Ryseck, Ilona: Modulation von Proliferation und Migration boviner kornealer Endothelzellen in Kultur durch humanes Kammerwasser, Transforming Growth Factor-Beta 2 und Ascorbinsäure

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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Zellen

Für die Gewinnung der Endothelzellen wurden Rinderaugen aus einem nahegelegenen Schlachthof verwendet. Die Bulbi wurden direkt post mortem enukleiert und, auf Eis gelagert, in unser Labor transportiert. Vor der weiteren Präparation wurden die Bulbi maximal vier Stunden bei 4 °C in der feuchten Kammer gelagert. Es wurden nur Augen verwendet, die keine Epitheldefekte und kein Hornhautödem aufwiesen.

3.1.2 Laborinventar

3.1.2.1 Gefäße

- sterile Bechergläser, Petrischalen und Glasflaschen (mit Verschluß)

- sterile 50 ml Plastikröhrchen
- sterile 15 ml Zentrifugenröhrchen

- Easy Flow-Sterilfilter

- 6 und 12 Well Kulturschalen

3.1.2.2 Instrumente

- 1 Schere

- 3 sterile Pinzetten

- 1 sterile gebogene Schere

- 1 steriles Skalpell

- 1 steriles Hockeymesser

- Eppendorfpipetten (1000 µl, 100 µl) mit sterilen Pipettenspitzen

- sterile Einmalpipetten ( 10 ml, 25 ml)

- 1 steriler Trepan (5,5 mm)


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3.1.2.3 Geräte

- sterile Werkbank mit Laminar Flow und Abflammgerät

- Brutschrank

- Kühlschrank

- Gefrierschrank

- Wasserbad

- inverses Mikroskop mit Kamera

- Zentrifuge

- Autoclaviergerät

- Heißluftsterilisator

- Stoppuhr

- Pipettierhilfe
- Neubauer - Zählkammer

3.1.3 Medium und Lösungen

3.1.3.1 Zusammensetzung des Kulturmediums

- 100,0 ml DMEM (GIBCO BRL, Paisley, Schottland)

- 2,5 ml HEPES mit ph 7,2 (Serva, Feinbiochemica, Heidelberg)

- 1,0 ml L-Glutamin (GIBCO BRL, Schottland)

- 1,0 ml Penicillin/ Streptomycin (Sigma, St.Louis, U.S.A.)

- 0,1 ml Gentamycin (GIBCO BRL, Paisley, Schottland)

- 10,0 oder 5,0 ml fetales Kälberserum (GIBCO BRL, Paisley, Schottland)

Die fertige Lösung wurde sterilfiltriert und bei 4 °C gelagert. Vor Gebrauch wurde das Kulturmedium auf Zimmertemperatur erwärmt.

3.1.3.2 Sonstige Lösungen

PBS - Pufferlösung

8,1 g Natriumchlorid

100 ml Phosphatpuffer ph 7,2


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900 ml Aqua dest.

sterilfiltrieren

PBS/EDTA-Lösung

100 ml PBS - Pufferlösung

0,02 g EDTA

sterilfiltrieren

PBS - Natriumthiosulfat - Lösung

1000 ml PBS - Pufferlösung

1 g Natrium - Thiosulfat

sterilfiltrieren

1 % ige Trypsin/EDTA-Lösung

9 Teile sterile PBS-Lösung

1 Teil steriles Trypsin/EDTA

Giemsa - Farbsubstratlösung

je 0,5 ml Giemsa auf 10 ml mit Aqua dest. auffüllen

- Absoluter Methanol

Trypan - Blau - Farbsubstrat - Lösung

Herstellen einer 0,5 %igen Lösung mit PBS - Pufferlösung

3.2 Methoden

3.2.1 Präparation und Anlegen der Primärkultur

Die Bulbi wurden nach dem Eintreffen im Labor unter fließendem Wasser gewaschen. Augen mit einem sichtbaren Epitheldefekt, Einblutungen oder Hornhauttrübungen wurden nicht verwendet. Mit einer Schere wurde das anhängende Bindegewebe entfernt. Die gesäuberten Bulbi wurden für 5 min in einer 2,5 % igen PVP- Jodlösung desinfiziert. Zur Titration des Jods wurden die Bulbi 5 min in PBS - Natriumthiosulfat - Pufferlösung gespült und verweilten weitere 5 min in PBS - Pufferlösung. Zur Präparation der Korneoskleralscheiben wurde die Sklera mit einem Skalpell im Abstand von 2-3 mm vom Limbus inzidiert und der Schnitt mit einer gebogenen Schere zirkulär erweitert. Die Korneoskleralscheibe konnte dann mit einer Pinzette vorsichtig von der Iris abgehoben werden. Es wurden 12 - 15 Hornhautscheiben präpariert und in PBS -


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Pufferlösung bei 4 °C gesammelt. Zur Ablösung der Endothelzellen wurde die Hornhaut mit dem Endothel nach oben zeigend in eine sterile Petrischale gelegt. Mit einem Hockeymesser wurden die Endothelzellen vorsichtig von der Descemet - Membran abradiert. Die Zellen wurden in 2 ml PBS - Pufferlösung in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen gesammelt und 7 min mit einer Trypsin/EDTA - Lösung der Endkonzentration 1% inkubiert. Durch das Trypsin sollen die Interzellularräume erweitert werden. Das Zentrifugenröhrchen wurde dann mit Kulturmedium+10% fetales Kälberserum (FCS) aufgefüllt und bei 1000 U/min und 15 °C für 10 min zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abpipettiert und das Pellet in 2 ml Kulturmedium resuspendiert. Die Aussaat der Zellen erfolgte durch gleichmäßiges Verteilen der Zellösung auf einer 6 Well-Kulturschale in je 2 ml Kulturmedium+10% FCS. Alle 2 - 3 Tage wurde das Medium gewechselt. Nach 12 - 14 Tagen war ein konfluenter Zellrasen gewachsen. Die Kulturen wurden im Brutschrank bei 5% CO2 und 37 °C gelagert. Bei fortgeschrittener Konfluenz wurde der Serumanteil im Kulturmedium auf 5% reduziert. Von der Aussaat bis zur Konfluenz wurden die Zellen regelmäßig mit einem Lichtmikroskop beurteilt. Eine genaue Beobachtung des Zellwachstums ist besonders wichtig, da es zu einer Kontamination mit Fibroblasten kommen kann, die dann die Kulturen überwuchern.

3.2.2 Passage der Primärkultur

Für die weitere Verwendung wurden die konfluenten Zellkulturen passagiert. Dazu wurde jedes Well der Kulturschale mit 1 ml PBS - Lösung und 1 ml PBS/EDTA - Lösung gespült und anschließend mit 1fach konzentrierter Trypsin/EDTA - Lösung 7 min inkubiert. Unterstützt wurde der Ablösevorgang durch Schütteln und Klopfen der Kulturschale. Die Trypsin/EDTA - Lösung mit den abgelösten Zellen wurde in einem Zentrifugenröhrchen mit der 10 fachen Menge Kulturmedium+10% FCS gesammelt und bei 1000 U/min und 15 °C 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 1 ml Kulturmedium+5% FCS resuspendiert. Die Zellzahl/µl wurde mit der Neubauer - Zählkammer bestimmt.


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3.2.3 Proliferationsassay

Für die Experimente zur Untersuchung der Proliferation wurden die Endothelzellen der ersten Passage zu 15.000 Zellen / Well auf 12-Well-Kulturschalen in je 1 ml Kulturmedium+5% FCS ausgesät. Nach 6 - 8 Stunden hatten sich die vitalen Zellen am Kulturschalenboden angeheftet. Die Experimente wurden 12 Stunden nach Aussaat der Zellen gestartet. Das Medium wurde abgenommen und frisches Kulturmedium+5% FCS mit Zusatz der zu untersuchenden Substanzen in den entsprechenden Konzentrationen dazugegeben (1 ml / Well). Nach abgelaufener Inkubationszeit im Brutschrank von 3 oder 4 Tagen wurden die Experimente abgebrochen. Das Vorgehen dabei war der Prozedur des Passagierens ähnlich. Nach Abnehmen des Mediums und Waschen mit PBS - Pufferlösung und PBS/EDTA - Lösung wurden die Kulturen mit Trypsin/EDTA - Lösung (300 µl/ Well) für 7 min inkubiert. Dieser Vorgang wurde durch Schütteln und Klopfen der Kulturschale unterstützt. Unter dem Mikroskop wurde überprüft, ob sich alle Zellen vom Kulturschalenboden gelöst haben. Die gelösten Zellen wurden in seperaten Zentrifugenröhrchen mit der 10 fachen Menge Kulturmedium+10% FCS gesammelt und bei 1000 U/min und 15 °C 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und das Pellet in 100 µl Kulturmedium+5% FCS resuspendiert. Mit der Neubauer - Zählkammer wurden die Zellen in vier Großquadraten gezählt, die Zellzahl / Well bestimmt und der Mittelwert berechnet.

3.2.4 Wundassay

Für die Experimente zur Untersuchung der Migration wurden die Endothelzellen der ersten Passage mit einer Zellzahl von 25.-30.000 Zellen/ Well auf 12 Well- Kulturschalen in je 1 ml Kulturmedium+5% FCS ausgesät. Der Durchmesser eines Wells beträgt 2,5 cm. Nach spätestens 5 Tagen waren die Zellkulturen im Brutschrank zur Konfluenz herangewachsen und standen für die Experimente zur Verfügung. Mit einem Trepan vom Durchmesser 5,5 mm wurden zirkuläre, zentrale Wunden in den Zellrasen gestanzt. Der Trepan wurde in seinem Hohlraum durch einen Gummi ausgefüllt, der den unteren Rand um 1 - 2 mm überragte (siehe Abb. 3.1.). Somit wurden beim Setzen der Wundläsion die Zellen im Wundinneren abradiert. Der initiale


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Wundrand blieb durch die Stanzmarkierung des Trepans über den gesamten Versuchsablauf sichtbar.

Abb. 3.1: Trepan

Direkt nach Setzen der Wunden wurde das Medium abgenommen und die Zellkulturen mit je 1 ml Kulturmedium+5% FCS/ Well gewaschen. Anschließend wurde je 1 ml frisches Kulturmedium+5% FCS, das die zu untersuchenden Substanzen in den entsprechenden Konzentrationen enthielt, zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden im Brutschrank inkubiert.

Nach einer Inkubationszeit von 3 oder 4 Tagen wurden die Experimente abgebrochen. Dafür wurden die Zellkulturen mit 1 ml PBS - Pufferlösung / Well gewaschen und mit absolutem Methanol fixiert. Nach Abnehmen des Methanols und Zugabe von PBS - Pufferlösung konnten die Zellkulturen bei 4 °C zwischengelagert werden.

Zur Auswertung und Photodokumentation wurden die Zellkulturen angefärbt. Die verwendete Giemsa - Farbsubstrat - Lösung mußte 10 min einwirken und durch mehrmaliges Spülen mit Aqua dest. ausgewaschen werden. Anschließend wurden die Kulturen luftgetrocknet. Durch den rot - violetten Farbstoff Giemsa wurden die Zellkerne und das Zellplasma angefärbt.


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Die Auswertung erfolgte mit einem Zählraster (Abb. 3.2.) bei 160 facher Vergrößerung. Die Zellen wurden an 5 verschiedenen Stellen, ausgehend vom Wundrand gezählt. Jede Stelle hatte die Flächengröße 0,25 mm², entsprechend 5x5 Kästchen. Der auswertenden Person waren die Daten zu den ihr vorliegenden Experimenten unbekannt.

Aus den Zahlenwerten der 5 ausgezählten Areale wurde ein Mittelwert berechnet

Abb. 3.2: Zählraster

3.2.5 Proliferations - Experimente

Alle Experimente wurden mindestens drei Mal durchgeführt, wobei für jede Konzentration einer getesteten Substanz drei Wells verwendet wurden.

3.2.5.1 Humanes Kammerwasser

Das Kammerwasser wurde bei Standard - Kataraktextraktionen im Operationssaal der Augenklinik am Campus Virchow - Klinikum der Charité entnommen. Die Patienten hatten keine Erkrankungen, die u.U. Einfluß auf die Zusammensetzung des Kammerwassers nehmen und waren nicht voroperiert. Es konnten ca. 100 µl


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Kammerwasser/ Kataraktextraktion gewonnen werden. Die Proben wurden in sterilen Eppendorf - Behältern gesammelt und bei -20 °C gelagert. Nach spätestens 2 Monaten wurde das Kammerwasser in den Experimenten verwendet.

Das so gewonnene humane Kammerwasser wurde in unverdünnter Form und als 10%ige Lösung in Kulturmedium+5% FCS zwölf Stunden nach Aussaat zu den Endothelzellen gegeben. Nach weiteren 72 Stunden Inkubation wurden die Zellen vom Kulturschalenboden abgelöst und gezählt.

3.2.5.2 TGF-ß2

Der Wachstumsfaktor TGF-ß2 (R&D Systeme, Wiesbaden) wurde in den Konzentrationen 0,1, 1 und 10 ng/ml Kulturmedium+5% FCS verwendet. Die Inkubationszeit betrug 96 Stunden. Es wurden zur Kontrolle Zellen mit frischem Kulturmedium+5% FCS ohne Zusatz von TGF-ß2 inkubiert.

3.2.5.3 Ascorbinsäure

Ascorbinsäure (Sigma, U.S.A.) wurde in den Konzentrationen 50, 100 und 200 µg/ml verwendet. Die Zellzahl/Well wurde nach den beiden Inkubationszeiten, 72 und 96 Stunden, bestimmt. Zur Kontrolle wurden die Zellzahlen von Kulturen bestimmt, bei denen dem Medium keine Ascorbinsäure zugesetzt wurde.

In einem zusätzlichen Versuch wurde dem Medium, welches bereits Ascorbinsäure in der Konzentration 50 µg/ml enthielt, 12-S-HETE (Sigma, U.S.A.) in der Konzentration 0,1 µM zugesetzt.

3.2.6 Wundmodell - Experimente


Durch das Wundmodell kann die Migration kornealer Endothelzellen untersucht werden. Die Zellzahl der über den Wundrand eingewachsenen Zellen stellt ein Maß für die Migrationsrate der Zellen dar. Durch das Waschen der Zellkulturen direkt nach Wundläsion und Zusetzen der zu untersuchenden Faktoren zu frischem Kulturmedium, kann ihr exogener Einfluß auf die Zellen untersucht werden.

Alle Wundmodell - Experimente wurden drei Mal durchgeführt und für jede Versuchsgruppe drei Wells ausgewertet.


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3.2.6.1 Humanes Kammerwasser

Im Experiment wurde der Einfluß von unverdünntem Kammerwasser und auf 10% Kammerwasser im Kulturmedium+5% FCS untersucht. Kontrollgruppen wurden nur mit Kulturmedium+5% FCS inkubiert. Nach 3 Tagen Inkubationszeit wurden die Versuche ausgewertet und photodokumentiert.

3.2.6.2 TGF-ß2

Der im Kammerwasser enthaltene Wachstumsfaktor TGF-ß2 wurde in den Konzentrationen 0,1, 1, und 10 ng/ml Kulturmedium+5% FCS verwendet. Diese Konzentrationen sind mit der TGF-ß2 - Konzentration im Kammerwasser vergleichbar. Als Kontrolle dienten Zellen ohne Zusatz von TGF-ß2 zum Kulturmedium.

Die Experimente wurden nach 3 Tagen ausgewertet und photodokumentiert.

3.2.6.3 Ascorbinsäure

Verwendet wurde L-Ascorbinsäure (Sigma, U.S.A.). Die Konzentration im Kammerwasser beträgt ca. 50-100 µg/ml. In den Experimenten wurden die Konzentrationen 50, 100, und 200 µ/ml verwendet. Dazu wurde aus dem wasserlöslichen Vitamin eine Lösung der Konzentration 100 mg/ml in Aqua dest. hergestellt. Diese Lösung wurde dann zur Herstellung der verwendeten Konzentrationen in Kulturmedium+5%FCS benutzt. Als Kontrolle dienten Zellen ohne Zugabe von Ascorbinsäure zum Medium.

Nach einer Inkubationszeit von drei oder vier Tagen wurden die Experimente
abgebrochen, ausgewertet und photodokumentiert.

3.2.7 Toxizitätstests

Um eine eventuelle toxische Wirkung von TGF-ß2 und Ascorbinsäure auf die Endothelzellen beurteilen zu können, wurden Vitalitätsprüfungen durchgeführt. Es wurde eine 0,5 % ige Trypanblau - Farblösung verwendet. Nach abgelaufener Inkubationszeit wurde das Medium abgenommen. Nach Spülung mit PBS - Pufferlösung wurde je 150 µl Trypanblau - Farblösung zu den Zellen gegeben. Nach


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einer Einwirkzeit von 1 min wurden die Zellen mit je 1 ml PBS - Pufferlösung gespült und mit absolutem Methanol fixiert. Das Färbeergebnis wurde photodokumentiert.

Trypanblau ist ein Farbstoff, der zur Vitalitätsprüfung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Er permeiert in geschädigte Zellen und färbt den Zellkern blau an. Besonders günstig ist die anschließende Fixierbarkeit des Färbeergebnisses.

3.2.8 Statistik

Die statistische Auswertung aller Versuche erfolgte unter Zuhilfenahme des Computer - Statistikprogrammes Jandel Scientific, Sigma Stat Version 1.0.

Es wurden zwei verschiedene Tests verwendet. Bei dem ersten handelt es sich um den Student´s t-Test. Er vergleicht ungepaarte Stichproben, die normalverteilt sind und die gleiche Varianz haben, auf ihre Signifikanz zueinander. Der zweite verwendete Test ist der Whitney - Man Rank Sum Test. Er kam zum Einsatz, wenn keine Normalverteilung und/oder Varianz der Stichproben vorlag. Ein p - Wert von < 0,01 wurde als signifikant angesehen.


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Tue Sep 11 15:37:37 2001