einem Molekulargewicht von 170000 Dalton, an dessen externer Domäne EGF spezifisch


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bindet. Die Tyrosinkinaseaktivität des EGF - Rezeptors bewirkt Phosphorilierungen im Zytoplasma (Carpenter und Wahl 1990). Der Rezeptor konnte in kornealen Endothel - und Epithelzellen nachgewiesen werden (Wilson et al. 1994).

Die Wirkung von EGF auf die verschiedensten Zellarten wurde bereits erforscht. Bei okulären Zellen zeigte sich eine fördernde Wirkung auf die Proliferation (Gospodarowicz et al. 1977, Raymond et al. 1986) und Migration (Watanabe et al. 1987) von kornealen Endothelzellen und auf die Proliferation von Linsenepithelzellen (Reddan und Wilson-Dziedzic 1983).

1.6.2 Die Fibroblast Growth Factors (FGF)

Die beiden Hauptformen der Familie der Fibroblast Growth Factors bilden der basische (hoher isoelektrischer Punkt) und der saure Fibroblastenwachstumsfaktor (niedriger isoelektrischer Punkt). Der basische Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) hat ein Molekulargewicht von 16500 Dalton und besteht aus 146 Aminosäuren (Esch et al. 1985), der saure Fibroblastenwachstumsfaktor hat ein Molekulargewicht von 15500 Dalton und ist aus 140 Aminosäuren aufgebaut (Thomas et al. 1984, Esch et al. 1985). Zu ca. 55 % sind bFGF und aFGF in ihrer Sequenz identisch (Esch et al. 1985).

Der aFGF wurde z.B. in Gehirn (Lobb und Fett 1984) und Retina (Baird et al. 1985) gefunden und scheint auf das Vorkommen in neuronalem Gewebe beschränkt zu sein, wohingegen bFGF in einer Vielzahl von Zellen gefunden wurde.

Der Rezeptor für aFGF und bFGF ist ein einkettiges Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 110 - 150 kda. Er besitzt eine hohe Affinität für beide Faktoren, die für bFGF aber höher ist als für aFGF (Baird und Böhlen 1990).

Die Wirkung von bFGF und aFGF auf eine Vielzahl von Zellen in vitro und in vivo wurde bereits untersucht. Oft zeigte sich eine stimulierende Wirkung, wie z.B. bei der Proliferation kornealer Endothelzellen in vitro (Gospodarowizc et al. 1977, Rieck et al. 1992).


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1.6.3 Die Transformig Growth Factors beta (TGF-ß)

Der TGF beta wurde 1983 von Assoian et al. isoliert. Dieser Wachstumsfaktor wird heute TGF-ß1 genannt. Inzwischen sind weitere vier Isoformen bekannt (Roberts und Sporn 1990).

In humanen Geweben konnten die Isoformen TGF-ß1 (Derynck et al. 1985), TGF-ß2 (de Martin et al. 1987) und TGF-ß3 (ten Dijke et al. 1988, Derynck et al. 1988) isoliert werden. Es handelt sich um homodimerische Peptide und jeder der TGF-ßs wird aus einem Vorläuferprotein (~ 400 Aminosäuren) proteolytisch in ein reifes Peptid umgewandelt (112 Aminosäuren). Die TGF-ß - Isoformen sind zu 70 - 80 % identisch (Miyazono et al. 1993).

Die Wirkungen, die durch TGF-ß vermittelt werden, reichen von der Regulation von Proliferation, Differenzierung, Adhäsion und Migration über die Stimulation von extrazellulärer Matrixsezernierung bis zur Modulation von vielen entzündlichen und immunologischen Reaktionen (Roberts und Sporn 1990).

Die TGF-ßs vermitteln ihre Wirkungen durch Bindung an eigene, spezifische Rezeptoren. Ich möchte etwas näher auf die TGF-ß - Rezeptoren I, II und III (TßR I, TßR II und TßR III) eingehen.

Das Verständnis der Signaltransduktion durch die TGF-ß - Rezeptoren wurde stark verbessert durch die Klonierung und Charakterisierung von TßR II (Lin et al. 1992) und TßR III (Wang et al. 1991, Lopez-Casillas et al. 1991).

TßR I und TßR II sind Glycoproteine, wobei der TßR II ein Molekulargewicht von 80 kDa hat und zur Familie der Serin/Threonin - Kinase - Rezeptoren gehört. Die Struktur des TßR I ist nicht eindeutig aufgeklärt. Der TßR III ist, im Gegensatz zu allen bekannten Polypeptid - Rezeptoren, ein Proteoglykan. Er setzt sich aus einem Kernprotein von 120 kDa und Glykosaminoglykan - Seitenketten zusammen, die einen hohen Gehalt an Heperansulfat und Chondroitinsulfat haben. Zur Bindungskapazität der einzelnen Isoformen an die Rezeptoren ist zu sagen, daß TßR II mit hoher Affinität TGF-ß1 und 3 bindet, TGF-ß2 aber hauptsächlich an TßR III bindet. Wie kann nun TGF-ß ein intrazelluläres Signal induzieren? Dafür müssen in jedem Falle TßR I und TßR II auf der Zelloberfläche vorhanden sein. TGF-ß bindet an den TßR II, der allein kein Signal auslösen kann. Bei Bindung von TGF-ß kommt es vielmehr zu einer Rekrutierung des TßR I und darauffolgenden Ausbildung eines Liganden -TßR I - TßR II - Komplexes.


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Durch die Einbeziehung des TßR I in den Komplex kommt es zu einer Phosphorilierung von TßR I und damit zur Weiterleitung eines intrazellulären Signals. Der TßR III nimmt nicht direkt an der Signaltransduktion teil. Bei Bindung von TGF-ß2 an TßR III produziert dieser ein transmembranäres Signal, welches TßR II präsentiert wird (Lopez-Casillas et al. 1993).

Abb. 1.1 Darstellung TGF-ß-Rezeptor III und Rezeptorkomplex aus TGF-ß-Rezeptor
I und II (modifiziert aus Heldin et al. 1997)

Die drei besprochenen Rezeptoren sind auf der Oberfläche kornealer Endothelzellen zu finden (Joyce und Zieske 1997). Es können also die im Kammerwasser enthaltenen TGF-ß - Isoformen auf die Endothelzellen einwirken.

1.6.3.1 Der Transforming Growth Factor Beta 2 (TGF-ß2)

Der TGF-ß2 ist ein homodimerisches Peptid mit einer dreidimensionalen Struktur. Jede Kette ist aus 112 Aminosäuren aufgebaut, die zu zwei antiparallelen ß-Faltblättern und drei alpha-Helices zusammengesetzt und zusätzlich durch acht Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Eine Disulfidbrücke zwischen den beiden Ketten stabilisiert die dimerische Struktur. Jedes TGF-ß2 - Monomer ähnelt in seinem Aufbau einer ausgestreckten Hand (siehe Abb.1.2.) und bildet so kein kompaktes, globuläres Protein (Miyazono et al. 1993).

Humanes Kammerwasser hat einen hohen Gehalt an TGF-ß. Die höchste Konzentration wurde für TGF-ß2 gefunden (1-3 ng/ml), der überwiegend in aktiver Form vorliegt.


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Abb. 1.2. Struktur von TGF-ß2 (aus Miyazono et al. 1993)

1.7 L-Ascorbinsäure ( Friedrich 1987, Nobile und Woodhill 1981)


L-Ascorbinsäure ist ein 2,3-Endiol-L-gulonsäure-gamma-lacton. Als Redoxsystem des Vitamin C bezeichnet man die 3 Verbindungen L-Ascorbinsäure, Dehydro-L-Ascorbinsäure und die radikalische Zwischenstufe, genannt Monodehydroascorbinsäure (siehe Abb. 1.4.). Aus L-Ascorbinsäure entsteht durch Oxidation Dehydroascorbinsäure, die durch Reduktion mit H2S zu L-Ascorbinsäure regeneriert werden kann. Ascorbinsäure liegt als weißes, farbloses Kristallinpulver vor, das aus quadratischen oder etwas länglichen monoklinen Kristallen besteht und gehört zu den wasserlöslichen Vitaminen (siehe Abb. 1.3.). Die erstmalige Isolierung gelang 1928 und durch Strukturaufklärung ist seit 1933 die chemische Synthese möglich.

Für den menschlichen Organismus ist Ascorbinsäure essentiell, da das Enzym L-Gulonolacton - Oxidase im Laufe der Evolution durch Mutation verlorenging. Vielen


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Tierarten, die diesen Mangel nicht aufweisen, ist es möglich, aus Glukose selbst Ascorbinsäure zu bilden.

Der tägliche Bedarf an Ascorbinsäure beträgt ca. 20-30 mg. Davon werden 80-90 % im Duodenum, Jejunum und über die Mundschleimhaut durch einen Carrier - und Na+- abhängigen aktiven Transport resorbiert.

Im menschlichen Körper ist Ascorbinsäure in hoher Konzentration in stoffwechselaktiven Geweben zu finden. So liegt Vitamin C in sehr hoher Konzentration in Nebenniere, Hypophyse, Gehirn, Augenlinse, Milz ,Leber und Pankreas vor.

Eine hohe Ascorbinsäurekonzentration ist auch im Kammerwasser zu finden. Sie beträgt ca. 100 µg/ml und somit das Doppelte der Ascorbinsäurekonzentration des Serums.

Die Wirkungen der Ascorbinsäure sind vor allem ihrer Eigenschaft als Redoxpartner zuzuschreiben. Als biochemisches Redoxsystem ist das Vitamin C an vielen Eletronentransportreaktionen beteiligt. Zu den bekanntesten biochemischen Reaktionen, die durch Vitamin C stimuliert werden, zählen Hydroxilierungen.

Zu einigen wichtigen Funktionen gehören die Beteiligung an der Kollagensynthese (Katalyse durch Ascorbinsäure), die Bedeutung beim Abbau der Aminosäure Tyrosin, die Funktion als Cofaktor bei der Synthese von Noradrenalin sowie die antioxidative Wirkung als Radikalfänger z.B. zum Schutz vor lichtinduzierten Gewebeschäden. Bei der letztgenannten Funktion reagiert Ascorbinsäure mit den toxischen Formen des Sauerstoffs, dem Superoxidanion und dem Hydroxylradikal. Dabei entsteht Monodehdroascorbinsäure, die rasch zu Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure disproportioniert wird.

Neben diesen biochemischen Wirkungen nimmt Ascorbinsäure einen Einfluß auf Zellteilungs - und Differenzierungsprozesse. So wurden antiproliferative (Knorr et al. 1996) bzw. zelltoxische (Wunderlich et al. 1992) als auch proliferationsfördernde (Liso et al.1984) Effekte gezeigt.


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Abb. 1.3. Vitamin C (aus Friedrich 1987)

L-Ascorbinsäure

(reduziert)

Dehydro-L-Ascorbinsäure

(oxidiert)

Abb. 1.4: Redoxsystem des Vitamin C, Strukturformeln der L-Ascorbinsäure und der
Dehydro-L-Ascorbinsäure (aus Friedrich 1987)


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1.7.1 Zusammenhang mit Lipoxygenase

Arachidonsäure wird über drei verschiedene enzymatische Wege zu biologisch aktiven Eicosanoiden metabolisiert (Needleman et al. 1986, Abb. 1.5.).

Das Enzym Cyclooxygenase bildet aus Arachidonsäure Prostaglandine, Prostacyklin und Thromboxan.

Der Arachidonsäure - Stoffwechsel durch Epoxygenase ist abhängig von Cytochrom P450 - Monoxygenasen. Zu den entstehenden Metaboliten gehören Epoxyeicosatrienoicsäure, 12-R-Hydroxyeicosatetraenoicsäure und 12-R-Hydroxyeicosatrienoicsäure.

Lipooxygenase wandelt die Arachidonsäure zu Hepoxillinen, Lipoxinen, Leukotrienen und den unstabilen Hydroperoxyeicosatetraenoicsäuren (HPETEs) um, aus denen rasch Hydroxyeicosatetraenoicsäuren (HETEs) gebildet werden. 12-Lipoxygenase katalysiert die Oxidation von Arachidonsäure zur unstabilen 12-HPETE, bzw. zur stabilen 12-S-HETE.

Das Hauptprodukt des Arachidonsäurestoffwechsels in kornealen Zellen von Ratten ist 12-S-HETE, was aussagt, daß der Lipoxygenaseweg den vorherrschenden Weg der Metabolisierung von Arachidonsäure in kornealen Zellen darstellt (Hurst et al. 1991).

Die Zellproliferation epidermaler Zellen wird durch Lipoxygenase und die durch ihre Katalysierung entstehende 12-S-HETE günstig beeinflußt (Chan et al. 1985). Es wurde bereits gezeigt, daß eine Hemmung der Lipoxygenase eine Verzögerung der Wundheilung kornealer Rattenepithelzellen zur Folge hat (Gupta et al. 1992).

Durch Willams et al. wurde nachgewiesen, daß Ascorbinsäure die Bildung von 12-S-HETE durch korneale Zellen inhibiert (Williams et al. 1986).

Es besteht also die Möglichkeit, einen evtl. hemmenden Effekt von Ascorbinsäure auf den Lipoxygenaseweg des Arachidonsäuremetabolismus durch Zugabe von 12-S-HETE zu vermindern.


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Abb. 1.5: Metabolisierung von Arachidonsäure


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Tue Sep 11 15:37:37 2001