Ryseck, Ilona: Modulation von Proliferation und Migration boviner kornealer Endothelzellen in Kultur durch humanes Kammerwasser, Transforming Growth Factor-Beta 2 und Ascorbinsäure

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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1 Humanes Kammerwasser

4.1.1 Proliferationsversuche

Der Einfluß von unverdünntem und 10% igem humanen Kammerwasser (KW) in Kulturmedium+5%FCS auf die Proliferation der bovinen kornealen Endothelzellen (BCEC) ist in Abbildung 4.1. dargestellt. Angegeben ist die Zellzahl/Well in Prozent. Die Inkubationszeit betrug 72 Stunden und die Versuche wurden direkt nach den 72 Stunden abgebrochen. Es wurden zwei Versuchsansätze mit je drei Wells pro Untersuchungsgruppe (Kontrolle, KW 100% und KW 10 %) durchgeführt. Es ergab sich eine signifikante Inhibierung der Proliferationsrate der Zellen (p<0,005). Für unverdünntes Kammerwasser betrug die Hemmung nahezu 100 %, für 10%iges Kammerwasser in Kulturmedium 30 % im Vergleich zur Kontrolle.

Abb. 4.1


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4.1.2 Wundmodellversuche

Die in den Wundversuchen untersuchte Migration der BCEC, sowie der Einfluß von unverdünntem humanen Kammerwasser und 10%igem Kammerwasser in Kulturmedium ist in Abbildung 4.2. dargestellt. Die Ergebnisse sind als Zellzahl in Prozent / 0,25 mm² auf der Ordinate aufgetragen.

Auch auf die Migration der BCEC hatte humanes Kammerwasser einen hemmenden Einfluß. Dabei lag auch hier die Migrationsrate der Zellkulturen unter Einfluß von 10%igem Kammerwasser in Kulturmedium bei 70% der Kontrollzellkulturen (p<0,0001). Unverdünntes humanes Kammerwasser hatte einen stark inhibierenden Einfluß auf die Migration. Die Migrationsrate betrug 15% der Kontrolle (p<0,0001). Die Ergebnisse wurden photodokumentiert und sind mit je einem Ausschnitt in Abb. 4.3. - 4.5. dargestellt.

Abb. 4.2:


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Abb. 4.3: Kontrolle

Abb. 4.4: 10%iges Kammerwasser

Abb. 4.5: unverdünntes Kammerwasser


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4.2 Transforming Growth Factor Beta 2 (TGF-ß 2)

4.2.1 Proliferationsversuche

TGF-ß2 wurde in drei verschiedenen Konzentrationen: 0,1, 1 und 10 ng/ml Kulturmedium +5% FCS zu den Zellen gegeben. Die Auswirkungen auf die Proliferationsrate nach vier Tagen sind in Abbildung 4.6. dargestellt. Die Versuche wurden drei Mal durchgeführt, bei jeweils drei Ansätzen/ Konzentration.

Für alle drei Konzentrationen von TGF-ß2 ist eine Stimulation der Poliferationsrate nachweisbar, die höchste Stimulationsrate wurde bei den TGF-ß2 - Konzentrationen 0,1 und 1 ng/ml Medium gemessen. Die Werte sind im Vergleich zur Kontrolle für alle drei Konzentrationen signifikant (p<0,001). In einem vierten Versuchsansatz wurden die Zellkulturen fixiert und gefärbt. Die Photodokumentation ist in Abb. 4.7. - 4.10. dargestellt.

Abb. 4.6:


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Abb. 4.7: Kontrolle

Abb. 4.8: TGF-ß2 0,1 ng / ml


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Abb. 4.9: TGF-ß2 1 ng / ml

Abb. 4.10: TGF-ß2 10 ng / ml


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4.2.2 Wundmodellversuche

Für die Untersuchung der Migration wurde TGF-ß2 ebenfalls in den Konzentrationen 0,1, 1 und 10 ng/ ml Kulturmedium+5% FCS zu den Zellkulturen gegeben. Im Gegensatz zur Proliferation ergab sich eine signifikante Inhibierung der Migration bei allen TGF-ß2- Konzentrationen (p<0,01), wie in Abbildung 4.11. dargestellt. Bei diesen Versuchen wurden die Zellen 72 h inkubiert. Die Migrationshemmung betrug jeweils ca. 50% im Vergleich zur Kontrolle. Als Kontrolle dienten Zellkulturen, die nur mit Kulturmedium+5%FCS versorgt wurden. Je ein Ausschnitt der Wundregion der Zellkulturen, die zu den in Abbildung 4.11. dargestellten Ergebnissen führten, ist in den Abb. 4.12. - 4.15. dargestellt.

Abb. 4.11:


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Abb. 4.12: Kontrolle

Abb. 4.13: TGF-ß2 0,1 ng / ml


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Abb. 4.14: TGF-ß2 1 ng / ml

Abb. 4.15: TGF-ß2 10 ng / ml


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4.2.3 Toxizitätstests

Bei Abbruch der Proliferations- und Migrationsversuche wurde Trypanblau zu den Zellkulturen gegeben. Nach Abspülen des Farbstoffes wurden die Kulturen mit reinem Ethanol fixiert. Die Ergebnisse der Toxizitätstestung wurden photodokumentiert und zwei Beispiele sind in Abb. 4.16. und 4.17. dargestellt. Die Zellkerne und das Zytoplasma sind nicht blau gefärbt. Das bedeutet, daß TGF-ß2 weder in den Proliferations - noch in den Migrationsversuchen eine toxische Wirkung auf die bovinen kornealen Endothelzellen hatte.

Abb. 4.16: Proliferation TGF-ß2 0,1 ng / ml

Abb. 4.17: Abb. 4.17. Migration TGF-ß2 10 ng / ml


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4.3 Ascorbinsäure

4.3.1 Proliferationsversuche

Um den Einfluß auf die Proliferation der BCEC zu untersuchen, wurde L-Ascorbinsäure in drei verschiedenen Konzentrationen, und zwar 50, 100 und 200 µg/ml Kulturmedium, zu den Zellkulturen gegeben. Die verwendeten Inkubationszeiten betrugen 72 Stunden und 96 Stunden. Es wurden 3 Versuche durchgeführt. Als Kontrolle dienten jeweils Zellkulturen, die 12 Stunden nach der Aussaat der Zellen mit frischem Kulturmedium+5%FCS ohne weitere Zusätze versorgt wurden. Die Ergebnisse der Versuche sind in Abbildung 4.18. dargestellt. Es ergab sich eine signifikante Inhibierung bei allen Konzentrationen und beiden Inkubationszeiten (p<0,004). Die Inhibierung ist bei 200µg Ascorbinsäure/ml Medium am stärksten ausgeprägt und beträgt ca. 90 - 95% im Vergleich zur Kontrolle. Dies trifft für beide Inkubationszeiten zu. Wenn Ascorbinsäure in den Konzentrationen 50 und 100µg/ml im Medium vorhanden war, lag die Proliferationsrate nach 72 Stunden bei ca. 50%, sowie nach 96 Stunden bei ca. 70 - 80% im Vergleich zur Kontrolle. Für die Photodokumentation wurde ein vierter Versuch durchgeführt, wobei die Zellen nach abgelaufener Inkubationszeit mit absolutem Methanol fixiert und mit Giemsa gefärbt wurden (Abb. 4.19. - 4.26.).

Abb. 4.18:


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Abb. 4.19: Kontrolle . . . . . Inkubation 72 h

Abb. 4.20: AS 50µg / ml . . . . . Inkubation 72 h


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Abb. 4.21: AS 100 µg / ml . . . . . Inkubation 72 h

Abb. 4.22: AS 200 µg / ml . . . . . Inkubation 72 h


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Abb. 4.23: Kontrolle . . . . . Inkubation 96 h

Abb. 4.24: AS 50 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h


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Abb. 4.25: AS 100 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h

Abb. 4.26: AS 200 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h


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4.3.2 Wundmodellversuche

Auch für die Untersuchung der Migration wurde Ascorbinsäure in den Konzentrationen 50, 100 und 200 µg/ml Kulturmedium verwendet und nach dem Spülen der Wundläsionen zu den Zellkulturen gegeben. Als Kontrolle dienten Zellkulturen, die nach dem Spülen der Wundläsionen mit frischem Kulturmedium ohne Zusatz von Ascorbinsäure versorgt wurden. Es wurden drei Versuchsansätze durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4.27. dargestellt. Es zeigte sich, im Gegensatz zur Proliferation, eine signifikante Stimulation bei allen drei Konzentrationen (p<0,0001). Sie war nach einer Inkubationszeit von 96 Stunden ausgeprägter als nach 72 Stunden Inkubation. Die Ergebnisse aus Abbildung 4.27. sind mit je einem Ausschnitt in Abb. 4.28. - 4.35. dargestellt.

Abb. 4.27


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Abb. 4.28: Kontrolle . . . . . Inkubation 72 h

Abb. 4.29: AS 50 µg / ml . . . . . Inkubation 72 h


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Abb. 4.30: AS 100 µg / ml . . . . . Inkubation 72 h

Abb. 4.31: AS 200 µg / ml . . . . . Inkubation 72 h


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Abb. 4.32: Kontrolle . . . . . Inkubation 96 h

Abb. 4.33: AS 50 µg / m . . . . . Inkubation 96 h


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Abb. 4.34: AS 100 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h

Abb. 4.35: AS 200 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h


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4.3.3 Toxizitätstests

Auch bei den Proliferations- und Migrationsversuchen mit Ascorbinsäure wurden Vitalitätsprüfungen durchgeführt. Trypanblau wurde nach Abbruch der Versuche zu den Zellkulturen gegeben. Nach einer Einwirkzeit von 1 min wurde der Farbstoff abgespült und die Zellkulturen mit Ethanol fixiert. Ascorbinsäure hat in den verwendeten Konzentrationen keine toxische Wirkung auf die Proliferation und Migration der bovinen kornealen Endothelzellen. Die Zellkerne und das Zytoplasma sind nicht blau angefärbt. Einige Beispiele der Photodokumentation sind in Abb. 4.36. - 4.40. dargestellt.

Abb. 4.36: Migration Kontrolle . . . . . Inkubation 96 h

Abb. 4.37: Migration AS 200 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h


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Abb. 4.38: Proliferation Kontrolle . . . . . Inkubation 72 h

Abb. 4.39: Proliferation AS 100 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h

Abb. 4.40: Proliferation AS 200 µg / ml . . . . . Inkubation 72 h


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4.3.4 Beeinflussung der Wirkung von Ascorbinsäure auf die Proliferation
von BCECdurch 12-S-HETE

Bei diesem Versuch wurde 12-S-HETE in der Konzentration 0,1 µM zum Medium gegeben, das Ascorbinsäure in der Konzentration 50 µg/ml enthielt. Als Kontrolle dienten Zellkulturen, die mit Medium inkubiert wurden, das weder Ascorbinsäure noch 12-S-HETE enthielt. Die Inkubationszeit betrug 96 Stunden. Das Medium wurde nach der Hälfte der Inkubationszeit erneuert, da 12-S-HETE eine sehr geringe Halbwertzeit besitzt.

Die Ergebnisse dieses Versuches sind in Abbildung 4.41. dargestellt. Die Hemmung durch Ascorbinsäure konnte durch 12-S-HETE in der Konzentration 0,1 µM partiell aufgehoben werden (Hemmung durch Ascorbinsäure: ca. 70%, Verminderung der Hemmung durch 12-S-HETE 0,1 µM auf ca. 50%).

Es wurde ein Versuchsansatz mit je 5 Wells/Konzentration durchgeführt. Es ergab sich eine Signifikanz der 12-S-HETE-Konzentration im Vergleich zur Kontrolle sowie im Vergleich zur alleinigen Ascorbinsäure - Zugabe (p<0,006).

Abb. 4.41


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Tue Sep 11 15:37:37 2001